Экспериментальные подходы к повышению эффективности GM-CSF - секретирующей цельноклеточной противоопухолевой вакцины.

Манина, Ирина Владимировна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Экспериментальные подходы к повышению эффективности GM-CSF - секретирующей цельноклеточной противоопухолевой вакцины.

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Манина, Ирина Владимировна Москва 2011 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.01.12

Автореферат диссертации по медицине на тему Экспериментальные подходы к повышению эффективности GM-CSF - секретирующей цельноклеточной противоопухолевой вакцины.

Пи Приыиь ^ми»».

МАНИНА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

Экспериментальные подходы к повышению эффективности СМ-СБР-секретирующей цельноклеточной противоопухолевой вакцины

Специальность: 14.01 Л2 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 з ЯНВ 2011

МОСКВА 2010

004618861

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских нау Российском Онкологическом Научном Центре имени H.H. Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов)

Научные руководители:

доктор медицинских наук Козлов Алексей Михайлович

кандидат медицинский наук Михайлова Ирина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кадагидзе Заира Григорьевна

доктор медицинских наук, профессор Голенков Анатолий Константинович

Ведущая организация:

ФГУ Московский Научно-Исследовательский Онкологический Институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий (МНИОИ им. П.А. Герцена)

Защита диссертации состоится /А 010 г. в^часов на заседании

диссертационного Совета (Д.001.017.02) Российского Онкологическог Научного Центра им. H.H. Блохина РАМН по адресу: 115478 Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Из методов эффективной иммунотерапии опухолей наиболее перспективным является вакцинотерапия - введение в организм опухолевых антигенов.

Введение инактивированных опухолевых клеток больному сравнимо с введением опухолевых антигенов, так как предполагается, что после инъекции опухолевые клетки будут захвачены антиген-презентирующими клетками (АПК), процессированы и представлены в виде антигенных пептидов в комплексе с молекулами МНС. В настоящее время в научных центрах мира проходят исследования по применению противоопухолевых вакцин на основе опухолевых клеток. Для генерации более мощного иммунологического ответа опухолевые клетки трансфицируют геном, который кодирует тот или иной цитокин. Наибольшей активностью обладает GM-CSF. При использовании аллогенной вакцины решается проблема со временем и трудностью получения клеточной линии. Самый главный вопрос - это адекватность использования аллогенных опухолевых клеток для лечения и профилактики рецидивов онкологических заболеваний. Известно, что опухоль одинакового гистогенеза у одного больного будет отличаться от опухоли другого больного по спектру экспрессируемых опухолевых антигенов. Таким образом, эффективность лечения, при прочих равных условиях, будет зависеть от степени перекрывания опухолевых антигенов, экспрессирующихся на вводимой клеточной линии и опухоли самого больного, то есть повышения иммуногенности вакцины.

Опыт клинического применения GM-CSF-секретирующих вакцин из транзиторно трансфицированных аутологичных опухолевых клеток пациентов подтвердил эффективность такого вида биотерапии опухолей человека. Позитивные клинические изменения были получены у пациентов с III и IV стадией меланомы, недостаточно отвечающих на предшествующие

курсы химиотерапии. Дополнительными преимуществами вакцин, секретирующих ОМ-СББ, оказались: хорошая переносимость и широкий интервал терапевтических доз (в сравнении с 1Ь-2,1Ь-4,1Ь-6, ШЫ-у).

В то же время, противоопухолевая вакцинация оказалась недостаточно эффективной в качестве самостоятельного средства терапии злокачественных новообразований. Одной из главных причин низкой эффективности противоопухолевых цельноклеточных вакцин является низкая иммуногенность самих опухолевых клеток. Плохое распознавание опухолевых клеток Т-лимфоцитами происходит вследствие неадекватной презентации антигенов. Это часто происходит по причине утрачивания комплексов МНС I и II классов, необходимых для презентации антигенов. Так, в случае с меланомой показано, что из 11 первичных линий клеток от больных меланомой, антигены НЬА I класса были экспрессированы только в 10 случаях, а антигены НЬА II - в 1 из клеточных линий.

Таким образом, восстановление экспрессии комплексов МНС имеет принципиальное значение для реализации нормального противоопухолевого иммунного ответа. Сложившаяся ситуация подталкивает исследователей к поиску методов повышения иммуногенности вакцин, подбору более эффективных комбинаций иммунотерапевтических методов с радио- и химиотерапией, а также к сочетанному применению иммунопрепаратов, воздействующих на разные этапы формирования и реализации противоопухолевого иммунного ответа.

Цель работы: экспериментальное обоснование подходов к повышению специфической активности цельноклеточной противоопухолевой вакцины, трансфицированной геном СМ-СБР.

Задачи исследования:

1. Изучить возможность повышения эффективности противоопухолевой цельноклеточной вакцины, секретирующей GM-CSF, с помощью цитокинов (IFN-y, TNF-a) in vitro.

2. Изучить возможность повышения эффективности противоопухолевой цельноклеточной вакцины, секретирующей GM-CSF, с помощью модификатора биологических реакций (ингибитора Н2-рецепторов гистамина - циметидина) ш vivo.

3. Провести сравнительное исследование профилактической эффективности in vivo биотерапии с использованием интактной и модифицированной цитокинами in vitro цельноклеточной противоопухолевой вакцины, секретирующей GM-CSF.

4. Провести сравнительное исследование терапевтической эффективности in vivo биотерапии с использованием интактной и модифицированной цитокинами in vitro цельноклеточной противоопухолевой вакцины, секретирующей GM-CSF.

5. Изучить возможность повышения эффективности биотерапии путем сочетанного применения вакцинотерапии и других методов противоопухолевой терапии (низко- и высокодозная химиотерапия, хирургическое лечение, трансплантация костного мозга).

Научная новизна Впервые изучено и показано, что терапевтическая эффективность цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF, при воздействии IFN-y значительно повышается. Впервые доказано, что увеличение уровня экспрессии МНС I и МНС II на опухолевых клетках в присутствие IFN-y приводит к усилению противоопухолевого иммунного ответа. Впервые апробировано в эксперименте применение модифицированных преинкубацией с цитокинами in vitro цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF, в различных терапевтических и профилактических режимах. Впервые

выялено, что сочетанное применение блокаторов Н2-рецепторов гистамина (циметидина) и целъноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF, приводит к усилению профилактического действия вакцинотерапии.

Практическая значимость

1. Разработан метод увеличения уровня экспрессии МНС I и МНС II на поверхности клеток путем культивирования in vitro в среде, содержащей IFN-y.

2. Получены данные, свидетельствующие о потенциальной способности блокаторов Н2-рецепторов гистамина повышать профилактическое действие цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF, при их сочетанном применении.

3. Разработаны рациональные схемы сочетанного применения цитостатиков, хирургического лечения и биотерапии цельноклеточными противоопухолевыми вакцинами, секретирующими GM-CSF, модифицированными in vitro с помощью IFN-y .

4. Полученные экспериментальные данные демонстрируют целесообразность рекомендовать для клинического апробирования способа повышения in vitro иммуногенности цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующими GM-CSF, и схемы сочетанного применения такой вакцины, цитостатиков и хирургического лечения.

Апробация работы.

Апробация диссертационной работы состоялась на совместной научной конференции НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН с участием лабораторий: лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории иммунофармакологии, лаборатории биохимической фармакологии,

лаборатории фармакологии и токсикологии, лаборатории лучевых методов лечения опухолей, лаборатории трансгенных препаратов, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории фармацитокинетики, лаборатории медицинской химии, и отдела биотерапии опухолей НИИ Клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, состоявшейся 6 июля 2010 года.

Публикации

Материалы данной работы представлены на Национальной конференции «Аллергология . и клиническая иммунология практическому здравоохранению» (Москва, 2010 г.), на Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии - междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010 г.), на XIV Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2010 г.)

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 статьи, и 3 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 13 рисунков, 24 таблицы. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Литература». Библиографический указатель включает 47 отечественных и 206 зарубежных источников.

Материалы и методы.

Клеточные линии и их культивирование. Клетки меланомы мышей В16 клон F10 были предоставлены профессором М. Бернстилом (IMP, Вена, Австрия). Клетки линии B16F10 имеют гаплотип Н-2Ь, свойственные линии мышей С57В1/б, из которых выделены эти клетки. Клетки линии B16-F10 не несут молекул МНС I, МНС II на своей поверхности.

Клетки GM-CSF-секретирующего клона BG получены путем стабильной трансфекции клеток линии B16-F10 генетической конструкцией, кодирующей кДНК GM-CSF мыши. При получении клонов стабильно трансфицированных клеток использовали конструкцию под контролем раннего цитомегаловирусного промотора на базе вектора pBK-CMV, содержащего ген устойчивости к генетицину (G418). Подбор условий трансфекции с использованием липидов Unifectin-56 осуществляли согласно рекомендации производителя. В качестве репортерной конструкции использовали плазмиду p-EGFP-N2 (ClonTech), кодирующей зеленый флюоресцирующий белок (GFP). Клетки всех использованных линий культивировали в стандартных условиях в.среде DMEM (ПанЭко, РФ) с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (HyClone, США), 10 мг/мл гентамицина (ПанЭко, РФ) при 37°С и 5% С02 в инкубаторе. Смену культуральной среды проводили каждые 48 часов.

Приготовление цельноклеточных противоопухолевых вакцин. При достижении монослоя 50% при смене культуральной среды вводили исследуемый цитокин: рекомбинантный мышиный IFN-y (kat № 315-05, PetroTech Inc., USA) или рекомбинантный мышиный TNF-a (kat № 315-01 А, PetroTech Inc., USA). Клетки культивировали в С02-инкубаторе в стандартных условиях.

Для культивирования клеток в присутствии INF-y использовали концентрации 5 нг/мл и 10 нг/мл культуральной среды в двух временных режимах культивирования: 24 и 48 часов. Для культивирования клеток в присутствии TNF-a применяли концентрации 25 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл культуральной среды в 3 временных режимах культивирования: 12, 24, 48 часов. В качестве сравнения использовали клетки GM-CSF-секретирующего клона BG, которые культивировали в аналогичных условиях без добавления цитокинов. При завершении сроков инкубации проводили обзорную микроскопию полученных планшетов для визуальной оценки

фенотипических признаков клеток после воздействия цитокина и определения жизнеспособности клеток. Следующий этап - снятие инкубированных клеток с подложки при помощи раствора Версена, подсчет и оценка жизнеспособности по стандартной методике. Для приготовления вакцин полученные клетки отмывали трижды культуральной средой с помощью осаждения на центрифуге. Инактивацию клеток проводили путем ионизирующего облучения по общей методике. Клетки помещали в стерильные стеклянные флаконы (с добавлением культуральной среды для поддержания жизнедеятельности) и облучали на источнике "/-излучения Агат-Р с источником облучения 60Со в клинике экспериментальной терапии РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Суммарная доза облучения, получаемая клетками, используемыми для вакцинации животных, составляла 100 Грей.

Условия криоконсервации и создание банка клеточных культур. Для длительного хранения клетки консервировали путем замораживания в жидком азоте в среде, содержащей питательную среду ДМЕМ (45%), ТЭС(50%), ДМСО(5%). Режим замораживания-, снижение температуры на ГС в минуту до минус 25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводили в 10 мл среды ДМЕМ и осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Жизнеспособность клеток после размораживания составляла 90%. Культуры клеток переносили в культуральный флакон объемом 25 см2 для поддержания их роста.

