Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Препараты на основе иммуноактивного дипептида и его координационных соединений с ионом цинка

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ЭКСПЕРТИЗЫ СРЕДСТВ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И

СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИИ ТАДЖИКСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени С.АЙНИ

О 5 2 О 13 £ 0 3 4 6 На правах рукописи

Бобиев Гуломкодир Муккамолович

ПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ ИММУНОАКТИВНОГО ДИПЕПТИДА И ЕГО КООРДИНАЦИОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ИОНОМ ЦИНКА

Диссертация

на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук 14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Научные консультанты:

доктор фармацевтических наук, профессор Бунятян Наталья Дмитриевна доктор медицинских наук, профессор Меркулов Вадим Анатольевич

Москва - 2013

)

Содержание

Содержание

Список использованных сокращений Введение

2-5

6-8

9-15

Глава 1.

1.1 1.2.

1.3.

1.4.

1.5.

Глава 2 2.1 2.2

Глава 3

3.1

3.2 3.3. 3.4 3.5.

Низкомолекулярные тимусные пептиды и 16-44 биокоординационные соединения аминокислот и низкомолекулярных пептидов с биометаллами

Открытие и роль тимусных пептидов в 16-21 формировании иммунитета

Проблемы синтеза тимусных пептидов и их 21-23 аналогов

Применение иммуноактивных пептидов в качестве 23-31 лекарственных средств

Значение цинка для функционирования иммунной 31-33 системы

Современное состояние исследований 34-44 биокоординационных соединений аминокислот и низкомолекулярных пептидов

Материалы и методы исследований 45-78

Химическая часть 45-67

Экспериментальная биологическая часть 67-78

Получение низкомолекулярных иммуноактивных 79-109 пептидов

Оптимизация условий синтеза аналогов 79-84 тимопентина

Синтез низкомолекулярных тимусных пептидов 85-89

Синтез тирозинсодержащих тетрапептидов 89-93

Синтез потенциально иммуноактивных дипептидов 93-96

Иммуностимулирующая активность 96-97

исследование 97-109

97-103 103-109 110-122

110-113

113-122

123-151

синтезированных пептидов

3.6 Химико-фармацевтическое

синтезированных пептидов

3.6.1. Выбор методов стандартизации

3.6.2. Изучение реакций разложения

Глава 4 Разработка методов стандартизации препарата на основе триптофансодержащих дипептидов

4.1 Производственная схема синтеза дипептида

изолейцил-триптофан

4.2. Стандартизация дипептида изолейцил-триптофан

как субстанции для создания препарата

Глава 5 Технологическая схема производства препарата на основе дипептида изолейцил-триптофан и его стандартизация

5.1 Разработка технологической схемы производства

5.2. Стандартизация тимогара

5.3. Валидация методики количественного определения тимогара

5.4. Стабильность тимогара

5.5 Сравнительные фармакологические исследования

тимогара и его натриевой соли тимогара

5.5.1 Сравнительное изучение токсических свойств тимогара и его натриевой соли

5.5.2 Изучение иммуностимулирующей активности натриевой соли дипептида изолейцил-триптофан (тимогара)

5.5.3 Аллергизирующие свойства натриевой соли изолейцил-триптофана (тимогара)

5.5.4 Эффективность применения натриевой соли дипептида изолейцил-триптофан (тимогара) при

123-126 126-129 129-134

134-136 136-151

136-138

138-142

142-144

144-148

неспецифических заболеваниях легких

5.5.5 Эффективность применения натриевой соли 149-151 тимогара при лечении кровепаразитарных заболеваний

Глава 6 Разработка препарата на основе координационных 152-216 соединений дипептида изолейцил-триптофан с ионом цинка

6.1. Изучение взаимодействия лизин-, серин-, тирозин- и 152-173 триптофансодержащих дипептидов с ионом цинка

6.2 Стандартизация лекарственной формы 173-183

6.3. Валидация методики количественного определения 183-188 тимоцина

6.4. Валидация методики количественного определения 188-198 содержания цинка в тимоцине

6.5. Стабильность координационных соединений цинка 198-200 с иммуноактивными пептидами

6.6. Общетоксические свойства тимоцина (157 мкг/мл) 200

6.7. Изучение аллергизирующих свойств тимоцина (157 200-203 мкг/мл)

