Автореферат и диссертация по медицине (14.00.43) на тему:Роль наследственных факторов в развитии хронических обструктивных заболеваний органов дыхания

£

РВДНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПУЛЬМОНОЛОГИИ

На правах рукописи УДК [616.2-036.12+616.24-006.61-056.7

Самильчук Елена Ивановна

РОЛЬ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ФАКТОРОВ В РАЗВИТИИ ХРОНИЧЕСКИХ ОБСТРУКТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ

14.00.43 - Пульмонология 03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте пульмонологии Министерства здравоохранения Российской федерации

Научный консультант: академик РАМН, профессор А.Г. Чучалин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор НА. Дидковский доктор медицинских наук, профессор Ю.К. Новиков доктор биологических наук, профессор В.А. Спицын

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт канцерогенеза Онкологического Научного Центра РАМН

Защита диссертации состоится " " июня 1997 года на заседании диссертационного совета Д.084.59.01 при Научно-исследовательском институте пульмонологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской федерации (105077, Москва, 11-я Парковая 32/61).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ пульмонологии МЗ и МП РФ

Автореферат разослан " " мая 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета Д.084.59.01

доктор медицинских наук О.С. Васильева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Хроническая патология органов дыхания является одной из основных причин заболеваемости и смертности. Среди многочисленных факторов, приводящих к поражению респираторных путей, важная роль, несомненно, принадлежит наследственности. Это очевидно в случае таких заболеваний легких, как муковисцидоз (MB) и эмфизема, связанная с недостаточностью ААТ (ЭМ-ААТ), в основе этиопатогенеза которых лежат мутации в генах CF и PI, соответственно (Kalsheker N.A., 1994; Zielenski J. & Tsui L.C., 1995). Однако роль генетических механизмов в развитии наиболее распространенных форм легочной патологии, таких как хронический бронхит или эмфизема без дефицита ААТ, остается неясной. Для обозначения данной патологии часто используется термин "хроническое обструктивное заболевание легких" (ХОЗЛ) (Ingram R.H., 1991; Cherniack N.S., 1991). Клинических проявления ХОЗЛ и вышеупомянутых наследственных заболеваний легких во многом сходны. Поэтому закономерности, установленные при изучении функций генов, ответственных за развитие MB и ЭМ-ААТ, могут оказаться значимыми и для ХОЗЛ. Примером этому может служить концепция, согласно которой эмфизема является следствием дисбаланса между протеазами и их ингибиторами (Wewers М., 1989.) Обобщенная для эмфиземы в целом, эта концепция, фактически, опирается на данные, полученные при изучении сравнительно редкой формы эмфиземы -

ЭМ-ААТ. В рамках концепции дисбаланса протеаз и их игибиторов заслуживает внимания и ген другого ингибитора протеаз - альфа-1-антихимотрпсина (А1СНТ), который как было недавно показано может играть роль в этиопатогенезе некоторых случаев ХОЗЛ (Poller W. et al., 1992). С учетом вышеизложенного данное диссертационное исследование было сфокусировано на изучении трех генетических систем -CF, PI и А1СНТ. Поскольку немаловажный аспект изучения роли данных генов в развитии легочной патологии связан с возможностью моделирования ассоциированных с ними заболеваний на экспериментальных животных и предклини-ческих испытаний новых терапевтических подходов, представлялось целесообразным изучит данные генетические системы не только у человека, но и у животных. Обезьяны, в силу их наибольшей близости к человеку, предоставляют уникальные возможности в этой области, что и обусловило включение в данное исследование соответствующих генетических систем обезьян. Последнее, помимо информации имеющей чисто биологическое значение, может оказаться весьма полезным и при решении медицинских задач.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящего исследования было изучение роли генетических факторов в этиопатогенезе ХОЗЛ.

В рамках этой цели были поставлены следующие задачи:

з

1. Изучить частоты дефицитных и полиморфных аллелей гена Р1 при ХОЗЛ и другой патологии человека, ассоциированной с дефицитом ААТ.

2. Изучить возможность ассоциации полиморфизмов в З'-фланкирующей области гена Р1 с ХОЗЛ.

3. Провести сравнительное исследование Р1 системы человека и обезьян различных видов.

4. Получить гибридомы продуцирующие моноклональные антитела против ААТ приматов.

5. Изучить распространенность мутации 22?Рго—>227А1а в гене А1СНТ у больных ХОЗЛ.

6. Изучить возможность присутствия мутаций гена СГ у больных ХОЗЛ.

Научная новизна. Впервые:

Разработан тест для определения А1а213/Уа1213 полиморфизма в гене Р1 на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и изучена частота данного полиморфизма у больных ХОЗЛ.

Разработан ПЦР тест для определения Тач1 полиморфизма в З'-фланкирующей области гена Р1 и изучена частота этого полиморфизма у больных с различными формами легочной патологии и здоровых лиц в России.

Изучен филогенез Тад1 полиморфизма и идентифицирован предковый аллель.

Идентифицировано 42 кодоминантных алеля Р1-системы обезьян. Не выявлено ни одного общего аллеля для Р1-систем человека и обезьян.

Получены гибридомы, продуцирующие монокло-нальные антитела против общих эпитопов ААТ человека и обезьян.

Изучена распространенность мутации 227Рго~» 227А1а в гене А1СНТ у больных ХОЗЛ в России.

Проведено определение наиболее частых мутаций гена СР (ДГ508, 0542Х, С55Ш, \V1282X, И553Х, 1717-Ю->А, 8549Ы/1, 3849+ЮкЬ С-»Т) у больных ХОЗЛ в России.

Практическая значимость.

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела против ААТ приматов, депонированы в бывшей Всесоюзной коллекции клеточных культур. Данные моноклональные антитела могут использоваться в диагностических целях (например, для типирования некоторых форм лейкозов), а также в научных исследованиях.

Разработанный ЦПР тест для детекции TaqI полиморфизма в З'-фланкирующей области гена Р1 может быть использован для выявления лиц, относящихся к группе риска по ХОЗЛ.

Полученная информация в отношении Р1-аллелей обезьян позволяет проводить видовую идентификацию и контроль родословных, что имеет важное значение для медицинской приматологии.

Внедрение в практику.

Методика фенотипирования ААТ внедрена в работу 23-го терапевтического отделения ГКБ N0. 7. Моноклональ-ные антитела против ААТ используются в работе лаборатории иммунологии НИИ микробиологии и эпидемиологии им. Габричевского. ПЦР тест для определения Тад1 полиморфизма используется в работе Института клинической онкологии.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Дефицитные аллели гена Р1, также как и мутация 227Рго-»227А1а гена А1СНТ не играют существенной роли в заболеваемости ХОЗЛ в России.

2. Частоты аллелей двух полиморфных систем гена Р1 (подтипы М и А1а213/Уа1213) в группе ХОЗЛ не отличаются от контроля.