Определение жизнеспособности и роста клеток. Оценку скорости роста клеток и их подсчет проводили в инвертированном световом микроскопе DMIL (Leica Microsystems, Германия). За монослой принимали слой плотно прилегающих друг к другу клеток, растущих на одной поверхности. Окраску клеток проводили раствором Эозин-синий с последующим подсчетом в камере Горяева общепринятым методом. Допустимым считали 5% гибель клеток. Микрофотосъемку выполняли с помощью . оборудования Nikon (Nikon digital camera DXM1200F,

инвертированный световой микроскоп Nikon Eclipse TE2000-U, Япония) в культуралъной среде при увеличении х40.

Проточно-цитофлуориметрический анализ. Полученные клетки центрифугировали дважды в течение 7 мин при 1000 об/мин в растворе PBS и ресуспензировали. Вводили по 4 мкл необходимых антител. В работе использованы антитела производства Becton Dickinson and Company (BD Biosciences), USA: F1TC Mouse-Anti Mouse 1-Ab mouse, клон AF6-120.1, (Balb|c) IgG2a, K, кат. номер553551 (для МНС 2) и FITC Mouse-Anti Mouse Н-2Db mouse, клон (Balb|c) IgG2b, к, кат. номер 553573 (для MHC1), поставщик: ООО «БиоЛайн». К клеткам негативного контроля добавляли 300 мкл формальдегида. Инкубацию проводили в течение 30 мин при ТС, далее полученные смеси дважды центрифугировали при добавлении 1 мл раствора PBS. Оценку уровня экспрессии антигенов МНС I и МНС II проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), укомплектованном аргоновым лазером (длина волны 488 нм), с использованием программного обеспечения CELLQuest. В каждой пробе анализировали до 5000 событий.

Экспериментальные животные. Эксперименты с

трансплантированными опухолями проведены на мышах линии С57В1/б (гаплотип Н-2Ь), полученных из питомника лабораторных животных РАМН «Столбовая» с содержанием в стандартных условиях. В работе использовали мышей-самцов 8-12 недельного возраста, массой 20-25 г в количестве до 2000 особей. Для каждого опыта в соответствии со схемой эксперимента мышей разделяли на группы по 8 мышей в каждой. У мышей линии C57BI/6 отсутствуют локусы Н-2Еа и H-2L МНС 1 и II классов.

Иммунизацию мышей проводили подкожно, в область левой подмышечной впадины по 1х106 клеток в 100 мкл 0,9% раствора натрия хлорида с помощью инсулиновых шприцов. Предварительно заготовленную цельноклеточную GM-CSF секретирующую вакцину после хранения в

жидком азоте дважды отмывали путем осаждения на центрифуге (бессывороточной средой ДМЕМ, далее 0,9 % раствором натрия хлорида).

Трансплантация опухолевых клеток и учет динамики роста опухоли. Для индукции опухолей ЖИВОТНЫМ ЛИНИИ С57В1/6 подкожно в область правой подмышечной впадины трансплантировали по 1x105 клеток линии В16Р10 в 100 мкл суспензии (что составляет для данных животных 10 ТОюо). Через 5 дней после трансплантации и далее через каждые 2-3 дня животных обследовали на наличие пальпируемых опухолей в области введения клеток. Отмечали сроки достижения опухолями линейного размера 15 мм в любом измерении, сроки гибели животных. Формирующиеся опухоли измеряли дважды в неделю. Объем опухоли определяли по формуле У=ОтаххО|х(Отах/2), где Бтах равен максимальному диаметру опухоли, а Э, - диаметру перпендикулярному максимальному. Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле:

ТРО(%) У(контр.)-У(опыт-)х100%

= V (контр.) , где V - объем опухоли (мм3).

Увеличение продолжительности жизни (УПЖ) рассчитывали по формуле:

УПЖ(%) СПЖ(контр.)-СПЖ(о пыт.)х 100% СПЖ (контр.)

где СПЖ - средняя продолжительность жизни (сут).

Торможение роста метастазов (ТРМ) рассчитывали по формуле:

ТРМ (%) М (контр.)-М (опыт.)х 100%

= М (контр.) , где М - масса легкого с метастазами (г).

Статистическая обработка результатов. Анализ динамики роста опухолей у экспериментальных животных проводили с расчетом среднего значения объема опухоли у мышей экспериментальной группы и ошибки среднего значения. Статистическую достоверность различий между контрольной и опытной группами определяли по методу АЫОУА. Определение шансов возникновения признака и расчет доверительных интервалов проводили с помощью пакета программ 8ТАТ18Т1СА.

Результаты исследования и их обсуждение.

По разработанной методике из клеток В16Р10 СМ-С8Р-секретирующего клона ВО получено 8 видов цельноклеточной ОМ-С8Р секретирующей противоопухолевой вакцины (Табл.1).

Таблица 1

Виды целыюклеточных противоопухолевых вакцин, секретирукнцих С М-СвГ, модифицированных с помощью преинкубации с цитокинами.

Цитокин Время культивирования (час.) Концентрация цитокина (нг/мл культуральной среды)

INF-Y 24 5

INF-y 24 10

INF-y 48 5

INF-y 48 10

TNF-a 24 25

TNF-a 24 50

TNF-a 48 25

TNF-a 48 50

Было отмечено, что присутствие INF-у в среде в концентрации 5 и 10 нг/мл культуральной среды и времени экспозиции 48 часов значительно повышает способность клеток B16F10 GM-CSF-секретирующего клона BG к дифференцировке. При обзорной микроскопии выявлено выраженное увеличение гиперпигментированных гранулсодержащих клеток, снижение количества делящихся клеток. На Рис Л представлены результаты обзорной микроскопии клеток GM-CSF-секретирующего клона BG, культивированых 48 часов в присутствии INF-y (концентрация 10 нг/мл культуральной среды), по сравнению с клетками той же линии, культивированной без присутствия цитокинов в среде (Рис. 2). Морфологические свойства клеток не менялись при культивировании по описанной ранее методике в присутствии TNF-a при концентрации 25, 50,100 нг/мл культуральной среды в течение 12-, 24-, и 48 часов. При культивировании в присутствии TNF-a в концентрации 100 нг/мл культуральной среды в течение 12 часов гибель клеток составила более 30%. Данная концентрация в ходе дальнейших экспериментов не применялась в связи с выраженным цитотоксическим эффектом.

Жизнеспособность клеток, культивированных в присутствии Т№-а и ЮТ-у в течение 24 и 48 часов не отличалась от контроля (составила более 95%).

Щь

Рис. 1. Микроскопия клеток СМ-секретирующего клона ВС, культивированных без присутствия цнтокииов в срсдс (контроль).

Jlp

Рис. 2. Микроскопии клеток GM-CSF секретирующего клона BG, культивированных 48 ч. в присутствии INF-y (10 нг/мл культуральнон среды).

А 1

[1 \ М1 I

10й 10'

10 FL1-H

10 10

Рис. 3. Гистограмма распределения клеток Рис. 4. Гистограмма распределения клеток линии B16F10, клона BG по интенсивности линии B16F10, клона BG при инкубации с флуоресценции (контроль); темно- IFN-y (10 нг/мл, 48 ч.) по интенсивности окрашенная кривая - негативный флуоресценции; темно-окрашенная кривая -контроль, наложенная сверху кривая - негативный контроль, наложенная сверху клетки, положительно окрашенные кривая - клетки, положительно окрашенные антителами к МНС I. антителами к МНС I.

Показано, что преинкубация клеток в среде с указанными цитокинами повышает экспрессию МНС как I, так и II класса. Более выраженную активность продемонстрировал INF-у. Преинкубация клеток B16F10 клон BG в течение 48 час в среде, содержащей INF-y в концентрации 5 нг/мл достоверно повышала экспрессию МНС II до 14%, а в концентрации 10 нг/мл - до 16% (по сравнению с контролем более чем в 4 раза и более, чем в 5 раз - соответственно). Экспрессия МНС I достоверно увеличилась на 92% и 97% соответственно (р<0,05), что приблизительно в 100 раз выше соответствующих значений контрольной группы (Рис. 3, 4). Время инкубации имело принципиально важное значение: 24-часовая инкубация была не эффективна.

ТИБ-а оказывал гораздо менее выраженное влияние на экспрессию клетками В16Р10 клон ВО антигенов МНС I и II класса. При 48-часовой инкубации клеток в присутствии ТОТ-сс в концентрации 50 нг/мл среды выявлено увеличение экспрессии МНС I до 13% по сравнению с контрольной группой. Остальные режимы культивирования не выявили существенных изменений. Данные представлены в виде диаграмм на рисунках 5,6.

о/ ^отрицательно контроль п+АткМНСП

Рис. 5. Экспрессия МНС II на клетках СМ-С8Р-секретирующего клона ВС, культивированных в присутствии цитокинов в различных режимах.

% отраца тельный контроль я лт к МНС 1

юо -

80 -

70 -

60 Г'Щ

БО I АО ^--------------------------- 1 — Щ- -........................—_

| 3 О 1 го I 10 ------------- ¡ш« ...... ......... —...........^щ---

| о контроль ^ - «Г # ^ ^ « ^ ^ ^

* — р<0,05 по сравнению с контрольной группой

1'ис. 6. Экспрессия МНС I на клетках СМ-СвР-секрегирующего клона ВС, культивированных в присутствии цитокинов в различных режимах.

Дизайн проведенных irt vivo экспериментов для изучения экспериментальных подходов к повышению эффективности цельноклеточной GM-CSF секретирующей противоопухолевой вакцины представлен в виде схемы на рисунке 7.

Эффективность профилактического применения вакцин выражена в значительном увеличении продолжительности жизни вакцинированных животных по сравнению с контрольными. Максимально эффективным для первичной профилактики возникновения меланомы оказался режим вакцинации с использованием цельноклеточной противоопухолевой СМ-СБР секретирующей вакцины, модифицированных 48-часовой преинкубацией с ЮТ-у в концентрации 10 нг/мл. Показано достоверное увеличение средней продолжительности жизни животных по сравнению с контролем до 53,1± 3,0 суток (р<0,05), при этом у 28,5% мышей отмечено полное торможение опухолевого процесса. На 52 сутки после трансплантации клеток меланомы роста опухоли не наблюдалось у 72% животных (95% ДИ (63,2- 80,8)), достоверность различий с контрольной группой р<0,05.

Сравнительная оценка эффективности интактной, модифицированной с помощью INF-y и модифицированной с помощью TNF-a цельноклеточной GM-CSF секретирующей противоопухолевой вакцины представлена в виде диаграмм на рисунках 8, 9. Показано достоверное увеличение УПЖ (р<0,05) по сравнению с контрольной группой животных, которым не проводили профилактическую вакцинотерапию. В ходе проведения данных экспериментов было выявлено появление инфильтратов на месте введения вакцины. Данный процесс отражает развитие локальной реакции гипечувствительности замедленного типа (ГЗТ) и степень ее выраженности.

