Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуномодулирующие и антиоксидантные свойства биологически активных веществ из морских гидробионтов и их использование в гериатрической практике.

| На правах рукописи

0034613(4

Шутнкова Анна Леонидовна

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ И АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ МОРСКИХ ГИДРОБИОНТОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ГЕРИАТРИЧЕСКОЙ

ПРАКТИКЕ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток -2009

003461374

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Запорожец Татьяна Станиславовна Научный консультант:

доктор биологических наук Пивненко Татьяна Николаевна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Авдеева Жанна Ильдаровна доктор медицинских наук, профессор Селькова Евгения Петровна

Ведущее учреждение:

Государственное учреждение Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии северо-западного отделения Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится » ЩЭ&^Р&'/Л. 2009 г. в_часов на

заседании Диссертационного совета д Шшт при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, по адресу: 125212, г.Москва, ул. Адмирала Макарова, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, по адресу: 125212, г.Москва, ул. Адмирала Макарова, 10

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 208.046.02 кандидат медицинских наук

Л.И. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Старение населения - объективный общемировой процесс, обусловленный сложным комплексом факторов, включающих особенности воспроизводства населения, интенсивность и направленность миграции, санитарно-демографические последствия войн и др. Доля пожилых, старых и очень старых людей в общей популяции населения неуклонно увеличивается (Шабалин В.Н.,.2001). Темп прироста лиц пожилого возраста значительно опережает темп прироста всего населения. В России формирование существенной прослойки пожилых людей, прежде всего, связано со снижением рождаемости и сокращением доли детей в общей численности населения, а также с высокой смертностью людей трудоспособного возраста. Увеличению численности пожилых людей также способствуют внедрение достижений медико-биологических исследований, эффективное лечение он-,~ кологических заболеваний, более действенная, чем ранее профилактика инфаркта и инсульта. За период с 1959 г по 2000 г численность лиц старше 60 лет в России увеличилась более чем в два раза и составила в 2000 году 30,18 млн. человек (18,5%), из них лица старше 65 лет - 67,6%, старше 75 лет - 22,3%, старше 80 лет - 10,9%, старше 100 лет - 0,05% (Шабалин В.Н., 2001). По прогнозам Государственного комитета Российской Федерации по статистике, население страны к 2016 году сократится по сравнению с началом 2001 года на 10,4 млн. человек, а численность лиц пожилого возраста возрастет и почти в два раза превысит численность детей.

В то же время физиологическое старение, не сопровождаемое развитием каких-либо хронических заболеваний, определяется лишь у 3-6% людей пожилого и старческого возраста. Снижение резервных, адаптационных возможностей организма пожилых людей, обусловленные постепенно нарастающими сдвигами в структуре и функции клеток, органов и систем, создают условия для возникновения множества различных болезней.

Значительную роль в процессе старения играют иммунологические механизмы и свободнорадикальное окисление. Для пожилого и старческого возраста характерно снижение противомикробного иммунитета, противовирусной и противоопухолевой защиты (Mysliwska J., 2000; Solana R., 2000), Т-клеточного звена иммунитета (Кишов М.Г. с соавт., 1996; Ярилин, A.A., 2003; Effros R.B et al., 1994 , Haynes L. et al., 1999), гуморального иммунного ответа как на аутологич-ные, так и на экзогенные антигены (Макинодан Т., 1980), изменение рецепторного аппарата иммунокомпетентных клеток, и соотношения клеточных субпопуляций. (Хаитов P.M., 1995; Effios R.B et al., 1994; Herndon F.J., 1997; Chen J.J., 2000; Schindowski K., 2002). Одной из основных причин ослабления пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов является снижение секреции IL-2 (Rea I.M. et al, 1996; J. Mysliwska et al., 2000).

Накопление повреждений в клетках и скорость старения зависят также от соотношения процессов образования активных форм кислорода и их обезвреживания ферментативной системой антиоксидантной защиты (Гусев В.А., 2000). Повреждение макромолекул АФК приводит к мутациям, нестабильности генома в целом и развитию ряда возрастных патологий, таких как онкологические и сер-

дечно-сосудистые заболевания, возрастная иммунодепрессия, дисфункция мозга, развитие катаракты и многие др. (Пескин А.В, 1997; Гусев В.А., 2000; Ланкин В.З., 2001).

В этой' связи применение иммунокорректоров и антиоксидантов является одной из наиболее актуальных и в то же время наиболее дискутабельных проблем современной геронтологии. Использование таких препаратов может способствовать разрыву патологической цепи в структуре старение — болезнь, что, в свою очередь,, позволит уменьшить предпосылки к развитию патологии в старости и тем самым уменьшить вероятность развития заболеваний. Включение иммунокорректоров и антиоксидантов в базисную терапию при различных заболеваниях у лиц старших возрастных групп способствует расширению адаптационных возможностей организма и профилактике преждевременного старения, обусловленного влиянием болезней старости (Чеботарев Д.Ф., 2001).

В настоящее время наиболее предпочтительным представляется применение у лиц пожилого возраста препаратов, в том числе БАД, природного происхождения, оказывающих мягкое иммуномодулирующее и антиоксидантное действие и имеющих минимум побочных эффектов.

К числу таких препаратов относятся БАД «ДНКаС» и «Моллюскам», разработанные в ФГУП «ТИНРО-центр». Исследованию антиоксидантного и имму-номодулирующего действия этих БАД у пожилых людей и посвящена настоящая работа.

Цель работы:

Экспериментальное и клинико-иммунологическое обоснование применения БАВ из. морских гидробионтов н-ДНК и моллюскама для коррекции иммунных нарушений, свободнорадикальных процессов и профилактики заболеваний органов дыхания у людей пожилого возраста. Задачи исследования:

1. Исследовать антиоксидантные свойства н-ДНК и моллюскама и их воздействие на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови здоровых доноров в экспериментах in vitro.

2. Изучить морфофункциональную структуру эпителия слизистой оболочки трахеи крыс при прямом холодовом воздействии и на фоне введения н-ДНК и моллюскама.

3. Исследовать действие БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» на популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов (CD3+-, CD4+-, CD8+-, CD20+-, CD16+-лимфоциты) периферической крови пожилых людей.

4. Изучить влияние БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» на уровень иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA) в сыворотке крови, на фагоцитарную активность и кисло-родзависимую цитотоксичность нейтрофилов периферической крови у пожилых людей.

5. Исследовать влияние БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» на показатели перекис-ного окисления липидов и антиоксидантной защиты у пожилых людей.

Научная новизна.

Экспериментально доказано, что моллюскам обладает антиоксидантным действием, которое проявляется в прямых реакциях нейтрализации свободных ра-

дикалов и в опосредованных, реакциях накопления вторичных продуктов пере-кисного окисления липидов in vitro.

Экспериментально обоснована возможность применения БАД «Моллюскам» для профилактики и в комплексном лечении заболеваний органов дыхания. Доказано, что моллюскам защищает слизистую оболочку трахеи экспериментальных животных при общем охлаждении.

В результате комплексной оценки состояния факторов врож&енного и адаптивного иммунитета у пожилых людей показана эффективность применения БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» для коррекции иммунных нарушений. Установлена направленность действия БАД, зависящая от исходных значений показателей.

Установлено, что БАД «Моллюскам» оказывает антиоксидантное действие, снижая в эритроцитах уровень МДА и повышая АОА плазмы крови у пожилых людей, смещая баланс между процессами перекисного окисления липидов и механизмами антиоксвдантной защиты клетки в сторону последней.

Установлено, что БАД «ДНКаС» оказывает регулирующее действие на процессы липопероксидации у пожилых людей, восстанавливая баланс между процессами перекисного окисления липидов и механизмами антйоксидантной защиты клетки.

Практическая значимость.

Обоснована целесообразность применения биологически активных добавок к пище «ДНКаС» и «Моллюскам», обладающих иммуномодулирующим действием, для коррекции возрастных иммунных нарушений.

Установлена эффективность применения «Моллюскама» в качестве БАД, обладающей антиоксидантным действием. Рекомендовано ее применение при гиперактивации системы перекиснбго окисления липидов у пожилых людей.

Установлена эффективность «ДНКаС» в качестве БАД, оказывающей регулирующее действие на процессы липопероксидации. Рекомендовано ее применение для коррекции свободнорадикальных процессов у пожилых людей.

Внедрение результатов работы.

Подготовлены и утверждены Департаментом здравоохранения администрации Приморского края методические рекомендации «Использование биологически активных добавок к пище «ДНКаС» и «Моллюскам» для коррекции нарушений иммунной и антиоксидантной систем у пожилых людей» (г. Владивосток, 2007) (Авторы: Шутикова А.Л., Запорожец Т.С. и др.).

БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» используются в отделении Седанкинского дома-интерната для ветеранов для профилактики и коррекции расстройств иммунной и оксидантной систем (акт внедрения от 07.11.2008 г).

Полученные новые данные по применению в геронтологической практике биологически активных веществ из морских гидробионтов используются при обучении студентов медицинских ВУЗов и факультетов, а также на курсах ФПК (акт внедрения от 10.11.2008 г).

Отчеты об экспериментальном исследовании моллюскама и БАД на его основе были включены в пакет документов для регистрации в Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека,

по результатам экспертизы получено свидетельство № 77.99.11.3.У.4071.10.04 от 08.10.04г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Моллюскам обладает прямым антиоксидантным действием.

2. Моллюскам защищает слизистую оболочку трахеи экспериментальных животных при общем охлаждении.

3. БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» оказывают модулирующее действие на факторы врожденного и адаптивного иммунитета у пожилых людей, зависящее от исходного уровня показателей.

4. БАД «Моллюскам» оказывает антиоксидантное действие на систему ПОЛ-АОЗ у пожилых людей, смещая баланс между процессами перекисного окисления липидов и механизмами антиоксидантной защиты клетки в сторону последней. БАД «ДНКаС» оказывает регулирующее действие на процессы ли-попероксидации.

Апробация результатов диссертационной работы: Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ГУ НИИЭМ СО РАМН (протокол №5 от16.05.2007г.).

Материалы диссертации представлены на II Дальневосточном региональном конгрессе «Человек и лекарство» с международным участием (Владивосток, 2005), Итоговой научно-практической конференции с международным участием: «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2005), I Международной научно-технической конференции молодых ученых: «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2005), II региональной научной конференции «Исследования в области физико-химичеокой биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2006), V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007), V Европейском конгрессе по астме (Москва, 2007). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «материалы и методы исследования», 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 294 источника, из них 91 отечественный и 203 иностранных. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования

Экспериментальные и клинические исследования проведены в лаборатории иммунологии ГУ НИИЭМ СО РАМН, а также совместно с сотрудниками Седан-кинского дома-интерната для ветеранов (г. Владивосток). Отдельные разделы работы выполнены совместно с лабораторией прикладной биохимии ФГУП «ТИНРО-центр» и кафедрой гистологии, цитологии и клеточной биологии ГУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия Росздрава». Все экспе-

риментальные и клинические исследования проведены с разрешения Комитета по биомедицинской этике ГУ НИИЭМ СО РАМН (протокол № 3/2 от 14.07.2004 г.).

1 .Исследуемые препараты

Ннзкомолекулирная ДНК (н-ДНК) - выделена из молок лососевых рыб в ФГУП «ТИНРО-центр» (патент РФ № 2122856 от 10.12.98). Химический состав: массовая доля ДНК - 79,02%, содержание белка - 7,8%, липидов - 2,1%, воды -10,68%, нуклеиновых кислот - 70-80%, м.м. 270-500 кДа. Метод выделения - солевая экстракция с последующим осаждением конечного.вещества из раствора этиловым спиртом и удалением жира и влаги сушкой на воздухе при комнатной температуре.

