Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Иммунологическое обеспечение аллогенных трансплантаций костного мозга и почки

РГ6 од

На правах рукописи

1 з ШОН 19В5

Бубнова Людмила Николаевна

ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ АЛЛОГЕННЫХ ТРАНСПЛАНТАЦИЙ КОСТНОГО МОЗГА И ПОЧКИ

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии

Научные консультанты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук

профессор К.М.Абдулкадыров доктор биологических наук профессор С.А.Кетлинский

Официальные оппоненты:

чл.-корр. АЕН РФ, доктор биологических наук профессор Ю.М.Зарецкая академик АМН РФ, доктор медицинских наук профессор В.А.Алмазов ' доктор медицинских наук

профессор И.ГМуткевич

Ведущая организация - Военно-медицинская академия

Зашита состоится " "__ 1995 г.

на заседании диссертационного совета Д084Д9.01 при Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии;

/193024, Санкт-Петербург, 2-я Советская ул., д.16/ С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан " "_1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

старший научный сотрудник В.С.Быков

Актуальность проблемы.

Достижения трансплантационной иммунологии последних десятилетий превратили пересадки аллогенных органов из экспериментального в лечебный метод, позволяющий добиваться спасения жизни и восстановления трудоспособности многих тысяч больных ежегодно. Так, по данным на 7.12.1994 /G.Opelz, 1994/ было выполнено трансплантаций: почек - 134573; сердца - 15507; печени -6382.

В нашей стране научные разработки и организационные мероприятия, связанные с проблемами трансплантологии, также занимали значительное место - течение последних десятилетий. Становление и развитие этого раздела медицины связано прежде всего с именами Б.В.Петровского, В.И.Шумакова, Р.В.Петрова, Ю.М.Зарецкой, К.М.Абдулкадырова, В.Н.Шабалина, Л .Д.Серовой, В.И.Говалло и других.

Однако, в настоящее время возникли новые проблемы, решение которых необходимо для дальнейшего развития этого направления медицины.

Важнейшей из них является определение эффективности различных методов воздействия на трансплантационный иммунитет при аллогенных пересадках органов и тканей в клинике.

Как . известно, из трех основных методов преодоления иммунологического барьера ' при аллогенной трансплантации: иммунологического подбора, иммунодепрессии и создания иммунологической толерантности, - в настоящее время широкое практическое применение нашли лишь первые два.

Появление в последние годы высокоэффективных препаратов иммуносупрессивного действия, таких как сандиммун /циклоспорин А/, ОКТ-3 /антитела к Т-клеточным реиегггорам/ привело в глазах некоторых клиницистов к снижению значения иммунологического подбора для успешного функционирования аллогенного трансплантата /Middlton Р., 1991; Zmijewski С., 1991/, вплоть до предложения отменить законодательно закрепленную в настоящее время за рубежом систему, предусматривающую очередность трансплантации поступающих донорских органов в соответствии со степенью совместимости по антигенам HLA донора и реципиента /Matas А., 1991/.

Это побудило организации Евротранспланта, занимающиеся иммунологическим типированием, начать широкое международное исследование, посвященное роли подбора по различным иммунологическим параметрам для успешного функционирования аллогенного трансплантата, на современном этапе.

Указанную проблему пытаются разрешить участники научного исследования Collaborative Transplant Stady /CTS/, в котором сотрудничают 102 иммунологические лаборатории из различных стран мира.

Длительное эффективное существование трансплантированного органа возможно только при осуществлении постоянного контроля за его функцией, дающего возможность прогнозирования и предупреждения отторжения трансплантата, а в случае пересадки костного мозга и болезни "трансплантат против хозяина". Разработка новых эффективных методов мониторинга функционирования трансплантата стала еще одной важной научной задачей трансплантационной иммунологии.

В настоящее время коренному пересмотру подвергается сама методика иммунологического типирования, поскольку классическое серологическое типирование не удовлетворяет исследователей, особенно при идентификации антигенов HLA 2 класса /Scherer et al, 1993; SchreuderG., 1993/.

Основными направлениями иммуногенетического типирования доноров и реципиентов является разработка и клиническое применение новых методов гистотипирования, позволяющих с большей точностью идентифицировать трансплантационные антигены. Таким условиям «отвечают ДНК-типирование и использование моноклональных антител, направленных против HLA-детерминант. Указанным вопросам были посвяшены последние научные совещания как Американской /ASHI, Финикс, 1993/, так и Европейской /EFI, Страссбург, 1994/ ассоциаций иммуногенетиков.

Актуальным аспектом иммунологического подбора, особенно при аллогенной трансплантации костного мозга, является наличие достаточного количества типированных доноров, без чего выявление фенотипически идентичного неродственного донора становится практически невозможным. Показателем важности этой проблемы является внесение в Сенат США законопроекта "Об улучшении трансплантаций", где представлены законодательные основы создания регистра доноров костного мозга /Kennedy et al, 1991/.

Научные и организационные вопросы по этой проблеме разрабатываются и в нашей стране, поскольку успешный подбор донора для аллогенной трансплантации невозможен без наличия или регистра типированных доноров при трансплантации костного мозга, или "листа ожидания" реципиентов при трансплантации почки.

Работы по созданию таких регистров и объединению их в международном масштабе интенсивно проводятся в настоящее время во всем мире.

В нашей стране в течение последних десятилетий трансплантология активно развивалась: увеличивалось число трансплантационных центров, внедрялись трансплантации костного мозга, легких, печени.

Несмотря на это, число аллогенных трансплантаций и их эффективность ешо значительно уступают зарубежным результатам, что диктует необходимость интенсификации научных исследований в данном направлении.

Научные задачи лаборатории иммуногематологии Российского НИИ гематологии и трансфузиологин обусловлены тем, что, с одной стороны, она является центром, где проводится скрининг типируюших реагентов, поступающих из зональных центров России, и формирование отечественной типирующей панели, а с другой стороны, она участвует в проведении иммунологического подбора и иммуномониторинга при трансплантациях костного мозга, проводимых в гематологической клинике института, а ранее и трансплантациях почки в Санкт-Петербургском центре трансплантации, почки. Это позволяет проводить анализ всех этапов проведения аллогенных трансплантаций и дает возможность своевременно вносить коррективы.

Цель работы;

на основании комплексного исследования влияния иммунологического подбора на результаты аллогенных трансплантаций костного мозга и почки и сравнительного изучения различных видов иммунологического типирования и мониторинга провести углубленный анализ состояния иммунологического обеспечения аллогенных трансплантаций и разработать комплекс мероприятий, повышающих эффективность этого лечебного метода.

Для выполнения указанной цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Провести сравнительное изучение иммунологического обеспечения трансплантаций аллогенной почки в Санкт-Петербурском центре и в аналогичных центрах Евротранспланта.

2. Определить значимость различных параметров иммунологического . подбора для приживления аллогенного трансплантата и опасности возникновения болезни "трансплантат против хозяина" при применении современных иммунодепрессантов.

3. Изучить возможность использования системы медиаторов иммунитета - цитокинов для прогнозирования отторжения аллогенного трансплантата и возникновения болезни "трансплантат против хозяина".

4. Изучить закономерности восстановления иммунологической реактивности реципиента после трансплантации аллогенного костного мозга и возможность использования их для прогнозирования посттрансплантационных осложнений.

5. Провести сравнительное изучение серологического и молекулярного типирования и использования моноклональных антител для идентификации антигенов гистосовместимости 1 и 2 класса.

6. Обосновать и разработать методы улучшения качества типируюших реагентов, вспомогательных реактивов и учета результатов реакции тканевого типирования.

.7. Разработать и предложить научно обоснованную систему иммунологического подбора и мониторинга при аллогенных трансплантациях.

Научная новизна.

Проведено сравнительное изучение иммунологического обеспечения аллогенных трансплантаций костного мозга и почки и определена j относительная • значимость различных факторов иммунологического / подбора для успешного функционирования аллогенного трансплантата.