3. Частота TaqI полиморфизма в З'-фланкирующей области гена Р1 достоверно повышена у больных ХОЗЛ. Имеется тенденция к повышению частоты этого аллеля у больных раком легкого.

4. Основная мутация гена СГ (АГ508) встречается с повышенной частотой у больных ХОЗЛ.

Апробация работы.

Основные положения работы неоднократно докладывались на научных сессиях НИИ пульмонологии МЗ и МП РФ, Москва, Института медицинской приматологии РАМН (бывший Институт экспериментальной патологии и терапии АМН СССР), Адлер-Сухуми. Материалы работы также были представлены на следующих международных и всесоюзных

симпозиумах и конференциях: "Прогресс в медицинской приматологий"; Сухуми, 1987; "Стандартизация лабораторных моделей на животных", Москва, 1987; "Проблемы изучения наследственности человека на уровне белковых продуктов генной экспрессии", Москва, 1989; "3-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания", Санкт-Петербург, 1992.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 18 работ, из которых 13 - журнальные статьи (4 из них в зарубежных изданиях), 4 - материалы конференций и симпозиумов, 1 -авторское свидетельство. Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и иллюстрирована 17 таблицами и 29 рисунками. Текст изложен на 181 страницах. Список литературы включает 212 источников (21 на русском языке, 191 на английском языке).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Образцы сывороток крови.

Для фенотипирования, ААТ были собраны образцы сывороток крови от 892 человек (пациентов с заболеваниями, известными своей ассоциацией с дефицитными вариантами ААТ, а также здоровых лиц). Распределение исследованных лиц по соответствующим нозологическим формам представлено в табл. 1.

Табл. 1. Сыворотки крови и ДНК людей, использовавшиеся в данном исследовании. А) Сыворотки

Группа К-во Пол Возраст

ХОЗЛ 230 м-125 ж-105 17-76 лет

Другие заболевания легких 225 м-102 ж-123 17-68 лет

Хронические бронхиты у детей 15 м-8 ж-7 3 мес-2 года

Детские гепатиты и циррозы 216 м-103 ж-113 5-12 лет

Панникулиты 11 м-3 ж-8 22-45 лет

Здоровые 195 м-109 ж-86 20-51 лет

Б) ДНК

Группа К-во Пол Возраст

ХОЗЛ 66 м-30 ж-36 17-76 лет

Другие заболевания легких 35 м-16 ж-20 17-68 лет

Рак легкого 49 м-23 ж-26 42-66 лет

Здоровые 110 м-63 ж-57 20-51 лет

Табл. 2. Виды и количество исследованных обезьян

РОД Вид Кол-во сывороток К-во ДНК

MACACA (Макаки) M. mulatta M. nemestrina M. fascicularis M. arctoides M. assamensis M. fuscata M. sylvanus M. sínica M. nigra 1121 448 234 334 74 13 6 8 1 3 3

CERCOPITHECUS (Мартышки С. aethiops С. pygerythrus С. sabaeus С. mona С. diana С. negléctus 244 104 13Í 3 4 1 1 2

ERYTHROCEBUS (Красные обезьяны) Е. patas 4 4 1

PAPIÓ (Павианы) P.hamadrias Р. рарго P. anubis 230 225 2 3 15

MANDRILLUS (Мандриллы) M. sphynx ' 4 4

THEROPITHECUS (Гелады) T. gèlada 3 3

CERCOCEBUS (Монгобеи) С. torquatus 2 2

HYLOBATES (Гиббоны) H. moloch 1 1

PONGO (Орангутан) P. pygmaeus 1 1

PAN (Шимпанзе) P: troglodytes 6 6 3

Образцы сывороток крови были собраны также от 1616 обезьян 10 родов и 25 видов (табл. 2.).

Сыворотки хранили в замороженном состоянии при температуре ниже -40°С.

.. Обманы ДНК

В работе были использованы образцы ДНК от 261 человека. Распределение данных образцов по нозологическим формам представлено в табл. 1. Кроме того в работе использовались ДНК от 23 обезьян 4 родов (табл. 2).

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови проводили путем экстракции фенолом-хлороформом (Sambrook J. et al., 1989), высоливанием NaCl (Miller S.A. et al., 1987) и с помощью "килекс-100" (chelex-lûO) (Walsh P.S. et al.,1991). ДНК хранили замороженными при температуре ниже 20°С.

Фенотипирование ААТ с помощью изоэлектрофокусирова-ния и иммуноблоттинга

Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) сывороток человека проводили на амфолиновых ПАГ-пластинах рН 4-5; эти же пластины использовались для большинства видов обезьян. Для ААТ мартышек применяли ПАГ-пластины рН 4-6,5.

Иммунологическую идентификацию полос ААТ в геле проводили с помощью иммуноблоттинга. Перенос белка из геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли либо электрофоретически с помощью аппарата "Трансфор" либо методом контактной диффузии (Kamboh M.I. & Ferrell R.E., 1986) с последующим иммунопроявлением с помощью моно-

специфических гипериммунных сывороток или мышиных моноклональных антител против ААТ человека

Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела против ААТ приматов.

Получение гибридом включало иммунизацию мышей линии ВАЬВ/с препаратом очищенного ААТ человека, слияние имунных спленоцитов с клетками миеломной мышиной линией X63-Ag8.653 помощью полиэтиленгликоля 6000, культивирование гибридных клеток и их последующее клонирование. Тестирование культуральной жидкости микрокультур на наличие антител против ААТ приматов осуществляли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием в качестве антигена ААТ человека и павиана. Специфичность отобранных с помощью ИФА положительных клонов дополнительно подтверждали с помощью иммунопроявления полос ААТ человека и обезьян после их переноса из ИЭФ геля на нитроцеллюлозную мембрану. Моноклональность антител подтверждали с помощью электрофореза в агарозном геле. Типирование класса/подкласса тяжелых цепей и типа легких цепей моноклональных антител проводили с помощью реакции иммунодиффузии с использованием соответствующих моноспецифических антисывороток.

Полимеразная цепная реакция (ПИР)

ПЦР проводили на основе приводимого ниже "базово-вого" протокола ПЦР. В ряде тестов, однако в этот протокол вносились модификации, связанные с особенностями нуклео-

тидной последовательности амплифицируемого фрагмента и праймеров.

Базовый протокол ПЦР Реакционная смесь готовилась из расчета, что конечный объем должен составлять 25 мкл. В ее состав входили 10 шМ Трис-HCl (рН 8,3); 50 mM КС1; 1,5 mM MgCl2; 0,001% желатины; 50 дМ каждого дНТФ; 0,4 цМ праймеров; 0,75 единиц Taq полимеразы (Perkin Elmer) и 200-1000 нг геномной ДНК. Термоциклирование включало начальную денатурацию при 94"С в течение 4 мин, 30 трехстадийных циклов денатурации-отжига-элонгации (94°С - ЗОсек; 55°С -30 сек; 72°С - 30 сек) и конечную инкубацию при 72°С в течение 7 мин. Термоциклирование осуществляли в приборе System 9600 (Perkin Elmer).