Повышение экспрессии антигенов МНС клетками противоопухолевой вакцины при инкубации их с INF-y in vitro может приводить к повышению на поверхности клеток уровня опухоль-ассоциированных антигенов и как следствие, специфической эффективности вакцинотерапии.

Рис. 8. Увеличение продолжительности жизни животных с меланомой Н16Р10, вакцинированных в профилактическом режиме интактной, модифицированной с помощью ЮТ-у и Т№-а цельноклеточной СМ-С8Р

секретирующей противоопухолевой вакциной.

Рис. 9. Частота «излечения»** животных с меланомой В16Р10, вакцинированных в профилактическом режиме интактной, модифицированной с помощью ЮТ-у и ТОТ-а цельноклеточной GYJ-C.SK секретирующей противоопухолевой вакциной.

* -р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

** - «излечение» - отсутствие роста опухоли па месте трансплантации опухолевых клеток на фоне профилактического применения вакцины.

Исходя из полученных данных в экспериментах по цитотоксичности на основании Ь050 для применения в последующих экспериментах в качестве адъювантной терапии при вакцинации бМ-СБР секретирующей цельноклеточной противоопухолевой вакциной выбрана доза 25 мг/кг в сутки, режим введения - пятикратный, схема введения - пятикратное введение циметидина до- и пятикратное введение после вакцины.

На фоне 5-кратного введения циметидина значительно усиливается профилактическая активность цельноклеточной ОМ-СБР секретирующей противоопухолевой вакцины. Выявлено, что циметидин в дозе 25 мг/кг в сутки способен существенно ингибировать развитие опухоли. Показано достоверное увеличение средней продолжительности жизни животных по сравнению с контрольной группой до 46,0±5,7 суток (р<0,05), при этом у 33% мышей отмечено полное торможение роста опухоли (Рис. 10, 11).

34,014,5

12 15 13 20 22 25 27 29 32 сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки I—№йтротгь -«Ь-вакцина —вэкцинащиметидим

46,015,7

Рис.10. Влияние циметидина в адьювантном режиме на развитие меланомы В16К10 при

вакцинотерапии СМ-СвР

секретирующей цельноклеточной противоопухолевой вакциной.

Рис.11. Средняя продолжительность жизни животных, вакцинированных С.М-СНР секретирующей

цельноклеточной противоопухолевой вакциной в режиме ионотерапии и вакцинированных СМ-СвР

секретирующей цельноклеточной противоопухолевой вакциной с применением циметидина в

адьювантном режиме.

* - р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

В терапевтическом режиме применение интактной и модифицированной преинкубацией в среде, содержащей цитокины (TNFa или INF-y) GM-CSF секретирующей вакцины в качестве монотерапии, а также применение ингибитора Н2-рецепторов гистамина циметидина в качестве адьювантной терапии при вакцинации не оказывает влияния на продолжительность жизни мышей с развившимися опухолями. Показано,что применение вакцины на фоне циметидина оказывало стимулирующее влияние на рост первичной опухоли. При этом, нельзя исключить, что в данном случае мы имеем дело с «ложной» стимуляцией опухолевого роста, обусловленной повышенной ее инфильтрацией иммунных клеток и клеток стромы, гиперпролиферирующих в зоне опухолевого роста. Об этом свидетельствует появление инфильтратов на месте вакцинации, что указывает на развитии реакции по типу ГЗТ.

Изучение противоопухолевой активности модифицированных in vitro цитокинами цельноклеточных противоопухолевых вакцин in vivo в терапевтическом режиме в комбинации с цитостататическими средствами (высоко- и низкодозовая химиотерапия) через 48 часов после трансплантации опухолевых клеток или отсроченно на 7-е сутки опыта (для лечения развившейся опухоли). В проведенных экспериментах использовали циклофосфамид (в дозах 300, 150, 100 или 30 мг/кг), цисплатин (в дозах 8, 4 и 2,5 мг/кг), доксорубицин (в дозе 7 мг/кг), лизомустин (в дозе 175 мг/кг) внутрибрюшшшо.

Применение вакцины не усиливало противоопухолевого действия циклофосфамида в высокой дозе (300 мг/кг) по критерию увеличения продолжительности жизни. Сочетанное применение вакцинотерапии через 7 дней после химиотерапии, не усиливая эффекта терапии в отношении первичного опухолевого узла, достоверно увеличивало среднюю продолжительность жизни животных с развившимися опухолями (Рис. 12).

0 Л» / /> / / & / / / / / ./ / / / „/

1 ^ / // // // // / ' ^ / V /////

^ * ~ р<0,05 по сравнению

¿Р с контрольной группой.

<чО ^ ЦФ-циклофосфамид.

ЦП-цисплатин.

Рис. 12. Влияние химиотерапии в сочетании с вакцинотерапией цельноклеточной противоопухолевой &У1-С8Е секретирующей вакциной на продолжительность жизни мышей с меланомой НК)110.

Введение противоопухолевой ОМ-СЗБ секретирующей цельноклеточной вакцины при отсроченном начале вакцинотерапии (на 14 сутки эксперимента) не усиливало эффекта терапии в отношении первичного опухолевого узла, однако достоверно увеличивало среднюю продолжительность жизни животных с развившимися опухолями (р<0,05 по сравнению с контрольной группой). Более выраженный терапевтический эффект выявлен при комбинированной терапии цисплатином в дозе 8,0 мг/кг и вакцинотерапии вМ-СБР секретирующей цельноклеточной вакцины на 14 сутки эксперимента. Отмечено достоверное увеличение продолжительности жизни на 41% и торможение роста опухоли на 57% к завершению периода наблюдения (19 сутки эксперимента), р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

Оценку эффекта вакцинотерапии ОМ-СБР секретирующей цельноклеточной вакцины при сочетанном применении с циклофосфамидом в низких дозах проводили в терапевтическом режиме спустя 7 дней после трансплантации меланомы В16Р10. Циклофосфамид применяли в дозе 30

мг/кг, ежедневно в течение пяти последующих дней до или после вакцинации Результаты представлены на рисунке 13.

£ 150%

з: с;

с 100%

сх о

? 50%

-100%

* р < 0,05 (различия с контрольной группой) **р < 0,05 (различия с группой, получавшей —♦—вакцина вакцину в режиме монотерапии)

-150%

—иакцина1ЦФ 130 мг/кг, 7-11 сутки)

ЦФ — циклофосфамид

* ЦФ (30 мг/кг, 2-6 сутки)+ вокцима+ЦФ (30 мг/кг, 7-11 сутки)

Рис. 13. Влияние инзкодозовой химиотерапии цнклофосфамидом в комбинации с СМ-СйК секретнрующен цельиоклеточной вакциной на торможение роста первичной опухоли в отсроченный период наблюдения.

На фоне комбинированного применения вМ-СБР секретирующей цельиоклеточной вакцины и циклофосфамида в режиме до- и после вакцинации отмечено достоверное подавление роста опухоли в динамике более, чем на 60% (р<0,05 по сравнению с контрольной группой). На 25 сутки эксперимента, к моменту начала гибели животных контрольной группы, торможение роста опухоли составило 73% (р<0,05 по сравнению с контрольной группой; р<0,05 по сравнению группой животных, получавших вакцину в режиме монотерапии). Контрольные животные, не получавшие лечения, прожили 24.9±1.2 дня; а животные, получавшие комбинированное лечение (циклофосфамид в дозе 30 мг/кг в режиме до- и после вакцинации) -37.0±5.1 дней (УПЖ до 49%, р<0,05 по сравнению с контрольной группой). На начальных сроках наблюдения за динамикой развития опухоли отмечена стимуляция её роста в группе животных, получавших вакцину в режиме монотерапии, и группе животных, получавших циклофосфамид после

проведения вакцинотерапии. Этот феномен, вероятно, связан с инфильтрированием опухолевого узла активированными в результате вакцинации клетками иммунной системы. Эти результаты совпадают с полученными ранее данными роста опухоли на фоне вакцинации GM-CSF секретирующей цельноклеточной вакциной в режиме монотерапии. В пользу такого предположения свидетельствуют результаты дальнейшего наблюдения за ходом эксперимента, где не выявлено достоверного увеличения размеров опухолевого узла в группе животных, получавших вакцину в режиме монотерапии, по сравнению с контрольной группой.

Сочетанное применение высокодозной химиотерапии, вакцинотерапии с применением цельноклеточной противоопухолевой GM-CSF секретирующей вакцины и биотерапии (трансплантация костного мозга -1x10й клеток костного мозга, выделенных из бедренной кости сингенных животных) по сравнению с проведением высокодозной химиотерапии (циклофосфамид в дозе 350 мг/кг или цисплатин 8 мг/кг однократно) в режиме монотерапии оказывало приблизительно равный терапевтический эффект, достоверно отличающийся от контрольной группы животных, (р<0,05); от группы животных, получавших вакцинацию в режиме монотерапии (р<0,05); от группы животных с проведенной трансплантацией костного мозга в режиме монотерапии (р<0,05). В то же время, воздействие цитостатиков в режиме высокодозной монотерапии было не достаточно эффективным в отношении процесса метастазирования опухоли в легкие.

Результаты типичного эксперимента с использованием

циклофосфамида в качестве циторедуктивного агента представлены в

таблице 2. Для вакцинотерапии использовали три вида цельноклеточной

противоопухолевой GM-CSF секретирующей вакцины: первая

модифицированная преинкубацией in vitro с INF-y (в концентрации 10 нг/мл

среды), вторая- модифицированная преинкубацией in vitro с TNF-a (50 нг/мл

среды) в течение 48 часов, по описанной ранее методике, третья- интактная

(немодифицированная цитокинами). У 43% мышей, получавших

циклофосфамид в режиме монотерапии, развились метастазы. В то же время в группах животных, получавших циклофосфамид совместно с трансплантацией костного мозга и целыгоклеточной противоопухолевой GM-CSF секретирующей вакциной, модифицированной преинкубацией in vitro в присутствии INF-у, метастазы возникли только у 14% мышей в группе.

Таблица 2

Влияние сочстанного применения цнклофосфамида и вакцинотерапии на продолжительность жизни мышеи с подкожно привитой меланомой B16F10 и процесс ее метастазирования в легкие.

№ Воздействие СПЖ УПЖ Частота метаста-

/дни / /%/ зирования /%/

1 Контроль 22,7 ±3,5 - 0

2 вакцина Т№-а 19,5 ±3,8 ......0

3 вакцина ЮТ-у 27,9 ±3,7 23 14

95% ДИ 95% ДИ (7,2+20,8)

(14,8-31,2)

4 циметидин 23,4 .f 4.1 3 о"

95% ДИ (0-6,3)

5 циметидин + 24.212.6' 6 И """......

вакцина ГЫ^у 95% ДИ (1,3-10,7)

6 циклофосфамид + 52 *),**),*** 0

костный мозг 95% ДИ

(£2,2*61,8)

7 циклофосфамид + 80 *),**),*** 14

костный мозг + 95% ДИ 95% ДИ (7,2+20,8)

вакцина ЮТ-у (72,2-87,8)

8 циклофосфамид + 29,7 !. 4.3 31 *),**),***

костный мозг + 95% ДИ

вакцина ТОТ^а (21,9-40,1)

9 циклофосфамид + 32,6 ± 1,5 43 *),**),*** .....о ...........