На основе н-ДНК разработана БАД «ДНКаС» (н-ДНК+ витамин С) (регистрационное удостоверение МЗ РФ №004978.Р.643.10.2002 от 30.10.2002, свидетельство Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 77.99.23.3.У.8747.10.08 от 13.10.2008).

Моллюскам - комплекс свободных аминокислот, низкомолекулярных белков и пептидов, выделенный в ФГУП «ТИНРО-центр» методом ферментативного гидролиза из двустворчатых и головоногих моллюсков (патент РФ № 2171066 от 22.03.2000). Химический состав: свободные аминокислоты (таурин, аспарагино-вая кислота, треонин, глутаминовая кислота, пролин, глицин, аланин, цистеин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, р-аланин, орнитин, лизин, гистидин, аргинин) - 56-71%, липиды - менее 1%, белки - 19-25%, углеводы - менее 1%, минеральные вещества - 7,9-8,5 %, гистидинсодержащие дипеп-тиды-2-14,3 %.

На основе моллюскама разработана БАД «Моллюскам», зарегистрирована в Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (свидетельство № 77.99.11.3.У.4071.10.04 от 08.10.2004).

2. Лабораторные животные

Экспериментальные исследования выполнены на 80 крысах массой 200 г., находившихся на стандартной диете в боксированных помещениях с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах (1986). Разброс животных в группе по массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные группы составили животные одного пола (самцы) и возраста (6 месяцев).

3. Клинический материал

В соответствии с протоколом исследования (протокол № 3/2 от 14.07.2004 г.) клинические и лабораторные данные были проанализированы у 57 пожилых людей Седанкинского дома-интерната для ветеранов - 42 женщины и 15 мужчин в возрасте от 67 до 93 лет.

Исследование было рандомизированным, обеспечивающим случайное распределение пожилых людей в 2 группы (для оценки эффективности применения БАД «ДНКаС» и «Моллюскам»).

/ группа - 30 пожилых людей (20 женщин и 10 мужчин в возрасте от 67 до 87 лет, их средний возраст составил 77±10 лет), которые получали БАД «ДНКаС» по 2 таблетки, содержащие по 50 мг ДНК, 1 раз в день в течение 30 дней.

2 группа - 27 пожилых людей (22 женщины и 5 мужчин в возрасте от 69 до 93 лет, их средний возраст составил 81 ±12 лет), которые получали БАД «Моллюскам» по 1 капсуле, содержащей 250 мг моллюскама, 1 раз в день в течение 15 дней.

Для исследования иммунного статуса и показателей системы ПОЛ-АОЗ использовали венозную кровь. Забор крови проводили в равных условиях (утром, натощак, в количестве 12-15 мл).

Исследование иммунного статуса и показателей системы ПОЛ-АОЗ проводили дважды - до и после окончания приема БАД.

4. Микроорганизмы

Staphylococcus aureus (штамм 209) (музей культур микроорганизмов ГУ НИИЭМ СО РАМН) выращивали при температуре 37°С в течение 18-24 часов на мясопептонном агаре (ph 7,2), после чего культуру микроорганизмов смывали 0,85% раствором NaCl и готовили взвесь микробов нужной концентрации по оптическому стандарту мутности.

Все направления, методы и объем проведенных исследований представлены в табл. 1.

Таблица 1

Направления, методы и объем исследований_

№ Направления исследования Методы исследования Объем исследования

1 Исследование влияния БАВ н-ДНК и моллюскам на функциональную активность нейтрофилов 1.Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов крови здоровых доноров in vitro (Лебедев КА., 1990) 80 проб

2 Оценка антиокси- . дантной активности БАВ н-ДНК и моллюскам. Определение антиоксндантной активности моллюскама и н-ДНК 1.Прямые методы: - Образование хлораминовых комплексов при взаимодействии антиоксиданта с гипохлорит-анионом (Фор-мазюк В.Е. с соавт., 2003) - Ингибирование скорости образования свободных радикалов антиоксидантами методом обесцвечивания ABTS (2,2 азинобис-З-этил-бензотиадолин-6-сульфоновой кислоты) (Re R. et al„ 1999) 2. Непрямые методы: - Определение накопления МДА in vitro (Чумак А.Д., 1992) 3 пробы 3 пробы 40 проб

3 Исследование влияния БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» на гуморальный и клеточный иммунитет пожилых людей ¡.Определение популяционного и субпопуляционного состава ' лимфоцитов периферической крови (CD3+, CD4+, CD8+, CD20\ С016+-лимфоциты) методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием мо-ноклональных ФИТЦ-меченных антител (Лебедев К.А., 1990) 2.0пределение основных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови (IgG, IgA, IgM) методом радиальной иммунодиффузии по Манчини (Manchini G. et al., 1964) 3.Исследование фагоцитарной активности нейтрофи-лов крови в латекс-тесте (Лебедев К.А., 1990) 4. Определение восстановления нитросинего тетразолия фагоцитирующими клетками периферической крови спектрофотометрическим методом (Хаитов P.M. с со-авт., 2003) 114 проб 114 проб 114 проб 114 проб

4 Исследование влияния БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» на параметры системы ПОЛ-АОЗу пожилых людей 1.Определение малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах крови спектрофотометрическим методом (Нов-городцева Т.П. с соавт., 2003) 2.0пределение общей антиокислительной активности плазмы крови спектрофотометрическим методом (Нов-городцева Т.П. с соавт., 2003) 114 проб 114 проб

5 Исследование влияние моллюскама и н-ДНК на мукоциллиарную систему воздухоносного отдела легких, показатели перекисного окисления тшидов и антиоксидантной системы при общем охлаждении 1.Исследование морфологических изменений слизистой оболочки трахеи под действием БАВ; - Трансмиссионная электронная микроскопия (Уикли Б., 1975) - Сканирующая электронная микроскопия (Ровенский Ю.А., 19,69). 2. Определение содержания МДА в плазме крови крыс (Бородин Е.А. с соавт., 1987) 3. Определение содержания витамина Е в липодных экстрактах из крови (Кисилевич Р.Ш. с соавт., 1972) 80 неин- бредных крыс

Статистический анализ Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы «Биостат» и «Excel». Использовались следующие методы статистического анализа: проверка нормальности распределения количественных признаков при малом числе наблюдений, t-критерий Стьюдента (для независимых выборок и для двух связанных между собой вариационных рядов), W-критерий Уилкок-сона. Выборочные параметры, приводимые далее в таблицах, имеют следующие обозначения: средняя арифметическая (М), средняя ошибка средней арифметической (т), объем анализируемой группы (п). Уровень доверительной вероятности был задан равным 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Исследование антиоксидантной активности моллюскама и н-ДНК с использованием прямых и непрямых методов в экспериментах in vitro

В результате проведенных исследований было установлено, что моллюскам

обладает прямым антиоксидантным действием в реакциях нейтрализации активных форм кислорода и свободных радикалов.

1.1. Регистрация хлораминового комплекса, появляющегося при добавлении момюскама к раствору гипохлорита натрия (N0010)

Моллюскам в концентрации 0,2 мг/мл связывал гипохлорит натрия в концентрации 5 мМ в течение 15 мин, образуя стабильное соединение (т.н. хлорами-новый комплекс). При этом оптическая плотность, регистрируемая при X = 265270 нм, характерная для гипохлорита натрия изменялась: регистрировался пик с максимумом поглощения при Х=255нм, свидетельствующий об образовании хлораминового комплекса (рис. 1). Образование хлораминового комплекса свидетельствует об инактивации гипохлорит аниона в реакционной смеси, демонстрируя способность моллюскама связывать активные формы кислорода.

Спектры поглощения образцов

г о,7

| 0,6 ■ .-----ч

1 а 0,в ■ i|o,*.

if0-3 Р 0 0,2 | 0,1

240 24$ 250 255 260 26! 270 275 290 285 290

длина волны

-- Моллюскам-Гипохлорит - - - гипохлорит + моллюскам

Рис.1. Спектры поглощения гипохлорита натрия и комплекса гипохлорит-моллюскам.

Для н-ДНК таких исследований не проводили, т.к образование хлорамино-вых комплексов характерно только для некоторых аминокислот и пептидов.

1.2. Ингибирование образования свободных радикалов моллюскамом и н-ДИК методом обесцвечивания ABTS (2,2 азинобис-З-этал-бензотиадолин-б-сульфоновой кислоты)

Моллюскам ингибировал свободнорадикальный катион ABTS*+, изменяя величину оптической плотности реакционной смеси. Величину антиоксидантной активности выражали в виде тролоксового эквивалента антиоксидантной емкости ТЕАС (trolox equivalent antioxidant capacity) (тролокс - синтетический аналог природного антиоксиданта токоферола). При этом моллюскам в количестве 1000 мг обеспечивал' антиоксидантную активность, эквивалентную 45 мг тролокса. Величины ТЕАС для различных готовых форм БАД «Моллюскам» (таблетки, капсулы) коррелировали с содержанием вещества моллюскам в этих формах (табл.2). В таблетированной форме БАД «Моллюскам» в антиоксидантную активность также вносит свой вклад аскорбиновая кислота.

Н-ДНК прямым антиоксидантным действием, обеспечивающим инактивацию радикала ABTS*+, практически не обладала. Проявление слабой антиокси-

дантной активности в случае БАД «ДНКаС», наиболее вероятно, является результатом действия, входящей в ее состав аскорбиновой кислоты (табл.2).

■ • Таблица 2 -_Антиоксидантная активность моллюскама и н-ДНК_

Готовая форма Состав ТЕАС (мг/г сухого вещества)

БАВ Моллюскам 100 % моллюскам 45,0 ± 2,7

БАД «Моллюскам» (таблетки) МКЦ - 35,5%; аскорбиновая кислота-12%; моллюскам - 25 % 14,0 ±1,6

БАД «Моллюскам» (капсулы) МКЦ - 28 %; моллюскам - 64 % 29,0 ±1,9

БАВ н-ДНК 100% нуклеопротеидный комплекс 1,2 ±0,6

БАД «ДНКаС» (таблетки) МКЦ - 35,5 %; глюкоза - 25 % аскорбиновая кислота - 12,5%; ДНК -25% 6,4 ±0,9

Умеренное антиоксидантное действие моллюскама позволяет использовать его в достаточно больших дозировках, необходимых для обеспечения включения в метаболизм различных тканей и органов. Умеренность антиоксидантного действия предпочтительна с точки зрения предотвращения дальнейшего окисления биологических субстратов, имеющего место при использовании мощных антиок-сидантов, которые в высоких концентрациях становятся прооксидантами.

1.3 Определение накопления малонового диальдегида (вторичный продукт перекисного окисления липидов) в модельной системе in vitro

Этот метод позволяет оценить антиоксидантные свойства веществ в условиях, наиболее приближенных к живому организму.

В результате проведенных исследований установлено статистически значимое Снижение уровня МДА в сыворотке крови после добавления моллюскама, БАД «Моллюскам». Низкомолекулярная ДНК влияния на уровень МДА в системе in vitro не оказывала (габл.З).

Таблица 3

Антиоксидантный эффект моллюскама и н-ДНК_

Реакционная среда прирост МДА мг/мл сыворотки крови

Контроль (сыворотка крови + катализатор окисления) 0,070±0,0030

Сыворотка крови + катализатор окисления + БАВ моллюскам 0,021±0,0022 р=0,000

Сыворотка крови + катализатор окисления + БАД «Моллюскам» (таблетки) 0,032±0,0024 />=0,000

Сыворотка крови + катализатор окисления + БАВ н-ДНК 0,068±0,0015 ¿>=0,558

Примечание: р - значимость различий при сравнении с контролем; использован параметрический /-критерий Стьюдента для двух попарно несвязанных между собой вариационных рядов.