В случае использования двухстадийного ("nested") протокола ПЦР в качестве матрицы для второй стадии использовалось 0,5 мкл реакционной смеси, полученной в результате первого циклирования.

Прямое определение мутаций.

Диагностика мутаций включала в качестве первой стадии ПЦР-амплификацию соответствующих геномных фрагментов. Наличие мутации тестировалось с помощью электрофоретического анализа размеров либо самого ПЦР продукта либо продуктов его перевара соответствующими рестриктазами. Перевар ПЦР продукта проводили в буфере, оптимальном для каждой рестриктазы.

ПЦР тесты для детекции Ala213/VaI213 и Taql полиморфизмов гена PI были разработаны в данном исследовании. Праймеры для данных тестов были выбраны с помощью программы OLIGO 5.0 (National Biosciences Inc.). на основе нуклеотидной последовательности гена PI и его З'-флан-кирующей области (Accession No. К02212 и Х60765, соответственно, в EMBL и GenBank). Нуклеотидная последовательность праймеров для Ala213/Val213 идентична для человека и обезьян за исключением одного нуклеотида Синтезированный праймер включал оба варианта последовательности.

"Сенс": 5'- TCAGGCAGGAAGAAGATG -3'

"Антисенс": 5'- GGAGAGACCCTTTGA(A/G)GT- 3'

Для анализа Taql полиморфизма было разработано два варианта ПЦР: одностадийный, использующий одну пару праймеров и двухстадийный ("nested"), с использованием двух пар праймеров (наружных и внутренних). Наружный "сенс": 5'-GCTGTCCCTGCAGTCTTAGA-3' Наружный "антисенс": 5'-GTGGAGAGTGAAAGGCTGTC-3' Внутренний "сенс" : 5 '-CTGAATAGCCCCTGTGGTAА-3' . Внутренний "антисенс" : 5-CAGGAGACTTGTGTGGGAAA-3'

Тесты на другие мутации были воспроизведены на основании опубликованных методик. Амплификация фрагмента, включающего сайт мутации 227Рго-»227А1а гена AI CHT, проводилась с помощью праймеров ACHI и АСН2 (Poller W. et al., 1992) Наличие мутации тестировалось с помощью рестриктазы Alul.

Амплификация фрагмента гена CF, включающего сайт делеции AF508/AI507, проводилась с помощью праймеров С16В и C16D (Кегет В. et al., 1979) с последующим анализом ПЦР продукта в полиакриламидном геле.

Детекция наиболее частых мутаций 11 экзона гена CF осуществлялась путем рестрикционного анализа ПЦР продукта, амплифицированного с помощью праймеров М11е-5 и lli-3 (Ng LS. et al, 1991). Для диагностики мутации G542X использовалась рестриктаза EcoRII, для мутации S549N -рестриктаза Ddel, а для мутаций G551D и R553X -рестриктаза HincII (с последующим анализом Mbol).

Детекция мутации W1282X гена CF включала ПЦР с использованием праймеров 20-5' и 20-3' (Zielenski J. et al., 1991) с последующим переваром рестриктазой Mnll.

Фрагмент, содержащий сайт CF мутации 1717-1G->A, амплифицировали с помощью праймеров 1 Ii—5 (Zielensky J. et al., 1991) и M1717 (оригинальный праймер). Наличие мутации определяли с помощью рестриктазы Avail.

Праймеры 4712 и 4713 (Highsmith W.E. et al., 1994), амплифицирующие фрагмент, содержащий сайт CF мутации 3849+lOkb С ->Т были любезно предоставлены д-ром К. Friedman. Тестирование мутации осуществляли с помощью рестриктазы Hphl.

Анализ размеров ПЦР продуктов.

В большинстве случаев для анализа размеров ПЦР продукта использовался электрофорез в 1,5-2,5% агарозном геле. С целью разрешения фрагментов, отличие в размере

которых составляло лишь несколько пар нуклеотидов (п.н.), применялся электрофорез в 12,5% полиакриламидном геле.

Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью метода х2 и точного метода Фишера (Rosner В., 1994).

Компьютерные программы для анализа ДНК.

Поиск нуклеотидных последовательностей в базах данных GenBank и EMBL и их последующий анализ проводились с помощью программ DNASIS 1.1 (Hitachi Software Engineering Inc., LTD) и DNASTAR (Dnastar, Inc.). Для выбора ПЦР праймеров использовалась программа OLIGO 5.0 (National Biosciences Inc.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Дефицитные и полиморфные аллели гена PI при ХОЗЛ и другой патологии человека.

1. Частота наследственного дефицита ААТ среди больных с заболеваниями легких, ювенильной патологией печени и панникулитами.

В данном фрагменте работы частота дефицитных вариантов ААТ была изучена среди 195 здоровых лиц и 697 пациентов из групп "повышенного риска" по дефициту ААТ (470 - ХОЗЛ и другие заболевания легких; 216 - ювенильная патология печени, 11 - панникулиты). Фенотипирование вариантов ААТ проводилось с помощью ИЭФ. Данные о распределении дефицитных фенотипов ААТ в исследованных группах представлены в табл. 3.

Табл. 3. Дефицитные варианты ААТ среди пациентов "групп повышенного риска" и здоровых лиц

Фенотипы Группа (к-во) ZZ MZ (M1Z/M2Z/M3Z) MS (M1S/M2SJ/M3S MI (МП/М31) М1Р

хозл (230) - 5 (4/1*/-) 3 (3/-/-) - 1

Другие 3JI (225) - 1 (-/-/1) 2 (1/-/D - -

ХБ у детей (15) - - - - -

ГШ у детей (216) 3 5 (3/2/-) 3 (2/1/-) 2 (2/-) -

Панникулиты (П) - - - - -

Здоровые (195) - 2 (1/1/-) 2 (2/-/-) 1 (-/1) -

*-данный пациент имел также AF508 мутацию гена CF

Табл. 4. Частоты дефицитных Р1 аллелей среди пациентов "групп повышенного риска"и здоровых лиц.

PI аллели Группа (к-во) Z S I Р

ХОЗЛ (230) 0,0109 0,0065 0 0,0022

Другие ЗЛ (225) 0,0022 0,0044 0 0

ПП у детей (216) 0,0255 0,0069 0,0046 0

Здоровые (195) 0,0051 0,0051 0,0025 0

Среди исследованных образцов были выявлены дефицитные аллели Ъ, Р, 8 и I. ААТ, контролируемый аллелем I, помимо его более анодной позиции в геле имел характерное соотношение интенсивностей основных полос: зона гп4 была значительно сильнее, чем шб (у других Р1 аллелей интенсивность ш4 и тб одинакова). Другой дефицитный вариант, контролируемый аллелем Р, был смещен в сторону катода в сравнении с М2, однако в меньшей степени, чем аллель 8. Кроме того интенсивность его полос была существенно ниже, чем у другого аллеля этого пациента (пациент был гетерозиготой М1Р). Известно несколько подтипов аллеля Р, в частности, Р1о\лге11, Ряат1 а1Ьапй (ГаЬег J.P., 1989), однако из-за отсутствия контрольных сывороток с данными вариантами ААТ, более точно определить подтип наблюдавшегося аллеля Р не представлялось возможным. Частоты дефицитных аллелей в исследованных группах даны в табл. 4.