циметидин 95% ДИ

(33,3-52,7)

10 циклофосфамид + 35.0; 4.6 54 *),**),*** 16

костный мозг + 95% ДИ 95% ДИ (8,8+23,2)

вакцина 1ЫР-у +циметидин (44,2+63,8)

П циклофосфамид 42.4 ! 6.1 87*),**),*** " 43*),**),***

95% ДИ 95% ДИ

(80,4-93,6) (33,3+52,7)

костный мозг 3 0

95% ДИ (0+6,3)

* - р<0,05 по сравнению с контрольной группой

** - р<0,05 по сравнению с группой животных, получавших циметидин в режиме монотерапии

*** - р<0,05 по сравнению с группой животных с проведенной транспчантацией костного мозга в режиме монотерапии

Применение комбинации цельноклеточной GM-CSF секретирующей вакцины, модифицированной INF-y in vitro, и дополнительно циметидина в адьювантном режиме снижало эффективность терапии по отношению к росту первичного опухолевого узла. Выявлено увеличение индекса ТРО до 50% (р=0,05 по сравнению с контрольной группой), что совпадает с результатами, полученными в ранее проведенных экспериментах. Вероятно, это обусловлено повышенной инфильтрацией опухоли клетками иммунной системы и клетками стромы, гиперпролиферирующих в зоне опухолевого роста. Применение циметидина приблизительно в 2 раза снижало эффективность сочетанной терапии по сравнению с применением высокодозной химиотерапии в режиме монотерапии. Однако по сравнению с контрольной группой достигнуто достоверно значимое повышение индекса УПЖ.

Изучение противоопухолевой активности модифицированной in vitro цитокинами цельноклеточной GM-CSF секретирующей противоопухолевой вакцины in vivo в терапевтическом режиме в комбинации с хирургическим удалением первичного опухолевого узла проводили по общей схеме. На 0-й день эксперимента каждой мыши в опытной и контрольной группах трансплантировали подкожно по 1x106 клеток меланомы B16F10. В каждой группе было по 7-8 животных. На 9-й день опыта первичные опухоли (достигшие размера 700-1000 мм3) у всех животных удаляли хирургическим способом. Операцию проводили с использованием гексеналового наркоза (100 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Животным разных групп вакцину вводили до операции (за 5 дней до удаления первичного опухолевого узла), после операции (через 5 дней после операции), а также, до- и после операции (в те же сроки).

Применение модифицированной преинкубацией с INF-y in vitro

цельноклеточной GM-CSF секретирующей вакцины на фоне хирургического

удаления первичного опухолевого узла обладает более выраженной

антиметастатической активностью по сравнению с интактной

(немодифицированной с помощью ЮТ-у) вакциной. В апробированных режимах применение вакцинотерапии на фоне хирургического удаления первичного опухолевого узла отмечено ингибирование процесса метастазирования меланомы в легких на 21-43% (в разных схемах введения). Предоперационная вакцинация животных не показала достоверного снижения интенсивности метастазирования. Наиболее выраженный антиметастатический эффект отмечали в группе животных, получавших вакцину после -, а также в режиме до- и после удаления первичного опухолевого узла. Торможение роста опухоли составило 37% (р<0,05 по сравнению с контрольной группой) в режиме послеоперационной вакцинации, и 43% (р<0,05 по сравнению с контрольной группой) в режиме двукратной вакцинации (до- и после хирургического удаления первичного опухолевого узла. Полученные данные представлены на рисунке 14.

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

29% 20,1г37 9

mmSmmB&i

43%* 33,3+52,7

шШШШИа

до хирургического лечения после хирургического лечения до/после хирургического

лечения

Различия с контрольной группой: *р<0,05

Рис. 14. Анти мета стати ческа я активность цельноклеточной противоопухолевой GM-CSF секретирующей, модифицированной INF-y in vitro, вакцины (при разных режимах введения) на фоне хирургического удаления первичного опухолевого узла.

Выводы.

1. Повышение экспрессии антигенов МНС клетками противоопухолевой вакцины при их инкубации с INFy in vitro приводит к повышению эффективности цельноклеточной противоопухолевой GM-CSF секретирующей вакцины.

2. Для повышения экспрессии МНС необходима инкубация опухолевых клеток в среде, содержащей INFy, в течение длительного времени. Максимальный уровень экспрессии отмечен при концентрации 10 нг/мл среды в течение 48 часов. Менее продолжительная инкубация при той же концентрации не вызывает достаточного увеличения экспрессии МНС.

3. Применение ингибитора Н2-рецепторов гистамина (циметидина) дает основания рассматривать его как возможный метод повышения иммуногенности цельноклеточной противоопухолевой вакцины, секретирующей GM-CSF, in vivo.

4. Вакцина, полученная на основе модифицированных геном GM-CSF клеток, после их преинкубации в среде, содержащей оптимальную концентрацию INFy и достаточное время экспозиции, оказывает более выраженное профилактическое и терапевтическое действие.

5. Наилучший терапевтический эффект отмечен при сочетанном применении биотерапии на основе GM-CSF-секретирующих клеток, инкубированных в присутствии INFy in vitro, и хирургическом удалении первичного опухолевого узла. Эти результаты позволяют оптимизировать режимы проведения вакцинотерапии в клинической практике.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Манина И.В., Перетолчина Н.М., Сапрыкина Н.С., Козлов A.M., Михайлова И.Н., Барышников А.ГО. Доклинические исследования иммунотерапии меланомы кожи с помощью цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF. // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. -№3. - С. 47-50.'

2. Манина И.В., Перетолчина Н.М., Сапрыкина Н.С., Козлов A.M., Михайлова И.Н., Жорданиа К.И., Барышников А.Ю. Перспективы применения антагониста Н2-гистаминовых рецепторов (Циметидина) в качестве адьюванта биотерапии для лечения меланомы. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2010. - №4. - С. 10-17.

3. Козлов A.M., Манина И.В. Повышение эффективности биотерапии опухолей путем модификации иммунного ответа с помощью ингибитора Н2-рецепторов гистамина. Материалы Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология практическому здравоохранению». Москва, 25-26 февраля 2010. // Российский Аллергологический Журнал. - 2010. - №1 (1). - С. 81-82.

4. Манина И.В., Сапрыкина Н.С., Козлов A.M., Михайлова И.Н. Экспериментальные исследования иммунотерапии меланомы кожи с помощью цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF. // Материалы Межрегионального форума «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии - междисциплинарные проблемы». Санкт-Петербург 27-30 сентября 2010. // Российский Аллергологический Журнал. - 2010.-№1 (1).-С. 176-177.

5. Манина И.В., Сапрыкина Н.С., Перетолчина Н.М., Михайлова И.Н., Козлов A.M. Изучение применения методов комбинированной терапии меланомы кожи в эксперименте. // Материалы XIV Российского онкологического конгресса. Москва 23-25 ноября 2010. - С. 256-257.

Подписано в печать оа.ц.ю Формат60*84/16. Бумага офисная «Бу^оСору». Тираж 100 экз. Заказ №956 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Оглавление диссертации Манина, Ирина Владимировна :: 2011 :: Москва

Список сокращений.

Введение.

Глава 1.Обзор литературы

1.1 .Биотерапия - как перспективный подход к лечению онкозаболеваний.

1.2.Способы получения и виды противоопухолевых вакцин.

1.3.Представление антигенов в клетке меланомы

1.4. Реализация противоопухолевого иммунного ответа.

1.5.Изменение экспрессии МНС в опухолевых клетках как причина низкой иммуногенности опухолей.

1.6.Применение цельноклеточных GM-CSF секретирующих противоопухолевых вакцин в онкологии.

1.7. Способы повышения эффективности противоопухолевых вакцин.

1.8. Комбинирование разных терапевтических подходов как способ повышения эффективности биотерапии.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1.Клеточные линии и их культивирование.

2.2.Приготовление цельноклеточных противоопухолевых вакцин.

2.3.Условия криоконсервации и создание банка клеточных культур.

2.4. Определение жизнеспособности и роста клеток.

2.5. Проточно-цитофлуориметрический анализ.

2.6. Экспериментальные животные.

2.7. Иммунизация мышей.

2.8. Трансплантация опухолевых клеток и учет динамики роста опухоли.

2.9. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Результаты исследования.

Раздел 3.1. Повышение эффективности цельноклеточной GM-CSF секрети-рующей противоопухолевой вакцины in vitro.

3.1.1. Повышение эффективности цельноклеточной GM-CSF секрети-рующей противоопухолевой вакцины in vitro путем культивирования в присутствии цитокинов.

3.1.2.Изучение экспрессии МНС I и МНС II на клетках GM- CSF секретирующей противоопухолевой вакцины.

Раздел 3.2. Изучение эффективности цельноклеточной GM-CSF секретирующей противоопухолевой вакцины in vivo.

3.2.1.Изучение эффективности цельноклеточной противоопухолевой GM-CSF секретирующей вакцины in vivo в различных профилактических режимах :.

3.2.1.1. монотерапия.

4.2.1.2. в комбинации с адьювантной терапией.

3.2.2.Изучение эффективности цельноклеточной противоопухолевой GM-CSF секретирующей вакцины in vivo в различных терапевтических режимах :.

3.2.2.1.монотерапи я.

3.2.2.2. в комбинации с цитостатиками.

3.2.2.3. в комбинации с трансплантацией костного мозга и применением цитостатиков.

3.2.2.4. в комбинации с адьювантной терапией, трансплантацией костного мозга и применением цитостатиков.

3.2.2.5. в комбинации с хирургическим удалением первичного опухолевого узла.

Глава 4. Обсуждение.

Введение диссертации по теме "Онкология", Манина, Ирина Владимировна, автореферат

Актуальность исследования.

Из методов эффективной иммунотерапии опухолей наиболее перспективным является вакцинотерапия - введение в организм опухолевых антигенов [3]. После введения антигена в организм он должен быть захвачен антиген-презентирующими клетками (АПК), процессирован и представлен в виде пептидных фрагментов в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) [14].

Введение инактивированных опухолевых клеток больному сравнимы с введением опухолевых антигенов, так как предполагается, что после инъекции опухолевые клетки будут захвачены АПК. В настоящее время в научных центрах мира проходят исследования по применению противоопухолевых вакцин на основе опухолевых клеток [20,68,70]. Для генерации более мощного иммунологического ответа опухолевые клетки трансфицируют геном, который кодирует тот или иной цитокин. Наибольшей активностью обладает ОМ-СйР. При использовании аллогенной вакцины решается проблема со временем и трудностью получения клеточной линии. Самый главный вопрос - это адекватность использования аллогенных опухолевых клеток для лечения и профилактики рецидивов онкологических заболеваний. Известно, что опухоль одного и того же гистогенеза у одного больного будет отличаться от опухоли другого больного по спектру экспрессируемых опухолевых антигенов. Таким образом, эффективность лечения, при прочих равных условиях, будет зависеть от степени перекрывания опухолевых антигенов, экспрессирующихся на вводимой клеточной линии и опухоли самого больного, то есть повышения иммуногенности вакцины [23,29,66].