Установлено, что наиболее значимым фактором для успешного приживления аллогенного трансплантата почки является совместимость по антигенам системы HLA, и в первую очередь локусов В и DR. Показано, что несовпадение по антигенам этих локусов, а также наличие преформированных антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости и неидентичность донора и реципиента по антигенам ABO снижают выживаемость трансплантата. Высокий уровень стимуляции в обратном варианте реакции смешанной культуры лимфоцитов сопровождается повышением частоты возникновения болезни "трансплантат против хозяина" при трансплантации костного мозга.

Установлено, что повышение уровня ФНО-а и И/I-ip в посттрансплантационном периоде отмечается на ранних стадиях отторжения трансплантата и может служить надежным прогностическим . признаком этого осложнения. Повышение уровня ФНО - а сопровождает также возникновение болезни "трансплантат протиа хозяина".

Показано, что иммунологическая реконституция основных лимфоидных субпопуляций: CD3, CD4, CD8, CD22, CD38, CD25, DR+, CD16 наступает между 30 и 60 днями после аллогенной трансплантации костного мозга от идентичного сиблинга, а отсутствие ее в эти сроки свидетельствует о развитии осложнений.

Выявлены значительные преимущества молекулярного метода типирования по сравнению с серологическим для идентификации антигенов главного комплекса гистосовместимости 2 класса.

Применение моноклональных антител для идентификации антигенов HLA 1 и 2 класса показало целесообразность их использования для выявления редких специфичностей.

Практическая значимость роботы.

На основании выполненных исследовгший предложена эффективная система иммунологического подбора и мониторинга аллогенных трансплантаций. При этом разработаны:

- усовершенствованные наборы для серологического типирования, отвечающие международным стандартам;

- метод лиофилизации сывороток, допускающий хранение реагентов редких специфичностей в течение нескольких лет без утраты их активности;

- метод высушивания комплемента, позволяющий сохранять его при температуре +4 С и транспортировать в нерегулируемых температурных условиях;

модификация иммунофлюоресцентного метода тканевого типирования с помощью разработанной люминесцентной насадки для светового микроскопа, позволяющая улучшил» учет результатов микролимфоцитотоксической реакции.

- адаптированный к условиям лаборатории метод ДНК-типирования для идентификации аншгенов 2 класса;

- метод мониторинга иммунореконституции после аллогенной трансплантации костного мозга, включающий определение основных лимфоидных популяций с помощью моноклональных антител, направленных к антигенам дифференшровки;

- способ прогнозирования острого криза отторжения аллогенной почки с помощью определения уровня цитокинов ФНОа и ИЛ-lp в сыворотке крови реципиента,- алгоритм поиска гистотипирующих стандартов к антигенам HLA 2

класса.

Поло«е:шп, вадпсншмыекамншпу:

1. Длительность успешного функционирования аллогенного трансплантата коррелирует со степенью иммунологического подбора пар донор-реципиент. Основными факторами, обуславливающими отторжение аллогенного трансплантата почки, является несовместимость по антигенам HLA-B и DR, предсушествуюшие антитела к антигенам главного комплекса гистосовместимости и. несовпадение по антигенам системы ABO. Различия по антигенам В и DR отрицательно сказываются на выживаемости почечного трансплантата на всех сроках его существования, при этом значимость, различий возрастает к 3 годам наблюдения.

2. Повышение уровня цитокинов: фактора некроза опухоли а и интерлейкина-1Р и нарушение восстановления ' лимфошных субпопуляций в посттрансплантационном периоде позволяют прогнозировать начинающийся криз отторжения и реакцию трансплантат против хозяина.

3. Для повышения качества иммунологического типирования. при проведении аллогенных трансплантаций необходимо использовать молекулярное типирование при идентификации генов HLA 2 класса, а при идентификации HLA антигенов 1 класса - серологический метод с использованием .монокл опальных антител к редким специфичностям. Серологическое типирование должно базироваться на использовании высококачественного набора типируюших стандартов, лиофильно высушенного стандартизованного комплемента и возможности иммунофлюоресцентного варианта учета ' результатов лимфоцитотоксической реакции с помощью люминесцентной насадки к световому микроскопу.

/ 4. Система иммунологического . обеспечения аллогенных / трансплантаций должна включать иммунологический подбор, ' основанный на молекулярном и серологическом типировании антигенов главного комплекса гистосовместимости, выявлении предсушествующих антилейкоцитарных антител, учете результатов реакции смешанной культуры лимфоцитов, совместимости по антигенам системы ABO, и иммуномониторинг, включаюший определение уровня медиаторов, - инициирующих иммунный ответ, и показателей иммунореконстшуции.

Наличие представительного донорского регистра и/или "листа ожидания" является необходимым 'для эффективного применения аллогенных трансплантаций как лечебного метода у значительного числа больных.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях: Международного симпозиума "Molecular factors of hematopoiesis and stem cell" /Москва, 1990/; 3 Всесоюзного съезда гематологов и трансфузиологов /Киров, 1991/; 1 съезда иммунологов России /Новосибирск, 1992/; Международного симпозиума "10th CTS Anniversary and 100000 CTS Transplants" /Гейдельберг, 1992/; 2 -й Международной конференции "Спид, рак и ретровирусы человека" /Санкт-Петербург, 1993/; 9-й Европейской конференции иммуногенетиков /Брайтон, 1995/; 18 конгрессе Скандинавского общества трансплантологов/Рига, 1995/.

По теме исследования опубликована 33 работы в научных журналах и сборниках научных трудов, получено авторское свидетельство на изобретение и патент.

Практ/мсскап рсолнадимп работы.

Разработанные при выполнении исследования методы иммуномониторинга / определение уровня цитокинов в сыворотке крови реципиентов и реконсттуции лимфоидных субпопуляций после трансплантации костного мозга/ используются в работе отделения трансплантации костного мозга Российского НИИ гематологии и трансфузиологии. •

Метод ДНК типирования внедрен в практику работы Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Метод лиофильного высушивания сывороток используется в Республиканском центре иммунологического типирования тканей для сохранения редких типируюших реагентов.

Производство сухого комплемента на основе разработанного метода лиофилизации налажено на базе опытной лаборатории института. Препарат в настоящее время используется всеми зональными лабораториями иммунологического типирования тканей, а также большинством типируюших центров России.

Иммунофлюоресцентный метод серологического типирования с помощью ' разработанной люминесцентной насадки к микроскопу "Бнолам-П1" внедрен. в работу лаборатории типирования Республиканского центра иммунологического типирования тканей, Белорусской Республиканской станции переливания крови, Московского НИИ ветеринарии, лаборатории иммунологии Нижегородской СПК и других.

Структура и объем работы.

: Диссертация состоит из введения, описания материала и методов, трех разделов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы. /'

Основной текст изложен на 187 страницах машинописи, работа иллюстрирована 42 таблицами и 46 рисунками. Указатель литературы содержит 307 работ.

Содержание работы.

Матер налиметоды исследования.

Исследования по изучению частоты встречаемости HLA - антител 1 класса выполнены на основе изучения 250000 образцов сывороток женщин-доноров из различных регионов России, поступивших в центр иммунологического типирования тканей Российского НИИ гематологии и трансфузиологии с 1988 по 1993 год.

Изучение выявления антител к антигенам 2 класса проводили при исследовании 14560 образцов сывороток повторнобеременных женщин.

' Сроки появления антител к антигенам 2 класса были изучены на 965 образцах сывороток, полученных от женшин на различных сроках беременности.

Эффективность абсорбции тромбоцитами антител к антигенам 1 класса из сывороток, содержащих антитела к антигенам обоих классов, исследовалась в 984 образцах таких сывороток.

Изучение, распределения HLA-ангигенов, включая сплиты, было / проведано у 1011 человек, составивших основу донорского регистра Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Организационно-методические принципы создания наборов " для серологического типирования разрабатывались на основе изучения шести последовательных модификаций панели сывороток, которые изготавливались в лаборатории на протяжении последних пяти лет, и были реферированы в лабораториях иммунологии Амстердама /проф. Д. ван Руд/, Софии /проф. М.Минев/, Москвы /проф. Ю.М.Зарецкая/, Новосибирска /проф. В.И.Коненков/, Кирова /д.м.н. Г.А.Зайцева/, а также в сотрудничестве с типирующими лабораториями Евротранспланта /проф. Г.Опельц/.