Варианты ААТ с резко выраженным дефицитом (генотип ЪЪ) присутствовали только в группе детской патологии печени. В других группах дефицитные варианты были представлены нормальными гетерозиготами: дефицитный аллель на одной хромосоме и нормальный аллель М на другой. Эти варианты характеризуются лишь умеренным дефицитом ААТ.

В группе детской патологии печени было выявлено наибольшее число дефицитных вариантов ААТ: 3 гомозиготы 5 гетерозигот МЪ, 3 - М8 и 2 - М1. Все три гомозиготы ЪЪ

имели хронический гепатит с переходом в двух случаях в цирроз печени. Концентрация ААТ в сыворотке этих больных, определенная с помощью радиальной иммунодиффузии по Манчини, составляла лишь 15-20% от нормального уровня. Среди дефицитных аллелей, выявленных у гетерозигот, по-видимому, только Z может рассматриваться как этиологический фактор имеющейся у них патологии печени. Как известно, поражение печени характерно только для тех дефицитных аллелей, при которых мутантный ААТ накапливается в клетках печени (из-за дефекта созревания ААТ не секретируется из клетки). Аллели Б и 1 не относятся к числу таких аллелей. Исходя из этого, можно считать, что в исследованной группе наследственный дефицит ААТ является этиологическим фактором в 3,7% случаев (ZZ -1,4%; ТА2,-2,3%).

Среди больных с заболеваниями легких во всех трех группах было выявлено 6 гетерозигот MZ и 5 гетерозигот МБ, Таким образом, частота гетерозигот составила 3,4% в группе ХОЗЛ и 1,5% среди пациентов с другими заболеваниями легких и в контроле. У больных панникулитами не было обнаружено ни одного дефицитного аллеля Р1. Группа с панникулитами, хотя и насчитывала всего 11 пациентов, была достаточно репрезентативной, учитывая редкость этого заболевания.

Относительная редкость дефицитных вариантов ААТ в группах повышенного риска коррелировала с довольно низкой частотой соответствующих Р1 аллелей в контрольной

группе - частоты всех трех дефицитных аллелей, присутствовавших в этой группе, не достигали уровня полиморф-ности - 0,01. Таким образом, полученные даннные свидетельствуют о значительно меньшей распространенности наследственного дефицита ААТ в России по сравнению со странами Северной Европы, '"эндемичными" по данному генетическому дефекту.

2. Распространенность подтипов аллеля М среди больных ХОЗЛ и здоровых лиц

Основной полиморфизм ААТ связан с наличием подтипов М1, М2 и МЗ. В литераторе имеются сообщения о повышенной частоте фенотипов, формируемых аллелями М2 и МЗ у больных ХОЗЛ (Басис В.Ю., 1989; Черненко В.Ю. и др., 1989; Фридлянд А.К. и др., 1991; СетЫ1экауа Т.Е. е1 а1., 1991). Поскольку ни М2 ни МЗ не являются дефицитными аллелями, эти данные предполагают существование нового, пока неизвестного, механизма ассоциации ХОЗЛ с какими-то недефицитными гаплотипами Р1 локуса. В данном разделе работы были проанализированы частоты подтипов М среди 184 больных ХОЗЛ и 168 контрольных лиц. Меньшее число исследованных случаев в сравнении с предшествующим разделом данной работы связано с тем, что для данного анализа были использованы только те ИЭФ гели, на которых подтипы М были четко различимы. Распределение фенотипов ААТ в обеих исследованных группах приведены в табл. 5. Частоты подтипов аллеля М, расчитанные только среди

Табл. 5. Фенотипы ААТ среди пациентов с ХОЗЛ и контрольных лиц.

ХОЗЛ (184 ) Контроль (168)

М1 99 101

М2 8 4

МЗ 2 0

мигд^.Р) 9 4

М2 (г^д^Р) 2 1

мз(гд1,гд») 0 1

М1М2 45 43

М1МЗ 15 13

М2МЗ 4 1

Табл. 6. Частоты подтипов аллеля М среди пациентов с ХОЗЛ и контрольных лиц

Все аллели Исключая (2,3,1,Г,Р)

ХОЗЛ Контроль ХОЗЛ Контроль

368 хром. 336 хром. 357 хром. 330 хром.

М1 0,7255 0,7798 0,7479 0,7939

М2 0,1821 0,1577 0,1877 0,1606

МЗ 0,0625 0,0446 0,0644 0,0455

(гд^.р) 0,0299 0,0179

хромосом, несущих аллель М, даны в табл. 6. Статистический анализ этих данных на основе метода X2 показал, что различие в частотах фенотипов М2, МЗ, М2МЗ между группой больных ХОЗЛ и контролем не является статистически достоверным как для каждого из этих вариантов, так и их суммарного значения. Таким образом, полученные результаты не подтверждают наличия ассоциации между ХОЗЛ и фенотипами М2, МЗ и М2МЗ.

3. Изучение полиморфизма А1а213->Уа1213 у больных ХОЗЛ и здоровых лиц.

В кодирующей области гена Р1 (экзон III) имеется полиморфный сайт, связанный с заменой С—»Т. В результате аминокислотная последовательность ААТ может иметь в позиции 213 либо аланин (А1а213) либо валин (Уа1213) (1*}ик1\¥а Т. е1 а1., 1987). Данная аминокислотная замена не приводит к изменению подвижности ААТ при ИЭФ и поэтому изучение данного полиморфизма, практически, возможно только на уровне ДНК. Известно, что подтипы М2 и МЗ связаны только с гаплотипом Уа1213, однако подтип М1 -подразделяется на два варианта М1(Уа1213) и М1(А1а213). Для изучения ассоциации данного полиморфизма с ХОЗЛ представлялось целесообразным использовать только хромосомы с субтипом М1, поскольку таким образом исключалось возможное влияние других геномных отличий (например замен, определяющих подтипы М2 и МЗ) .

В данном фрагменте работы проводилась детекция аллелей М1(Уа1213) и М1(А1а213) у 40 пациентов с ХОЗЛ и

40 здоровых лиц. В каждую группу были включены 25 лиц с фенотипом М1 и 15 с фенотипом М1М2. Таким образом количество исследованых хромосом с аллелем М1 составляло 65 для каждой группы.