Таким образом, защитный эффект моллюскама проявляется в том, что он препятствует накоплению в сыворотке крови МДА - вторичного продукта перекисного окисления липидов.

II. Действие биологически активных веществ н-ДНК и моллюскама на функциональную активность нейтрофилов

Фагоцитарную активность нейтрофилов исследовали в модельной системе in vitro, позволяющей оценить прямое действие веществ на фагоцитирующие клетки (нейтрофилы крови здоровых доноров инкубировали с исследуемыми БАВ в течение 60 минут при 37°С в конечной концентрации - 1 мкг/мл, 10 мкг/мл, 100 j мкг/мл с последующим внесением в клеточную суспензию S. aureus и дальнейшей инкубацией в течении 30 и 120 минут).

Инкубирование нейтрофилов крови здоровых доноров с н-ДНК и моллю-скамом в течение 30 минут приводило к увеличению количества клеток, участвующих в фагоцитозе-, и усилению их способности поглощать S. aureus по сравнению с контролем (нейтрофилы крови здоровых доноров, инкубированные с S. aureus).

Через 120 минут в контроле изменения фагоцитарной активности нейтрофилов не обнаружено (по сравнению с показателями, зарегистрированными через 30 минут инкубации). Динамика изменений показателей фагоцитарной активности нейтрофилов, инкубированных с исследуемыми БАВ представлена на рис. 2,3.

%

100 98 96 94 92 90 88 86 84 82 80 78

"К

14 12 10 8 6 4 2 0

30' 120' контроль

30' 120' 1 мкг/мл

30' 120' 10 мкг/мл

30' 120' 100 мкг/мл

усл.ед.

ФП ФЧ

Рис.2. Влияние БАВ н-ДНК на функциональную активность нейтрофилов крови здоровых доноров.

I юо ......

96 94

92 90 88 86 84 82 80 78 76 74 72 70

гъ*

□

14

12 10 8 6 4 2 0

30' 120' контроль

30'

120' 1 мкг/мл

30' 120' 10 мкг/мл

30' 120' 100 мкг/мл

усл.ед.

:фп -фч

Рис.3. Влияние БАВ моллюскам на функциональную активность нейтрофилов крови здоровых доноров.

Инкубирование нейтрофилов с н-ДНК в концентрации 1 мкг/мл способствует усилению поглощения микроорганизмов (ФЧ30 10,75±0,63 и ФЧцо 11,77±0,66; />=0,004); при инкубировании нейтрофилов с н-ДНК в. концентрации 10 мкг/мл и 100 мкг/мл значения ФЧ снижаются, что может расцениваться как усиление процессов переваривания микроорганизмов (ФЧ30 1 1,43±1,22 и ФЧ^о 9,36±1,29; />=0,001 и ФЧ30 10,84±0,42 и ФЧ120 8,04±0,58;/>=0,027 соответственно); при инкубации нейтрофилов с моллюскамом в концентрации 1 мкг/мл и 10 мкг/мл наблюдалась аналогичная динамика изменений показателей фагоцитоза (ФЧ30 12,19±0,68 и ФЧ,20 10,08±0,41; />=0,020 и ФЧ30 Ю,69±0,10 и ФЧ,20 7,13±0,10; />=0,003 соответственно).

Таким образом, н-ДНК в конечной концентрации 1 мкг/мл, 10мкг/мл, 100мкг/мл и моллюскам в конечной концентрации 1 мкг/мл, 10мкг/мл увеличивают количество клеток, участвующих в фагоцитозе, и усиливают их способность поглощать и переваривать S. aureus.

III. Влияние моллюскама и н-ДНК на мукоциллиарную систему воздухоносного отдела легких, показатели перекисного окисления липидов и ан-тиоксидантной системы при общем охлаждении

Выполнение данного фрагмента работы обосновано тем, что в структуре заболеваемости людей пожилого возраста значительный удельный вес занимают хронические неспецифические заболевания легких и пневмонии (Коркушко О.В., 1993; Чеботарев Д.Ф., 1997; Фещенко Ю.И., 2002)! Заболевания бронхов и легких у пожилых людей характеризуются склонностью к раннему возникновению функциональной недостаточности дыхательной системы в результате истощения физиологических механизмов защиты, что определяет необходимость особых подходов к профилактике и лечению заболеваний органов дыхания у пожилых людей

Экспериментальная часть работы по исследованию изменений, возникающих в эпителии слизистой оболочки трахеи и в системе ПОЛ-АОЗ при длительном холодовом воздействии, выполнена на крысах (самцах) массой 200 г., которых разделили на группы:

• контрольная группа (К) - интактные животные, которые содержались в стандартных условиях вивария при температуре +18- +20°С.

• контрольная группа холод (X) - животные, подвергнутые холодовому бездействию, охлаждались в течение 28 дней по 3 часа ежедневно при температуре -15 °С.

• опытные группы (ХМ) и (ХД) - животные, которые ежедневно в течение 14 дней получали перорально моллюскам (ХМ) и н-ДНК (ХД) в дозе 10 мг/кг, после чего охлаждались в течение 28 дней по 3 часа ежедневно при температуре -15 °С на фоне введения Б AB (за 30 минут до охлаждения).

В эксперименте изучали морфологическую структуру эпителия слизистой оболочки трахеи крыс. При действии холода слизистая оболочка трахеи подвергалась значительной перестройке: снижался регенерационный потенциал эпителия за счет уменьшения промежуточных и базальных клеток, увеличивалось содержание бокаловидных и мигрирующих тучных клеток, приводящее к гиперсекре-

ции слизи (табл.4), нарушалось регулярное расположение ресничек. Вследствие этих процессов нарушался мукоциллиарный транспорт (рис.4 Б, В).

Пероральное введение крысам моллюскама оказывало выраженное защитное действие на эпителий слизистой оболочки трахеи экспериментальных животных, предупреждая изменения, характерные для холодового воздействия (нарушение регулярности расположения ресничек, исчезновение поперечных волн движения ресничек, гиперсекрецию слизи). Реснитчатый покров сохранял характерный волнообразный рельеф (рис.4 Г).

В Г

Рис.4. Поверхность слизистой оболочки трахеи крыс (сканирующая электронная микроскопия)

А - интактные крысы (увеличение х 2000). На боковой поверхности трахеи обнаруживаются островки, состоящие из 5 - 15 бокаловидных клеток

Б, В - крысы, подвергнутые охлаждению (увеличение х 3500). Нарушение мукоцил-лиарного транспорта в результате скопление слизи на поверхности ресничек (В) и их «склеивания» (Б).

Г - крысы, подвергнутые охлаждению на фоне введения моллюскама (увеличение х 5000) Сохраняется нормальный рельеф реснитчатого покрова слизистой оболочки. Между ресничками выделяются апикальные полюса бокаловидных клеток с большим количеством микроворсинок.

Слизистая оболочка животных, получавших моллюскам, как по морфологическому строению, так и по клеточному составу фактически не отличалась от таковой интактных крыс (табл.4.).

Таблица 4

Сравнительная характеристика морфометрических показателей слизистой оболочки трахеи экспериментальных животных_

Структура слизистой оболочки трахеи Единицы измерений Вид эксперимента

К п=20 М±ш X п=20 М±т ХМ п=20 М±т

Клетки покровного эпителия % % % %

1. реснитчатые % 52,3±4,3 52,59±4,4 _р=0,963 52,4±4,3 р=0,636

2. бокаловидные % 11,53±1,1 14,66±1,3 /з=0,074 10,78±1,2 р=0,648

3. промежуточные % 10,57±0,9 4,41±0,4 2 р=0,000 П,1±0,92 /3=0,683

4. базальные % 21,3±1,8 15,52±1,3 /з=0,013 ' 21',8±1,9 /3=0,850

5. щетинчатые % 2,0±0,6 2,0±0,7 р=1,000 2,0±0,6 /з=0,907

6. мигрирующие % ' • -2,3±0,8 10,34±0,9 /з=0,000 2,6±0,7 /з=0,779

7. ширина базальной пластины мкм 3,2±0,2 4,0±0,3 /7=0,033 3,4±0,2 /з=0,484

8.высота эпителиального пласта мкм 18,3±1,0 20,1±1,6 р=0,346 18,7±1,1 /з=0,789

Примечание: К- контрольная группа; X - животные, подвергнутые охлаждению; ХМ - животные, подвергнутые охлаждению на фоне введения моллюскама; р - значимость различий при сравнении с контролем (К), использован параметрический /-критерий Стьюдента для двух попарно не связанных между собой вариационных рядов.

Низкомолекулярная ДНК оказывала слабое защитное действие на эпителий слизистой оболочки трахеи экспериментальных животных, уменьшая лишь выраженность изменений, характерных для холодового воздействия.

У этих же животных были исследованы показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в плазме крови при действии холода. Установлено, что длительное охлаждение животных сопровождается повышением содержания вторичного продукта перекисного окисления липидов - малонового ди-альдегида в плазме крови и снижением уровня витамина Е, являющегося природным антиоксидантом, по сравнению с интактными животными. Введение крысам, подвергнутым охлаждению, моллюскама и н-ДНК в дозе 10 мг/кг предупреждало увеличение уровня МДА, и снижение уровня витамина Е (табл. 5).

Таким образом, предварительное (перед Холодовым воздействием) и последующее введение крысам моллюскама и н-ДНК предупреждает как изменения слизистой оболочки трахеи, характерные для холодового воздействия, так и усиление процесса липопероксидации, снижая расход природных антиоксидантов, в частности, витамина Е.

Таблица 5

Показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в плазме

крови крыс

Группы жи- Количество жи- Малоновый диальдегид Витамин Е (мкг/мл)

вотных вотных в группе (нмоль/л)

(П)

к 20 4,9 ± 0,37 43,38 ±4,30

X 20 6,06 ±0,34 32,48 ±2,29

р=0,029 р=0,031

ХД • 20 5,08 ±0,28 39,07 ±1,16

/?=0,691 р=0,340

хм 20 4,97 ±0,24 39,77 ±2,15

р= 0,863 /7=0,458

Примечание: К- контрольная группа; X - животные, подвергнутые охлаждению; ХМ - животные, подвергнутые охлаждению на фоне введения моллюскама; ХД - животные, подвергнутые охлаждению на фоне введения н-ДНК; р - значимость различий при сравнении с контролем; использован параметрический /-критерий Стьюдента для двух попарно не связанных между собой вариационных рядов.

Моллюскам целесообразно использовать как средство защиты органов дыхания от повреждающего действия холода и с целью профилактики заболеваний органов дыхания, особенно в холодное время года.

1У.Влияние БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» на факторы врожденного и адаптивного иммунитета у пожилых людей

У обследованных пожилых людей до приема БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» установлено снижение относительного содержания СОЗ+, С04+, СБ8+-лимфоцитов, показателей спонтанного НСТ-теста, повышение уровня ^А в сыворотке крови и относительного содержания СВ20+- лимфоцитов по сравнению с возрастными нормами. После приема БАД «Моллюскам» и «ДНКаС» в этих группах выявлено увеличение относительного содержания СЭЗ+-, С04+-у С08+-лимфоцитов (табл. 6). При анализе изменений показателей иммунного статуса после приема БАД «ДНКаС» и БАД «Моллюскам с учетом исходного уровня показателей были выделены три подгруппы пожилых людей:

1. с высокими показателями иммунного статуса (значения показателей, находящиеся в пределах верхней границы нормы и/или выше границ нормальных значений);

2. со средне-нормальными значениями (показатели, находящиеся на уровне средних значений физиологической возрастной нормы);

3. со сниженными показателями иммунного статуса (значения показателей, находящиеся в пределах нижней границы нормы и/или ниже границ средне-нормальных значений физиологической возрастной нормы).