Опыт клинического применения СМ-СБР-секретирующих вакцин из транзиторно трансфицированных аутологичных опухолевых клеток пациентов подтвердил эффективность такого вида биотерапии опухолей человека. Позитивные клинические изменения были получены у 25-30% пациентов с III и IV стадией меланомы, недостаточно отвечающих на предшествующие курсы химиотерапии. Дополнительным преимуществом вакцин, секретирующих ОМ-СЭР, оказались хорошая переносимость и широкий (в сравнении с 1Ь -2, 1Ь -4, 1Ь-6, ШЫ-у) интервал терапевтических доз [2,4,6,18,27,80].

В то же время противоопухолевая вакцинация оказалась недостаточно эффективной в качестве самостоятельного средства терапии злокачественных новообразований [30]. Одной из главных причин низкой эффективности противоопухолевых цельноклеточных вакцин является низкая иммуногенность самих опухолевых клеток. Плохое распознавание опухолевых клеток Т-лимфоцитами происходит вследствие неадекватной презентации антигенов. Это часто происходит по причине утрачивания комплексов МНС I и II классов, необходимых для презентации антигенов' [13].Так, в случае с меланомой показано, что из 11 первичных линий клеток от больных меланомой, антигены НЬА I класса были экспрессированы в 10 случаях, а антигены НЬА И- в 1 клеточной линии [23,78].

Таким образом, восстановление экспрессии комплексов МНС имеет принципиальное значение для реализации нормального противоопухолевого иммунного ответа [13, 210]. Сложившаяся ситуация подталкивает исследователей к поиску методов повышения иммуногенности вакцин, подбору более эффективных комбинаций иммунотерапевтических методов с радио- и химиотерапией, а также к сочетанному применению иммунопрепаратов, воздействующих на разные этапы формирования и реализации противоопухолевого иммунного ответа.

Цель исследования: экспериментальное обоснование подходов к повышению специфической активности цельноклеточной противоопухолевой вакцины, трансфицированной геном GM-CSF.

Задачи исследования:

Научная новизна:

Впервые изучено и показано, что терапевтическая эффективность цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF, при воздействии IFN-y значительно повышается. Впервые доказано, что увеличение уровня экспрессии МНС I и МНС II на опухолевых клетках в присутствие IFN-y приводит к усилению противоопухолевого иммунного ответа. Впервые апробировано в эксперименте применение модифицированных преинкубацией с цитокинами in vitro цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF, в различных терапевтических и профилактических режимах. Впервые выялено, что сочетанное применение блокаторов Н2-рецепторов гистамина (циметидина) и цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF, приводит к усилению профилактического действия вакцинотерапии.

Научно-практическая значимость:

Заключение диссертационного исследования на тему "Экспериментальные подходы к повышению эффективности GM-CSF - секретирующей цельноклеточной противоопухолевой вакцины."

выводы

1. Повышение экспрессии антигенов МНС клетками противоопухолевой вакцины при их инкубации с INF-y in vitro приводит к повышению эффективности цельноклеточной противоопухолевой GM-CSF секретирующей вакцины.

2. Для повышения экспрессии МНС необходима инкубация опухолевых клеток в среде, содержащей INF-y, в течение длительного времени. Максимальный уровень экспрессии отмечен при концентрации 10 нг/мл среды в течение 48 час. Менее продолжительная инкубация при той же концентрации не вызывает достаточного увеличения экспрессии МНС.

3. Применение ингибитора Нч-рецепторов гистамина (циметидина) дает основания рассматривать его как возможный метод повышения иммуногенности цельноклеточной противоопухолевой вакцины, секретирующей GM-CSF, in vivo.

4. Вакцины, полученные на основе модифицированных геном GM-CSF клеток, после их преинкубации в среде, содержащей оптимальную концентрацию INF-y и достаточное время экспозиции, оказывают значительно более выраженное профилактическое и терапевтическое действие.

5. При сочетанном применении биотерапии на основе GM-CSF-секретирующих клеток, инкубированных в присутствии INF-y in vitro, и хирургическом удалении первичного опухолевого узла отмечен наилучший терапевтический эффект. Эти результаты создают предпосылки для оптиматизации режимов проведения вакцинотерапии в клинической практике.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе на адекватной экспериментальной модели меланомы B16F10 апробированы подходы к повышению эффективности противоопухолевой цельноклеточной вакциной, секретирующей GM-CSF, с помощью методик in vitro и in vivo. Проведен сравнительный анализ эффективности биотерапии интактной и цитокин-модифицированной in vitro с помощью преинкубации с IFN-y и TNF-a клеток вакцины. Культивирование клеток GM-CSF секретирующего клона BG меланомы B16F10 в присутвии INF-y приводит к выраженному увеличению МНС I и II классов на поверхности клеток. При введении INF-y модифицированной вакцины отмечено усиление развития реакции ГЗТ в месте вакцинации, что вероятнее всего связано с повышением иммуногенности цельноклеточной вакцины. В различных профилактических и терапевтических режимах выявлено существенное преимущество модифицированной in vitro с помощью INF-y вакцины в противоопухолевой и антиметастатической активности. В экспериментальных условиях апробированы подходы к повышению эффективности вакцинотерапии in vivo. Перспективными для клинического применения являются адъювантная терапия с применением низкодозовой химиотерапии циклофосфамидом, а также использование антагонистов Н2-рецепторов гистамина. С целью отработки максимально эффективной схемы вакцинотерапии на фоне хирургического удаления первичного опухолевого узла проведены серии экспериментов, предполагающих введение вакцины до- и после хирургического лечения: наиболее эффективным является режим двукратной вакцинации. Совокупность полученных экспериментальных данных дает основание полагать, что применение комбинированных подходов био-химиотерапии позволит построить более рациональные схемы сочетанного применения их компонентов и, как следствие, значительно повысить противоопухолевую и антиметастатическую активность вакцинотерапии в клинической практике.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Манина, Ирина Владимировна

1. Балмасова И.П. Естественный иммунитет и персистенция вирусов гепатита В и С. / И.П. Балмасова.// Российский медицинский форум. -2007.-№4. - С.24-29.

2. Барышников А.Ю. Взаимоотношение опухоли и иммунной системы организма. /А.Ю. Барышников. //Практическая онкология 2003. - Т.4, № 3 - С. 127-130.

3. Барышников, А.Ю. Принципы и практика вакцинотерапии рака / А.Ю.Барышников // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. — 2004. — Т. 2. С. 59-63.

4. Бережная, Н.М. Тучные клетки и гистамин: физиологическая роль. / Н.М.Бережная, Р.И.Сепиашвили Р.И.// Аллергология и иммунология. -2003.-№4.-С. 29-38.

5. Березиной, А.Е. Разработка способов повышения эффективности клеточных противоопухолевых вакцин: Дис. канд. биол. наук: 14.00.14 /А.Е. Бережной.-Москва, 2007.-125 с.

6. Блохин, Б. М. Клиническое значение фактора некроза опухоли. / Б. М. Блохин, Е. С. Дубровина, А. Ю. Щербина и др. // Гематология и трансфузиология. — 1995. — Т. 40, № 5. — С. 34-35.

7. Хансон // Российский биотерапевтический журнал. 2003. - Т. 2, № 3 -С. 47-53.

8. Ершов, Ф.И. Интерфероны и их индукторы./ Ф.И. Ершов, О.И., Киселев.- М.: Геотар, 2005.- 356 с.

9. Закеева, ИР. Изучение роли неканонической молекулы главного комплекса гистосовместимости человека HLA-E в регуляции противоопухолевого иммунного ответа: Автореф. дис.канд. биол. наук: 03.00.03/ И.Р. Закеева.- Москва.- 2006.- 24 с.

10. Заридзе, Д.Г. Канцерогенез, /под ред.Д.Г. Заридзе.-М.:Медицина, 2004.576 с.

11. Кадагидзе, З.Г. Цитокины и их использование в онкологии / З.Г.Кадагидзе, // Int. J. Reabilitation. 1997. - Т. 6. - С. 47-56.

12. Кащенко, Э.А. Ксеновакцинотерапия меланомы в эксперименте./ Э.А. Кащенко, С.Н. Белогородцев, Г.В. Селедцова, Д.М. Самарин, И.В. Майбородин, В.И. Селедцов, A.A. Шишков, И.В. Савкин, В.А. Козлов.//Сиб.онкол.журн 2009. - №1 (31). - С. 28-31.

13. Ковалевский, Д.А. Экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов при меланоме кожи человека: Дис. канд. биол. наук: 14.01.12, 03.01.04/ Д.А. Ковалевский.- Москва, 2010.- 123 с.

14. Колесник, Е. А. Противоопухолевая аутовакцина в лечении больных распространенным колоректальным раком. / Е.А. Колесник, Г.П. Потебня, В.А. Кикоть, В.А. Черный, Г.С. Лисовенко, В.А. Семерников / / Онкология.- 1999.-(2).-С. 104-109.

15. Лисяный, Н.И. Достижения и проблемы применения интерферонов в нейроонкологии. /Н.И. Лисяный, В. М. Семенова, Ч. Д. Любич//Укр. Нейрохирург.журн. -2004.-ЖЗ.- С.29-36.

16. Михайлова, И.Н. Вакцинотерапия меланомы дендритными клетками /И.Н. Михайлова, H.H. Петенко, JT.B. Демидов // Российский биотерапевтический журнал, -2007. Т. 6, № 3. - С. 8-18.

17. Мкртчян, JIM. Эмбриональность и злокачественный рост: проблемы, созлание противораковой вакцины. /Л.М. Мкртчян. / /Новый армянск. Мед.журн. 2008. - Т.2, №1. - С. 36-55.

18. Моисеенко, В.М. Вакцинотерапия при меланоме кожи. / В.М. Моисеенко. // Рос. онкол. журнал. — 2005. —N 3. — С. 52—56.

19. Моисеенко, В.М. Возможности вакцинотерапии меланомы кожи / В.М. Моисеенко // Практическая онкология. 2001. - Т. 4, № 8. - С. 58-64.

20. Моисеенко, В.М. Проблемы иммунологии опухолевого роста и возможности вакцинотерапии В.М. Моисеенко, И. А. Балдуева //Медицинский академический журнал. -2007. Т. 7, № 4. - С. 17-35.

21. Москалева, Е.Ю. Перспективы создания противоопухолевых вакцин с использованием дендритных клеток человека/ Е.Ю. Москалева, С. Е. Северин // Иммунология. 2002.- Т.23, №1.- С. 8-15.

22. Пат. RU 219288 С2, 7 А61К39/00. Вакцина для стимуляции противоопухолевого иммунитета. / В.И. Селедцов, Д.М. Самарин, Г.В. Селедцова, В.В. Сенюков, Д.Н. Стрункин, A.B. Козлов. -№ 2000127993/14; Заявлено 2000.11.09; Опубл. 2002.11.20

23. Пат. RU2169006 С1, 7 А61К38/19, А61Р27/00, А61Р35/00. Способ лечения увеальной меланомы. / В.Г. Лихванцева, А.Ф. Бровкина, В .В. Вальский—№ 2000104108/14; Заявлено 2001.06.20; Опубл. 2001.06.20.

24. Переводчикова, Н.И. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний./под ред. Н.И. Переводчиковой.-2-е изд., перераб. и доп.,-М.: Практическая медицина,2005.-704 с.