6.8. Изучение эмбриотоксичности и тератогенности 203-208 тимоцина в сравнении с циклофосфамидом

6.9. Первичная фармакодинамика тимоцина (157 мкг/мл) 208-215

6.10 Вторичная фармакодинамика тимоцина 215-216

Глава 7 Результаты клинических испытаний тимогара и 217-240

тимоцина

7.1. Результаты клинических испытаний тимогара 217-228

7.2. Результаты клинических испытаний препарата 228-240 тимоцин

7.2.1. Применение тимоцина при лечении хронических 229-235 диффузных заболеваний печени

7.2.2. Результаты применения тимоцина при лечении рака 235-237 молочной железы

7.2.3. Клиническое исследование препарата тимоцин при 237-240 псориазе и нейродермите

Нормативные документы на разработанные 241 препараты

Список патентов по теме диссертации 241

Выводы 242-243

Список использованной литературы 244-273

Приложение 274-345

Список использованных сокращений

АКТГ - адренокортикотропный гормон

ВАК - высшая аттестационная комиссия

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГО АЛ - гидроокисьалюминиевая

Да - дальтон

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

Е АС-РОК - иммунологический тест по оценке количества В-лимфоцитов ЕКК - естественные киллерные клетки

Е-РОК - иммунологический тест по оценке количества Т-хелперных клеток

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИК - инфракрасный

ИНФ - интерферон

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛГ - лютеотропный гормон

ЛПНП - липопротеиды низкой плотности

ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности

М.в. — молекулярный вес

мМоль - миллимоль

МСХ - министерство сельского хозяйства МТ - металлотионеины

ПВТА - поливинилбензилтриметиламмоний

ПВЭНТИ - поливинилэтинилтриметилпиперидол с иодом

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПСА - вариант метода смешанных ангидридов

РА - реакция агглютинации

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТ - Республика Таджикистан

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РТПХ - реакция трансплантат против хозяина

РФ - Российская Федерация

РФИ - рентгенофлюорографическое исследование

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

СФИ - суммарный фагоцитарный индекс

СЭФ - суммарный эффект фагоцитоза

УФ - ультра-фиолетовый

ФАН% - количество нейтрофилов

ФНО - фактор некроза опухоли

ФОС - фосфорорганические соединения

ФСП - фармакопейная статья предприятия

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Асш - ацитометил

AcONH4 - ацетат аммония

Вое - трет-бутилоксикарбонильная группа

CD - обозначение маркера рецептором

Dien - диэтилентриамин

DMSO - диметилсульфоксид

DMF - NjN-диметилформамид

H2Ida - иминдиуксусная кислота

H2Heida - гидроксиэтилиминдиуксусная кислота

H3Nta - нитрилотриуксусная кислота

IL - интерлейкин

МНС - главный комплекс гистосовместимости MIF - фактор миграции макрофагов OB и - трет-бутиловый эфир

OEt - этиловый эфир

ОМе - метиловый эфир

ONp - п-нитрофениловый эфир

OSu - N-оксисукцинимидный эфир

Рер - пептид

Pg - простагландин

TAF - тимусный активный фактор

TdT - терминальная деоксинуклеотидил трансфераза

TGP - пептид роста тимоцитов

THF - тимусный гуморальный фактор

v/v - объем/объем

Z - карбобензокси-защитная группа

Введение

Актуальность проблемы. В настоящее время установлено, что нарушение функции иммунной системы организма зачастую приводит к возникновению широкого круга заболеваний. С целью профилактики таких патологий успешно используются иммуномодулирующие препараты, нередко полученные синтетическим путем. Однако, являясь чужеродными для живого организма, они могут провоцировать возникновение неблагоприятных побочных реакций (НПР). Альтернативой синтетическим средствам могут стать препараты, созданные на основе эндогенных иммуномодулирующих пептидов. В 70-х годах XX века из тимуса были получены экстракты, обладающие иммуномодулирующими свойствами (В.Г. Морозов и соавт., 2000). На основе этих экстрактов разработано несколько препаратов - тималин, тактивин и др., представляющих собой смесь большого количества пептидов, из которых были выделены индивидуальные пептиды и изучены их биологические свойства. При этом установлено, что некоторые триптофансодержащие дипептиды обладают иммуномодулирующими свойствами, в том числе Н-Не-Тгр-ОН и Н-01и-Тгр-0Н, на основе которого создан препарат тимоген (Яковлев Г.М. и соавт., 1990). В отличие от тимогена, дипептид Н-11е-Тгр-ОН оказывал влияние как на Т-хелперные (СБ4+), так и на Т-супрессорные (СЭ8+) клетки, что позволило сделать предположение о том, что лекарственные средства, изготовленные на его основе должны обладать более широким спектром иммунологической активности. Преимущество таких препаратов состоит в том, что они не являются чужеродными организму, вследствие чего не обладают токсичностью и не оказывают НПР. Опыт применения тимогена, вилона, иммунофана и других препаратов, являющихся синтетическими пептидами, соответствующими по аминокислотной последовательности природным, подтвердил справедливость данного утверждения. Все вышеизложенное показывает актуальность разработки новых иммуномодулирующих препаратов на

( 1 I I4 I I1 | ' ' 1 I 1?

основе синтетических пептидов эндогенного происхождения, обладающих иммунотропной активностью.

Малое содержание этих пептидов в организме и сложность выделения их из тимуса в чистом виде обуславливает особую актуальность разработки оптимальных методов их химического синтеза.

Известно, что в функционировании иммунной системы важную роль играют некоторые микроэлементы, наиболее значимым из которых с этой точки зрения является цинк. Роль его в клеточном и гуморальном иммунитете уже ни у кого не вызывает сомнений (Кудрин A.B. и соавт., 2000, 2007; Takahashi К., 1999; Tran C.D., 1999; Segurado М., 1999).

Установлено, что при комплексообразовании ионов различных металлов с биологически активными соединениями, в том числе иммуноактивными, происходит увеличение специфической и расширение спектра биологической активности последних. Однако до настоящего времени не был разработан ни один лекарственный препарат на основе биокоординационных соединений иммунологически активных микроэлементов и низкомолекулярных пептидов. В связи с этим, представляется актуальным изучение путей комплексообразования низкомолекулярных иммуноактивных пептидов с ионами биологически активных металлов, таких как цинк; создание на их основе иммуномодулирующих препаратов; разработка методов стандартизации и технологических схем производства.

Цель и задачи исследования: разработка методов получения иммуноактивных пептидов и их координационных соединений с ионом цинка и создание на их основе новых иммуномодулирующих препаратов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Оптимизировать пути синтеза тимопентина и его гексапептидного аналога, синтезировать потенциально иммуноактивные

лизин-, серии- и тирозинсодержащие дипептиды и тирозинсодержащие тетрапептиды, изучить применимость 1Ч-карбоксиангидридного метода для синтеза дипептида изолейцил-триптофан.

2. Определить параметры стандартизации и методики анализа субстанции, стандартного образца и препарата на основе дипептида изолейцил-триптофан (тимогар) с использованием методов спектрофотометрии, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3. Изучить взаимодействие лизинсодержащих и триптофансодержащих дипептидов с ионом цинка с использованием методов рН-метрического и окс-редметрического титрования.

4. Изучить влияние соле- и комплексообразования на хроматографическую подвижность триптофансодержащих дипептидов.

5. Разработать условия хроматографирования методом ВЭЖХ дипептида изолейцил-триптофан и его координационных соединений с ионом цинка.

6. Изучить стабильность препаратов тимогар и тимоцин в условиях длительного хранения согласно требованияям разработанных фармакопейных статей.

7. Разработать нормативную документацию на препараты тимогар и тимоцин.

8. Провести сравнительные фармакологические исследования тимогара и его натриевой соли, завешить доклинические и клинические исследования препаратов тимогар и тимоцин.

Научная новизна работы. Впервые разработаны методы стандартизации иммуномодулирующих препаратов тимогар - 0,01% водный раствор дипептида и тимоцин - 0,0157% водный раствор координационных соединений дипептида изолейцил-триптофан с ионом

цинка; исходных фармацевтических субстанций и их стандартных образцов.

Впервые изучена возможность использования ПСА-метода для синтеза аналогов тимопентина и №карбоксиангидридного метода для синтеза дипептида Н-11е-Тгр-ОН. Экспериментально подтверждено преимущество использования активированных (пентафторфениловых) эфиров при получении низкомолекулярных тимусных пептидов.

Получены координационные соединения лизинсодержащих и триптофансодержащих дипептидов Н-01у-Тгр-0Н и Н-11е-Тгр-ОН с ионом Ъи . Использование окислительной функции позволило установить состав координационных соединений и дипептида Н-11е-Тгр-ОН.

Разработаны методы стандартизации триптофансодержащего дипептида и его координационных соединений с ионом цинка, основанные на использовании современных физико-химических методов анализа.

Установлено, что препарат тимогар является высокоэффективным при лечении нефрологических, ревматологических и пульмонологических заболеваний человека. Показана эффективность монотерапии тимогаром при лечении псориаза. Впервые показано, что тимоцин (157 мкг/мл) не обладает аллергизирующими, эмбриотоксическими и тератогенными свойствами. Отмечено сокращение срока и увеличение эффективности лечения заболеваний человека, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний при совместном применении тимоцина (157 мкг/мл) с химиотерапевтическими лекарственными средствами.

Практическая значимость результатов исследования.

Разработаны методы стандартизации новых иммуномодулирующих препаратов тимогар, тимоцин, включенные в 5 Фармакопейных статей (ФСП 42 Т}-00001-08, 42 Т>00002-08, ФСП 42-Т)-0001-08, ФС 42-^-0002-08, 42-Т)-0003-08), утвержденных Министерством Здравоохранения Республики Таджикистан. Разработанные препараты тимогар и тимоцин

\>Лу' ) *!1 ' 1 ',1 .'V ' » -|Ч'! ,, I < I \ 7», -< У' I 1 , и

* I ' )\ \ ' { ' )

зарегистрированы в Республике Таджикистан (per. № 000084Т и 000085Т), препарат тимоцин также зарегистрирован в Туркмении (per. №006371) и Кыргызской Республике (КР № 7137). Препараты тимогар и тимоцин внедрены в медицинскую и ветеринарную практику. Получен 1 патент Республики Таджикистан (№ TJ 453, приоритет от 19.10.2006 г.).

Связь задач исследований с проблемным планом.

Диссертационная работа осуществлялась в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора по теме: «Разработка принципов и методов контроля различных групп биотехнологических препаратов» и планами исследований кафедры органической и биологической химии Таджикского государственного педагогического университета имени С. Айни Республики Таджикистан по теме: «Исследование низкомолекулярных иммуноактивных пептидов и их координационных соединений с биометаллами».

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на: международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» (Душанбе, 2003), третьей республиканской научной конференции биохимиков РТ «Вклад биохимиков в развитие биологической науки» (Душанбе, 2003), научно-практической конференции «Аналитик кимё ва экологиянинг долзарб муаммолари» (Самарканд, 2006), научной конференции «Проблемы клинической онкологии» (Душанбе, 2008), совместной республиканской научно-практической конференции «Перспективы развития фундаментальных медицинских наук в Таджикистане и 56-ой годичной конференции ТГМУ им. Абуали ибни Сино «Перспективы развития семейной медицины в Таджикистане» (Душанбе, 2008), международной конференции «Вакцинология-2008» (Москва, 2008), международной конференции «Состояние и перспективы

1 t ,<f'tm«Wbi|i 11 ',) I 'J/ Л'ч И Ч I <<V !| f ' jM и> '

I \ 1 v f I

развития биохимии в Таджикистане» (Душанбе, 2009), VI съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Душанбе, 2010), республиканской конференции «Проблемы современной координационной химии» (Душанбе, 2011), международной конференции «Синтез, выделение и изучение комплексных свойств биологически активных соединений» (Душанбе, 2011), международной научно-практической конференции «Ислохоти сохаи маориф ва шаклгирии муносибатхои бозаргони» (Душанбе, 2011), на совместном заседании секции №1 и секции №2 Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России.

Личный вклад автора. Автором осуществлен выбор научного направления, сформулированы цель и задачи исследования, обоснован выбор адекватных путей их решения. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах научно-практического исследования. Автором предложена схема синтеза изуч