После приема БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» были выявлены следующие закономерности: в группе пожилых людей с высокими показателями клеточного иммунитета наблюдалась нормализация до средне-нормальных значений; у пожилых людей со средними значениями показатели не изменялись; при сниженных значениях показателей отмечалось их повышение до уровня средне-нормальных значений.

Относительное содержание СОЗ+-лимфоцитов в группе пожилых людей с высокими показателями после приема БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» незначительно снижалось (с 67,1±0,9% до 62,7±1,6%; /5=0,039 и с 66,8±0,7 % до 62,1±1,6 %; />=0,066 соответственно), оставаясь в границах физиологической возрастной нормы. В том случае, когда показатели были снижены, относительное содержание СОЗ+-лимфоцитов повышалось (с 47,7±1,1% до 61,6±1,3%; />=0,0001 и с 46,4±1,2 % до 60±1,3 %; />=0,0001 соответственно).

Относительное содержание С04+-лимфоцитов практически у всех пожилых находилось на уровне нижней границы физиологической нормы, либо было ниже ее. После приема БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» содержание CD4+-лимфоцитов увеличивалось (с 28,9±0,72% до 34,1±0,58%; р=0,0001 и с 28,1±0,9% до 34,8±0,9%; />=0,0001 соответственно).

Относительное содержание субпопуляции CD8+ цитотоксических лимфоцитов/ супрессоров после приема БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» у пожилых людей в группе со средне-нормальными значениями показателей незначительно снижалось или не изменялось. В том случае, когда показатели были снижены, относительное содержание этих клеток увеличивалось (с 19,5±0,84% до 27,6±0,61%; р=0,0001 и с 18,9±0,9% до 23,8±0,8%; />=0,0001 соответственно).

Для пожилого возраста характерно снижение не только противомикробного иммунитета, но и противовирусной и противоопухолевой защиты, в которой принимают участие натуральные киллеры (NK-клетки). В наших исследованиях после приема БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» у лиц с низкими показателями содержание С016+-лимфоцитов увеличивалось (с 8,4±0,35% до 13,9±2,4%; />=0,05 и с 8,4±0,7% до 14,6±3,1%;/>=0,065 соответственно). У пожилых людей с высокими показателями СБ16+-лимфоцитов после приема БАД «Моллюскам» наблюдалась нормализация данного показателя до уровня средне-нормальных значений (с 22,9±1,6% до 11,5±1,7% />=0,0001). В группе обследуемых со средними показателями значимых изменений не выявлено.

Абсолютное количество В-клеток у пожилых людей, по данным литературы, не изменяется, однако относительное содержание может возрастать с возрастом, как следствие усиления поликлональной активации, связанной со снижением содержания Т-лимфоцитов, а также супрессорной функции CD8+- лимфоцитов (Макинодан Т., 1980; Хаитов P.M. с соавт., 1995). В результате проведенных исследований мы также установили, что у большинства пожилых относительное содержание этих клеток находилось на уровне верхней границы физиологической нормы, либо было выше ее. После приема БАД «Моллюскам» у людей с высокими показателями относительного содержания В-лимфоцитов выявлена тенденция к его снижению (с 25,2±1,5 % до 21,4±1,6 %; р=0,055). На фоне приема БАД «ДНКаС» у всех обследуемых пожилых людей независимо от исходного уровня показателя относительное содержание В-лимфоцитов увеличивалось (с 21,1±2,3% до 31,2±2,0%; />=0,001). При этом, чем ниже был исходный уровень В-лимфоцитов, тем более выраженной была стимуляция.

С возрастом часто наблюдается развитие дисбаланса основных классов иммуноглобулинов: в периферической крови уменьшается концентрация IgM,

Таблица 6

Показатели иммунного статуса у пожилых людей до и после приема БАД «ДНКаС» и «Моллюскам»

Показатели Единицы измерения Возрастные значения нормы М±ш До приема БАД «ДНКаС» После приема БАД «ДНКаС» До приема БАД «Моллюскам» После приема БАД «Моллюскам»

М±ш, п=30 М±т, п=30 М±ш, п=27 М±т, п=27

Лейкоциты 10% 6,5±0,45 7,6±0,38 6,6±0,38 /7=0,151 6,65±0,35 6,91±0,42 р=0,560

Лимфоциты % 28,0±1,64 39,7±2,1 43,1±1,9 />=0,087 49,1±1,88 45,9±2,4 /7=0,034

Лимфоциты 10% 2,1±0,16 3,04±0,26 2,90±0,23 р=0,692 3,27±0,21 3,05±0,19 р=0,328

СОЗ+-лимфоциты % 62,0± 1,99 53,7±1,5 62,1 ±1,03 р=0,0001 50,9±1,7 61,1±1,1 />=0,0001

СОЗ+-лимфоциты 107л 1,2±0,13 1,65±0,16 1,79±0,14 /7=0,408 1,67±0,13 1,85±0,12 /7=0,173

С04+-лимфоциты % 37,0±1,44 30,1 ±0,8 34,5±0,6 /7=0,0001 30,8±1,2 35,9±0,8 р=0,0001

С04+-лимфоштты 10% 0,7±0,07 0,93±0,09 0,99±0,082 /7=0,444 1,00±0,07 1,08±0,06 р=0,304

СВ8+-лимфоциты % 30,0±1,66 23,7±1,18 27,3±0,68 /7=0,027 20,2± 1,04 24,6±0,9 р=0,0001

С08+-лимфоциты 10% 0,6±0,09 0,72±0,07 0,79±0,066 р=0,331 0,67±0,06 0,75±0,059 /7=0,165

С020+- лимфоциты % 10,0±0,9 21,1±2,3 31,2±2,0 /7=0,001 24,3±1,52 21,0±1,5 р=0,148

С020+-лимфоциты 10% 0,46±0,08 0,631±0,08 0,917±0,11 р=0,055 0,78±0,05 0,65±0,07 р=0,099

СО 16+-лимфоцты % 15,0±0,9 15,1±1,3 16,1±1,6 р=0,647 15,0±1,5 12,8±1,6 р=0,223

СО 1 б*-лимфоциты 10ч/л 0,47±0,07 0,49±0,09 0,48±0,074 р=0,922 0,46±0,05 0,36±0,04 /з=0,173

ИРИ (С047 С08+) 1,25±0,03 1,36±0,08 1,28±0,03 />=0,352 1,59±0,07 1,51 ±0,06 р=0,759

ДО т/л 12,21±0,54 12,36±0,45 9,88±0,5 р=0,001 10,9±0,27 9,8±0,29 /7=0,0001

1ёМ г/л 1,09±0,12 1,23±0,12 1,07±0,08 р=0,135 1,22±0,09 1,27±0,1 р=0,607

г/л 1,27±0,19 2,37±0,16 2,1 Ш,14 р=0,132 2,9±0,18 2,75±0,18 р=0,045

ФП % 60,0±3,65 75,4±2,9 74,2±2,7 р=0,776 69,8±2,2 70,3±1,7 р=0,853

ФЧ усл.ед. ' 5,1±0,18 4,44±0,4 3,61±0,2 р=0,068 3,07±0,14 2,9±0,13 р=0,392

спонтанный НСТ-тест (Ю х 10'3 89,77±9,3 37,5±4,51 22,1±4,35 *р =0,013 42,3±7,86 34,9±6,03 *р=0,449

индуцированный НСТ-тест ООхН)-' 141,1±12,26 108,2±14,2 188,6±10,5 *р=0,000 177,7±40,2 . 154,6±22,6 *р=0,493

Примечание: *р - значимость различий при сравнении с показателями, полученными до приема БАД (использован параметрический ¿-критерий Стьюдента для двух попарно связанных между собой вариационных рядов); р — значимость различий при сравнении с показателями, полученными до приема БАД (использован непараметрический ^-критерий Уилкок-сона).

уровень IgA и IgG увеличивается (Кишов М.Г.с соавт.,1996). Такое соотношение иммуноглобулинов, отражающее доминирование Th2 - иммунного ответа у людей пожилого возраста, приводит к снижению противомикробной защиты и повышению восприимчивости к инфекциям (Петров Р.В., 1984; Сепиашвили Р.И., 2003). В наших исследованиях у большинства пожилых людей выявлена подобная закономерность, а также установлено модулирующее действие БАД «ДНКаС» и «Моллюскам», зависящее от исходного уровня иммуногобулинов.

При оценке фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови было установлено, что у пожилых людей со сниженными значениями показателей фагоцитарной активности после приема БАД «ДНКаС» наблюдалось увеличение ФП (с 63±1,9% до 79±4,7%; р=0,022), поглотительная способность нейтрофилов при этом не изменялась. После приема БАД «Моллюскам» увеличивался как ФП (с 53,6±2,4% до 67,2±3,6%;р=0,031), так и ФЧ (с 2,42±0,23 до 2,7б±0,17; р=0,01). У обследованных лиц с высокими значениями фагоцитоза (что может быть отражением максимального уровня напряжения резервных способностей) показатели не изменялись.

Основой кислородзависимого механизма цитотоксичности нейтрофилов, ответственного за разрушение бактерий, является способность к продукции активных форм кислорода (т.н. респираторный взрыв) (Фрейдлин И.С., 1998). Сравнительное изучение спонтанного и индуцированного НСТ-теста позволяет судить о функциональной активности и потенциальных ресурсах бактерицидной системы нейтрофилов.

В результате проведенных исследований было установлено, что показатели спонтанного и индуцированного НСТ-теста у пожилых людей были значительно снижены. После приема БАД «ДНКаС» показатели спонтанного НСТ-теста снижались (с 37,5±4,51 до 22,1±4,35; р=0,013), а индуцированного НСТ-теста - повышались (с 108,2±14,2 до 188,6±10,5; />=0,0001), что свидетельствует об увеличении резервного потенциала нейтрофилов (табл. 6).

Полученные результаты позволяют предположить, что даже сниженные (по отношению к лицам среднего возраста) показатели спонтанного НСТ-теста у пожилых людей могут свидетельствовать о напряжении бактерицидной системы, что в свою очередь может быть связано с наличием в органах и тканях у лиц данной возрастной группы персистирующих бактерий и вирусов. Прием БАД «ДНКаС» приводит систему генерации АФК нейтрофилов в спокойное состояние, что соответственно влечет за собой увеличение резервных возможностей фагоцита. После приема БАД «Моллюскам» значимых изменений со стороны бактерицидной системы нейтрофилов выявлено не было.

Анализируя полученные данные после применения БАД «Моллюскам» и «ДНКаС», мы установили, что влияние данных БАД на организм пожилого человека неоднозначно, и зависит от исходного уровня показателей иммунной системы: повышает - если показатели были снижены, снижает — если показатели были высокими и не изменяет - если они были в пределах средне-нормальных значений.

Таким образом, БАД «ДНКаС» оказывает модулирующее действие на клеточный и гуморальный иммунитет у пожилых людей, оказывает умеренное стимулирующее влияние на B-лимфоциты и увеличивает функционально-метаболические резервы нейтрофилов. БАД «Моллюскам» оказывает модули-

рующее влияние на показатели клеточного и гуморального иммунитета, зависящее от исходных значений и не влияет на активность кислородзависимого метаболизма нейтрофилов.

V. Влияние БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» на показатели системы перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты (ПОЛ-АОЗ) у пожилых людей

Исследование системы перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты (ПОЛ-АОЗ) у пожилых людей показало, что у четверти обследуемых показатели находились на уровне нормальных значений. В 20% случаев- наблюдалось повышенное содержание МДА в эритроцитах, при этом уровень АОА был также повышен. Эти факты свидетельствуют о том, что у этих людей компенсаторные возможности функционирования системы ПОЛ-АОЗ сохранены, что выражается в повышении антиокислительной активности плазмы крови в ответ на высокий уровень МДА. В то же время большая часть обследованных пожилых людей имела сниженные значения МДА, показатель АОА при этом незначительно превышал верхнюю границу нормальных значений. Сниженный уровень МДА является неблагоприятным показателем перекисного гомеостаза и отражает снижение обменных процессов в мембране клетки (Банкова В.В., 1990).