25. Попович A.M. Иммунотерапия в онкологии./ A.M. Попович.// Справочник по иммунотерапии для практического врача СПб: Диалог, 2002. - С. 335-352.

26. Потебня, Г. П. Противоопухолевая вакцина повышает эффективность лечения онкологических больных. / Г. П. Потебня, Г. С. Лисовенко, С. И. Ялкут, Л. И. Русанова.//Провизор. 2002.- №5. - С. 15-22.

27. Потебня, Г. П. Эффективность иммунотерапии аутовакциной в лечении больных раком легкого. / Г. П. Потебня, И.И. Смоланка, Г.С. Лисовенко, Н.И. Ромашко, В.А. Семерников, Е.А. Колесник. // Онкология.- 2000.- 2 (3).- С. 191-194.

28. Потебня, Г.П. Противоопухолевые аутовакцины: перспективы применения. / Г.П. Потебня, Г.С. Лисовенко, С.И. Ялкут. // Доктор.-2002,- №2.- С. 24-30.

29. Poiim, А. Иммунология./А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл.-М.:Мир, 2000.- 582с.

30. Сепиагивши Р.И. Естественные киллеры и биогенные амины: паракринная регуляция в иммунной системе. Р.И. Сепиашвили, И.П. Балмасова. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. -2005.-91(8).-С. 927-941.

31. Серебрянская М.В. Динамика содержания простагландина Е у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки при различных видах лечения./ Серебрянская М.В., Масенко В.П. // Клиническая медицина.-1993.-(71).-С. 4547.

32. Скрыпник, И.Н. Современные подходы к назначению блокаторов Н2-гистаминоых рецепторов для лечения заболеваний органов пищеварения. /И.Н. Скрыпник, В.М. Потяженко, Т.В. Мельник. //Сучасна гастроэнт.-2005.-№2(22).- С.76-81.

33. Хабриева, Р.У J Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ./ под общ.ред. Р.У. Хабриева.-2-е изд.,перераб. и доп.-М.:Медицина,2005.-832 с.

34. Чиссов, В. И. Состояние онкологической помощи населению России в 2009 году. /Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой.-М.: ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий», 2010,- 196 с.

35. Яршин, А.А. Использование цитокинов в онкологической практике. / А.А. Ярилин.// Новости науки и техники. Сер. Медицина. Аллергия, астма и клин, иммунология. — 1999. — № 10. — С. 3-16.

36. Andrews. DM. Cancer vaccines for established cancer: how to make them better?/ DM. Andrews, E. Maraskovsky, MJ. Smyth.// Immunol Rev. -2008.-Apr. — 222. — P. 242-225.

37. Asakage, M. The effect of cimetidine mainly increases CD4+ cells of peripheral blood T lymphocytes. / Asakage M, Tsuno NH, Kitayama J, et al. // Gan To Kagaku Ryoho. — 2005. —32(11). — P. 1576-1577.

38. Atzpodien, J. GM-CSF plus antigenic peptide vaccination in locally advanced melanoma patients./ J. Atzpodien, Reitz M.// Cancer Biother Radiopharm. -2007.- Aug.-22(4).- P. 551-555.

39. Barrow, C. Tumor antigen expression in melanoma varies according to antigen and stage / С Barrow, J Browning, D MacGregor, ID Davis, S.

40. Sturrock, AA Jungbluth, J Cebon // Clin Cancer Res. 2006. - Vol. 12, №3 Pt l.-P. 764-771.

41. Becker, JC. Mouse models for melanoma: a personal perspective./ JC. Becker, R. Houben, D. Schrama, H. Voigt, S.Ugurel, RA. Reisfeld.// Exp Dermatol.- 2010.- Feb.-19(2).- P.157-164.

42. Bendelac, A. Mouse CDl-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. / A.Bendelac, M.N.Rivera, S.H.Park, J.H. Roark. // Annu. Rev. Immunol. -1997.- Vol. 15.- P.535-562.

43. Berd, D. Treatment of metastatic melanoma with an autologous tumor-cell vaccine: clinical and immunologic results in 64 patients. / D. Berd, H.C.J.Maguire, P.McCue, M.J. Mastrangelo. // Clin. Oncol.- 1990.- Vol. 8.-P.1858-1867.

44. Berinstein, NL. Strategies to enhance the therapeutic activity of cancer vaccines: using melanoma as a model./ NL.Berinstein // Ann N Y Acad Sci. 2009.- Sep.-l 174,- P.107-117.

45. Bhatia, S. Treatment of metastatic melanoma: an overview./ S. Bhatia, SS. Tykodi, JA. Thompson.// Oncology (Williston Park).- 200.- May.-23(6).- P. 488-496.

46. Biassoni, R. Human natural killer cell receptors: insights into their molecular function and structure. / R.Biassoni, C.Cantoni, D.Marras, J.Giron-Michel, M.Falco, L .Moretta, N. Dimasi. // J Cell Mol Med.- 2003 Vol. 7.- P.376-387.

47. Borrello, I. GM-CSF-based cellular vaccines: a review of the clinical experience. / Borrello I, Pardoll D. // Cytokine Growth Factor Rev.- 2002.-Vol. 13.- P. 185-193.

48. Botella-Esfrada, R. Cytokine production by peripheral lymphocytes in melanoma. / Botella-Estrada R, Escudero M, O'Connor JE, et al. // Eur Cytokine Netw.- 2005.-16(1).- P.47-55.

49. Burgess, A.W. The nature and action of granulocyte-macrophage colony stimulating factors. // A.W. Burgess, D. Metcalf. // Blood 1980.- Vol. 56.-P.947-958.

50. Cahalan, MD. Imaging the choreography of lymphocyte trafficking and the immune response. / MD. Cahalan, I. Parker. // Curr Opin Immunol. 2006.-Vol. 18,- P.476-482.

51. Chan, RC. Enhancement of DNA cancer vaccine efficacy by combination with anti-angiogenesis in regression of established subcutaneous B16 melanoma./ RC. Chan , B. Gutierrez, TE. Ichim, F. Lin.// Oncol Rep.- 2009.-Nov.-22(5).-P. 1197-203.

52. Chapman, P^.Melanoma vaccines./ PB.Chapman.// Semin Oncol.- 2007 .-Dec.-34(6).- P. 516-523.

53. I.Chen, PW. Therapeutic antitumor response after immunization with a recombinant adenovirus encoding a model tumor-associated antigen. / PW. Chen, M. Wang, V. Bronte, Y. Zhai, SA. Rosenberg, NP. Restifo.// J Immunol.-Vol. 156,-P.224-231.

54. Cianchi, /^.Histamine in cancer: the dual faces of the coin. / Cianchi, F., Vinci M. C., Masini E. // Cancer Biol Ther.-2008.- (7).-P. 36-37.

55. Coley WB. The treatment of malignant tumors by repeated inoculations of erysipelas: with a report of ten original cases. /WB. Coley // Am J Med-Sci.1893.-Vol. 105 P.487-511.

56. Copier, J. Whole-cell vaccines: A failure or a success waiting to happen?/ J. Copier , A. Dalgleish.// Curr Opin Mol Ther.- 2010.- Feb.-12(1).- P. 14-20.

57. Cvassalli, P. The pathophysiology of tumor necrosis factors. / P. Vassalli. // Annu. Immunol. 1992.- Vol. 10.- P. 411-425.

58. Degenhardt, Y. Distinct MHC gene expression patterns during progression of melanoma./ Y. Degenhardt, J. Huang, J. Greshock, G. Horiates, K. Nathanson, X. Yang, M. Herlyn, B. Weber.// Genes Chromosomes Cancer. -2010.-Feb.-49(2).-P. 144-154.

59. Disis, M.L. Oncogenic proteins as tumor antigens. / M.L. Disis, M.A. Cheever // Curr. Opin. Immunol.- 1996.- Vol. 8.- P.637-642.

60. Dranoff ,G. Cytokines in cancer pathogenesis and cancer therapy. / G. Dranoff. // Nat Rev Cancer.- 2004.- Vol. 4.- P. 11-22.

61. Dranoff, G. GM-CSF-secreting melanoma vaccines. / G. Dranoff. // Oncogene.- 2003.- Vol. 22.- P.3188-3192.

62. Erdmann, M. Towards a standardized protocol for the generation of monocyte-derived dendritic cell vaccines./ M. Erdmann, B. Schuler-Thurner.//Methods Mol Biol. -2010.-595.- P. 149-63.

63. Enbel, J. Dendritic cell vaccination as a treatment modality for melanoma./ J. Eubel, AH. Enk. // Expert Rev Anticancer Ther.- 2009.- Nov.-9(ll).- P. 1631-1642.

64. Feldman, JD. Immunological enhancement: a study of blocking antibodies. / JD. Feldman// Advances in Immunology.-1972.- Vol. 15.- P.167-214.

65. Ferrantini, M. Dendritic cells and cytokines in immune rejection of cancer./ M. Ferrantini, I. Capone I, F. Belardelli.// Cytokine Growth Factor Rev.2008.- Feb.-19(l).- P. 93-107.

66. Fidler ,IJ. Biological behavior of malignant melanoma cells correlated to ' their survival in vivo. / IJ. Fidler. // Cancer Res.- 1975.-Vol. 35.- P.218-224.

67. Fogler ,WE. Nonselective destruction of murine neoplastic cells by syngeneic tumoricidal macrophages. / WE. Fogler, IJ.Fidler. // Cancer Res.-1985.-Vol. 45.- P.14-18.

68. Fujikawa, T. Cimetidine inhibits epidermal growth factor-induced cell signaling./ Fujikawa T, Shiraha H, Nakanishi Y, et al.// J Gastroenterol Hepatol.- 2007.-22(3).- P.436-443.

69. Fujimoto, M. Histamine inhibits immunoglobulin production via histamine H2 receptors without affecting cell growth in human cells. / M. Fujimoto, H. Kimata. // Clin. Immunol. Immunopathol.—1994.—Vol. 73.—P. 96—102.

70. Garcia-Lora, A. Tumour immunology, vaccination and escape strategies. /

71. A.Garcia-Lora, I.Algarra, A. Collado, F. Garrido. // European Journal of Immunogenetic .-2003,- Vol. 30,- P.177-183.

72. Gattinoni, L. Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. / L.Gattinoni, DJ Jr. Powell, SA. Rosenberg, NP. Restifo. // Nat Rev Immunol.- 2006.- Vol. 6,- P.383-393.

73. Gavin, A. Adjuvant-Enhanced Antibody Responses in the Absence of TollLike Receptor Signaling. / A.Gavin, K.Hoebe, B.Duong, T.Ota, C.Martin,

74. B.Beutler, D. Nemazee. // Science.- 2006.- Vol. 314.- P. 1936-1938.

75. Gerner, MY. Antigen processing and MHC-II presentation by dermal and tumor-infiltrating dendritic cells./ MY. Gerner, MF. Mescher.// J Immunol.2009.-1 Mar.-182(5).- P.2726-2737.

76. Gifford, RR. Cimetidine protection against lethal tumor challenge in mice. /Gifford RR, Voss BV, Ferguson RM. //Surgery.- 1981 .-90(2).- P.344-351.

77. Gillespie, AM. The potential of melanoma antigen expression in cancer therapy. / AM Gillespie, RE Coleman // Cancer Treat Rev. 1999. -Vol. 25, №4.-P. 219-227.