Разработка метода получения сухих антилейкоцитарных сывороток проводилась на 9 сериях сывороток различных специфичностей, а метода получения активного лиофилизированного комплемента - на 14 сериях свежезаготовленной сыворотки кроликов.

Изучение использования моноклональных антител /МАТ/ для определения антигенов 1 класса проводили с помошью панели из 19 МАТ, направленных к с плитам антигенов А10 и А19. Эта панель антител была исследована с лимфоцитами 76 доноров.

Молекулярное типирование генов 2 класса главного комплекса гистосовместимости методом, основанным на оценке полиморфизма длины рестрикиионных фрагментов /ПДРФ/, параллельно с серологическим титрованием, было проведено у 121 индивидуума.

Сравнение молекулярного типирования 2 класса методом SSO и серологического типирования проводилось у 19 пар донор-реципиент аллогенной почки, а определение аллелей DRB1 и DQB1 было

и

проведено в 30 образцах ДНК, выделенной из клеток периферической крови больных гемобластозами.

Раздел, касающийся иммунологического подбора для обеспечения трансплантации костного мозга, основан на результатах иммунологических исследований, выполненных у 95 предполагаемых реципиентов костного мозга и их родственников, при этом значение совместимости по локусу D изучали в реакции смешанной культуры лимфоцитов /MLС/, которая была проведена у 13 предполагаемых пар донор-реципиент.

Клинико-иммунологические корреляции, а также изучение прогностической значимости уровня цитокинов - фактора некроза опухоли а /ФНО-а/ и интерлейкина - 1р /ИЛ-1 р/, и иммунореконституции были выполнены на основании анализа результатов 10 аллогенных трансплантаций костного мозга, проведенных в клинике Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Изучение роли антигенов гистоссвместимости и предсуществуюших антилейкоцигарных антител при трансплантации аллогенных органов выполнено по результатам 215 трансплантаций аллогенной почки, проведенных в Санкт-Петербургском, центре трансплантации. Среди реципишггов были 131 мужчина и 84 женщины, возраст которых колебался от 14 до 45 лет. Основной патологией, приведшей к почечной недостаточности, являлись гломерулонефрит /84,7%/, пиелонефрит /5,6%/, поликистоз /3,7%/ и диабет /2,3%/.

Все трансплантации были выполнены с использованием кадаверных органов, полученных от лиц, погибших в подавляющем большинстве случаев /85,5%/ от черепно-мозговой травмы.

Исследование прогностической значимости определения уровня цитокинов у реципиентов аллогенной почки было проведено на основании анализа результатов 69 трансплантаций, выполненных в 1989 -1992 годах.

При выполнении исследования были использованы следующие методы.

- серологическое типирование в двух вариантах: стандартном /для определения антигенов 1 .vracca/ и пролонгированном /для определения антигенов 2 класса/ микролимфоцитотоксическом тесте;

- молекулярное типирование с помощью оценки полиморфизма длины рестрикционных фрагментов исследуемых ДНК и методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических пар праймеров;

- реакция смешанной культуры лимфоцитов радиоизотопным микрометодом по B.Bradeley, S.Corbin, 1988/ в двух вариантах: прямом и обратном;

- определение субпопуляций лимфоцитов CD3, CD4, CD8, CD22, CD16, CD25, CD38, DR+ в процессе реконеттуши реципиентов

аллогенного костного мозга производили с помошыо панели моноклональных антител серии ИКО, направленных к дифференцировочным антигенам;

- определение уровня цитокинов ФНО-а и ИЛ-lß в сыворотке крови реципиентов проводили методом иммуноферменгного анализа с использованием. диагностикумов, изготовленных в лаборатории иммунофармаколотии НИИ особо чистых биопрепаратов.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием критериев Стьюдента, Вилкоксона-Манна-Уитни, критерия знаков. Вычисление актуариальной выживаемости проводили по методу Busson M., Hors J. Частоту распределения антигенов, коэффициенты корреляции исследуемых сывороток определяли общепринятыми для этих вычислений методами.

/ Результаты исследования.

Значение. иммунологического подбора для успешного функционирования аллогенного трансплантата.

Обследование больных, которым была произведена трансплантация аллогенной кадаверной почки, и анализ актуариальной выживаемости трансплантата в зависимости от степени подбора донора и реципиента по HLA-антигенам выявили, что имеется прямая. коррелятивная зависимость между числом совпадений по антигенам локусов В и DR и -длительностью функционирования почечного трансплантата/рис.1 и 2/

Выживаемость первичного почечного трансплантанта в зависимости от расхождеций по В-иата генам

1M.CS

и.«% 7t.g% 10.84 Н.0%

м.*% и.еч М.0%

1».»* ■ ' ~ 4

'».е% -1 I-1 I-1 I-1---1-1-1

1 2 J 4 *

Голы.

При совпадении по обоим антигенам локуса В через год после трансплантации продолжали функционировать 95% трансплантатов, при

несовпадении по 1 антигену - 70,9% и по двум - 68,7%. Через 2 года различия углубились: из группы полностью совпадающих функционировали по-прежнему ■ 95%, различающихся по одному антигену - 59,6%, а не совпадающих полностью - 50,1%. К пятилетнему сроку число функционирующих трансплантатов в 1 группе составляло 71,9%, а во второй и третьей - 46,5% и 37,4% соответственно /рис.1/.

Анализ подбора по НЬА - Ой антигенам /рис.2/ дал следующие результаты: через год после трансплантации продолжали функционировать 81,6% трансплантатов, совпадающих по обоим антигенам, 68,7% не совпадающих по одному антигену и 70,1% различающихся по обоим. Эта тенденция продолжала усиливаться и в более поздние сроки: через 2 года после трансплантации функционировали 73,4% совпадающих по обоим антигенам Бй-покуса, 57,7% при расхождении по одному антигену и 45,5% не совпадают!« по обоим. Через 5 лет функционировали 63,4% аллогенных трансплантатов при идентичности НЬА-Ой антигенов, 45,7% при одном несовпадающем антигене и 27,2% при полном несовпадении.

Выживаемость первичного почечного трансплантанта в зависимости от ргегкиштенпй по ОП-антягенвм

Рисунок 2.

Анализ актуарнальной выживаемости в зависимости от степени подбора по антигенам обоих локусов - В и Ой - показал суммацию эффекта: к 1 году прекратили существование все не совпадающие по 4 антигенам, к двум годам - не совпадающие по 3 антигенам трансплантированные почки.

Изучение влияния подбора по антигенам НЬА - А локуса на длительность функционирования аллогенного трансплантата не выявило каких-либо различий в актуариальной выживаемости трансплантата в зависимости от этого параметра.

Данные по влиянию иммунологического подбора не зависели от схемы иммунодепрессии и оказались аналогичными как в группе больных, получавших циклоспорин А, так и при его отсутствии.

По сравнению с результатами аналогичных исследований зарубежных трансплантационных центров отмечено, что влияние подбора по Н1_А-ОЯ антигенам не только не прекращается через 6 мес. -1 год после трансплантации, но продолжает усиливаться в более поздние сроки /2-3 года/ -рис.3.

а б

Рис. 3 а,б. Актуариальная выживаемость аллогенной почки в зависимости от совпадения по антигенам Н-А-ОИ: а/ в сроки 0-6 мес.; б/ в сроки 1-5 лет /для наглядности количество трансплантатов, функционировавших 1 год, принято за 100%/.

Актуариальная выживаемость до 3-х месяцев не различалась в зависимости от числа расхождений по БЯ-антигенам. К 6 месяцам различия выживаемости полностью совпадающих по сравнению с не совпадающими по обоим ОЯ-антигенам аллогенных органов составили около 10%. Это расхождение резко увеличилось после 1 года: к 3-х летнему сроку различия в выживаемости совпадающих по обоим ОН антигенам и полностью различающихся по ним аллогенных трансплантатов составили более 30%.

Отличие полученных результатов от. данных Евротранспланта, вероятно, объясняется меньшим количеством препаратов

иммуносупрессивного действия, используемых в Санкт-Петербургском центре трансплантации.

Предсушествуюшие антитела к антигенам главного комплекса гистосовместимости.

Результаты изучения актуариальной выживаемости аллогенного трансплантата почки в зависимости от уровня сенсибилизации реципиента к антигенам главного комплекса гистосовместимости, определяемого по количеству образцов клеток рандомизированной панели, с которыми реагировала сыворотка реципиента, показали следующие результаты /рис.4/.

Выживаемость первичного почечного трансплантанта в зависимости от уровня антител в после/шей сыворотке

1М.0* 10.0% ■ чЧ^ —< 10% --- >10%

«о.«* 70.0% М.1Ч емч ----^^

<о.г% м.о% »0% 0.0% .......

1 » Голы а 4

Рисунок 4.

Если сыворотка реципиента, взятая непосредственно перед трансплантацией, реагировала менее чем с 10% образцов клеточной панели, то актуариальная выживаемость трансплантата через 1 год после трансплантации была 70,2%, а при высоком уровне сенсибилизации, когда сыворотка реагировала более чем с 10% образцов лкеток, - 50,4%. Этот разрыв, равный в различные периоды 10% - 17%, сохранялся на протяжении всего срока наблюдения.

Несколько меньшее влияние на выживаемость трансплантата оказывал высокий уровень сенсибилизации реципиента в более ранние сроки, когда какой-либо образец его сыворотки реагировал более чем с 10% клеток рандомизированной панели /рис.5/.

Выкш&аемость первичного почечного трансплантата в зависимости от напасшего уровня антител о сыворотке кроен реципиента

100.0% »0.0% 80.0% 70.0% 60.0% 60.0% 49.0% 30.0% 20.0% 10.0% 0.0%

1 2 > 4

Годы

/ Рисунок 5.

Через 1 год после трансплантации актуариальная выживаемость аллогенных трансплантатов при низком уровне сенсибилизации превышала выживаемость в группе реципиентов с более высоким уровнем на 12%. Далее эти различия несколько уменьшались, однако и через 4 года продолжали составлять около 10%.

Совместимость по антигенам системы ABO.

Анализ актуариальной выживаемости аллогенных трансплантатов в зависимости егг. подбора по антигенам ABO показал, что лучшие результаты получены в группе, где донор и реципиент были идентичны по ABO, а в группе, где трансплантации выполнены у неидентичных, но совместимых по ABO пар, выживаемость хуже примерно на 10%.

Реакция смешанной культуры лимфоцитов.

Изучение этой реакции при трансплантации аллогенного костного мозга от сиблингов показало, что интенсивность пролиферации зависит от совпадения между антигенами HLA донора, и реципиента, наиболее высокой в обоих направлениях она была при несовпадении по HLA-антигенам.

При проведении реакции MLC у фенотипически идентичных сиблингов в большей части случаев отмечалась- корреляция между уровнем пролиферации и частотой возникновения и тяжестью болезни трансплантат против.хозяина в постгрансгшантационном периоде.

Иммуномоннторннг аллогенных трансплантаций.

Определение уровня иитокинов.

Цитокины ФНО-а и И/1-1Р играют важную роль в инициации иммунных и воспалительных реакций, изменение их содержания в сыворотке крови реципиентов аллогенного трансплантата может адекватно отражать развивающийся иммунологический конфликт.

Изучение содержания уровня иитокинов было проведено у 69 больных после трансплантации аллогенной почки с различным клиническим течением послеоперационного периода. Исследование проводили в раннем /до 2 месяшев/ постгрансплангашонном периоде и в поздние сроки - 2-4 года после проведения трансплантации. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1. Содержание ФНО а к И/1-1 р в сыворотке крови реципиентов аллогенной почки.___

Обследуемая группа Количество . Уровень ФНО пд/т1 Уровень И/1-1 пд/т1

Здоровые лица 64 0,02+0,002 0,04+0,004

Больные с острым кризом отторжения 6 6,7+1,94 0,39+ 0,11

Больные с благоприятным- течением раннего периода 19 0,76+0,21 0,21+0,11

Больные. с признаками хронического отторжения 16 2,12+0,93 0,15+0,08

Больные со стабильной функцией трансплантата 28 0,38+0,12 0,11+0,04 |

Как видно из представленной таблицы, наименьший уровень ФНО-а был у реципиентов с длительной стабильной функцией трансплантата, он составил 0,38±0,12 нг/мл.

Больные с длительно живущим трансплантатом и снижением функциональной активности пересаженной почки вследствие развития хронического отторжения имели более высокий уровень ФНО-а: 2,12±0,93 нг/мл.

У больных в раннем посттрансплантаиионном периоде в целом показатели более высокие, при этом -у больных с отсутствием осложнений уровень ФНО-а составил 0,76±0,21 нг/мл, в то время как у пациентов, имевших эпизоды острого отторжения, уровень этого цитокина был значительно выше, составляя 6,7±1,94 нг/мл.

Аналогичное изменение сывороточных уровней отмечено и для И/1-1р, наиболее высокий уровень этого медиатора зарегистрирован у пациентов, имевших острые кризы отторжения в раннем посттрансплантационном периоде - 0,39±0,11 нг/мл.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что плазменные уровни ИЛ-1Р и ФНО-а значительно повышаются при нарушении функции почечного трансплантата вследствие развития как острого, так и хронического отторжения, и изменения их в зависимости от течения раннего и позднего посттрансплантационного периода аналогичны.

У четверых реципиентов аллогенной почки из наблюдаемой группы / в раннем посттрансплантаиионном периоде развился острый криз / отторжения, который был купирован применением медикаментозной терапии.

Результаты исследования ФНО-а в период благополучного послеоперационного течения, перед началом острого криза отторжения, в момент клинических проявлений и после его купирования представлены на рис.6

Содержание ФИО у больных с острым кризом отторжения.

После криза

□ Среди««

Рисунок 6.

Как видно из рисунка, у всех больных наблюдался значительный подъем содержания ФНО-а в период, предшествовавший появлению других признаков отторжения. После купирования криза содержание ФНО-а в сыворотке больных или возвращалось к исходным величинам, или, по крайней мере, значительно снижалось.

Повышение уровня ФНО-а в период, предшествующий другим признакам отторжения, позволяет рекомендовать это исследование для прогнозирования начинаюшнгося криза.

Изменение уровней цитокинов у реципиентов после трансплантации аллогенного костного мозга показало, что уровень ФНО-« при благоприятном течении посттрансплантационного периода постепенно снижался, достигая 0,06±0,08 нг/мл к четырем месяцам после трансплантации.

При развитии РТПХ, напротив, отмечалось повышение уровня ФНО-а в 5-7 раз: до 1,0 - 1,4 нг/мл к третьему-четвертому месяцу после трансплантации костного мозга. Исследование уровня И/I-ip не выявило каких-либо закономерностей в изменении его как при благоприятном течении постгрансплантационного периода, так и развитии осложнений.

Иммунореконстотуцня после трансплантации костного мозга.

Иммунитет после трансплантации костного мозга /ТКМ/ отражает взаимодействие между угасающим иммунитетом хозяина, активизирующимся донорским иммунитетом и разрегулированным иммунным ответом, провоцируемым различиями донора и реципиента /Wingard J., 1993/. Темпы и характер восстановления иммунитета зависят от множества факторов, среди которых степень совместимости по антигенам HLA и не-HLA, наличие РТПХ, развитие некоторых вирусных инфекций /Lum L.G., 1990/.

В качестве одного из показателей иммунореконституции нами было проведено изучение восстановления лимфоидных субпопуляций с маркерами CD3, CD4, CD8, CD22, CD16, CD25, CD38, DR+ у реципиентов аллогенного костного мозга начиная от срока 10-15 дней до трансплантации, и до 3,5 месяцев после нее у больных с благоприятным течением, и до 2-х - 3-х месяцев - с неблагоприятным.

Полученные результаты после математической обработки представлены в виде суммационных графиков для трех групп больных:

1 - с' благополучным посттрансплантационным течением и стойкой ремиссией;

2-е рецидивом заболевания и гибелью больного;

3-е развитием РТПХ, также приведшим к гибели больного.

Небольшое количество реципиентов /в каждой группе лишь 3/,

безусловно, не позволяет делать какие-либо категоричные выводы, однако, учитывая, что аллогенная трансплантация костного мозга лишь начинает по-настоящему развиваться в нашей стране, мы сочли возможным представить полученные результаты и обсудить тенденции, которые выявляются при их изучении.

На рис. 7 представлены изменения содержания CD25 субпопуляции /клетки с рецептором к интерлейкину-2/.

Дни

Рисунок 7. Количество СЭ25 лимфоцитов у реципиентов костного мозга.

В группе реципиентов с благополучным течением после снижения содержания клеток изучаемой субпопуляции к моменту трансплантации, начиная с 15 дня наблюдалось постепенное увеличение их количества, к 30 дню достигшее нормальных значений и затем остававшееся в их пределах.

В группе с развитием РТПХ наблюдался незначительный подъем числа клеток к 15 суткам, и затем вновь снижение.

В группе с рецидивом заболевания также наблюдались Незначительные колебания содержания клеток, не достигающие нормальных значений.

Сходная картина наблюдалась при изучении субпопуляции С1Э4 /рис.8/

Рис.8. Количество CD4 лимфоцитов у реципиентов костного мозга.

Как видно на рисунке, в группе с благополучным течением после снижения количества клеток к моменту трансплантации постепенно начинался их подъем, при этом нижней границы значений у здоровых лиц количество клеток достигало к 60 дням после операции.

При развитии у больных РТПХ наблюдался крайне незначительный подъем их количества, к концу 2-х месяцев далеко не достигавший нормальных значений.

При развитии рецидива картина была схожей: содержание субпопуляции увеличивалось очень мало.

Аналогично выглядели графики и всех остальных исследуемых субпопуляций.

Анализируя изменения содержания различных субпопуляций лимфоидных клеток перед ТКМ и в посттрансплантационном периоде, можно отметить. следующие особенности: динамика их различается в группе с приживлением трансплантата и благополучным посттрансплантационным течением и при развитии осложнений независимо сгт их природы - РТПХ или рецидив заболевания.

Приживление трансплантата костного мозга при отсутствии осложнений сопровождалось восстановлением количества всех исследованных субпопуляций, начало которого отмечалось в большинстве случаев уже к 15 дню. Содержание клеток достигало нормальных величин в сроки с 20-го до 60-го дня после трансплантации.

При возникновении РТПХ, как правило, не отмечалось подъема численности лимфоидных субпопуляций в посттрансплантационном периоде, или он был крайне незначительным, никогда не достигая нормальных значений.

Аналогичные изменения количества исследованных субпопуляций отмечены и в группе - больных при развитии рецидива заболевания. Следует лишь отметить, что в этом случае непрепывное падение числа клеток отмечалось, как правило, и в ближайшие сроки после ТКМ.

Приживление трансплантата костного мозга при отсутствии осложнений сопровождалось восстановлением количества лимфоидных клеток всех исследованных субпопуляций и у всех больных. Наиболее значительно возрастало содержание субгюпуляиии, несушей рецептор CD16, с которой связывают противоопухолевый эффект трансплантата /Marmont A.M. et al., 1989/.

Таким образом, динамика изменения лимфоидных субпопуляций адекватно отражает течение постгрансплантаиионного периода.

Совершенствование методов идентификации антигенов главного комплекса гистосовместимости.

Определение антигенов гистосовместимости является основой любого иммунологического подбора при трансплантации аллогенных органов и тканей.

В последние годы методы типирования претерпевают значительные качественные изменения. Доминирующее ранее серологическое типирова'ние, с одной стороны, непрерывно совершенствуется: расширяются типирующие наборы, улучшается методика типирвания, все более широко используются моноклональные антитела.

С другой стороны, серологическое типирозание уверенно вытесняется ДНК-анализом, захватившим ведущие позиции в идентификации 2 класса главного комплекса гистосовместимости. Причинами этого является отсутствие серологических стандартов к редко встречающимся антигенам, невозможность подтверждения гомозиготности, а также сниженная экспрессия антигенов гистосовместимости на клетках больных гемобластозами.

Сравнительная опенка ДНК- и серологического типирования.

Сравнительное изучение серологического и ДНК типирования 2 класса у 121 индивидуума было проведено совместно с лабораторией биохимии /руководитель-д.м.н. проф. М.Н.Блинов/.

В числе обследованных было 60 доноров крови, неоднократно обследованных серологически, и группа лиц, у которых антигенный состав был определен однократно /изучение проводилось в рамках международного популяционного исследования/.

Результаты серологического и ДНК-типирования обеих групп представлены в табл.2.

Табл.2. Расхождения между ДНК- и серологическим НЬА-ОЯ

типированием.

Результаты сравнения Всего обследовано п=121 Доноры крови п=60 Лица якутской национальности п=61

нет расхождений 73 /60,3%/ 45 /75%/ 28 /45,9%/

несовпадение по 1 антигену 41 /33,8%/ 15/25%/ ■ 26 /42,6%/

несовпадение по 2 антигенам 10 /8,2%/ 0 10 /16,3%/

АГ/"бланк" 26 /21,5%/ 8 /13,3%/ 18 /29,5%/

АГ/АГ 25 /20,6%/ 7/11,6%/ 18 /29,5%/

АГ/"бланк" - при серологическом тонировании невыявленный

антиген идентифицирован с помощью ДНК-типирования. . '

АГ/АГ - серологически неправильно определенный антиген заменен другим после ДНК-типирования.

Как видно из представленных данных, при сравнении результатов типирования доноров крови серологическим и молекулярным методами несовпадение установлено в 25% случаев. В группе однократно обследованных лиц расхождений значительно больше: около 50%. Очень важным результатом явилось подтверждение в ряде случаев гомозиготности", что серологическим методом возможно лишь на основании семейного анализа, далеко н»з всегда доступного.

Что касается определения отдельных специфичностей 2 класса, то здесь количество расхождений значительно варьировало при идентификации разных антигенов /табл.3/.

Табл. 3. Расхождения в выявлении антигенов двумя методами.

ОИ-антигены /п-121/ Определено серологически Специфичность подтверждена ДНК. типированием Расхождения

21 24 12,5%

0И2 25 28 10,7%

ОЯЗ 30 24 25%

0И4 49 52 5,7%

ЭИБ 20 24 16,6%

ЭИб 12 29 58,6%

0И7 23 26 11,5%

0И8 11 15 26,6%

0И9 14 15 6,6%

ОИЮ 3 5 40%

Как видно из представленной таблицы, наибольшие затруднения вызывает серологическое выявление антигена Причиной этого

является прежде всего отсутствие качественных типируюших реагентов к этому антигену, а также сложность интерпретаций кросс-реакций, прежде всего с антигеном ОЯЗ. Как видно, именно этот антиген дает расхождения в 25% случаев, почти столько же, сколько и антиген 0И8, также за счет кросс-реакций. Что касается специфичности БИЮ, то здесь расхождения значительны за счет редкой встречаемости антигена.

Таким образом, сравнение ДНК и серологического типирования позволило уточнить ряд результатов, исправив ошибки серологического типирования и подтвердив гомозиготность обследуемых индивидуумов. Кроме того, в ряде случаев применение метода ПДРФ позволило определить новые аллели генов НЬА 2 класса, не выявляемые с' помощью серологических реакций.

При проведении исследования в рамках Международного Воркшопа по контролю качества ДНК-типирования для лабораторий Центральной Европы, нами были использованы отчественные праймеры, изготовленные в отделе иммуногенетики /зав. - д.м.н. проф. Л.П.Алексеев/ института иммунологии МЗ РФ.

Среди участников Воркшопа были распределены 15 образцов ДНК, выделенных из лейкоцитов периферической крови больных лейкозами или доноров костного мозга. Образцы" были подобраны так, чтобы охватить широкий набор НЦ\-аллелей и включить по возможности редкие аллели ЭИ и 00 гаплотипов. Низкоразрешаюшее типирование 0ИВ1 и 0<ЗВ1 аллелей выполняли с помощью метода БЭР.

Результаты лабораторий- участников представлены в табл.4.

Табл.4. Используемая техника, уровень разрешения и количество

расхождений при исследовании контрольных образцов ДНК.

Лаборатория Метод Разрешающая Количество

исследования способность расхождений

А SSP высокая 5

В SSP базовая 4

С SSO высокая 2

D SSP базовая 3

Е SSP базовая 1

F SSO высокая 1

G SSO/SSP высокая 0

Н SSO средняя 3

I SSP базовая 0

J SSO высокая 6

К SSP базовая 10 . •

Результаты наших исследований представлены под буквой "I". Как видно из приведенной таблицы, задание было выполнено без ошибок, что свидетельствует о высоком качестве отечественных стандартов для ДНК-типирования.

Применение моноклональных антител для идентификации редких антигенов.

В связи со сложностью нахождения качественных антисывороток к редко встречающимся антигенам, была изучена возможность применения моноклональных антител /МАТ/ к детерминантам редких специфичностей. Набор гистотипирующих МАТ к сплитам антигенов А10 и А19, содержащий 19 различных антител, был предоставлен Оргкомитетом 12 Международного Воркшопа, итоги которого будут подведены в 1996 году. Среди изучаемых МАТ 9 содержали специфичности, направленные к сплитам антигена А19, 6 - к сплитам антигена А10. В четырех присутствовали антитела к сплитам обоих антигенов.

Антитела были исследованы в стандартном

микролимфоиитотоксическом тесте, с использованием собственных вспомогательных реагентов. Изучение проводили с клетками 76 типированных доноров, 29 из которых имели соответствующие антигены /положительный контроль/, 27 - не имели их /отрицательный контроль/, и у 20 с помощью стандартных типирующих наборов был выявлен только один антиген в локусе А. Последняя группа расценивалась как возможные носители антигенов, соответствующих специфичностям исследуемых МАТ..

На основании проведенных исследований активности и специфичности МАТ определены индексы корреляции каждого из исследованных антител. Результаты представлены в табл.5.

Табл. 5. Индексы корреляции МАТ, направленных к сплитам антигенов А10 и А19,

п исследуемого образца Специфичность МАТ Индекс корреляции г Обший антиген

1 А25,26,34 0,85

2 А25 0,81

3 А26.25 0,84 А10

4 А26,25,66 0,76

5 А26.34.66 0,46

ь А26,34,66 0,73

7 А29 0,35

8 А 29 0,55

9 А29,30,31 0,91

10 А30.31 0,71 А19

И А30.31 0,46

12 ■ А30.31 0,75

13 А31 0,75

1 15 А32 0,61

16 А33,34,68 0,38

17 А25.32 0.9 А10+А19

18 А33.34 0,48

1 19 А33.34 0,69

Как показали результаты проведенных испытаний МАТ, они в большинстве своем позволяют достаточно надежно идентифицировать антигены соответствующей специфичности.

Так, коэффициент корреляции к сплитам антигена А10 в среднем равен 0,74 /от 0,46 до 0,85/. Несколько ниже он к сплитам антигена А19 - в среднем 0,65. Снижение это происходит в основном за счет антител, направленных к антигену А29, где коэффициенты корреляции 0,35 и 0,55.

Гораздо хуже реагировали МАТ, содержащие специфичности, направленные против сплитов обоих антигенов, прежде всего из-за большого количества ложноположительных реакций.

Если же рассматривать специфичности отдельно, то наиболее эффективно проявили себя МАТ к антигену А25 - индексы корреляции от 0,76 до 0,85. Напротив, наиболее низкие индексы корреляции у МАТ к антигенам А33.34 - колебания от 0,33 до 0,69.

При исследовании реакций изучаемых МАТ с лимфоцитами доноров, имеющих в локусе А только 1 антиген, выявленный с помошью стандартной типируюшей панели, у 5 доноров из 20 удалось идентифицировать следующие специфичности: АЗО, А31, А34, А26, А29.

Из особенностей реагирования МАТ следует отметить их чрезвычайно высокую активность: практически все. реакции оцениваются на 8 баллов /максимальные показатели/, при этом обычно отмечается лизис 100% клеток.

Таким образом, использование МАТ к редким специфичностнм 1 класса может значительно повысить эффективность серологической идентификации антигенов 1 класса.

Однако основной задачей, стоящей перед нами, являлась разработка методов повышения качества серологического типирования с помощью собственных реагентов.

Способ /тигельного хранения типируюших реагентов редких спешфичностей.

При формировании гистотипируюшей панели значительные трудности представляет сохранение сывороток редких специфичностей, поступающих в центр иногда 1 раз в несколько лет. Как известно, недостатком хранения сывороток в замороженном состоянии является то, что сыворотка довольно быстро - в течение 3-4 лет - значительно снижает свою активность. Хранение в большом объеме дает лучшие результаты, однако в этом случае качество стандарта ухудшается из-за необходимости многократного размораживания при получении отдельных порций.

Для преодоления указанных недостатков была изучена возможность длительного сохранения активности анти-НЬА сывороток путем их лиофильного высушивания. Эта работа проводилась совместно с опытной лабораторией /руководитель - к.б.н. ст.н.с. Н.П.Сивакова/ Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

В результате исследований, проведенных на 9 сериях активных сывороток различных специфичностей, была разработана высокошадяшая технология, позволяющая проводить лиофилнэаиию сывороток с добавлением в качестве стабилизатора 2% сорбита. На

предложенный способ получены авторское свидетельство N1768105 от 14 апреля 1993 г. и патент.

Высушенные по этому способу сыворотки сохраняют свою специфическую активность в течение 4-х лет в условиях бытового холодильника /+4°С/.

Метол стандартизации и длительного хранения комплемента.

Кроме хорошего типируюшего набора сывороток, необходимо высокое качество всех реагентов, участвующих в микролимфоцитотоксической реакции, и, прежде всего, комплемента. Используемый для тканевого типирования кроличий комплемент нередко содержит естественные антитела, реагирующие с лимфоцитами человека /БЫеЫ В., 1991/. Как правило, такие антитела в сыворотках отдельных животных разводятся при пулировании сывороток от большого количества кроликов. Большой пул нивелирует также и различия в индивидуальной активности комплемента.

Известно также, что комплемент является очень лабильным биоматсриалом и может сохранять активность в исходном виде в течение всего одной недели при температуре -20°С, и 6-7 месяцев при температуре -196°С, а поэтому получение большого количества сыворотки для одной лаборатории нерационально, и хранение его весьма затруднительно.

В связи с изложенным получение стабильной формы препарата с длительным сроком сохранения активности и удобной формой хранения являлось крайне необходимым для получения точных воспроизводимых результатов лимфоиитотоксического теста.

Поэтому целью нашего исследования стала разработка оптимального метода лиофилизаиии комплемента. Эта работа также проводилась совместно с опытной лабораторией института.

В процессе разработки режима было произведено 8 сублимационных сушек кроличьего комплемента с одновременным определением активности сухого комплемента каждой серии по сравнению с нативным замороженным этой же серии в тесте комллементзависимой цитотоксичности. Результаты проделанной работы позволили подобрать оптимальный режим сублимационной сушки, сохраняющий высокую активность комплемента, в большинстве случаев на 10%-30% выше по сравнению с активностью замороженного комплемента той же серии, сохраняемого в жидком азоте.

В качестве оптимального режима хранения лиофилизированного комплемента определена температура +4°С, при которой препарат сохранял свою активность в течение 3 лет. При сохранении в условиях комнатной температуры активность начинает снижаться после 9 месяцев. Таким образом, разработанный режим сублимационной сушки позволил получить стандартизованный комплемент, сохраняющий высокую

активность в течение 3-х лет, что дает возможность повысить качество проведения лимфоцитотоксического теста.

Наличие высушенного комплемента избавляет от необходимости иметь дорогостоящее холодильное оборудование - дьюары с жидким азотом для хранения замороженного комплемента. Появилась возможность транспортировки сухого комплемента в нерегулируемых температурных условиях и использования его при работе в экспедиционных условиях /например, при проведении популяционных исследований/.

Усовершенствование метода оценки микролимфоиитотоксического теста.

Учет реакции серологического типирования DR-антигенов более сложен, чем при определении антигенов 1 класса, в связи с чем особое значение приобретает метод визуализации реакции.

Кроме традиционного окрашивания эозином, известен флюоресцентный метод, окрашивающий живые и погибшие клетки в зеленый и красный цвет.

Существуют автоматизированные люминесцентные микроскопы-фотометры, выпускаемые фирмами "Opton" и "Leitz", которые не получили широкого распространения из-за высокой стоимости, что делает их использование целесообразным только очень крупными лабораториями.

Это побудило к разработке более простого и дешевого прибора для' использования люминесцентного метода HLA-типирования. Указанная задача решалась совместно с коллективом сотрудников Государственного оптического института им. С.И.Вавилова /руководитель группы -И.Я.Барский/.

В ходе совместных исследований разработаны уникальные широкополостные интерференционные светофильтры и светоделители, позволяющие, в отличие от зарубежных аналогов, одновременно регистрировать флюоресценцию зеленых - живых, и красных - погибших клеток.

Для упрощения и удешевления прибора была разработана компактная люминесцентная насадка к широко используемому для тканевого типирования инвертированному микроскопу "Биолам П-1". В качестве источника света в насадке используется экономичная малогабаритная кварцевая лампа с йодным циклом - КГМ-9х75. Благодаря оптимальным характеристикам разработанных светофильтров, освещенность люминесцентных изображений в приборе вполне достаточна для тканевого типирования.

Модифицированный с помощью люминесцентной насадки инвертированный микроскоп "Биолам П-1" позволяет производить учет лимфошттотоксической реакции как традиционным способом - по

окрашиванию клеток раствором эозина, так и с применением люминесцентных красителей.

Регистр типированных доноров костного мозга и "лист ожидания" типированных реципиентов почин.

Создание при центрах трансплантации таких регистров является одной из основных задач лабораторий иммунологического типирования тканей, т.к. только это позволит полностью использовать преимущества качественного иммунологического подбора и обеспечить эффективное распределение донорских органов.

Проведенное исследование подтвердило, что эффективность работы донорского регистра прямо пропорциональна, во-первых, количеству и качеству типированных доноров собственного регистра, а во-вторых, степени участия его в работе более широких объединений, включающих другие регистры.

Многолетнее сотрудничество в качестве самостоятельного регистра с благотворительным регистром Кэтлин Реймонд /США/ позволяло при наличии в ретстре института 1200 типированных по антигенам А,В,С и 300 - по антигенам А,В,С и БЯ доноров выполнять 19,1% заявок с учетом антигенов 1 класса и 0,2% с учетом антигенов 1 и 2.

Работа же регистра института в составе Объединенного регистра доноров /с участием стран СНГ/ и выполнение целенаправленных заявок позволили увеличить количествот выполняемых подборов До 38,6% по антигенам 1 класса и до 5,6% по антигенам А,В,С и Эй.

Сравнительно низкая эффективность при подборе кадаверных донорских почек также свидетельствует о необходимости как значительного расширения собственного "листа ожидания" реципиентов, так и налаживания широкого международного сотрудничества и обмена донорскими органами.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют, что иммунологическое обеспечение аллогенных трансплантаций должно опираться на качественный иммунологический подбор пар донор -реципиент.

Важнейшим этапом подбора, определяющим приоритетность распределения донорских органов, является идентификация антигенов гистосовместимости.

Гистогапирование антигенов 1 класса может надежно осуществляться серологическим методом при использовании высококачественных типируюших панелей аллоантисывороток, наборов моноклональных антител к редким антигенам, а также стандартных вспомогательных реагентов. Идентификация антигенов 2 класса главного комплекса гистосовместимости должна проводиться ' с применением методов молекулярного типирования.

При проведении постгрансплантационного мониторинга информативным способом прогнозирования развития осложнений является определение уровней иммуномедиаторов ФНО-а и И/1-ip, a после трансплантации костного мозга также оценка иммунореконституции реципиента по восстановлению лимфоидных субпопуляций.

Для расширения использования аллогенных трансплантаций в качестве лечебного метода и увеличения количества больных, которым возможна пересадка фенотипически идентичных или близких по антигенному составу донорских органов и тканей, требуется расширение единого донорского регистра и "листа ожидания" тигшрованных реципиентов.

Вышеизложенная система иммунологического обеспечения должна повысить эффективность аллогенных трансплантаций в нашей стране и явиться одним из условий дальнейшего развития этого метода.

ВЫВОДЫ

1. Различия по антигенам главного комплекса гистосовместимости . значительно снижают длительность функционирования аллогенного

трансплантата: так, несовпадение по антигенам HLA-B уменьшает пятилетнюю выживаемость трансплантата почки с 72% при полном совпадении до 45,5% при одном несовпадении, и до 37% при двух' несовпадениях, а различие по антигенам HLA-DR вызывает уменьшение выживания трансплантата с 63,4% до 45,7% и 27,2% соответственно. ... '

2. Наличие преформированных антител, направленных к антигенам гистосовместимости, в сыворотке крови реципиента и неидентичность по антигенам системы ABO снижают трехлетнюю выживаемость почечного трансплантата на 10%.

3. Пятилетняя выживаемость аллогенного трансплантат почки в Санкт-Петербургском центре ниже, чем в среднем по Евротранспланту, на 20%, что коррелирует с худшим подбором в Санкт-Петербургском центре: так, при малом количестве расхождений /не более 2-х/ в Санкт-Петербурге произведено 13,3% трансплантаций по сравнению с 31,1% в Евротранспланту, тогда как при 4-х несовпадениях в Санкт-Петербурге -31,7% по сравнению с 21,4% в Евротранспланте.

4. При угрозе отторжения аллогенного трансплантата уровень содержания ФНО-а и ИЛ-1 р в сыворотке крови реципиента повышается до 6»12 нг/мл, т.е. в 3-4 раза. При возникновении острой или хронической РТПХ уровень ФНО-а повышается до 1-1,4 нг/мл, т.е. в 23 раза.

5. Иммунореконституция реципиентов после трансплантации костного мозга происходит в сроки от 25 - 30 дней /для субпопуляций CD22, CD25, CD16/, до 50-60 дней /для субпопуляций CD38, CD3, CD4, CD8/ при благоприятном течении посттрансплантационного

периода. При развитии РТПХ или рецидива заболевания иммунореконституция отсутствует.

6. Метод ДНК-типирования позволяет улучшить идентификацию антигенов 2 класса при сниженной экспрессии детерминант у гематологических больных и у здоровых лиц в среднем на 25% по сравнению с серологическим методом, и достоверно установить гомозиготность индивидуума.

7. В качестве гистотипйруюших стандартов могут быть использованы 0,6% образцов, отобранных в результате скрининга сывороток, поступающих из различных регионов.

8. Лиофилизация редких антилейкоцитарных сывороток позволяет сохранить их активность в течение 4-х лет без изменения и многократно использовать в типируюших панелях.

Лиоф ильное высушивание кроличьего комплемента сохраняет его в активном состоянии в течение 3-х лет, позволяя стандартизовать-условия проведения лимфицитотоксического теста.

9. Сотрудничество в рамках Объединенного регистра типированных доноров позволяет -значительно повысит эффективность подбора потенциальных доноров костного мозга.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Васильева З.Ф., Бубнова Л.Н., Беляева Е.В. DR-сенсИбилизашя беременных женщин// В сб. тезисов докл. 4-го Всесоюзного симпозиума с международным участием "Иммунология репродукции".- Киев.- 1990.-с.129.

2. Бубнова Л.Н., Серебряная Н.Б., Беляева Е.В. Иммуногенетические методы прогнозирования тяжести течения гематологических заболеваний.// В сб. тез. докл. 2 Всесоюзного съезда медицинских генетиков. - Алма-Ата. - 1990. - с.32.

3. Беляева Е.В., Бубнова Л.Н. Сравнительная оценка различных методов выявления HLA-антигенов.// В сб. теэ. докл. 1 съезда иммунологов Белоруссии. - Минск. - 1990.- с.24-25.

4. Беляева Е.В., Тимофеева Н.П., Черникова М.А., Бубнова /Т.Н., ¿ Николенко В.Н., Каукиайнен А.Б. Антигены HLA-A,B,DR у здоровых ^детей различных возрастных групп и у больных лейкозами детей и ^взрослых// Тезисы докладов 2 съезда гематологов Азербайджана. -Баку. -41990.-с. 170.

• 5. Беляева Е.В., Зарайский М.И., Зубарева Т.С., Тимофеева Н.П., ББубнова Л.Н. Применение флуоресцентных красителей при оорределении HLA-фенотипа больных острым лейкозом.// Сб. "Новое в гематологии" /теэ. докл. 2 съезда гематологов и трансфузиологов ^ЛЙбекистана. -Ташкент. -1990 .-с.48-49.

ббл Bubnova L.N, Belyaeva E.V, Glazanova T.V, Serebryanaya N.V. SSe'mifific basis for International cooperation and advanes in histotyping jn the

allogeneic bone marrow transplantation Symposium "Molecular factors of hematopoesis and stem cell". Moscow-Leningrad, 1990. p.lll

7. Беляева E.B., Зарайский М.И., Тимофеева Н.П., Бубнова Л.В., Хоменкова С.А., Соловьева Л.В., Лопаткина С.Б., Серова Л.Д. Тканевое типирование на отечественном люминесцентном микроскопе-фотометре //Лабораторное дело. -1991. - N8. -с.62-64.

8. Бубнова Л.Н., Блинов М.Н., Беляева Е.В., Салтыкова /Т.Б.^ А.В.Того, Н.Л.Вартанян. Опьгг применения ДНК-типирования доноров по DR и DQ л оку сам. // В кн. "Антигены гистосовместимости из заболевания". -Ленинград. -1991. -с.6-9.

9. Беляева Е.В., Бубнова Л.Н., Черникова М.А., Каукиайнен А.Б. Генетические маркеры системы HLA в различных возрастных группах. // там же., с.40-44.

10. Bubnova L.N, Pavlov S.A, Kabakov A.B, Serebryanaya N.B. Immunogenetic characteristics of donors of allogeneic organs in Leningrad /Transplantation Proceedings.- 1991, vol.5, p.278.

11. Bubnova L.N, Blinov M.N, Belaeva E.V, Berkos A.S. HLA-antigens jn Yakuts /Abstr. of 11th International Histocompatibility Workshop and Conference, 1991, Yokohama, p. 53.

12. Серебряная Н.Б., Бубнова Л.Н., Папаян Л.П. Плазменные уровни фактора некроза опухоли и фактора Виллебранда в диагностике отторжения почечного трансплантата. //Сб. тезисов 1 Всероссийского . съезда иммунологов. - Новосибирск. -1992. - с.397.

13. Кочеткова Г.А., Бубнова Л.Н., Иванова Р.И., Сивакова Н.П.. Получение сухих анти-HLA сывороток методом лиофилизаиии. -// там же. - с.248ч

14. Соловьева Л.В., Бубнова Л.Н., Хоменкова С.А., Беляева Е.В. Люминесцентное исследование антигенов гистосовместимости // Сб. мат. 4 Всесоюзного совещания "Люминесцентные методы исследования в клинической диагностике". - Москва. - 1992. - с.23.

15. Bubnova L.N, Rozanova О.Е, Kalinina N.M, Glazanova T.V, Pavlova .I.E, Serum TNF and IL-1 levels in leukemic patients /International Conference on ADS, cancer and human retroviruses. St.-Petersburg, 1992, p.33.

16. Bubnova L.N, Glazanova T.V, Moiseev S.I, Abdulkadirov K.M. Lymphocyte subpopulations in acute leukemia / 8th International Congress of Immunology.- Budapest, 1992, p.432

17. Глазанова T.B., Бубнова Л.Н., Кочеткова Г.А., Хорошайлова А.Е. Особенности экспрессии антигенов CD18, lib, CD4, CD8, CD3, выявляемых моноклональными антителами серии ИКО в крови больных гемабластозами. // Гематология и трансфизиология. - 1992. - N5. - с.24-26.

18. Bubnova L.N, Kabakov A.B, Serebryanaya N.B, Ketlinsky S.A. Interleukin-1 and Tumor Necrosis Factor serum levels in renai ^ograft recipients /Transplahtation Proceedings, 1992, vol.24, N6, p 2545

19. Бубнова Л.H., Сивакова Н.П., Кочеткова Г.А., Иванова Р.П. Способ консервирования сыворотки крови //Авт. свид. N1768105. -1992.

20. Bubrtova L.N, Rozanova О.Е, Kalinina N.M, Glazanova T.V, Pavlova I.E. Serum TNF and IL1 levels in hematological patients during bone marrow transplantation /19th Annual Meeting of the ЕВМТ,- Garmish-Partenkirchen, Germany, 1993, p.25.

21. Bubnova L.N, Rozanova O.E, Glazanova T.V, Pavlova LE, et al. Serum TNF levels in leukemic patients during autologous bone marrow transplantation / ХП Meeting of International Society of Hematology.-Vienna Austria 1993, N526

22. Bubnova L.N, Glazanova T.V, Rozanova O.E, Pavlova I.E. et al. Cell Immunity in leukemik patients during bone marrow transplantation /XII Meeting of International Society of Hematology -Vienna, Austria, 1993, N531

23. Bubnova L.N, Moiseev S.l, Glazanova T.V, Abdulkadirov K.M. Lymphocyte subpopulations in different stages of acute leukemia / ХП Meeting of International Society of Hematology -Vienna, Austria, 1993, N457

24. Bubnova L.N, Glazanova T.V, Rozanova O.E, Pavlova l.E Subpopulations of lymphocytes and TNF levels in leukemic patients during autologous bone marrow transplantation / "Immunology of BMT", Annual Meeting, Kiel, Germany, 1993, p.2

25. Bubnova L.N, Rozanova O.E, Glazanova T.V, Pavlova l.E, Moiseev S.I Scrum Cytokines in leukemia / 2nd International Conference "AIDS, Cancer arid Human Retroviruses" -St.-Petersburg, 1993, p.23

26. Bubnova L.N, Glazanova T.V, Pavlova l.E, Rozanova O.E, Moiseev S.I. CD38 antigen in acute leukemia / Tissue Antigens -1993, vol.42, N4, p.426 -Proc. of Vth International Conference of Human Leucocyte Differentiation Antigens

27. Bubnova L.N, Rozanova O.E, Glazanova T.V, Pavlova LE, Moiseev S.L Serum TNF and IL-1 levels in leukemia / "Immunology of leukemias"-GEIL 94 Meeting. -France, 1994. -N26

28. Bubnova L.N, Blinov M.N, Lyschov A.T, Togo A.V. Distribution of HLA DR and -DQ allels revealed by restriction fragment length polymorphism analysis in donors from St.-Petersburg /Advances in Forensic Immvmogenetics, 1994, N%, p.472-474, Ed. by W.Bar.Springer-Veriag

29. Bubnova L.N, Rozanova O.E, Glazanova T.V, Pavlova I.E, Moiseev S.I. Serum TNF in leukemia /5th International TNF Congress - California, USA, 1994. N.417

30. Bubnova L.N, Belyaeva E.V, Berkos A.S, Nikolenko V.N, Erochina L.. Screening of anti-HLA-A,B,C,DR sera in Russian Histotyping Centre / European Journal of Immunogenetics. - 1995, vol.22, p.105 (Abstr. from Joint Meeting of EFIS and BSHI. - U.K