Анализ изучаемых показателей системы ПОЛ-АОЗ после приема БАД «ДНКаС» выявил повышение уровня МДА в эритроцитах у лиц с исходным низким уровнем этого показателя (с 5,6 ±0,31 до 7,4±0,31 мкмоль/гНв, /з=0,001). Показатели АОА плазмы значимо не изменялись, соотношение МДА/АОА, свидетельствующее об уровне липопероксидации, нормализовалось (табл. 7).

У пожилых людей с исходными высокими и нормальными значениями уровня МДА в эритроцитах значимые изменения после приема БАД «ДНКаС» не выявлены, интегральный показатель АОА также значимо не изменялся, соотношение МДА/АОА соответствовало нормальным значениям.

Таблица 7

Состояние системы ПОЛ-АОЗ у пожилых людей после приема БАД « ДНКаС»

Показатель МДА, мкмоль/гНв АОА, % . соотношение МДА/АОА

Возрастные значения показателей 7,34-7,9 59,6-66,4 0,11 -0,13

Исходный уровень МДА в эритроцитах низкий п=15 5.6±0.31 7,4±0,31 р=0,001 69.2±4.03 72,01±3,5 />=0,613 0.082±0.007 0,1±0,007 />=0,011

норма п=6 7.6±0.09 7,3±0,53 />=0,686 59.9±5.4 78,5±3,4 /з=0,077 0.13±0.011 0,095±0,005 />=0,063

высокий п=5 8.67±0.37 7,95±0,78 /з=0,438 72.Ш.8 69,6±6,3 /з=0,696 0,И±0.003' 0,11±0,01 /3=0,984

Примечание: в числителе - значения показателей до приема БАД, в знаменателе - значения показателей после приема БАД; р - значимость различий при сравнении с показателями, полученными до приема БАД; использован параметрический /-критерий Стьюдента для двух" попарно связанных между собой вариационных рядов.

После приема БАД «Моллюскам» независимо от исходного состояния системы ПОЛ-АОЗ отмечено повышение интегрального показателя АОА крови (с 64,9±2,28 до 71,3±9,27%, р=0,005) и снижение содержания конечного продукта пероксидации МДА (с 6,62±0,16 до 5,5б±0,27 мкмоль/гНв, />=0,014), при этом

показатель МДА/АО А также снижался (с 0,10±0,004 до 0,07±0,005, р=0,004) (табл. 8).

Таблица 8

Состояние системы ПОЛ-АОЗ у пожилых людей после приема БАД «Моллюскам»

Показатель Нормальные возрастные значения До приема После приема Р

М±гп, п=26 М±ш, п=26

МДА, мкмоль/гНв 7,34-7,9 6,62±0,16 5,56±0,27 0,005 .

АОА,% 59,6-66,4 64,9±2,28 71,3±9,27 0,014

соотношение МДА/АОА 0,11-0,13 0,10±0,004 0,07±0,005 0,004

Примечание: р - значимость различий при сравнении с показателями, полученными до приема БАД; использован параметрический /-критерий Стьюдента для двух попарно связанных между собой вариационных рядов.

Таким образом, БАД «ДНКаС» оказывает регулирующее действие на процессы липопероксидации (восстанавливает баланс между процессами перекисно-го окисления липидов и механизмами антиоксидантной защиты клетки). БАД «Моллюскам» обладает антиоксидантным действием, снижая в эритроцитах уровень МДА и повышая АОА плазмы крови, при этом баланс между процессами пе-рекисного окисления липидов и механизмами антиоксидантной защиты клетки смещается в сторону последней.

Полученные результаты позволяют рекомендовать применение БАД «ДНКаС» для коррекции возрастного иммунодефицита и восстановления баланса между процессами перекисного окисления липидов и механизмами антиоксидантной защиты у лиц пожилого возраста. БАД «Моллюскам» также может быть рекомендована для нормализации показателей иммунной системы и профилактики состояний, сопровождающихся интенсификацией свободнорадикаль'ных процессов.

Представленные в настоящей работе данные, являются экспериментальным и клиническим обоснованием возможного создания на основе биологически активных веществ н-ДНК и моллюскама новых эффективных лекарственных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Моллюскам обладает прямым антиоксидантным действием: связывает и инак-тивирует гипохлорит анион, ингибирует свободнорадикальный катион ABTS*+, снижает уровень МДА в реакционной смеси. Моллюскам и н-ДНК стимулируют in vitro функциональную активность нейтрофилов крови здоровых доноров, увеличивая количество клеток, участвующих в фагоцитозе и усиливая их способность-поглощать и переваривать S. aureus.

2. Моллюскам предупреждает изменения слизистой оболочки трахеи при холо-довом стрессе у экспериментальных животных.

3. БАД «ДНКаС» у пожилых людей оказывает иммуномодулирующее действие на клеточный (CD3+-, CD4+-,CD8+-,CD16+- лимфоциты) и гуморальный имму-

нитет (IgG, IgA, IgM), стимулирует пролиферацию B-лимфоцитов и фагоцитарную активность нейтрофилов, увеличивает функционально-метаболические резервы нейтрофилов.

4. БАД «Моллюскам» у пожилых людей оказывает иммуномодулирующее влияние на показатели клеточного (CD3+-, CD4+-,CD8+-,CD16+-,CD20+- лимфоциты) и гуморального иммунитета (IgG, IgA, IgM), стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов.

5. БАД «ДНКаС» у пожилых людей оказывает регулирующее действие на процессы липопероксидации: восстанавливает баланс между процессами пере-кисного окисления липидов и механизмами антиоксидантной защиты клетки. БАД « Моллюскам» оказывает антиоксидантное действие, снижая в эритроцитах уровень МДА и повышая АОА плазмы крови.

Список опубликованных научных работ по теме диссертации

1. Шутикова A.JI., Запорожец Т.С., Эпштейн J1.M., Серебрякова М.Ф., Корнеева H.A. Влияние БАД «ДНКаС» на показатели клеточного и гуморального иммунитета у лиц пожилого и старческого возраста// Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2005. №4. С.101-102.

2. Шутикова А.Л., Серебрякова М.Ф. Влияние БАД «ДНКаС» на иммунный статус лиц пожилого возраста// Материалы итоговой научно-практической конференции с международным участием «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири». Красноярск, 2005. вып.4. С.445.

3. Шутикова А.Л. Коррекция иммунных нарушений БАД «Моллюскам» в геронтологии // Актуальные проблемы технологии живых систем: материалы I международной научно-технической конференции молодых ученых. ТГЭУ, Владивосток, 2005. С.443.

4. Шутикова А.Л., Запорожец Т.С., Серебрякова М.Ф., Корнеева H.A.,. Эпштейн Л.М Влияние БАД «ДНКаС» на показатели клеточного и гуморального Иммунитета у лиц пожилого возраста// ЖМЭИ. 2006.№3. С.68-71.

5. Шутикова А.Л., Запорожец Т.С., Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М. Антиокси-дантная активность БАВ «Моллюскам» в экспериментах in vitro // Материалы II региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии». ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток, 2006. С.138.

6. Шутикова А.Л., Т.С. Запорожец, Эпштейн Л.М. Влияние БАД «Моллюскам» на показатели клеточного и гуморального иммунитета у лиц пожилого возраста // Дальневосточный медицинский журнал. 2006. №3, С.48-50.

7. Давидович В.В., Пивненко Т.Н., Шутикова А.Л., Аюшин Н.Б. Содержание свободных аминокислот и гистидинсодержащих дипептидов в двустворчатых и головоногих моллюсках - перспективных источниках получения биологически активных добавок//Известия ТИНРО-центра. 2006. Т. 147. С.333-339.

8. Шутикова А.Л., Запорожец Т.С. Влияние БАВ «Моллюскам» на мукоциллиар-ную систему при холодовом воздействии // Аллергология и иммунология. 2007.

Т.8, №1. С. 156 (Материалы V Всемирного конгресса по иммунопатологии и аллергии, V Европейского конгресса по астме, Москва, 2007). 9. Шутикова A.JL, Запорожец Т.С., Серебрякова М.Ф., Корнеева Н.А., Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. Использование биологически активных добавок к пище «ДНКаС» и «Моллюскам» для коррекции нарушений иммунной и антиоксидант-ной систем у пожилых людей (методические рекомендации). Владивосток: ГУ НИИЭМ СО РАМН, 2007. 35 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода АОА - антиокислительная активность БАВ - биологически активное вещество БАД - биологически активная добавка к пище МДА - малоновый диальдегид

н-ДНК - низкомолекулярная дезоксирибонуклеиновая кислота НСТ-тест - тест восстановления нитросинего тетразолия ПОЛ-АОЗ - перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита ФП - фагоцитарный показатель ФЧ - фагоцитарное число

ABTS -2,2 азинобис-3-этил-бензотиадолин-6-сульфоновая кислота

CD - cell differentiation antigen или claster definition - антигены кластеров диффе-

ренцировки клеток

Ig G, М,' А - иммуноглобулины G, М, А NK-клетки - натуральные киллерные клетки ТЕАС - trolox equivalent antioxidant capacity

Подписано в печать 22.01.2009 г. Формат 60x90/16. 1 уч.-изд. л. Тираж 100 экз. Заказ № 108. Отпечатано в типографии издательского центра ФГУП «ТИНРО-Центр» г. Владивосток, ул. Западная, 10

Актуальность проблемы

Старение населения - объективный общемировой процесс, обусловленный сложным комплексом факторов, включающих особенности воспроизводства населения, интенсивность и направленность миграции, санитарно-демографические последствия войн и др. Доля пожилых, старых и очень старых людей в общей популяции населения неуклонно увеличивается [88]. Темп прироста лиц пожилого возраста значительно опережает темп прироста всего населения. В России формирование существенной прослойки пожилых людей, прежде всего, связано со снижением рождаемости и сокращением доли детей в общей численности населения, а также с высокой смертностью людей трудоспособного возраста. Увеличению численности пожилых людей также способствуют внедрение достижений медико-биологических исследований, эффективное лечение онкологических заболеваний, более действенная, чем ранее профилактика инфаркта и инсульта. За период с 1959 г по 2000 г численность лиц старше 60 лет в России увеличилась более чем в два раза и составила в 2000 году 30,18 млн. человек (18,5%), из них лица старше 65 лет - 67,6%, старше 75 лет - 22,3%, старше 80 лет - 10,9%, старше 100 лет -0,05% [62, 88]. По прогнозам Государственного комитета Российской Федерации по статистике, население страны к 2016 году сократится по сравнению с началом 2001 года на 10,4 млн. человек, а численность лиц пожилого возраста возрастет и почти в два раза превысит численность детей.

В тоже время физиологическое старение, не сопровождаемое развитием каких-либо хронических заболеваний, определяется лишь у 3-6% людей пожилого возраста. Снижение резервных, адаптационных возможностей организма пожилых людей, изменения его реактивности, обусловленные постепенно нарастающими сдвигами в структуре и функции клеток, органов и систем создают условия для возникновения множества различных болезней.

Наблюдается значительное увеличение показателей заболеваемости и смертности в старших возрастных группах. Увеличивается частота хронических инфекционно-воспалительных, сердечно-сосудистых, онкологических, бронхолегочных, аутоиммунных и эндокринных заболеваний [3].

Значительную роль в процессе старения играют иммунологические механизмы и свободнорадикальное окисление. Для пожилого возраста характерно снижение противомикробного иммунитета, противовирусной и противоопухолевой защиты [216, 259], Т- клеточного звена иммунитета [37, 89, 133, 168], гуморального иммунного ответа, как на аутологичные, так и на экзогенные антигены [29, 37, 66], изменение рецепторного аппарата иммуноком-петентных клеток и соотношения клеточных субпопуляций [80, 120, 133, 172, 242]. Одной из основных причин ослабления пролиферации и дифференци-ровки Т-лимфоцитов является снижение секреции IL-2 [188, 215, 216, 236].

В многочисленных исследованиях отмечено, что накопление повреждений в клетках и скорость старения зависят также от соотношения процессов образования активных форм кислорода и их обезвреживания ферментативной системой антиоксидантной защиты [16]. Общий анализ данных об участии активных форм кислорода (АФК) в процессе старения позволяет ряду авторов утверждать, что повреждение макромолекул приводит к мутациям, нестабильности генома в целом и развитию ряда возрастных патологий, таких как: онкологические и сердечно-сосудистые заболевания, возрастная им-мунодепрессия, дисфункция мозга, развитие катаракты и многие др. [15, 16, 45,47,59, 180, 262].

В этой связи применение иммунокорректоров и антиоксидантов является одной из наиболее актуальных и в то же время наиболее дискутабельных проблем современной геронтологии. Использование таких препаратов может способствовать разрыву патологической цепи в структуре старение — болезнь, что, в свою очередь, позволит уменьшить предпосылки к развитию патологии в старости и тем самым уменьшить вероятность развития заболеваний. Включение иммунокорректоров и антиоксидантов в базисную терапию при различных заболеваниях у лиц старших возрастных групп способствует расширению адаптационных возможностей организма и профилактике преждевременного старения, обусловленного влиянием болезней старости [85].

В настоящее время наиболее предпочтительным представляется применение у лиц пожилого возраста препаратов, в том числе БАД, природного происхождения, оказывающих мягкое иммуномодулирующее и антиокси-дантное действие и имеющих минимум побочных эффектов.

Морские гидробионты, содержащие биологически активные вещества различной природы, являются замечательной основой для создания лечебно-профилактических пищевых продуктов или лекарственных средств [49, 51, 68]. К числу таких препаратов относятся БАД «ДНКаС» и «Моллюскам», разработанные в ФГУП «ТИНРО-центр». Ранее было показано, что н-ДНК -низкомолекулярная дезоксирибонуклеиновая кислота из молок лососевых рыб, входящая в состав БАД «ДНКаС», обладает общеукрепляющим действием, повышая сопротивляемость организма к действию неблагоприятных факторов внешней среды, увеличивает содержание гемоглобина, оказывает стимулирующее влияние на пролиферацию В-лимфоцитов, усиливает фагоцитоз, снижает уровень холестерина, оказывает стимулирующий эффект на физическую и умственную работоспособность [6, 63, 72]. БАД «Моллюскам» - комплекс свободных аминокислот (60-70%), низкомолекулярных белков и гистидинсодержащих дипептидов, выделенный из двустворчатых и головоногих моллюсков, положительно влияет на процесс кроветворения, усиливает фагоцитарные процессы в полиморфноядерных лейкоцитах, оказывает мягкое иммунокорригирующее действие и обладает антиоксидантными свойствами [19, 20]. Учитывая эти свойства, представляется обоснованным применить «Моллюскам» и «ДНКаС» у пожилых людей для коррекции иммунных нарушений и процессов свободнорадикального окисления.

Цель работы:

Экспериментальное и клинико-иммунологическое обоснование применения БАВ из морских гидробионтов н-ДНК и моллюскама для коррекции иммунных нарушений, свободнорадикальных процессов и профилактики заболеваний органов дыхания у людей пожилого возраста.

Задачи исследования:

1. Исследовать антиоксидантные свойства н-ДНК и моллюскама и их воздействие на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови здоровых доноров в экспериментах in vitro.

2. Изучить морфофункциональную структуру эпителия слизистой оболочки трахеи крыс при прямом холодовом воздействии и на фоне введения н-ДНК и моллюскама.

3. Исследовать действие БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» на популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов (CD3 -, CD4 -, CD8%, CD20 CD 16+- лимфоциты) периферической крови пожилых людей.

4. Изучить влияние БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» на уровень иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA) в сыворотке крови, на фагоцитарную активность и кислородзависимую цитотоксичность нейтрофилов периферической крови у пожилых людей.

5. Исследовать влияние БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» на показатели пере-кисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у пожилых людей.

Научная новизна.

Экспериментально доказано, что моллюскам обладает антиоксидант-ным действием, которое проявляется в прямых реакциях нейтрализации свободных радикалов и в опосредованных реакциях накопления вторичных продуктов перекисного окисления липидов in vitro.

Экспериментально обоснована возможность применения БАД «Моллюскам» для профилактики и в комплексном лечении заболеваний органов дыхания. Доказано, что моллюскам защищает слизистую оболочку трахеи экспериментальных животных при холодовом воздействии.

В результате комплексной оценки состояния факторов врожденного и адаптивного иммунитета у пожилых людей установлена эффективность применения БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» для коррекции иммунных нарушений. Установлена направленность действия БАД, зависящая от исходных значений показателей.

Установлено, что БАД «Моллюскам» оказывает антиоксидантное действие, снижая в эритроцитах уровень МДА и повышая АОА плазмы крови у пожилых людей, смещая баланс между процессами перекисного окисления липидов и механизмами антиоксидантной защиты клетки в сторону последней.

Установлено, что БАД «ДНКаС» оказывает регулирующее действие на процессы липопероксидации у пожилых людей, восстанавливая баланс между процессами перекисного окисления липидов и механизмами антиоксидантной защиты клетки.

Практическая значимость.

• Обоснована целесообразность применения биологически активных добавок к пище «ДНКаС» и «Моллюскам», обладающих иммуномодулирующим действием, для коррекции возрастных иммунных нарушений.

• Установлена эффективность применения «Моллюскама» в качестве БАД, обладающей антиоксидантным действием. Рекомендовано ее применение при гиперактивации системы перекисного окисления липидов у пожилых людей.

• Установлена эффективность «ДНКаС» в качестве БАД, оказывающей регулирующее действие на процессы липопероксидации. Рекомендовано ее применение для коррекции свободнорадикальных процессов у пожилых людей.

Внедрение результатов работы.

• Подготовлены и утверждены Департаментом здравоохранения администрации Приморского края методические рекомендации «Использование биологически активных добавок к пище «ДНКаС» и «Моллюскам» для коррекции нарушений иммунной и антиоксидантной систем у пожилых людей» (г. Владивосток, 2007) (Авторы: Шутикова А.Л., Запорожец Т.С. и

ДР-).

• БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» используются в отделении Седанкинско-го дома-интерната для ветеранов для профилактики и коррекции расстройств иммунной и оксидантной систем (акт внедрения от 07.11.2008 г).

• Полученные новые данные по применению в геронтологической практике биологически активных веществ из морских гидробионтов используются при обучении студентов медицинских ВУЗов и факультетов, а также на курсах ФПК (акт внедрения от 10.11.2008 г).

• Отчеты об экспериментальном исследовании моллюскама и БАД на его основе были включены в пакет документов для регистрации в Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, по результатам экспертизы получено свидетельство № 77.99.11.3.У.4071.10.04 от 08.10.04 г.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Моллюскам обладает прямым антиоксидантным действием.

2. Моллюскам защищает слизистую оболочку трахеи экспериментальных животных при общем охлаждении.

3. БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» оказывают модулирующее действие на факторы врожденного и адаптивного иммунитета у пожилых людей, зависящее от исходного уровня показателей.

4. БАД «Моллюскам» оказывает антиоксидантное действие на систему ПОЛ-АОЗ у пожилых людей, смещая баланс между процессами перекис-ного окисления липидов и механизмами антиоксидантной защиты клетки в сторону последней. БАД «ДНКаС» оказывает регулирующее действие на процессы липопероксидации.

Апробация результатов диссертационной работы:

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ГУ НИИЭМ СО РАМН (протокол №5 от 16.05.2007г.).

Материалы диссертации представлены на II Дальневосточном региональном конгрессе «Человек и лекарство» с международным участием (Владивосток, 2005), Итоговой научно-практической конференции с международным участием: «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2005), I Международной научно-технической конференции молодых ученых: «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2005), II региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2006), V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007), V Европейском конгрессе по астме (Москва, 2007).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «материалы и методы исследования», 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 294 источника, из них 91 отечественный и 203 иностранных. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 14 рисунками.

выводы

1. Моллюскам обладает прямым антиоксидантным действием: связывает и инактивирует гипохлорит анион, ингибирует свободнорадикальный катион ABTS*+, снижает уровень МДА в реакционной смеси. Моллюскам и н-ДНК стимулируют in vitro функциональную активность нейтрофилов крови здоровых доноров, увеличивая количество клеток, участвующих в фагоцитозе и усиливая их способность поглощать и переваривать S. aureus.

2. Моллюскам предупреждает изменения слизистой оболочки трахеи при холодовом стрессе у экспериментальных животных.

3. БАД «ДНКаС» у пожилых людей оказывает иммуномодулирующее действие на клеточный (CD3+-, CD4+-,CD8+-,CD16+- лимфоциты) и гуморальный иммунитет (IgG, IgA, IgM), стимулирует пролиферацию В-лимфоцитов и фагоцитарную активность нейтрофилов, увеличивает функционально-метаболические резервы нейтрофилов.

4. БАД «Моллюскам» у пожилых людей оказывает иммуномодулирующее влияние на показатели клеточного (CD3+-, CD4+-,CD8+-,CD16+-,CD20+-лимфоциты) и гуморального иммунитета (IgG, IgA, IgM), стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов.

5. БАД «ДНКаС» у пожилых людей оказывает регулирующее действие на процессы липопероксидации: восстанавливает баланс между процессами перекисного окисления липидов и механизмами антиоксидантной защиты клетки. БАД « Моллюскам» у пожилых людей оказывает антиоксидантное действие, снижая в эритроцитах уровень МДА и повышая АОА плазмы крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Со второй половины прошлого века проблема старения занимает существенное место в ряду медико-социальных проблем. Прогрессивное старение общества - объективный процесс, характерный для подавляющего числа стран и регионов, в последнее время становится чрезвычайно актуальным и для нашей страны. Пожилые люди нуждаются в особых медицинских подходах, касающихся всех сторон медицинского обслуживания, включая диагностику, амбулаторное и стационарное лечение, проведение на постоянной основе профилактических мер, направленных на предотвращение заболеваемости и инвалидности, улучшение качества жизни.

Для лиц пожилого возраста характерны разнообразные нарушения функционального статуса и множественность хронических заболеваний (по-лиморбидность), определяющие нужды и потребности в различного вида медицинской и социальной помощи [14]. В пожилом возрасте структура заболеваемости значительно изменяется за счет уменьшения острых и увеличения хронических болезней. Этому способствуют многочисленные факторы различной инфекционной и неинфекционной природы (антропогенные факторы, стрессы, нарушения питания и т.д.). Формирование вторичного иммунодефицита, нарушение соотношения процессов образования и обезвреживания активных форм кислорода усугубляют ситуацию, обусловливая более тяжелое течение заболеваний, развитие осложнений, затяжное течение воспалительных процессов.

Профилактика старения является одним из новых направлений научной и практической деятельности в медицине, наиболее активно и динамично формирующимся в настоящее время. Это направление предполагает разработку и использование принципиально новых подходов и современных высоких технологий, предназначенных для повышения качества жизни людей, снижения реальных темпов старения и увеличения продолжительности активной трудоспособной жизни. К настоящему времени изучены и описаны различные механизмы старения и создается все большее количество средств, способных влиять на эти процессы [2]. Одними из таких средств являются иммуномодуляторы и антиоксиданты, позволяющие обеспечивать профилактику заболеваемости, увеличивать длительность активной жизни, сдерживать темпы старения, длительно сохранять высокий уровень физической и психической активности

Необходимым условием для достижения высокого эффекта при применении таких средств является возможность комплексного воздействия на различные стороны процесса старения.

В последние годы все большее распространение получают биологически активные соединения, выделенные из природных объектов, обладающие, в ряду прочих свойств, иммуномодулирующим и антиоксидантным действием.

Многочисленные исследования показали, что источником уникальных БАВ широкого спектра действия являются морские гидробионты [19, 33, 49, 51, 55, 68]. Эти соединения, выделенные из объектов морской флоры и фауны, зачастую лишены отрицательных свойств и характеризуются широко и успешно воспроизводимой сырьевой базой [22].

В настоящей работе исследовали иммунотропное и антиоксидантное действие БАВ из морских гидробионтов — н-ДНК и моллюскама в эксперименте, а также эффективность применения БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» созданных на основе вышеуказанных БАВ у людей пожилого возраста для коррекции иммунных нарушений и нормализации показателей системы ПОЛ-АОЗ.

На первом этапе работы в экспериментах in vitro была изучена анти-оксидантная активность БАВ - моллюскама и н-ДНК, поскольку известно, что многие аминокислоты и гистидинсодержащие дипептиды сами по себе обладают антиоксидантной активностью [8, 35, 70, 75]. Для определения ан-тиоксидантной активности этих веществ использовали прямые и непрямые методы [74, 87, 244].

При использовании прямого метода, основанного на регистрации хло-раминового комплекса, было установлено, что моллюскам в концентрации 0,2 мг/мл связывал весь свободный гипохлорит в концентрации 5 мМ при равных объемах реагирующих компонентов в течение 15 мин, образуя стабильное соединение (т.н. хлораминовый комплекс).

Для н-ДНК таких исследований не проводили, т.к. образование хло-раминовых комплексов характерно только для некоторых аминокислот и пептидов.

В следующей серии экспериментов мы использовали метод, основанный на ингибировании свободных радикалов ABTS"+ (2,2 азинобис-3-этил-бензотиадолин-6-сульфоновой кислоты). Полученные данные показали, что моллюскам ингибирует свободнорадикальный катион ABTS"+, проявляя при этом умеренное антиоксидантное действие (1000 мг моллюскама обеспечивают антиоксидантную активность эквивалентную 45 мг тролокса), что позволяет использовать его в достаточно больших дозировках, необходимых для обеспечения включения в метаболизм различных тканей и органов. Умеренность антиоксидантного действия предпочтительна с точки зрения предотвращения дальнейшего окисления биологических субстратов, что имеет место при использовании мощных антиоксидантов, которые в высоких концентрациях становятся прооксидантами. н-ДНК прямым антиоксидантным действием, обеспечивающим инактивацию радикала ABTS*+, практически не обладала.

Определение уровня малонового диальдегида (МДА) в модельной системе in vitro позволяет оценить антиоксидантные свойства веществ в условиях, более приближенных к живому организму. МДА является одним из вторичных продуктов перекисного окисления липидов, накапливающихся в сыворотке крови, и является показателем интенсивности процессов перекисного окисления липидов, которое приводит к развитию целого ряда патологий [47].

В результате проведенных экспериментов было установлено, что уровень МДА в сыворотке крови после добавления моллюскама в концентрации 2 мкг/мл значимо снижался в 3,3 раза (р>=0,000). Н-ДНК влияния на уровень МДА в системе in vitro не оказывала.

Известно; что нейтрофилы составляют первую линию неспецифической противомикробной защиты. Они первыми мобилизуются в очаг воспаления или инфекции и от их фагоцитарной активности зависит элиминация; возбудителей. Нейтрофилы обладают всеми функциями фагоцитирующих клеток: адгезивностью, подвижностью, способностью к хемотаксису, способностью захватывать бактерии и другие частицы без участия специфических рецепторов или при участии FcR или GR1, убивать захваченные микроорганизмы с помощью кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов цитотоксичности и переваривать захваченные объекты фагоцитоза [76]. Поэтому нейтрофилы являются универсальным индикатором различных нарушений гомеостаза.

В связи с этим следующий раздел экспериментальной работы был выполнен с целью выяснения механизмов действия н-ДНК и моллюскама на фагоцитарную активность нейтрофилов в модельной системе in vitro, поскольку эта модель позволяет оценить прямое действие препаратов на фагоцитирующие клетки.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что инкубирование нейтрофилов крови здоровых доноров с н-ДНК в конечной концентрации - 1, 10 и 100 мкг/мл и моллюскамом в концентрациях - 1 и 10 мкг/мл через 30 минут приводило к увеличению количества клеток, участвующих в фагоцитозе, и усилению их способности поглощать S. aureus.

Через 2 часа инкубации нейтрофилов с исследуемыми веществами было выявлено, что н-ДНК в концентрации 1 мкг/мл способствует усилению поглощения микроорганизмов нейтрофилами (ФЧ30 10,75±0,63 и ФЧ120 11,77±0,66; /?=0,004), а в концентрации 10 и 100 мкг/мл способствует снижению значений ФЧ, что может расцениваться как усиление процессов переваривания микроорганизмов (ФЧ30 11,43±1,22 и ФЧ120 9,36±1,29; р=0,001; ФЧ30 10,84±0,42 и ФЧ120 8,04±0,58; />=0,027 соответственно). При инкубации ней-трофилов с моллюскамом в концентрации 1 и 10 мкг/мл наблюдалась аналогичная динамика изменений показателей фагоцитоза (ФЧ30 12,19±0,68 и ФЧ120 10,08±0,41; />=0,020 и ФЧ30 10,69±0,10 и ФЧ120 7,13±0,10; />=0,003 соответственно). Полученные результаты позволяют заключить, что н-ДНК в конечной концентрации 1, 10 и 100 мкг/мл и моллюскам в конечной концентрации 1 и 10 мкг/мл увеличивают количество клеток, участвующих в фагоцитозе, и усиливают их способность поглощать и переваривать S. aureus

Последним разделом экспериментальной работы явилось обоснование применения БАВ - моллюскама и н-ДНК с целью коррекции изменений слизистой оболочки воздухоносного отдела легких, инициированных действием холода.

Выполнение данного фрагмента работы обосновано тем, что значительный удельный вес в структуре заболеваемости людей пожилого возраста занимают болезни органов дыхания, в 7-8 раз превышая показатели у молодых [83]. В стареющем организме в силу развивающихся морфо-функциональных изменений, нарушения обменных процессов, снижения адаптационных возможностей, создаются условия для развития патологии органов дыхания, а факторы окружающей среды, такие как холод и влажность, еще в большей степени усугубляют этот процесс [5, 38, 39, 73, 77, 83, 84]. Адаптация к холоду сопровождается целым рядом функциональных нарушений и морфологических изменений в значительной степени затрагивающих органы дыхания [58]. Морфологические изменения при холодовой адаптации обусловлены нарушением целостности клеточных мембран, активированием перекисного окисления липидов, нарушением антиоксидант-ной защиты, напряжением кислородного режима, изменением реологических свойств крови и др. [58].

В экспериментальной работе на крысах мы изучили морфологическую структуру эпителия слизистой оболочки трахеи.

Полученные результаты показали, что при действии холода слизистая оболочка трахеи крыс подвергалась значительной перестройке. Снижался ре-генерационный потенциал эпителия слизистой оболочки трахеи за счет уменьшения промежуточных и базальных клеток. Происходило увеличение содержания бокаловидных и мигрирующих тучных клеток, что приводило к гиперсекреции слизи. Нарушалось регулярное расположение ресничек. В одних случаях реснички образовывали скопления по 20 - 60 штук, в других -были направлены в различные стороны, в результате чего исчезали поперечные волны движения, хорошо различимые у интактных животных. Вследствие этих процессов происходило нарушение мукоциллиарного транспорта.

Пероральное введение крысам моллюскама оказывало выраженное защитное действие, на эпителий слизистой оболочки трахеи экспериментальных животных, предупреждая изменения, характерные для холодового воздействия, такие как нарушение регулярности расположения ресничек, исчезновение поперечных волн движения ресничек, гиперсекрецию слизи. Реснитчатый покров сохранял характерный волнообразный рельеф. Слизистая оболочка трахеи этих животных, как по морфологическому строению, так и по клеточному составу фактически не отличалась от интактных крыс.

Что касается н-ДНК, то она оказывала слабое защитное действие на эпителий слизистой оболочки трахеи экспериментальных животных, уменьшая лишь выраженность изменений, характерных для холодового воздействия.

У этих же животных были исследованы показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в плазме крови при действии холода.

В результате мы установили, что длительное охлаждение животных сопровождается повышением содержания вторичного продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида в плазме крови (К - 4,9± 0,37 нмоль/л, X - 6,06±0,34 нмоль/л; />=0,028) и снижением уровня витамина

Е, являющегося природным антиокидантом, по сравнению с интактными животными (К - 43,38±4,30 мкг/мл, X - 32,48±2,29 мкг/мл, р=0,031).

Введение крысам, подвергнутым охлаждению, моллюскама и н-ДНК» вдозе10мг/кг предупреждало увеличение уровня малонового диальдегида, и снижение уровня витамина Е.

Таким образом, предварительное (перед Холодовым воздействием) и последующее введение крысам моллюскама и н-ДНК предупреждает как изменения слизистой оболочки трахеи, характерные для холодового воздействия, так и усиление процесса липопероксидации, тем самым, снижая расход природных антиоксидантов, в частности, витамина Е. Однако следует отметить, что защитное действие н-ДНК на слизистую оболочку трахеи значительно уступает таковому у моллюскама. и

На основании экспериментальных данных о защитном действии моллюскама можно высказать предположение о целесообразности использования этой БАВ как средства защиты органов дыхания от повреждающего действия холода и с целью профилактики заболеваний органов дыхания.

Следующим этапом работы было изучение влияния БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» на факторы врожденного и приобретенного иммунитета у пожилых людей. Поскольку в пожилом возрасте в результате инволюции тимуса формируется вторичный иммунодефицит, характеризующийся как изменениями самих клеток иммунной системы, так и изменениями клеточного окружения, нейрогуморального равновесия [29, 37, 138, 148, 216]. В процессе старения, не осложненного заболеванием, происходит закономерное изменение рецепторного аппарата и апоптоза клеток иммунной системы и изменение соотношения клеточных популяций [80, 120, 133, 172, 242]. С возрастом в большей степени снижается как абсолютное количество, так и относительное содержание С04+-лимфоцитов в циркулирующей крови, чем С08+-лимфоцитов и уменьшается индекс СБ4+/ СБ8+-лимфоциты [133, 242]. Содержание СБ8+-лимфоцитов с возрастом может, как снижаться [242], так и увеличиваться [80], либо не изменяется [120, 133, 197].

Для интерпретации результатов всех обследованных пожилых людей условно разделили на три группы с учетом исходного уровня показателей: с высокими показателями иммунного статуса, со средне-нормальными значениями, со сниженными показателями иммунного статуса.

В результате проведенных исследований установлено, что после приема Б АД «ДНКаС» и «Моллюскам» у обследуемых пожилых людей с высокими показателями относительное содержание СБЗ+-лимфоцитов снижалось незначительно (с 67,1±0,9% до 62,7±1,6%; р=0,039 и с 66,8±0,7 % до 62,1±1,6 %;/?=0,066 соответственно). В том случае, когда показатели были снижены относительное содержание СБЗ+-лимфоцитов повышалось (с 47,7±1,1% до 61,6±1,3%; /7=0,0001 и с 46,4±1,2 % до 60±1,3 %; />=0,0001 соответственно)

При изучении регуляторных субпопуляций было установлено, что практически у всех пожилых относительное содержание СБ4+-лимфоцитов находилось на уровне нижней границы физиологической нормы, либо было ниже ее. После приема БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» содержание СБ4+-лимфоцитов увеличивалось (с 28,9±0,72% до 34,1±0,58%; />=0,0001и4 с 28,1±0,9% до 34,8±0,9%; /7=0,0001 соответственно). Относительное содержание субпопуляции цитотоксических лимфоцитов/ супрессоров после приема БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» у пожилых людей в группе со средне-нормальными значениями показателей незначительно снижалось или не изменялось. В том случае, когда показатели СБ8+-лимфоцитов были снижены, относительное содержание этих клеток увеличивалось (с19,5±0,84% до 27,6±0,61%;/>=0,0001 и с 18,9±0,9% до 23,8±0,8%;/И),0001 соответственно).

Для пожилого и старческого возраста характерно снижение не только противомикробного иммунитета, но и противовирусной и противоопухолевой защиты, в которой принимают участие натуральные киллеры (№С-клетки). Эти клетки имеют большое значение в неспецифической защите организма и клеточно-опосредованном иммунном ответе, так как способны продуцировать и секретировать иммунорегуляторные цитокины, лизировать

Ill клетки, инфицированные внутриклеточными возбудителями, и ингибировать размножение микроорганизмов. Наибольшую активность NK-клетки проявляют по отношению к опухолевым и пораженным вирусом клеткам [76]. Содержание NK-клеток изменяется при различных патологических процессах: снижается при паразитарных, системных заболеваниях, стрессе, дефиците цинка и повышается при вирусных инфекциях и онкологических заболеваниях. С возрастом также увеличивается содержание в кровотоке NK-клеток [99, 152, 209, 216, 229, 258, 259], но происходит ослабление их функциональной активности [86, 115, 131, 216, 259].

В наших исследованиях после приема БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» у лиц с низкими показателями содержание CD 16+-лимфоцитов увеличивалось (с 8,4±0,35% до 13,9±2,4%; р=0,05 и с 8,4±0,7% до 14,6±3,1%; р-0,065 соответственно). У пожилых людей с высокими показателями CD 16+-лимфоцитов после приема БАД «Моллюскам» наблюдалась нормализация данного показателя до уровня средне-нормальных значений > (с 22,9±1,6% до 11,5±1,7% /я=0,0001).

Известно, что гуморальный иммунный ответ с возрастом изменяется в меньшей степени, чем клеточный [29, 152]. По данным литературы абсолютное количество B-клеток у пожилых людей не изменяется, однако относительное содержание может возрастать с возрастом, как следствие поликло-нальной активации [80] или в результате снижения содержания Т-лимфоцитов [29].

В результате проведенных исследований мы установили, что у большинства пожилых относительное содержание этих клеток находилось на уровне верхней границы физиологической нормы, либо было выше ее. На фоне приема БАД «ДНКаС» у всех обследуемых пожилых людей независимо от исходного уровня показателя относительное содержание В-лимфоцитов увеличивалось (с 21,1±2,3% до 31,2±2,0%; /7=0,001). При этом, чем ниже был исходный уровень B-лимфоцитов, тем более выраженной была стимуляция.

В то же время после приема БАД «Моллюскам» у людей с высокими показателями относительного содержания В-лимфоцитов выявлена тенденция к его снижению (с 25,2±1,5 % до 21,4±1,6 %;¿=0,055).

В процессе старения ослабевает гуморальный иммунный ответ, как на аутологичные, так и на экзогенные антигены, в чем непосредственно принимают участие разные классы иммуноглобулинов. С возрастом часто развивается дисбаланс основных классов иммуноглобулинов. Уменьшается концентрация в крови ^М, а уровень и увеличивается [37]. Такое соотношение иммуноглобулинов приводит к снижению противомикробной защиты и повышению восприимчивости к инфекциям у людей пожилого возраста [60, 66].

В наших исследованиях у большинства пожилых людей выявлена подобная закономерность, а также установлено модулирующее действие БАД «ДНКаС» и «Моллюскам», которое зависело от исходного уровня иммуно-гобулинов, отражающее влияние этих веществ на популяции иммунокомпе-тентных клеток.

При оценке фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови было установлено, что у пожилых людей со сниженными значениями показателей фагоцитарной активности после приема БАД «ДНКаС» наблюдалось увеличение ФП (с 63±1,9% до 79±4,7%; р=0,022), поглотительная способность нейтрофилов при этом не изменялась, после приема БАД «Моллюскам» увеличивался как ФП (с 53,6±2,4% до 67,2±3,6%; ¿=0,031) так и ФЧ (с 2,42±0,23 до 2,76±0,17; ¿=0,01). У обследованных с высокими значениями фагоцитоза (что может быть отражением максимального уровня напряжения резервных способностей) показатели не изменялись.

Основой кислородзависимого механизма цитотоксичности нейтрофилов, ответственного за разрушение бактерий, является способность к продукции активных форм кислорода (т.н. респираторный взрыв) [76]. Сравнительное изучение спонтанного и индуцированного НСТ-теста позволяет судить о функциональной активности и потенциальных ресурсах бактерицидной системы нейтрофилов.

В результате проведенных исследований было установлено, что показатели спонтанного и индуцированного НСТ-теста были значительно снижены. После приема БАД «ДНКаС» показатели спонтанного НСТ-теста снижались (с 37,5±4,51 до 22,1±4,35; р=0,013), а индуцированного НСТ-теста - повышались (с 108,2±14,2 до 188,6±10,5; р=0,0001), что свидетельствует об увеличении резервного потенциала нейтрофилов. Полученные результаты позволяют предположить, что даже сниженные по отношению к лицам среднего возраста показатели спонтанного НСТ-теста, у пожилых людей могут свидетельствовать о напряжении бактерицидной системы, что в свою очередь может быть связано с наличием в органах и тканях у лиц данной возрастной группы персистирующих бактерий и вирусов. Прием БАД «ДНКаС» приводит систему генерации АФК нейтрофилов в спокойное состояние, что соответственно влечет за собой увеличение резервных возможностей фагоцита. После приема БАД «Моллюскам» значимых изменений со стороны бактерицидной системы нейтрофилов выявлено не было.

Анализируя полученные данные после применения БАД «Моллюскам» и «ДНКаС», мы установили, что влияние данных БАД на организм пожилого человека неоднозначно и зависит от исходного уровня показателей иммунной системы: повышает — если показатели были снижены, снижает - если показатели были высокими и не изменяет - если они были в пределах средне-нормальных значений.

Таким образом, мы показали, что БАД «ДНКаС» оказывает модулирующее действие на клеточный и гуморальный иммунитет у пожилых людей, оказывает умеренное стимулирующее влияние на В-лимфоциты и увеличивает функционально-метаболические резервы нейтрофилов по данным спонтанного и индуцированного НСТ-теста. БАД «Моллюскам» оказывает модулирующее влияние на показатели клеточного и гуморального иммунитета, зависящее от исходных значений и не влияет на активность кислородзави-симого метаболизма нейтрофилов.

Согласно P.M. Хаитову и др. [81], установление иммунодефицита еще не является основанием для назначения иммуномодуляторов. Для обоснованного проведения иммунотерапии необходимо провести клинико-иммунологическое исследование. По его результатам авторы выделяют 3 группы людей: в первую входят лица, имеющие клинические признаки нарушения иммунитета и изменения иммунологических показателей; во вторую - лица с клиническими признаками нарушений иммунной системы при отсутствии изменений иммунологических показателей; в третью - лица, имеющие только изменения иммунологических показателей без клинических признаков недостаточности иммунной системы. И, если назначение иммуно-модулирующей терапии однозначно показано в первых 2-х группах, то третьей рекомендован только иммунологический мониторинг. По нашему мнению применение исследованных нами БАД, обладающих мягким иммуномодули-рующим действием, у этой группы лиц представляется возможным, особенно при нарушении клеточного звена иммунитета. Использование этих природных соединений будет способствовать восстановлению нарушенных иммунологических показателей и предотвратит дальнейшее развитие вторичного иммунодефицита.

В последнее время активно обсуждается свободнорадикальная теория старения, согласно которой причиной совокупного окислительного повреждения липидов, белков и нуклеиновых кислот являются АФК, что приводит к преждевременной гибели клеток и ускоренному старению организма [15, 16, 45, 59, 262]. Причиной возрастного окислительного повреждения может быть также снижение потенциальных ресурсов антиоксидантной системы и систем восстановления повреждений. При развитии различного рода патологических состояний возникают сдвиги метаболического гомеостаза и равновесия между процессами свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты. К патологическим изменениям, лежащим в основе развития некоторых заболеваний, относятся повреждение мембран, инактивация ферментов, гибель клеток, избыточное образование свободных радикалов, которые могут накапливаться в результате длительной активации процессов ПОЛ [47].

Этот раздел клинической работы посвящен изучению влияния БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» на параметры системы ПОЛ-АОЗ.

Результаты проведенной работы показали, что у четверти пожилых людей показатели системы ПОЛ-АОЗ находились на уровне нормальных значений. В 20% случаев наблюдалось повышенное содержание МДА, при этом уровень АОА был также повышен. Эти факты свидетельствуют о том, что у этих людей компенсаторные возможности функционирования системы ПОЛ-АОЗ сохранены, что выражается в повышении антиокислительной активности плазмы крови в ответ на высокий уровень МДА. В то же время большая часть обследованных пожилых людей имела сниженные значения МДА, показатель АОА при этом незначительно превышал верхнюю границу нормальных значений. Сниженный уровень МДА является неблагоприятным показателем перекисного гомеостаза и отражает снижение обменных процессов в мембране клетки [4].

После приема БАД «ДНКаС» у лиц с исходными низкими значениями показателя уровень МДА повышался (с 5,6±0,31 до 7,4±0,31 мкмоль/гНв; р=0,001), показатели АОА плазмы значимо не изменялись, соотношение МДА/АОА, свидетельствующее об уровне липопероксидации, нормализовалось. У пожилых людей с исходными высокими и нормальными значениями уровня МДА в эритроцитах значимые изменения после приема БАД «ДНКаС» выявлены не были, интегральный показатель АОА также значимо не изменялся, соотношение МДА/АОА соответствовало нормальным значениям. го продукта липопероксидации МДА (с 6,62±0,16 до 5,56±0,27 мкмоль/гНв; р=0,014).

Таким образом, мы установили, что БАД «ДНКаС» оказывает регулирующее действие на процессы липопероксидации (восстанавливает баланс между процессами перекисного окисления липидов и механизмами антиок-сидантной защиты клетки), а БАД «Моллюскам» обладает антиоксидантным действием, снижая в эритроцитах уровень МДА и повышая АОА плазмы крови, при этом баланс между процессами перекисного окисления липидов и механизмами антиоксидантной защиты клетки смещается в сторону последней.

Полученные результаты позволяют рекомендовать применение БАД «ДНКаС» для коррекции возрастного иммунодефицита и восстановления баланса между процессами перекисного окисления липидов и механизмами антиоксидантной защиты у лиц пожилого возраста. БАД «Моллюскам» также может быть рекомендована для нормализации показателей иммунной системы и профилактики состояний, сопровождающихся интенсификацией свободнора-дикальных процессов.

Результаты исследований БАД «ДНКаС» и «Моллюскам» показали перспективность их применения у пожилых людей для профилактики вторичного иммунодефицита и состояний, сопровождающихся нарушением в системе ПОЛ-АОЗ. Методы получения данных БАД относительно просты и не требуют больших затрат времени и дорогостоящего оборудования, что обуславливает экономическую выгоду от их производства и доступность по цене для широких слоев населения.

Представленные в настоящей работе данные, являются экспериментальным и клиническим обоснованием возможного создания на основе биологически активных веществ н-ДНК и моллюскама новых эффективных лекарственных препаратов.