78. Gruijl, TD. Whole-cell cancer vaccination: from autologous to allogeneic tumor- and dendritic cell-based vaccines./ TD de Gruijl , AJ. van den Eertwegh, HM. Pinedo, RJ.Scheper.// Cancer Immunol Immunother. -2008.-0ct.-57(10).- P.1569-1577.

79. Harland, CC. Regression of cutaneous metastatic malignant melanoma with topical diphencyprone and oral Cimetidine./ Harland CC, Saihan EM.// Lancet.- 1989.-2(8660).- P.445.

80. Hege, KM. GM-CSF gene-modified cancer cell immunotherapies: of mice and men. / KM. Hege, K.Jooss, D. Pardoll. // Int Rev Immunol.- 2006.- Vol. 25,- P.321-52.

81. Hegyesi, H. Histamine elevates the expression of Ets-1, a protooncogen in human melanoma cell lines through H2 receptor. / Hegyesi H, Horväth B, Pällinger E, et al.// FEBS Lett. -2005.-579(11).- P.2475-2479.

82. Hombach, A. Human CD4+ T cells lyse target cells via granzyme/perforin upon circumvention of MHC class II restriction by an antibody-like immunoreceptor. / A.PIombach,H. Kohler, G. Rappl, H. Abken. // J Immunol.- 2006,- Oct.- Vol. 177,- P.5668-5675.

83. Hsu, FJ. Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells. // FJ.Hsu, C.Benike, F.Fagnoni, TM.Liles, D.Czerwinski, B.Taidi, EG. Engleman, R. Levy. //Nat. Med.- 1996.- Vol. 2.-P.52-58.

84. Ibe, S. Tumor rejection by disturbing tumor stroma cell interactions./ S.Ibe, Z. Qin, T. Schuler, S.Preiss , T. Blankenstein T. // J. Exp. Med. -2001.- Vol. 194.-P. 1549-1559.

85. Inada, T. Vaccines using dendritic cells, differentiated with propofol, enhance antitumor immunity in mice./ T. Inada T, K. Kubo , K. Shingu.// Immunopharmacol Immunotoxicol.- 2009.-31(1).-P. 150-157.

86. Jaffee, EM. Considerations for the clinical development of cytokine gene-transduced tumor cell vaccines. / EM. Jaffee, DM. Pardoll.// Methods.-1997.- Vol. 12.- P.143-53.

87. Janeway, CA Jr. Innate immune recognition. / CA Jr. Janeway, R. Medzhitov // Annu Rev Immunol.- 2002.- Vol. 20.- P. 197-216.

88. Johansson, S. Effect of inflammatory cytokines on major histocompatibility complex expression and differentiation of human neural stem/progenitor cells./S. Johansson , J. Price, M. Modo.// Stem Cells.-2008.- Sep.-26(9).- P.2444-2454.

89. Jonasch, E. Interferon in oncological practice: review of interferon biology, clinical applications, and toxicities./ E. Jonasch, F.G. Haluska. //The Oncologist.- 2001.-Vol. 6.- P. 34-55.

90. Kanda, N. Histamine inhibits the production of interferon-induced protein of 10 kDa in human squamous cell carcinoma and melanoma./ Kanda N, Watanabe S. // J Invest Dermatol. 2002.-119(6). -P.1411-1429.

91. Kawase, J. An interesting change of E-selectin in cimetidine administration during anticancer drug use. / Kawase J, Kobayashi K, Imaeda Y, et al.// Gan To Kagaku Ryoho.- 2005.-32(11).- P. 1578-1579.

92. Kawase, J. Increase in E-selectin expression in umbilical vein endothelial cells by anticancer drugs and inhibition by cimetidine./ Kawase J, Ozawa S, Kobayashi K, et al. // Oncol Rep.-2009.-22(6).-P.1293-1297.

93. Khan, AN. An epigenetic vaccine model active in the prevention and treatment of melanoma./ AN. Khan , WJ. Magner, TB. Tomasi .// J Transl Med.- 2007,- 10 Dec .-5.- P.64.

94. Kircheis, R. Cytokine gene-modified tumor cells for prophylactic and therapeutic vaccination: IL-2, INF-y, or combination IL-2 + INF-y./

95. R.Kircheis, Z.Kupcu, G. Wallner, E. Wagner. // Cytokines, Cel. Mol. Ther.-1998.- Vol. 4.- P.95-103.

96. Lefranc, F. Cimetidine, an unexpected anti-tumor agent, and its potential for the treatment of glioblastoma. / Lefranc F., Yeaton P, Brotchi J, et al. // Int J Oncol.- 2006.-28(5).- P.1021-1030.

97. Lejeime, F.J. New approaches in metastatic melanoma: biological and molecular targeted therapies/ FJ. Lejeune . D.Rimoldi ,D. Speiser //Expert Rev Anticancer Ther.- 2007 May.- 7(5)- P.701-713.

98. Lens, M. The role of vaccine therapy in the treatment of melanoma./ M. Lens.// Expert Opin Biol Ther. -2008.- Mar.-8(3).- P. 315-323.

99. Liu, P. Administration of cyclophosphamide changes the immune profile of tumor-bearing mice./ P. Liu, J. Jaffar, I. Hellstrom, KE .Hellstrom.// J Immunother.- 2010 Jan.-33(1).-P. 53-59.

100. Logimova, NN. Restricted MHC-peptide repertoire predisposes to autoimmunity. / NN. Logunova, C.Yiret, LA.Pobezinsky, SA. Miller, DB. Kazansky, JP. Sundberg, AV. Chervonsky // J Exp Med.- 2005.- Vol. 202.-P.73-84.

101. MacGillivray, KC. Metastatic melanoma in horses. / MacGillivray KC, Sweeney RW, Del Piero F. // J Vet Intern Med.- 2002.-16(4).- P. 452-456.

102. Maker, AV. Analysis of the cellular mechanism of antitumor responses and autoimmunity in patients treated with CTLA-4 blockade. / AV. Maker, P.Attia, SA. Rosenberg. // J Immunol.- 2005.- Vol. 175.- P.7746-7754.

103. Manuel, L. Cancer and IgE. / Manuel L. Penichet, Erika. Jensen-Jarolim. // Introducing the Concept of AllergoOncology. P. 137-159.

104. Marchand, M. Tumor regressions observed in patients with metastatic melanoma treated with an antigenic peptide encoded by gene MAGE-3 and presented by HLA-A1 / M Marchand, N van Baren, P Weynants, V Brichard,

105. Markowicz, S. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor promotes differentiation and survival of human peripheral blood dendritic cells in vitro. / S. Markowicz, EG. Engleman.// Journal of Clinical Investigation.- 1990.-Vol. 85.- P.955-961.

106. Marsman, M. Chaperoning antigen presentation by MHC class II molecules and their role in oncogenesis. / M.Marsman, I. Jordens, A. Griekspoor, J. Neefjes. // Adv Cancer Res.- 2005.- Vol. 93.-P.129-158.

107. Martinez,FO. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: new molecules and patterns of gene expression. / FO. Martinez, S. Gordon, M.Locati, A. Mantovani // J Immunol.- 2006.- Vol. 177.- P.7303-7311.

108. Martínez-Escribano, JA. Prospective study of the levels of serum cytokines in patients with melanoma: prognostic value. / Martínez-Escribano JA, Campillo J, Piñero A, et al. // Actas Dermosifiliogr.- 2005.- 96(2).- P. 83-91.

109. Marturano, J. Endosomal proteases influence the repertoire of MAGE-A3 epitopes recognized in vivo by CD4+ T cells./ Marturano J, Longhi R, Russo V, et al. // Cancer Res.-2008.-68(5).-P. 1555-1562.

110. McCarter, M. Melanoma skews dendritic cells to facilitate a T helper 2 profile./ McCarter M, Clarke J, Richter D, et al. // Surgery.- 2005.-138(2).-P.321-328.

111. McEwan, MT.Regulation of tyrosinase expression and activity in human melanoma cells via histamine receptors./ McEwan MT, Parsons PG.// J Invest Dermatol.- 1991 .-97(5).-P.868-873.

112. Minkis, K. Type 2 Bias of T cells expanded from the blood of melanoma patients switched to type 1 by IL-12p70 mRNA-transfected dendritic cells./ Minkis K, Kavanagh DG, Alter G, et al.// Cancer Res.- 2008.-68(22).-P.9441-9450.

113. Mitchell, MS. Cancer vaccines, a critical review./ MS .Mitchell.// Curr Opin Investig Drugs.- 2002.- Jan.-3(1).- P.140-149.

114. Moreau-Aubry, A. A processed pseudogene codes for a new antigen recognized by a CD8(+) T cell clone on melanoma / A Moreau-Aubry, S Le Guiner, N Labarriere, MC Gesnel, F Jotereau, R Breathnach // J Exp Med.-2000.-Vol. 191.-P. 1617-1624.

115. Mulé, JJ. Dendritic cell-based vaccines for pancreatic cancer and melanoma./JJ. Mulé. // AnnN Y Acad Sci.- 2009.- Sep.-1174.- P.33-40.

116. Nagorsen, D. FILA typing demands for peptide-based anti-cancer vaccine./ D. Nagorsen, E. Thiel.// Cancer Immunol Immunother. -2008.- Dec.-57(12).- P. 1903-1910.

117. Natori, T. Cimetidine inhibits angiogenesis and suppresses tumor growth. /Natori T, Sata M, Nagai R, et al. // Biomed Pharmacother.- 2005.-59(1-2).-P.56-60.

118. Nevala, WK. Evidence of systemic Th2-driven chronic inflammation in patients with metastatic melanoma./ Nevala WK, Vachon CM, Leontovich AA, et al. //Clin Cancer Res.- 2009.-15(6).-P. 1931-1939.

119. Nishi, H. The expression of human high molecular weight melanoma-associated antigen in acral lentiginous melanoma./H. Nishi,Y. Inoue, T. Kageshita, M. Takata, H. Ihn.// Biosci Trends.- 2010.- Apr.-4(2).- P.86-89.

120. Ordaz, ML. DC-expressed MHC class I single-chain trimer-based vaccines prime cytotoxic T lymphocytes against exogenous but not endogenous antigens./ ML. Ordaz , N. Larmonier, L. Lybarger.// Cell Immunol.- 2010.-262(2).-P. 141-149.

121. Osband, ME. Successful tumour immunotherapy with cimetidine in mice. Lancet./ Osband ME, Hamilton D, Shen YJ, et al. // 1981.-1(8221).-P.636-638.

122. Palucka, K. Harnessing dendritic cells to generate cancer vaccines./ K. Palucka, H. Ueno, J. Fay, J. Banchereau.// Ann N Y Acad Sci.- 2009.- Sep.-1174,- P.88-98.

123. Pardoll,D.M. Spinning Molecular immunology into successful immunotherapy. / D.M. Pardoll. // Nature Reviews Immunology.- 2002.-Vol. 2.- P.227-238.

124. Park, D. An essential role for Aktl in dendritic cell function and tumor immunotherapy. / D. Park, N. Lapteva, M. Seethammagari, KM.Slawin, DM. Spencer. // Nat Biotechnol.- 2006.- Vol. 24.- P. 1581 -1590.