Детекция данного полиморфизма проводилась с помощью ПЦР с последующим переваром фрагмента ретриктазой В51ЕН. Амплифицируемый фрагмент имеет размер 186 п.н. В случае аллеля Уа1213 данный фрагмент при Вв1ЕИ переваре разрезается на два фрагмента (55 п.н. и 121 п.н.), тогда как в случае А1а213 его размер остается неизменным. Соответственно гомозигота по А1а213 характеризуется одной полосой 186 п.н., а гомозигота по Уа1213 двумя - 55 п.н. и 121 п.н. Гетерозиготы А1а213/Уа1213 имеют все три полосы - 55 п.н., 121 п.н. и 186 п.н. При анализе гетерозигот М1М2 гаплотип аллеля М1 определяется как А1а213, если наблюдается генотип А1а213/Уа1213 или УаШЗ в случае генотипа УаШЗ/УаШЗ (аллель М2 сцеплен только с Уа1213). Данные о генотипах г; • данному полиморфному сайту, наблюдавшихся среди исследованных пациентов с ХОЗЛ и контрольных лиц, представлены в табл. 7. Расчитанные на основании этих данных частоты аллелей А1а213 и Уа1213 приведены в табл. 8.

Частоты аллелей А1а213 и Уа1213 в отечественной популяции оказались близки к ранее опубликованным данным для лиц европейского происхождения: М1(Уа1213) -68%; и М1(А1а213) - 32% (Ии^а Т. еЬ а!., 1987). Анализ распределения аллелей А1а213 и УаШЗ у больных ХОЗЛ и в

Табл. 7. Генотипы по полиморфному сайту А1а213/\га1213 у больных ХОЗЛ и здоровых лиц

Генотип Группа ХОЗЛ Группа контроля

М1 (25 чел.) М1М2 (15 чел.) М1 (25 чел.) М1М2 (15 чел.)

А1а213/А1а213 3 - 4 -

Уа1213/Уа1213 15 9 12 10

А1а213/Уа1213 7 6 9 5

Табл. 8. Распределение аллелей А1а213 и Уа1213 среди больных ХОЗЛ и контрольных лиц

Аллель ХОЗЛ (65 хром.) Контроль (65 хром.)

А1а213 19 (29%) 22 (34%)

Уа1213 46 (71%) 43 (66%)

Всего 65 (100%) 65 (100%)

контроле; не выявил статистически значимых отличий между этими группами. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии ассоциации между ХОЗЛ и полиморфизмом А1а213 ->Уа1213.

Наличие двух полиморфных аллелей А1а213 и Уа1213 ставит вопрос о том, какой из этих аллелей является пред-ковым. Было возможно предположить, что им является аллель А1а213, поскольку именно этот вариант был выявлен при сиквенировании кДНК павиана (КигасЫ К. е1 а1., 1981). Однака, эта гипотеза основывалась на исследовании единственной обезьяны. Поэтому представлялось целесообразным проанализировать А1а213/Уа1213 сайт на большем числе обезьян, принадлежащим к разным родам. В данной работе такой анализ был проведен на образцах ДНК от 15 павианов, 3 макак, 2 зеленых мартышек и 3 шимпанзе. Детекция ал-леля проводилась с помощью того же теста (ПЦР с последующим переваром рестриктазой Вз1ЕП), который использовался для анализа данного полиморфизма у человека. Амплификация была успешной у всех обезьян за исключением ма14ак. Амплифицировавшийся фрагмент обезьян имел тот же размер, что и у человека. После перевара рестриктазой В51ЕП размер фрагмента не менялся. Таким образом, полученные данные подтверждают, что аллель А1а213 эволюциошш является более древним, чем аллель Уа1213.

Hind III и TaqI полиморфизм в З'-фланкирующей области

гена PI у больных ХОЗЛ и в контроле. 1. HindHI полиморфизм.

За пределами кодирующей последовательности гена PI (3'-фланкирующая область) был описан полиморфный сайт, связанный с утратой сайта для рестриктазы HindHI, причем данный полиморфизм встречался достоверно чаще среди пациентов с ХОЗЛ, чем в контроле (Buraczynska М. et al., 1987; Kalsheker N.A. & Watkins G.L., 1988). К сожалению нуклеотидная последовательность данной геномной области была неизвестена и поэто.му в настоящем исследовании изучение данного полиморфизма было возможно провести только с помощью саузерн-блоттинга. Это исследование включало 30 больных ХОЗЛ и 30 здоровых лиц. В соответствии с рестриктной картой гена PI зонд рб.5 должен выявлять два фрагмента: 6.4т.п.н. (включающий экзоны II и III) и 2.8т.п.н. (включающий экзоны IV и V, а также 3' фланкирующую область). Во всех исследованных образцах эти два фрагмента присутствовали в виде интенсивных полос. Помимо последних наблюдалось также несколько слабых полос, которые, по-видимому, были результатом гибридизации зонда с гомологичными учатками Pi-like гена. Ни в одном случае не обнаруживалось полосы, соответствовавшей утрате HindHI сайта. Это предполагает редкость HindHI полимофизма в популяции, однако следует иметь в виду, что отрицательный результат, в какой-то степени, может быть

связан и со сравнительно небольшим числом исследованных лиц.

2. Тад! полиморфизм в З'-фланкирующей области гена Р1.

Другой полиморный аллель в З'-фланкирующей области гена Р1, повышенная частота которого также обнаруживалась среди больных ХОЗЛ, связан с утратой сайта для рестриктазы Тад1 (Ка^Ьекег КА. е1 а1., 1987; 1990). Поскольку нуклеотидная последовательность данной геномной области была известна, то в настоящем исследовании детекция Тад1 полиморфизма проводилось с помощью специально разработанной для этой цели одно- или двух- стадийной ПЦР с последующим переваром Тад1. Данный подход был использован для анализа образцов ДНК от 147 пациентов с заболеваниями легких (ХОЗЛ - 66, рак легкого - 49, другие заболевания органов дыхания - 32) и 110 здоровых лиц.

При двухстадийной ПЦР наружные праймеры позволяют амплифицировать фрагмент длиной 435 п.н., который служит матрицей для второй стадии. Для второй стадии амплификации, также как и в одностадийном варианте ПЦР, использовалась пара внутренних праймеров, позволяющих амплифицировать фрагмент длиной 337 п.н. Двухстадийная ПЦР применялась для анализа тех образцов ДНК, которые при одностадийном варианте давали очень низкий выход ПЦР продукта. ДНК последовательность "дикого-типа" содержит Тад1 сайт и данная рестриктаза разрезает фрагмент длиной 337 п.н. на два субфрагмента, длины которых -251 п.н. и 86 п.н. В случае аллеля Тад!-, данный сайт утрачен

и фрагмент длиной 337 п.н. остается интактным. Гетеро-зиготы TaqI-/TaqI+ характеризуются, соответственно, наличием всех трех фрагментов - 337 п.н., 251 п.н. и 86 п.н.

Среди 257 исследованных лиц было выявило 24 индивидуума гетерозиготных по полиморфному TaqI аллелю. Гомозиготы по данному аллелю отсутствовали. Данные о частоте TaqI полиморфизма в контрольной группе и среди пациентов с различными формами заболеваний легких приведены в табл. 9.

Частота TaqI полиморфизма повышена в сравнении с контролем в группах больных ХОЗЛ и раком легкого. Однако, статистический анализ, проведенный с помощью метода х2> показал, что статистически достоверное различие с контролем имеется только для группы больных ХОЗЛ. Повышение частоты полиморфизма в группе больных с раком легкого не является статистически достоверным. Однако следует отметить что значение X2 в этом случае довольно близко к порогу статистической достоверности при р<0,05. Данный порог составляет 3,841, тогда как значение X2 для групп "рак легкого-контроль" равно 3,54. Для сравнения, аналогичный показатель для групп "другие заболевания легких-контроль" равен лишь 0,31.

Таким образом, полученные данные указывают, что TaqI полиморный аллель присутствует в популяции и его частота достоверно повышена среди отечественных больных ХОЗЛ.

Табл. 9. Частота TaqI полиморфизма среди пациентов с различными формами заболеваний легких и в контроле

хозл Рак легкого Другая патология Здоровые

10/66 (15,15 %) 7/49 (14,28 %) 1/32 3,12 % 6/110 5,45 %

Табл. 10. Частота Та91 полиморфизма в разных популяциях.

Популяция Аллель Россияне Арабы Британцы (КаЬЬекег et а!., 1987) Канадцы (Сох еЬ а!., 1987

Тач1+ 0.972 0.765 0.975 0.97

Тая1- 0.027 0.235 0.025 0.03

3. Популяиионный анализ Тад! полиморфизма и детекция "предкового" аллеля.

Аллельные частоты многих генов могут существенно варьировать в разных этнических группах. Имевшиеся данные о частотах Тад1 полиморфизма, фактически, ограничивались двумя странами - Великобританией и Канадой (в последней, только среди потомков европейцев) (КаЬЬекег Ы.А. е1 а1., 1987; Сох БЖ е1 а!., 1987). В настоящем исследовании частота Тад1 полиморфного аллеля была изучена среди россиян, а также кувейтских арабов (табл. 10). Среди арабов помимо гетерозиготных вариантов наблюдались и гомозиготы по TaqI полимерному аллелю.

Полученные данные показывают, что частота Тая1-аллеля среди россиян близка к частотам наблюдаемых у европецев (или их потомков), однако у арабов она почти в 10 раз выше.

Представлялось интересным изучить какой из двух аллелей Тая I сайта является "предковым". С этой целью, были исследованы образцы ДНК, полученные от двух шимпанзе -обезьян, филогенетически наиболее близких к человеку. Анализ проводился с помощью той же ПЦР, которая была разработана для ДНК человека (включая праймеры с "человеческой" последовательностью). Данная система оказалась эффективной и в отношении ДНК шимпанзе. Однако в последнем случае в дополнении к основной полосе ампли-фицировался также и неспецифический фрагмент (слабой интенсивности и меньшего размера). Основной фрагмент у

шимпанзе имел тот же размер, что и его человеческий аналог. После инкубации с рестриктазой Taql основной фрагмент шимпанзе разрезался на два субфрагмента, размеры которых соответствовали аллелю "дикого-тшта"человека. Таким образом, можно считать, что аллель "дикого-типа" является древним, а аллель Taql- возник уже в ходе эволюции человека.

Сравнительное изучепие PI системы приматов.

Сравнительное изучение генетических вариантов ААТ у различных родов и видов приматов проводилось с помощью ИЭФ в полиакриламидном геле. Для идентификация полос ААТ использовался иммуноблоттинг. Среди 1698 исследованных обезьян 10 родов и 23 видов было идентифицировано 43 обезьяньих PI аллеля (табл. 11). По отношению к варианту M ААТ человека имелись более анодные варианты (Р. hamadryas, T. gelada, M. fascicularis), более катодные (С. diana, Е. patas.) и варианты с изоточкой близкой к таковой у M (P. troglodytes, P. pygmaeus).

ААТ обезьян, также как и его аналог у человека, характеризовался негенетический микрогетерогенностью, т.е. наличием нескольких вариантов этого белка, имеющих идентичную аминокислотную последовательность, но отличающихся по изоточкам. Последнее связано с различными типами гликозилирования. Картина микрогетерогенности, выявляемая при ИЭФ ААТ человека и шимпанзе была идентична: две основные полосы (т4 и шб) примерно равной интенсивности и несколько полос значительно меньшей

Табл. 11. Количество Р1 аллелей, выявленных у обезьян разных родов и видов.

РОД (тривиальное наименование) Вид Кол-во обезьян Кол-во аллелей

МАСАСА (Макаки) 1121 18

M. mulatta 448 3

M. nemestrina 234 11

M. fascicularis 334 5

M. arctoides 74 1

M. assamensis 13 3

M. fuscata 6 1

M. sylvanus 8 1

M. sinica 1 1

M. nigra 3 2

CERCOPITIIECUS (Мартышки) 244 14

С. aethiops 104 5

С. pygerythrus 131 8

С. sabaeus 3 2

С. топа 4 2

С. diana 1 2

С. neglectus 1 1

ERYTHROCEBUS (Красные обезьяны) E.patas 4 2

РАРЮ (Павианы)P.hamadryas, рарг'о, anubis 230 1

MANDRILLUS (Мандриллы) M. sphynx 4 2

THEROPITHECUS (Гелады) T. gelada 3 2

СERCOCEBUS (Монгобеи) С. torquatus 2 1

HYLOBATES (Гиббоны) H. moloch 1 1

PONGO (Орангутан) P. pygmaeus 1 1

PAN (Шимпанзе) P. troglodytes 6 1

интенсивности. Однако у всех других обезьян (включая других антропоидов - орангутана и гиббона) картина была иной: одна основная и несколько минорных полос.

Поскольку многие роды и виды были представлены единичными образцами, изучение генетического полиморфизма ААТ внутри данных таксонов могло быть проведено лишь для макак, зеленых мартышек и павианов. Разные роды обезьян не имели как общих фенотипов ААТ, так и, за одним исключением, общих Р1 аллелей. Исключение представлял аллель, наблюдавшийся как у М. вркупх так и у Т. де1ас1а. Все остальные Р1 аллели обезьян были специфичными для рода, а некоторые и для вида. Следует отметить, что имеется значительное сходство ААТ щимпанзе и человека, которые однако были различимы при высоком разрешении ИЭФ геля (обезьянья полоса располагалась между М1 и МЗ вариантами ААТ человека). Таким образом, все генетические варианты ААТ обезьян, выявленные с помощью ИЭФ, были отличны от аллелей Р1-системы человека.

Получение мопоклопальпых антител против ААТ

После слияния спленоцитов мыши, иммунизированной ААТ человека, и клеток плазмоцитомы было "посажено" 480 микрокультур. В культуральной жидкости 28 из них (5,8%) были обнаружены антитела, реагирующие с ААТ человека и павиана. Данные микрокультуры были подвергнуты трем последовательным циклам клонирования, в результате которых было получено 13 независимых гибридом, продуцирующих моноклональные антитела против ААТ приматов. Специ-

фичнбсть этих моноклоналывых антител была подтверждена с помощью иммунопроявления полос ААТ человека и обезьян после их переноса из ИЭФ геля на нитроцеллюлозную мембрану.

Моноклональность антител в асцитах мышей инокули-рованных гибридомами была подтверждена с помощью электрофореза в агарозном геле, который выявил характерный для моноклональных иммуноглобулинов тип электро-форетической подвижности - единичную полосу с четкими границами в отличии от диффузной зоны, характерной для поликлональных иммуноглобулинов. Девять гибридом продуцировали моноклональные антитела подкласса IgGl, четыре гибридомы - подкласса IgG2a. Моноклональность антител была дополнительно подтверждена наличием у них только одного из двух типов легких цепей - либо к, либо X.

Полученные гибридомы были депонированы в бывшей Всесоюзной коллекции клеточных культур. Гибридома, продуцировавшая наиболее высокоаффинные моноклональные антитела против ААТ приматов, была защищена авторским свидетельствам N 1756352 (Самильчук Е.И. и др., 1992).

Изучение распространенности мутации 227Рго->227А1а в гене А1СНТ при ХОЗЛ и других заболеваниях легких.

Мутация 227Рго->227А1а в гене А1СНТ была описана у больного с выраженным дефицитом альфа-1-антихимо-трипсина (Poller W. et al., 1992). Особый интерес вызывало то обстоятельство, что данная мутация была обнаружена у 4%

пациентов с ХОЗЛ. С учетом существенных отличий, наблюдаемых в частотах мутаций в различных популяциях, представлялось важным изучить насколько часто мутация 227Рго-»227А1а встречается у отечественных больных ХОЗЛ. В данной работе на наличие мутации 227Рго—>227А1а были исследованы 102 пациента (66 с ХОЗЛ и 36 с другой патологией органов дыхания).

Детекция мутации 227Рго-»227А1а основывалась на ПЦР-амплификации фрагмента гена А1СНТ с последующим переваром ПЦР продукта с помощью рестриктазы Alul (мутация создает дополнительный Alul сайт).

Ни в одном из 102 образов ДНК, исследованных в данной работе, мутация 227Рго-»227А1а обнаружена не была.

Детекция CF мутаций у больных ХОЗЛ

Из многочисленных мутаций гена CF в данном исследовании определялись AF508/AI507, G542X, G551D, W1282X, R553X, 1717-lG-yA, S549N/I, относящиеся к числу наиболее распространенных (Zielenski J. & Tsui L.C., 1995). Некоторые образцы тестировались также на наличие мутации 3849+10kb С-УГ, необычность которой состоит в ее ассоциации с пороговым или даже нормальным значением потового теста (Highsmith W.E. et al., 1994).

Тестирование на AF508/AI507 было проведено у 66 больных ХОЗЛ, 35 больных с заболеваниями органов^ дыхания не относящимися к ХОЗЛ и 35 здоровых лиц. PCR фрагмент, амплифицированный с помощью праймеров С16В и C16D, имеет размер 98 п.н. в случае нормального гена CF

или 95 п.н. в случае мутации АГ508. У гетерозигот наблюдаются оба фрагмента, а также гетеродуплексы. Сходная картина характерна и для мутации Д1507, однако формируемые гетеродуплексы отличны от таковых при ДГ508. Данные о распространенности мутации ДГ508 в исследуемых группах приведены в табл. 12. Мутация ДГ508 отсутствовала у здоровых лиц, а также пациентов с заболеваниями легких не относящихся к ХОЗЛ. В группе больных с ХОЗЛ гетерозиготность по данной мутации была выявлена у 4 лиц.

Таким образом частота гетерозигот по ДГ508 в группе ХОЗЛ (1:16.5) более чем в в два раза превышала таковую в обеих контрольных группах (< 1:35). Эта различие, однако, не достигает уровня статистической значимости. Значение Х2> расчитанное при сравнении группы ХОЗЛ и контроля, составило лишь 2,24 (пороговое значение при р<0,05 равно 3,841). Однако, в случае объединения двух контрольных групп (частота гетерозигот в этом случае < 1:70), результат сравнения группы ХОЗЛ и объединенного контроля является статистически значимым (Х2=4,371 р<0,05). Такое объединение двух групп представляется оправданным, поскольку снижение частоты мутации ДР508 ниже популяционного уровня в группе больных с заболеваниями органов дыхания, отличных от ХОЗЛ, маловероятно. Таким образом, отмечается тенденция к увеличению частоты гетерозигот по Д1Г508 у больных ХОЗЛ, хотя вопрос о достоверности этой тенденции не может быть проинтерпретирован однозначно.

Табл. 12. Распределение мутации ЛЕ508 в исследованных группах

Группа Количество исследованных лиц ! Количество носителей мутации ДЕ508

хозл 66 4

Другие заболевания легких 35 0

Здоровый контроль 35' .; . . 0.

Табл. 13. Данные о пациентах, гетерозиготных по мутации ДЕ508

Пациент Пол Возраст ХОЗЛ с возраста ААТ Семейный анамнез

1. (Е.Л.) муж. 17 1 года шъ не отягощен

2. (О.В.) жен. 26 16 лет М1М2 не отягощен

3. (А.Г.) муж. .72 17 лет (связывает с ранением в легкое) М1 Мягкая форма МВ у внучки

4. (Н.Г.) муж. 56 19 лет М1 не отягощен

Анализ ДНК от 66 пациентов с ХОЗЛ на наличие мутаций G542X, S549N, G551D/I, R553X, W1282X, 1717-1G—»А не выявил ни одного положительного случая. Также не была обнаружена и мутация 3849+1 Okb С-»Т. Тестирование на эту мутацию было проведено у 10 пациентов с ХОЗЛ, включая четверых носителей AF508.

Хотя все четыре гетерозиготы по AF508 были отрицательны в тестах на другие CF мутаций, не исключена возможность того, что эти пациенты являются составными гетерозиготами. Однако, против наличия второй CF мутации у исследованных AF508 гетерозигот косвенно свидетельствуют следующие данные: отсутствие проявлений со стороны поджелудочной железы; нормальный лотовый тест во всех трех исследованных случаях; фертильность, по крайней мере, у трех пациентов (табл. 13). Как интерпретировать эти случаи - как ХОЗЛ или MB? В настоящее время однозначного ответа на этот вопрос нет и диагноз определяется субъективной оценкой всей совокупности клинических и лабораторных данных конкретным исследователем. Несомненно, однако, что клинические проявления мутаций гена CF со стороны органов дыхания не сводятся лишь к классической картине MB. Дополнительным подтверждением этому является недавнее обнаружение CF мутаций у больных с диссеминированными бронхоэктазами (Pignatti P. et al., 1996) и бронхо-легочным аспергиллезом (Miller P. et al, 1996).

ВЫВОДЫ

1. Наследственный дефицит ААТ встречается у 3,7% (ZZ - 1,4%; MZ - 2,3%) больных ювенильной патологией печени и 3,5% (MZ - 2,2%; MS - 1,3%) больных ХОЗЛ. Распространенность наследственного дефицита ААТ в России существенно ниже, чем в странах Северной Европы, эндемичных по данному заболеванию.

2. Частота аллеля Taql- в 3'-фланкирующей области гена PI достоверно повышена у больных ХОЗЛ. Имеется тенденция к повышению частоты этого аллеля у больных раком легкого. Данный Полиморфизм является маркером предрасположенности к ХОЗЛ.

3. Частоты Ala213/Val213 полиморфизма и фенотипов, формируемых аллелями М2 и МЗ гена PI, не отличаются у больных ХОЗЛ и здоровых лиц, что указывает на отсутствие ассоциации этих маркеров с ХОЗЛ.

4. Мутация 227Рго->227А1а в гене альфа-1^антихимо-трипсина не играет существенной роли в заболеваемости ХОЗЛ в России.

5. Лишь одна (AF508) из 9 наиболее распространенных мутаций гена CF (AF508, AI507, G542X, G551D, W1282X, R553X, 1717-1G-»A, S549N/I, 3849+lOkb С-»Т) обнаруживается у больных ХОЗЛ. Наличие гетерозиготности по AF508 у 6% больных указывает на возможное участие гена CF в этиопатогенезе некоторых случаев ХОЗЛ.

6. Частоты 42 идентифицированных аллелей Р1-систе-мы обезьян существенно варьируют у разных видов. Ряд аллелей является видоспецифическими. Все Р1 аллели обезьян, выявляемые с помощью ИЭФ, отличны от таковых у человека. Предковыми аллелями полиморфизмов А1а213/ Уа1213 и Тая1 являются А1а213 и Тач-.

7. Моноклональные антитела, продуцируемые полученной гибридомой, специфичны против общего эпитопа ААТ человека и обезьян.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАВОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Самильчук Е.И.

Сравнительная характеристика системы ингибитора протеаз у обезьян Старого Света // Материалы международного симпозиума "Прогресс в медицинской приматологии"; Сухуми. - 1987,- стр. 76-77.

2. Самильчук Е.И

Генетический полиморфизм альфа-1 -антитрипсина и верификация родословных в питомниках обезьян // Материалы Всесоюзной конференции "Стандартизация лабораторных моделей на животных"; М,- 1987.-стр. 20.

3. Самильчук Е.И., Лапин Б.А.

Изучение генетического полиморфизма а!-антитрипсина зеленых мартышек с помощью изоэлектрофокусирования и семейного анализа //Генетика.-1988.- N 8.-стр. 1402-1410.

4. Самильчук Е.И.

Система ингибитора протеаз макак. Идентификация аллелей с помощь, изоэлектрофокусирования и семейного анализа// Журнал общей биологии. - 1989. - том 50.- стр. 417-422.

5. Самильчук Е.И, Алымбаев Э.Ш.

Наследственный дефицит альфа-1-антитрипсина у детей с патологией печени //Материалы симпозиума "Проблемы изучения наследственности человека на уровне белковых продуктов генной экспрессии"; М.- 1989.- стр. 63,.

6. Самильчук Е.И., Лапин Б.А.

Наследственный дефицит al-антитрипсина: клинические проявления, методы диагностики, перспективы лечения // Терапевтический Архив. 1988.- N7.- стр. 141-144.

7. Чистова Л.В., Самильчук Е.И., Алымбаев Э.Ш.

Случай хронического гепатита с переходом в цирроз печени у ребенка с наследственным дефицитом альфа-антитрипсина // Педиатрия.- 1990,- N1.- стр. 88-90.

8. Самильчук Е.И., Сарсания Ж.Ш., Хаджирисян М.Л. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для получения моиоклональных антител к общей антигенной детерминанте альфа-1-антитрипсина человнка и обезьян // Авторское свидетельство N1756352 (бюллетень N31, 1992).

9. Самильчук Е.И., Чучалин А.Г.

Снижение синтеза эндогенного альфа-1-антитрипсина после переливания плазмы крови гетерозиготе MZ с первичной эмфиземой легких // Пульмонология.- 1992.- приложение 4.-стр.-868.

10. Самильчук Е.И.

Генная терапия наследственных заболеваний человека // Пульмонология.- 1993,- N2,- стр. 311-315.

11. Чучалин А.Г., Самильчук Е.И.

Муковисцидоз - состояние проблемы // Терапевтический Архив.- 1993,- N3.- стр. 3-9.

12. Самильчук Е.И., Чучалин А.Г.

Гетерозиготность по мутации AF508 гена муковисцидоза среди больных с хронической обструктивиой патологией органов дыхания // Пульмонология.- 1994,- N3.- стр. 47-50.

13. Чучалин А.Г., Кронина Л. А., Воронина JI.M., Самильчук Е.И. Случай сочетания муковисцидоза с дефицитом альфа-1-антитрипсина //Пульмонология.-1994,- N3,- стр. 82-84.

14. Самильчук Е.И., Гаспарян А.В., Лактионов К.К. , Чучалин А.Г. TaqI полиморфизм в З'фланкирующей области гена PI при хронической патологии органов дыхания и раке легкого // Пульмонология.- 1996.- N4.- стр. 17-21.

15. Samilchuk E.I., Chuchalin A.G.

Mis-sense mutation of alfal-antichymotrypsin gene (Pro227_ Ala) is not found in Russian patients with chronic obstructive pulmonary disease //The Lancet.-1993.- v. 342ii.-p. 624.

16. Samilchuk E.I., Sarsaniya S.

Genetic polymorphism of alpha-1-antitrypsin in macaque species // Primates.- 1994,- v. 35.-p. 353-360.

17. Samilchuk E.I.

Genetic polymorphism of alpha-1-antitrypsin correlates with a classification of African green monkeys // Primares.- 1996.-v. 37,- p. 57-63.

18. Samilchuk, D'Souza В., Voevodin A., Chuchalin A., Al-Awadi S. TaqI polymorphism in the 3' flanking region of the PI gene among Kuwaiti Arabs and Russians // Disease Markers.- 1997,-v. 13,- p. 87-92.

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Подп. к печати 2 8. 5". Заказ

Тираж ^ 00