125. Pietro, A. Oncophage: step to the future for vaccine therapy in melanoma./ A. di Pietro, G. Tosti , PF. Ferrucci, A. Testori.// Expert Opin Biol Ther. -2008.- Dec.-8(12).- P. 1973-1984.

126. Poland, G.A.Vaccines in the future./ G.A. Poland, D. Murray, R. Bonilla-Guerrero. // BMJ. — 2002. — N 7349. — P. 1315—1319.

127. Pos, Z. Histamine suppresses fibulin-5 and insulin-like growth factor-II receptor expression in melanoma./ Pos Z., Wiener Z., Pocza P., et al. // Cancer Res.-2008.-(68).-P. 1997-2005.

128. Prell ,RA. Administration of ■ IFN-alpha enhances the efficacy of a granulocyte macrophage colony stimulating factor-secreting tumor cell vaccine. / RA. Prell, B. Li, JM. Lin, M. VanRoey, K. Jooss // Cancer Res. -2005.- Vol. 65.- P.2449-2456.

129. Rajfaghello, L. Immunotherapy of neuroblastoma: present, past and future. / L. Raffaghello, V. Pistoia. // Expert Rev Neurother.- 2006.- Vol. 6,- P.509-518.

130. Rambow, F. Gene expression signature for spontaneous cancer regression in melanoma pigs./ F. Rambow, G. Piton, S. Bouet, JJ. Leplat, S. Baulande, A. Marrau, M. Stam, V. Horak, S. Vincent-Naulleau.// Neoplasia.- 2008 .-Jul.-10(7).- P. 714-726.

131. Redondo, P. Update on melanoma: incidence, development and biological aspects./ P.Redondo.//An Sist SanitNavar.- 2000.-23(l).-P.67-84.

132. Reynolds, JL. In vitro effect of histamine and histamine HI and H2 receptor antagonists on cellular proliferation of human malignant melanoma cell lines./ Reynolds JL, Akhter J, Morris DL. // Melanoma Res.- 1996.-6(2).-P.95-99.

133. Ribas, A. Anti-CTLA4 Antibody Clinical Trials in Melanoma./ A. Ribas.// Update Cancer Ther. -2007.- Sep.-2(3).- P. 133-139.

134. Robinson, B. W. Cross-presentation of tumour antigens: Evaluation of threshold, duration, distribution and regulation. // B. W. Robinson, R.A. Lake, D.J. Nelson, B.A. Scott and A.L. Marzo // Immunology and Cell Biology.- 1999.- Vol. 77.- P.552.i »

135. Sansom, DM. The role of CD28 and cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) in regulatory T-cell biology. / DM. Sansom, LS. Walker. // Immunol Rev.- 2006.- Vol. 212.- P.131-148.

136. Sanz, L. Antibody-based antiangiogenic cancer therapy. / L. Sanz, L. Alvarez-Vallina. // Expert Opin Ther Targets. -2005.- Vol. 9.- P.1235-1245.

137. Selvan, SR. Establishment of stable cell lines for personalized melanoma cell vaccine./ SR .Selvan, DJ. Carbonell, AW. Fowler, AR. Beatty, MH. Ravindranath, RO. Dillman.// Melanoma Res.- 2010.-1 Apr.- Epub ahead of print.

138. Shah, GD. Adjuvant therapy of melanoma./ GD. Shah , PB. Chapman.// Cancer J. -2007.- May-Jun.-13(3).- P. 217-222.

139. Slinglujf ,CL Jr. Peptide and dendritic cell vaccines. / CL Jr. Slingluff, VH. Engelhard, S. Ferrone // Clin Cancer Res. -2006 .-Vol. 12.-P.2342-2345.

140. Soloski, M.J. Recognition of tumor cells by the innate immune system. / M.J. Soloski. // Curr. Opin. Immunol. -2001.- Vol. 13.- P. 154-162.

141. Souberbielle, BE. Comparison of four strategies for tumour vaccination in the B16-F10 melanoma model. / BE. Souberbielle, M. Westby, S. Ganz, J. Kayaga, R. Mendes, WJ. Morrow, AG. Dalgleish.// Gene Ther.- 1998.- Vol. 5.- P.1447-1454.

142. Stagg, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-2 fusion cDNA for cancer gene immunotherapy. / J. Stagg, JH. Wu, N. Bouganim, J. Galipeau. // Cancer Res.- 2004.- Vol. 64.- P.8795-8799.

143. Steinman, R. M. The dendritic cell and its role in immunogenicity system. / R. M. Steinman. // Annual Review Immunology.-1991.-Vol.9.- P.271-296.

144. Stewart, TJ. Tumour susceptibility to innate and adaptive immunotherapy changes during tumour maturation. / TJ. Stewart, GJ. Fernando, IH. Frazer, GR. Leggatt. // Immunol Cell Biol.- 2004.- Vol. 82.- P.455-461.

145. Suckow, MA. Tissue vaccines for cancer./ MA. Suckow, J. Heinrich, ED. Rosen.// Expert Rev Vaccines.- 2007- Dec.-6(6).- P. 925-937.

146. Szincsäk, N. Different h2 receptor antihistamines dissimilarly retard the growth of xenografted human melanoma cells in immunodeficient mice./ Szincsäk N, Hegyesi H, Hunyadi J, et al. // Cell Biol Int.- 2002.-26(9).-P.833-836.

147. Szincsäk, N. Cimetidine and a tamoxifen derivate reduce tumour formation in SCID mice xenotransplanted with a human melanoma cell line./ Szincsäk N, Hegyesi H, Hunyadi J, et al. // Melanoma Res.- 2002.-12(3).- P.231-240.

148. Tarhini, AA. Clinical and immunologic basis of interferon therapy in melanoma./ A.A. Tarhini, JM. Kirkwood. // Ann N Y Acad Sei.- 2009.-Dec.- 1182.-P. 47-57.

149. Thaler, AK. The role of ultraviolet radiation in melanomagenesis./ AK. von Thaler , Y. Kamenisch, M. Berneburg. // Exp Dermatol.- 2010.- Feb.-19(2).-P.81-88.

150. Theoharides, T. C. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation./ Theoharides T. C., Kempuraj D., Tagen M., et al. // Immunol Rev.-2007.-(217).-P.65-78.

151. Thomas, DA. TGF-beta directly targets cytotoxic T cell functions during tumor evasion of immune surveillance. / DA. Thomas, J. Massague // Cancer Cell.- 2005.- Vol. 8.- P.369-380.

152. Thomas, MC. Enhanced tumor protection by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor expression at the site of an allogeneic vaccine. / MC. Thomas, T.F Greten, DM. Pardoll, EM. Jaffee. // Hum Gene Ther.-199.- Vol. 9.- P.835-843.

153. Tilly, BC. Histamine as a growth factor and chemoattractant for human carcinoma and melanoma cells: action through Ca2(+)-mobilizing HI receptors./ Tilly BC, Tertoolen LG, Remorie R, et al. // J Cell Biol.-1990.-110(4).-P.1211-1215.

154. Tosti, G. HSPPC-96 vaccine in metastatic melanoma patients: from the state of the art to a possible future. / G.Tosti , A. di Pietro, PF. Ferrucci, A. Testori. // Expert Rev Vaccines.- 2009 .-Nov.-8(l 1).- P.1513-1526.

155. Tovey, MG. Adjuvant activity of cytokines./ MG .Tovey, C. Lallemand .// Methods Mol Biol.- 2010.-626.- P.287-309.

156. Treisman, J.Systemic therapy for cutaneous melanoma./ J. Treisman, N. Garlie.// Clin Plast Surg.- 2010 .-Jan.-37(1).- P. 127-146.

157. Tsung, K. Macrophages as effector cells in interleukin 12-induced T cell-dependent tumor rejection. / K.Tsung , JP. Dolan, YL. Tsung, JA. Norton.// Cancer Res.- 2002.- Vol. 62.- P.5069-5075.

158. Uqar K.The effects of histamine H2 receptor antagonists on melanogenesis and cellular proliferation in melanoma cells in culture./ K. Ufar.// Biochem Biophys Res Commun.-1991.-177(1 ).-P.545-550.

159. Villinger, F. Cytokines as clinical adjuvants: how far are we? / F. Villinger.//Expert Rev Vaccines. -2003.- Vol. 2.- P.317-326.

160. Vohra, N. TNF-alpha-treated DC exacerbates disease in a murine tumor metastasis model./ N.Vohra, M. Verhaegen, L. Martin, A. Mackay, S. Pilon-Thomas.//Cancer Immunol Immunother.-2010.-59(5).-P.729-736.

161. Waller, EK.The role of sargramostim (rhGM-CSF) as immunotherapy./ EK.Waller. // Oncologist.- 2007.-12 Suppl 2.-P.22-26.

162. Whitehead, RJ. Demonstration of histamine H2 receptors on human melanoma cells./ Whitehead RJ, Taylor DJ, Evanson JM, et al.//Biochem Biophys Res Commun.- 1988.-151(l).-P.518-523.

163. Willem, W. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma./ W. Willem, Overwijk, N.P. Restifo.// Curr Protoc Immunol.- 2009.- 19 Oct .- 20(1).-P.l-33.

164. Wong, R. Immune responses to a class II helper peptide epitope in patients with stage III/IV resected melanoma./ Wong R, Lau R, Chang J, et al.//Clin Cancer Res.- 2004.-10(15).- P.5004-5013.

165. Wortzel, R.D. Multiple tumour-specific antigens expressed on a single tumour cell. / R.D.Wortzel, C.Philipps, H. Schreiber. // Nature.- 1983.- Vol. 304.- P.165-167.

166. Wright, SC. YAC-1 variant clones selected for resistance to natural killer cytotoxic factors are also resistant to natural killer cell-mediated cytotoxicity. / SC. Wright, B. Bonavida. // Proc Natl Acad Sci USA. -1983.- Vol. 80.-P.1688-1692.

167. Zarei, S. Role of GM-CSF signaling in cell-based tumor immunization./S. Zarei , F. Schwenter, P. Luy, M. Aurrand-Lions, P. Morel, M. Kopf, G. Dranoff, N. Mach.//Blood.-2009.-25 Jun .-113(26).-P. 6658-6668.

168. Zhalgasbayeva, G.T. Specific simian virus 40 (SV40)-induced immunity against transplantable SV40 tumor in Syrian hamsters: abrogation by BCG vaccination. /G.T. Zhalgasbayeva, GI. Deichman // J Natl Cancer Inst.- 1977 Vol. 58.-P.l 121-1124.

169. Zhou, F. Molecular mechanisms of IFN-gamma to up-regulate MHC class I antigen processing and presentation./ F. Zhou.// Int Rev Immunol.- 2009.-28(3-4).- P.239-260.

170. Работа выполнена при финансовой поддержке

171. Правительства Москвы в рамках научно-техническойпрограммы:

172. Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средствдиагностики и лечения онкологических и других заболеваний».

Автореферат диссертации по медицине на тему Экспериментальные подходы к повышению эффективности GM-CSF - секретирующей цельноклеточной противоопухолевой вакцины.

Оглавление диссертации Манина, Ирина Владимировна :: 2011 :: Москва

Введение диссертации по теме "Онкология", Манина, Ирина Владимировна, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Манина, Ирина Владимировна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций