Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Стратегия создания цельноклеточных антимеланомных вакцин

На правах рукописи

00504523О

МИХАЙЛОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

СТРАТЕГИЯ СОЗДАНИЯ ЦЕЛЬНОКЛЕТОЧНЫХ АНТИМЕЛАНОМНЫХ ВАКЦИН

14.01.12 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

О 1 г - - -

О 1 имя ¿1)1/

Москва - 2012

005045235

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук (директор — академик РАН и РАМН, профессор Давыдов Михаил Иванович)

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Лев Вадимович Демидов доктор медицинских наук, профессор Анатолий Юрьевич Барышников

Официальные оппоненты:

Алексеев Леонид Петрович член-корр. РАМН, доктор медицинских

наук, профессор, заместитель директора по научной работе и инновационной деятельности ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией комбинированной терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН доктор медицинских наук, профессор кафедры онкологии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Мин-здравсоцразвития России

Ведущая организация:

ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им.

П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России

Трещалина Елена Михайловна

Подвязников Сергей Олегович

Защита состоится

J?

2012 г. в

А?

часов на заседании

диссертационного совета Д.001.017.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН ( 115478. г.Москва Каширское шоссе, 24). Автореферат разослан j&t'i/hty^ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Заболеваемость меланомой в последние десятилетия характеризуется неуклонным ростом. На момент обращения до 40% больных имеют диссеминированный процесс, требующий применения химиотерапии, после которой 5-летняя выживаемость не превышает 5%. При генерализованных формах меланомы основным методом лечения является лекарственный с использованием химио- и иммунотерапии. Среди различных средств и методов имммунотерапии меланомы клиническое применение нашли препараты а-2Ь-интерферона. Эффективность консервативного лечения достигает 50%, однако улучшения общей выживаемости достичь не удается. Иммунотерапия применяется при иммуногенных видах опухолей (меланоме, раке почки, немелкоклеточном раке легкого), способных в некоторых случаях к спонтанной регрессии. Предполагают, что механизм спонтанной регрессии связан с активацией эффекторов иммунной системы в частности, Т-лимфоцитов, распознающих и убивающих опухолевые клетки, благодаря экспрессии на их поверхности опухолеассоциированных антигенов [Ваигг^аеЛпег Р., е1 а1., 2011]. Перспективы развития иммунотерапии меланомы связывают с созданием новых селективных методов, основанных на достижениях молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии. Одним из таких методов является вакцинотерапия, включающая различные модификации клеточной технологии, среди которых лучшие терапевтические характеристики имеют генно-инженерные и дендритные вакцины. Главная цель иммунотерапии меланомы - увеличение у пациентов популяции СЭ8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), способных убивать опухолевые клетки [ЯЬапкег А., е1 а!., 2009]. Антигенный материал, используемый для создания таких вакцин, может быть в виде цельных опухолевых клеток (аллогенных или аутологичных) или специфических антигенов, РНК, протеинов или пептидных эпитопов, рестриктированных по первому или второму классу гистосовместимости [НегаЬш^-МоПпаго .Г., е! а1., 2011]. В экспериментах и в клинике изучаются подходы, использующие аугологичные меланомные клетки, трансфицированные

геном интерлейкина-12 (ИЛ-12), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-4 (ИЛ-4) и др. Вакцины на основе ауто- и аллогенных опухолевых клеток, модифицированных указанными генами, проходят клинические испытания [Soiffer R., et. al., 2003; Maio M., et. al., 2002]. Помимо изучения таких вакцин в монорежиме, как правило, в последние годы их комбинируют с адъговантами, которые представлены цитокинами или нагруженными дендритными клетками, инициирующими иммунный ответ презентацией антигенных эпитопов к Т-лимфоцитам [Zhang H.L., et al., 2011]. Несмотря на многообразие иммунотерапевтических подходов, механизм действия вакцин связан с презентацией дендритными клетками опухолеассоциированных антигенов Т-клеткам пациента [Nencioni А., et al., 2004]. Чаще всего используется одна-две антигенные детерминанты с целью достичь монотаргетного контакта вакцины с мишенью, что важно, прежде всего, для уменьшения некоторых побочных эффектов. Однако по аналогии с цельноклеточными антибактериальными вакцинами более эффективное их применение определяет большее число присутствующих в них антигенов [Geier D., et. al., 2002].

Для лечения диссеминированной меланомы кожи монотаргетная стратегия создания вакцин пока себя не оправдывает в силу поликлональности опухоли, а также быстрой селекции клонов. Селекция является следствием не только скорости пролиферации в условиях васкулогенной мимикрии, но и влияния микроокружения. Профиль экспрессии опухолеассоциированных антигенов чрезвычайно разнообразен, что требует мультитаргетных контактов с эффекторами для запуска программы клеточной гибели. Для осуществления этого актуально создание коллекции культур клеток меланомы, презентирующих различные опухолеассоциированные антигены. Созданная Коллекция клеточных культур меланомы является источником вакцин, направленных на различные антигенные детерминанты и способных использовать максимальное число клеток-мишеней у разных пациентов на разных этапах роста и метастазирования опухоли. Таким образом, создание Коллекции клеточных линий, их последующая

,ансфекция, проведение доклинических и клинических исследований феделяют стратегию разработки цельноклеточных вакцин, что является ггуальным как решение важной проблемы иммунотерапии меланомы.

Цель исследования. Разработать стратегию создания цельноклеточных [тимеланомных вакцин, здачи исследования.

1. Получить и охарактеризовать из опухолевого материала больных клеточные шии меланомы с экспрессией различных опухоль-ассоциированных антигенов.

2. На основе клеточных линий меланомы, трансфицированных генами 'М-КСФ и tag7, разработать новые цельноклеточные аутологичные и аллогенные зкцины.

3. Изучить основные доклинические характеристики новых вакцин.

4. Оценить безопасность применяемых вакцин у больных меланомой.

5. Для оценки специфической активности определить динамику ммунологических показателей в процессе вакцинотерапии.

6. На основе доклинического и клинического изучения сформулировать пгоритм стратегии создания новых цельноклеточных вакцин.

Научная новнзна

Впервые в России из метастазов меланомы кожи человека от 68 пациентов, роходящих лечение в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, получены и характеризованы по основным биологическим, иммунологическим, юлекулярным и морфогенетическим параметрам 19 клеточных линий.

Получены и наработаны для доклинических и клинических испытаний ригинальные клеточные линии меланомы человека mel Р и mel Kor, рансфицированные генами tag7 или ГМ-КСФ соответственно. Проведены ;оклинические исследования цельноклеточных геномодифицированные вакцин :Аллоген» (из клеточной линии mel P/tag7) и «Мелавак» (из клеточной линии mel Сог/ГМ-КСФ), показавшие их безопасность. Обнаружена взаимосвязь между щнамикой клеточного ответа - снижением числа натуральных киллерных Т-леток (НКТ-клеток) и прогрессированием процесса. Анализ раково-

тестикулярных антигенов и дифференцировочных генов, подтвердивши" неоднородность изученных линий клеток и вакцин, позволил установит корреляцию между интенсивностью экспрессии генов раковотестикулярны антигенов (РТА) и степени дедифференцировки клеток в полученных и метастазов клеточных линиях меланомы. На основе результатов доклинического : клинического изучения разработан алгоритм оптимизации создания новы цельноклеточных вакцин из культур опухолевых и дендритных клеток больны меланомой.

Научно-практическая значимость

Создана Коллекция культур клеток меланомы из 19 новых оригинальны клеточных линий - субстрат для создания новых цельноклеточны противомеланомных вакцин. 15 новых линий клеток меланомы защищен] патентами РФ, 5 из которых вошли в 100 лучших изобретений РФ за 2009 г. Н основе дендритных и меланомных клеток созданы 3 новые цельноклеточны геномодифицированные и нативные вакцины, предназначенные для лечени онкологических пациентов. Разработан иммунобиохимический мониторин вакцинотерапии с использованием модифицированных вакцин. Результаты данно работы могут быть использованы как в области фундаментальных, так прикладных исследований. Полученные данные способствуют углубленном пониманию биологии опухолевой клетки и ее механизмов взаимодействия иммунной системой. Данные о фенотипе опухолевой клетки (разнородна экспрессия антигенов гистосовместимости, костимулирующих молекул) информация на уровне генов и антигенов дополняют фундаментальную баз знаний, лежащих в основе конструирования новых вакцин и их оптимизаци путем соответствующих модификаций.

Прикладное значение выполненной работы заключается в создани Коллекции полноценно охарактеризованных культур клеток, готовых к созданш на их основе цельноклеточных противоопухолевых вакцин. Подтверждение] прикладного характера исследований является разрешение МЗиСР РФ н проведение клинических исследований вакцин на основе дендритных

,iyxoлевых клеток, трансфицированных генами tag-7 и ГМ-КСФ [№371-373 от 6.08.08; №282 от 218.06.10 и №286 от 21.06.10].

Основные положения, выносимые на защиту

создана Коллекция опухолевых клеточных линий меланомы с различной репрессией антигенов;

созданы и охарактеризованы по основным доклиническим и клиническим оказателям 4 новые цельноклеточные вакцины: 2 аутологичные <АутологичнаяЛа§-7», «Дендритная») и 2 аллогенные («Аллоген», «Мелавак»);

доклинические исследования по безопасности исследуемых вакцин показали х безвредность;

стратегия мониторинга клинического изучения цельноклеточных вакцин у ольных меланомой направлена на контроль цитокиного профиля, НКТ-клеток и исла синтезирующих ИФН-у мононуклеарных клеток периферической крови.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на Всероссийской аучно-практической конференции с международным участием «Отечественные ротивоопухолевые препараты», Москва, 17-20 марта, 2002 г.; I Всероссийской аучно-практической конференции «Биотерапия рака», Москва, 18-20 июня, 2002 ,; European Society of gene therapy. 1 Ith Annual Congress, Edinburg, UK, 14-17 fovember, 2003 г.; VIII Всероссийском научном Форуме с международным частием «Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 27-30 ентября, 2004 г.; Всероссийской научно-практической конференции Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 16-18 марта, 2005 г.; V Симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических заболеваний», 1осква, 2006 г.; Всероссийской научно-практической конференции, Москва, 21— 4 марта 2006 г.; 15 Международной конференции «СПИД, рак и общественное цоровье», Санкт-Петербург, 22-26 мая, 2006 г.; 8th International Biological Therapy f Cancer, Dresden, 21-24 June, 2006 г.; Всероссийской научно-практической онференции «Онкология сегодня Успехи и перспективы», Казань, 2006 г.; VI ьезд онкологов и радиологов СНГ, Баку, 28 сентября-1 октября 2006 г.; Международной конференции «Биотехнология и медицина», Москва, 14-17 марта,

2006 г.; 6th ISREC Conference on Cancer Research, Lausanne, Switzerland, 2006 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участие! «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2007 г.; Научно практической конференции с международным участием «Актуальные вопрос] онкологии», Элиста, 23-24 апреля, 2007 г.; 43d Annual Meeting, Chicago, June 1-f

2007 г.; Европейской школе онкологии «Иммунология для онкологов», Москва, 31 марта- 01 апреля 2008 г.; 3-ем съезде токсикологов России, Москва, 2- 5 декабр?

2008 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Опухоли кожи мягких тканей», Санкт-Петербург, 2009 г.; Международной конференци «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 1-Л июня 2009 г Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность) Москва, 2009 г.; VIII Всероссийской научно-практической конференци «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 21- 22 апреля, 2009 г XIV Российском онкологическом конгрессе, Москва, 23-25 ноября, 2010 г Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии междисциплинарные проблемы», Санкт-Петербург, 27-30 сентября, 2010 г Совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики биотерапии опухолей, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатори фармакоцитокинетики, лаборатории клеточного иммунитета НИИ ЭДиТО ФГБ1 «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, отделения биотерапии НИИ КО ФГБУ «РОН1 им. Н.Н.Блохина» РАМН 14 июля 2011 г.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описани материалов и методов, 5 глав собственных результатов, обсуждения, выводо! списка сокращений, списка литературы, включающего 40 отечественных и 32 зарубежных источников и приложения (Протоколы клинического изучени вакцин, разрешения на исследования). Материалы диссертации изложены на 26 страницах машинописного текста и иллюстрированы 74 таблицами и 41 рисунком

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования и их характеристики

Из образцов опухолевых тканей получено 19 стабильных клеточных линий, прошедших более 30 пассажей. Определение фенотипа клеточной поверхности проводили в реакции непрямой иммунофлуоресценции с оценкой экспрессии антигенов на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson). Для реакции поверхностной иммунофлуоресценции использовали антитела ICO-90 (CD3 Т-клетки), ICO-180 (CD20 B-клетки), ICO-53 (НЬА-А,В,С-антиген гистосовместимости I класса), ICO-1 (HLA-DR-антиген гистосовместимости II класса), ICO-218 (HMW-меланомодифференцировочный антиген), анти-С086 и анти-С080 (ко-стимулирующие молекулы) и анти-С034 (маркер гемопоэтических стволовых клеток и эндотелиальных клеток). Для иммунопатологического исследования использовали антитела против дифференцировочных антигенов меланоцитов CD63, MelanA/MART-1, НМВ45, Tyrosinaza. Определение антигенов главного комплекса гистосовместимости HLA-A,B,C клеточных линий проводили набором сывороток антилейкоцитарных HLA-A,B,C. Исследование генов на клеточных линиях проводили методом ПЦР. Определяли экспрессию дифференцировочных антигенов меланомы (ДАМ): ML ANA, TYR, SILV, S100В и 15 РТА: семейства GAGE, MAGE, В AGE т NY-ESO-1; а также контрольных генов HLA-G, HLA-E и GAPDH. Клеточные линии обследованы на CMV, ВИЧ, гепатиты В и С, вирус папилломы человека, Mycoplasma sp., Herpes В virus методом молекулярного исследования и микробиологически - на бактерии и грибы.

Получено 5 оригинальных вакцин: 1. Вакцины аутологичные человеческие: «Дендритная», интактная, из нагруженных опухолевым лизатом дендритных клеток больных меланомой; «Аутологичная/tag?», генно-инженерная, из метастатических, трансфицированных геном tag7 клеток больного меланомой. 2. Вакцины аллогенные человеческие: «Аллоген», генно-инженерная, из клеточной линии меланомы человека mel Р, трансфицированных геном tag7; «Мелавак», генно-инженерная, из клеточной линии меланомы человека mel Kor,

трансфицированных геном ГМ-КСФ. 3. Сингенная мышиная: В16Р10/ГМ-КСФ, генно-инженерная, полученная из культуры клеток мышиной меланомы B16F10, трансфицированной геном ГМ-КСФ (аналогично вакцине «Мелавак»). С учетом действующих в РФ требований проведено доклиническое изучение четырех вакцин «Аутологичная/tag-V», «Аллоген», «Мелавак» и «Дендритная» Доклинические исследования вакцин

Исследования выполнены на 85 гибридных мышах-самцах BDF, или Fi из питомника «Столбовая» РАМН; 60 неинбредных крысах-самцах и 37 иммунодефицитных мышах-самках Balb/c nude из разведения ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохцна» РАМН; на 42 кроликах породы шиншилла из ФГУП «Опытно-производственное хозяйство «Манихино» и 104 морских свинках-самках альбиносах массой тела 240-250г. из питомника ГУНЦ Биомедицинских технологий «Филиал Андреевка» РАМН. Вакцины «Аллоген» и «Мелавак», предназначенные для внутрикожного применения, изучены по программе общей и локальной (местной) токсичности с патоморфологическим исследованием внутренних органов животных. Оценена иммунотоксичность, пирогенность и прогноз туморогенности. Вакцина «Мелавак» изучена по всем стандартным показателям безвредности, рекомендованным для медицинских иммунобиологическим препаратов. Вакцина «Аллоген», близкая по специфической активности к «Мелавак», изучена по сокращенной программе для оценки возможности оптимизации объема токсикологического исследования вакцин подобного типа. Прогноз туморогенности выполнен с исходными клеточными линиями обеих вакцин, которые были облучены в дозе 100 Гр на гамма-установке «Стебель-ЗА».

Клинические исследования вакцин

В клиническое исследование включены 148 больных с метастатической меланомой III—IV стадий, проходивших лечение в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН в 1999-2010 гг. Больные были разделены на 2 группы. Первая группа из 68 больных - доноры опухолевого материала, из которого получены новые клеточные линии — субстрат для разработки вакцин. Вторая

группа из 80 больных включена в клинические исследования. Изучены два режима применения накцин: терапевтический, при наличии опухолевого процесса, и адъювантный, при отсутствии признаков опухолевого процесса. Первичной конечной точкой клинического изучения вакцин была оценка безопасности, вторичной конечной точкой - оценка специфической иммунологической эффективности. О побочных эффектах судили по шкале токсичности СТСАЕ v.3.0. Иммунный ответ на вакцинотерапию оценивали по изменению иммунофенотипа лимфоцитов, количественному определению ЦТЛ по числу клеток, секретирующих ИФН-у и гранзим В; иммуногистохимическому исследованию кожи; по оценке цитокинового профиля ТЫ (ИЛ-2, ИЛ-12, ИФН-у) и Th2 (ИЛ-4, ИЛ-10). Кроме того, определяли фактор роста эндотелия сосудов (VEGFA); трансформирующий фактор роста ß2 (TGF-ß2); белок S100 (S100A1B и S100BB формы); молекулу адгезии CD44std.

Для получения разрешения МЗиСР РФ на проведение клинических исследований новых оригинальных цельноклеточных вакцин на основании результатов доклинических исследований подготовлен стандартный комплект документов. Разрешенные клинические испытания вакцин выполнены в соответствии с Протоколами в отделении биотерапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН (заведующий отделением биотерапии опухолей профессор Демидов Л.В.) с соблюдением стандартов GCP. Соответственно требованиям МЗиСР РФ для медицинских иммунобиологических препаратов проведены пилотные клинические исследования и открытые исследования I фазы и начата II фаза. Задачи отдельных клинических фаз касались изучения безопасности и эффективности вакцин, определению дозовых характеристик выявленных эффектов и оценки перспективности применения вакцин у онкологических пациентов.

Для проведения статистического анализа данных, включая проверку нормальности распределения количественных признаков, получение описательной статистики и проведение сравнения сформированных групп пациентов с использованием критериев Стьюдента (Т-критерия) и Манна - Уитни

(для признаков, имеющих отличное от нормального распределение), а также для формирования графиков использованы пакеты программ EXCEL 2003 и STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Клеточные линии меланомы как источник антигенов

Из образцов опухоли получено 19 стабильно растущих клеточных линий, представленных тремя вида клеток: эпителиоподобными, веретенообразными и невусоподобными или их сочетаниями. Линии различались по степени полиморфизма и атипии, количеству пигмента, митозов, гигантских многоядерных и одноядерных клеток. По преобладанию морфологических форм клеточные линии были разделены на три группы: высокодифференцированные, умеренно дифференцированные и низкодифференцированные (рис.1). Умеренно дифференцированные и низкодифференцированные клеточные линии характеризовались большим объёмом кариологических нарушений и большей экспрессией раково-тестикулярных генов по сравнению с умеренно дифференцированными линиями.

PS шЦР р& j IPNL ^ щ flfc

а. Высокодифференцирован-ная клеточная линия mel Si. б. Умеренно дифференцированная клеточная линия mel 11 в. Низкодифференци-рованная клеточная линия mel Mtp

Рисунок 1. Культуры клеток меланомы различной степени дифференцировки. х 100.

Анализ клеточных линий выявил экспрессию антигена CD63 во всех исследованных образцах (100%), антигена НМВ45 - в 11 (58%), антигенов MelanA/MARTl и Tyrosinase в 7 из 19 образцах (37%). На поверхности всех клеток культивируемых клеточных линий отсутствовали маркеры Т- и В-лимфоцитов CD3 и CD20. Ко-стимулирующая молекула CD80 экспрессирована в 9 случаях (47%), лишь в одном случае (5%) клетки экспрессировали антиген CD86. Обе молекулы CD86 и CD80 экспрессировала одна клеточная линия mel Р. Антиген CD54 молекулы адгезии ICAM-1 определялся на всех исследованных клеточных линиях (100%), а экспрессия CD95 была отрицательной во всех исследуемых случаях. Положительная экспрессия антигена CD34 найдена в 42% случаев. Положительная экспрессия меланомаассоциированного антигена HMW, выявлена в 10 из 15 образцов клеточных линий (66,5%). На рис. 2. представлен пример гистограмм клеточной линии mel Mtp, окрашенной с помощью МКА CD63, CD34, CD95, CD54. Экспрессия антигенов гистосовместимости I класса (HLA-A,B,C) имеется на 18 из 19 клеточных линиях (94,7%), а экспрессия антигена II класса (HLA-DR) - только на 4 линиях (21%). После культивирования число линий с антигеном гистосовместимости II класса увеличилось более чем в 3 раза и составило 13 из 19 (68%). К 30-му пассажу антигены гистосовместимости I и II классов определялись уже на 13 клеточных линиях (68%) и только на клеточной линии mel Kor эти антигены отсутствовали на всех пассажах. Исследование антигенов I класса гистосовместимости выявило следующую картину: аллель А26(10) и аллель A3 обнаружен на 6 линиях (32%); аллель А2 и аллель А23 - на 5 линиях (26%) ( табл. 1).

Таблица 1. HLA-фенотип клеточных линий меланомы

Клеточная линия Фенотип

mel Р A23(9), A26(10); B7, B56(22)

mel Kor A3, A26(10), B62(15), B55(22)

mel Mtp A3, A26(10), B13, B41

mel II A23(9), A26(10); B7, B56(22)

mel Is A2, B7, B64(14)

mel Si AI, A3, B51(5), B39(16)

mel Me A2, A31(19), B58(17), B56(22)

mel Gus AI, A3, B8, B60(40)

mel Z All, A26(10); B62(15), B44(12)

mel Ksen A24(9), A30(19); B39(16),B60(40)

mel Hn AI, A23(9);B51(5),B8

mel Gi AI, A30(19),B8, B44 (12)

mel Ibr A2, A24(9), B35, B62(15)

mel R A2, B27, В64(14)

mel Rae A23(9), A26(10), B39(16), B8

mel Ch AI, A3, B8, B63(15)

Mel Bgf A2, A23(9), B62(15), B18

mel H A3, A30(19), B13, B7

mel Cher A2, A25(10),B51(5), B49(21)

Для передачи на хранение в Специализированную коллекцию клеточных культур института Цитологии РАН все линии обследованы иммуноферментными методами на отсутствие бактериального и грибного обсеменения. Для исключения ДНК- и РНК-содержащих вирусов (ВИЧ, гепатитов В и С, папилломы человека, Herpes В), хламидий (CMV), токсо- и микоплазм (Mycoplasma species) проведена ПЦР-диагностика. В результате получено доказательство отсутствия указанны) видов загрязнения в 19 тестированных культурах меланомы клеток, которые стали основой посевного и рабочего банков. Посевной банк одобрен и зарегистрирован Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации i контроля медицинских биологических препаратов им. JI.A. Тарасевича.

10° 101 102 103 10" FL1-H

CD63

3,4%

FL1-H

I I IIIBI I I II1HI I I I1IB| I I mq 10° 101 10Z 103 104 FL1-H

10° 101 102 103 10" FL2-H

Рисунок 2. Гистограммы распределения клеток линии mel Mtp по интенсивности флуоресценции; синяя кривая - негативный контроль, зеленая кривая - клетки, положительно окрашенные моноклональными антителами.

Исследование экспрессии генов на клеточных линиях меланомы человека выполнено с помощью ПЦР. Полученные цифровые значения интенсивности полос продуктов ПЦР ранжированы по величинам их интенсивности на ранги: «0» - фоновое значение (желтый цвет от 0 до 50); «1» - малая интенсивность (зеленый цвет от 51 до 699); «2» — средняя интенсивность (серый цвет от 700 до 1299); «3» - высокая интенсивность (красный цвет - >1300) (табл. 1). Из таблицы

15

видно, что наиболее распространенным является ген S100В, который экспрессирован в 18 из 19 (95%) линий клеток. Реже встречается экспрессия гена SILV - в 16 из 19 (84%) линий клеток, гена TYR —в 15 из 19 линий клеток (79%) и гена MLAN - в 14 из 19 линий клеток (74%). Раково-тестикулярные гены экспрессированы более неоднородно: MAGE А2 выявлен на 18 из 19 линий клеток (95%), а ген MAGE В2 - только в 7 случаях (37%) (табл.2).

Таблица 2. Экспрессия дифференцировочных, РТА, HLA генов в клеточных линиях меланомы человека

Клеточные линии /гены

Кол-во антигенов

Определение экспрессии генов РТА и дифференцировочных меланомны.: антигенов и последующий двумерный иерархический кластерный анализ данны-: ПЦР ОТ позволили выделить 6 групп клеточных линий с различной степены-цитодифференцировки. Высокодифференцированные и умеренно дифференцированные клетки практически не экспрессируют гены РТА в отличие от низко-дифференцированных.

Клеточные вакцины, модифицированные геном tag-7 Аутологичная клеточная вакцина, модифицированная геном tag-7

Аутологичная вакцина готовится индивидуально для пациента. Клеточная линия культивируется из клеток опухолевого узла. Для получения геномодифицированной вакцины использована стандартная методика трансфекции геном клеток человека и животных. Трансфекция геном tag-7 клеток меланомы человека выполнена в Институте биологии гена РАН. Уровень трансфекции, рассчитанный по числу содержащих плазмиды с геном tag-7 и окрашенных зеленым белком клеток, составил 50-60%. Уровень секреции белка tag-7 составил 30-50 нг на 106 клеток. Готовые вакцинные препараты проходили стандартное тестирование на отсутствие бактерий, вирусов, стерилизованы на гамма-установке «СтебельЗА», разлиты в аликвоты по 500 тыс, 1 млн и 5 млн клеток соответственно начальной разовой дозе для человека. Изучение безопасности вакцины «Ayтoлoгичнaя/tag-7» выполнено в рамках пилотного клинического исследования у 8 больных с диссеминированной меланомой и раком почки. По результатам клинического исследования установлено, что вакцина «Ayтoлoгичнaя/tag-7» при многократном внутрикожном введении в диапазоне доз от 0,5 до 20 млн клеток не вызывает каких-либо лимитирующих побочных эффектов. Среди обратимых и кратковременных побочных эффектов отмечены маловыраженная пирогенность с повышением температуры тела до 38° С и локальная гиперемия по типу реакции гиперчувствителыюсти замедленного типа (РГЗТ) в течение первых суток после вакцинации. Вакцина не проявляет местно-раздражающего действия и не вызывает отсроченных побочных эффектов, в том числе аллергизирующего, анафилактогенного действия и других клинических проявлений токсичности. По критериям СТС вакцина соответствует 0—1 уровню токсичности. Выявлена положительная динамика экспрессии активационных маркеров и НК-клеток. Для проведения 2 фазы клинического изучения рекомендована начальная доза 10 млн клеток на пациента.

Аллогенная клеточная вакцина, модифицированная геном tag-7

Основой для создания вакцины «Аллоген» стала клеточная линия меланомы человека mel Р с транзиторным трансфицированием геном tag-7. Клеточная линия mel Р (рис. 3) умеренно дифференцированная и характеризуется наличием полиморфных меланомных клеток, преимущественно веретенообразной и вытянутой удлиненной формы с четкими границами базофильной цитоплазмы и гипер- и нормохромными ядрами с одиночными нуклеолами.

Клеточная линия mel Р обладает стабильными культуральными и морфологическими харак теристиками. На поверхности всех клеток культивируемой клеточной линии выявляются дифференте w цировочные, опухолеассоциированные и антиген! Рис. 3. Цитограмма умеренно

диференцированной клеточной гистосовместимости. линии mel Р. Окраска по методу Лейшмана. Увеличение х 100

Доклиническая оценка безвредности вакцины «Аллоген»

Задача исследований заключалась в оценке токсикологических параметро при однократном внутрикожном, подкожном или внутрибрюшинном применени]: вакцины в дозах от 1,0 до 6,0 млн клеток, а также в прогнозе туморогенности пс стандартной методике. Проведенное доклиническое изучение показало, чтг вакцина «Аллоген» при внутрикожном, подкожном и внутрибрюшинном введении в дозах от 1,0 до 6,0 млн клеток безвредна по показателям общей токсичности и н : проявляет туморогенности. Это позволило рекомендовать вакцину «Аллоген» дл:г клинического изучения в начальной разовой дозе 1 млн клеток. Клиническая оценка безвредности вакцины «Аллоген»

Лекарственная форма вакцины «Аллоген» представляет собой прозрачнун бесцветную жидкость для внутрикожного применения. Готовый вакцинньн препарат прошел стандартное тестирование на отсутствие каких-либс загрязнений, стерилизован на гамма-установке «СтебельЗА», разлит в аликвоты г

1 и 5 млн клегок соответственно начальной разовой дозе для человека. Изучение безопасности вакцины «Аллоген» выполнено в рамках Протокола клинического исследования у больных диссеминированной меланомой, утвержденного МЗиСР (разрешение № 372 от 06.08.08 г.). Клиническое изучение безопасности вакцины «Аллоген», представляющей собой модифицированную клеточную меланомную линию, проведено у 14 больных с диссеминированной меланомой Ш-ГУ стадии. Все больные включены в Протокол после стандартного комбинированного лечения по поводу меланомы. На момент включения в клиническое исследование у всех пациентов отмечено прогрессирование заболевания и неэффективность предыдущей терапии. В результате установлено, что вакцина «Аллоген» не приводит к каким-либо лимитирующим побочным эффектам или осложнениям. Биохимические и клинические показатели крови оставались стабильными, а выявленные изменения соответствовали основному заболеванию. Иммунотоксических проявлений (аллергических и анафилактических реакций) не было отмечено ни у одного пациента. Степень выраженности отмеченного у больных в 1-2 сутки после вакцинации легкого гриппоподобного синдрома (повышение температуры тела с ознобом, локальная гипертемия) соответствует 01 степени токсичности по шкале токсичности (критерии СТС-ИС1С). По результатам иммунологического исследования у 8 из 14 пациентов (57%) на фоне вакцинации отмечено значительное (на 50%) увеличение гранзима В на СО 16+ клетках. Увеличение этого маркера позволяет говорить об активирующем влиянии вакцины на иммунную систему пациентов. У 2 из 14 пациентов (14%) отмечена стабилизация процесса (рис. 4).

Рисунок 4. УЗИ печени пациентки Т.Ж.И., получившей вакцину «Аллоген»

Таким образом, вакцина «Аллоген» при внутрикожном многократном введении в дозах от 5,0 до 40,0 млн клеток не проявляет лимитирующего побочного действия, оказывает активирующее влияние на иммунную систему и в ряде случаев вызывает стабилизацию у пациентов с прогрессирующим процессом. Клеточная вакцина «Мелавак», модифицированная ГМ-КСФ

Основой для создания модифицированной генно-инженерной вакцины «Мелавак» стала клеточная линия меланомы человека mel ICor, стабильно трансфицированная геном ГМ-КСФ. Клеточная линия mel Kor (рис. 5) характеризуется наличием множественных плотных центров роста полиморфных меланомных клеток вытянутой, округлой и неправильной формы.

Показано, что клеточная линия mel Kor обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. На поверхности всех клеток культивируемой клеточной линии выявляются дифферен-цировочные, опухолеассоциированные антигены; отсутствуют антигены гистосовместимости. Отсутствие антигенов гистосовместимости I и II класса, редко встречающаяся особенность меланомных клеток, позволяет считать эту линию уникальной. Линия клеток передана на хранение в Специализированную коллекцию клеточных культур института Цитологии РАН.

Вакцина «Мелавак» получена из клона клеток меланомы человека линии mel Kor. Линия стабильно трансфицирована геном ГМ-КСФ и имеет генетическую конструкцию - вектор pBK-CMV (Clon Tech, США) со встроенной к ДНК ГМ-КСФ человека. Количество секретируемого ГМ-КСФ — 84,0 нг / 1 млн клеток за 24 ч. Лекарственная форма вакцины «Мелавак» для внутрикожного применения представляет собой взвесь облученных клеток mel Kor в питательной среде. Это -прозрачная бесцветная жидкость в эпендорфах, которые хранятся в дюаре с жидким азотом при температуре - 196 °С.

Рисунок. 5. Цитограмма низко-дифференцированной клеточной линии меланомы человека mel Kor, окраска по методу Лейшмана. увеличение хЮО.

Доклиническое изучение вакцины «Мелавак»

Изучение безвредности проведено по показателям общей и местной токсичности с патоморфологическим контролем и с прогнозом онкогенных потенций. Вакцину «Мелавак» вводили животным внутрикожно и/или подкожно многократно в диапазоне доз от 0,5 до 10 млн клеток.

В результате исследований установлено, что вакцина «Мелавак» при внутрикожном и/или подкожном применении крысам (п=30) в суммарных дозах 1,03x107 или 10,3х107 кл/кг (концентрация 1х107 кл/мл) при внутрикожном ежедневном на протяжении 7 дней введении вызывает обратимую локальную гиперемию и самопроизвольно рассасывающиеся инфильтраты, а также обратимые общие осложнения в виде пирогенной реакции до 38 °С в течение суток и незначительную гепатомегалию с относительно низким виражом печеночных проб, расцененную как реакция на длительно секретируемый клетками вакцины ГМ-КСФ (до 8 мкг/кг/сутки в неделю на крысу). При однократном в/к введении в дозе 5х105 кл/кг однократно (п=3) или 3-кратно на 5-е, 14-е и 30-е сутки (п=12) у кроликов вакцина вызывает очаговую пигментацию, расцененную как возможную окраску ткани меланином из частично разрушенных тотальным облучением вакцинных клеток. На крысах (п=60) в суммарных дозах 1,03х107 и 10,3х107 кл/кг, превышающих предполагаемые дозы для человека в 10 и 100 раз (пересчет доз по стандартному методу Freireich), вакцина не показала выраженных и необратимых признаков «субхронической» токсичности. Прогноз туморогенности на мышах Balb/c nude (п=22) из разведения ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН показал отсутствие онкогенных потенций у вакцины «Мелавак» при однократной подкожной имплантации в дозе 10 млн клеток с периодом наблюдения 9 нед. Контрольные клетки — меланома человека линии mel Kor - в течение 2 недель после имплантации в той же дозе вызывают развитие подкожных опухолей солидного строения, по морфологической картине соответствующих меланоме. Таким образом, вакцина «Мелавак» не имеет онкогенных потенций. Изучение иммунотоксичности вакцины «Мелавак» на морских свинках (п=40) с оценкой интенсивности реакции по Weigle

(четырехплюсовая система) и реакции активной анафилаксии показала только слабую аллергогенность вакцины при внутрикожном применении. В связи с видоспецифичностью вакцины «Мелавак» развитие специфического противоопухолевого ответа при вакцинации человеческими опухолевыми клетками, трансфицированными геном ГМ-КСФ, выполнено на мышиных клетках B16F10, трансфицированных мышиным геном ГМ-КСФ. Показано, что аналогичная по основным биологическим параметрам мышиная вакцина при адекватном режиме применения существенно в 1,5-2,0 раза снижает имплантационную способность меланомы В16, из клеток которой получена экспериментальная вакцина. Единственным осложнением вакцинации является локальная реакция, расцененная как РГЗТ. Таким образом, при доклиническом изучении вакцина «Мелавак» оценена как безопасная для человека и рекомендована для клинического изучения в начальной разовой дозе 10 млн клеток.

Клиническое исследование вакцины «Мелавак»

Исследование выполнено с цельноклеточной вакциной «Мелавак», полученной из клеток меланомы человека линии mel Kor, стабильно трансфицированных геном ГМ-КСФ, инактивированных у-излучением в дозе 100 Гр. Для проведения клинического изучения безопасности вакцины «Мелавак» у больных диссеминированной меланомой кожи разработан Протокол № 373,1 фаза. Клиническое изучение безопасности вакцины «Мелавак» проведено у 10 больных с диссеминированной меланомой III—IV стадии. Все больные включены в Протокол после стандартного комбинированного лечения по поводу меланомы. На момент включения в клиническое исследование у всех пациентов отмечено прогрессирование заболевания и неэффективность предыдущей терапии. В результате установлено, что вакцина «Мелавак» не приводит к каким-либо лимитирующим побочным эффектам или осложнениям. Биохимические и клинические показатели крови оставались стабильными, а выявленные изменения были транзиторными и/или соответствовали основному заболеванию. Иммунотоксических проявлений (аллергических и анафилактических реакций) не

было отмечено ни у одного пациента. Гриппоподобный синдром отсутствовал, локальная гиперемия была обратимой, проявлялась умеренно в зависимости от величины примененной дозы. Уровень токсичности соответствует 0-1 степени по шкале СТСАЕ v.3.0. Таким образом, вакцина «Мелавак» при внутрикожном многократном введении в дозах от 10,0 до 60,0 млн клеток не проявляет лимитирующего побочного действия. На основании проведенных исследований для проведения 2 фазы клинического изучения рекомендована разовая доза 30 млн клеток.

Клеточная вакцина «Дендритная»

Вакцина «Дендритная» приготовлена на основе аутологичных дендритных клеток (ДК), нагруженных опухолевым лизатом ш vitro. Для приготовления опухолевого лизата использовали аутологичный опухолевый операционный материал. ДК получали из мононуклеаров периферической крови пациентов, которые культивировали в присутствии цитокинов ГМ-КСФ и ИЛ-4. Созревание ДК индуцировали с использованием ФНО-а и ПГЕ2 по разработанной в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН методике [Чкадуа Г.З., и соав., 2002]. О зрелости ДК свидетельствовал иммунофенотип: CD83+, CD80+, CD54+, CD86+ и HLA-DR+. Клиническое изучение вакцины «Дендритная»

Для проведения клинического исследования безопасности вакцины разработаны 2 протокола, утвержденных на Ученом совете НИИ КО РОНЦ (см. Приложение №3) и МЗиСР РФ (разрешение № 371 от 06.08.2008 г). В исследование включено 48 пациентов с диссеминированной меланомой в возрасте от 26 до 82 лет (в среднем 54 года.). Вакцину «Дендритная» вводили пациентам внутрикожно в несколько точек в однократных дозах от 1,0 до 5,0 млн клеток с кратностью введения 2-6 нед и, как правило, до прогрессирования заболевания. Больные были разделены на группы.

Больные (п=7) с регионарными и/или отдаленными метастазами на фоне прогрессирования заболевания при отсутствии ответа на предыдущее лечение получали вакцину в качестве основного лечения (терапевтический режим). Больные (п=41) после эффективного лечения (хирургического, химио- или

иммуннотерапии) без клинических признаков заболевания получали вакцину в адъговантном режиме. При проведении вакцинации пациентов в 2-х группах (п=48) каких-либо выраженных побочных реакций не выявлено.

В течение первых суток после вакцинации в дозе 2,0 млн клеток наблюдали легкий гриппоподобный синдром, не требовавший симптоматической терапии и локальную реакцию, расцененную как РГЗТ. Клинические и биохимические показатели крови во время и после вакцинации оставались без динамики, как это было показано для вакцины «Аллоген», а обнаруженные изменения соответствовали прогрессированию заболевания. Аллергических или анафилактогенных реакций не отмечали. Вакцинация, как правило, не ухудшала качество жизни пациентов, большинство из которых вело активный образ жизни. Пациенты группы адъювантного режима во время лечения в полной мере сохраняли трудоспособность. Оценка токсичности соответствует 0-1 степени.

Мониторинг вакцинотерапии Исследование иммунологического статуса больных на фойе вакцинотерапии

25 пациентов, получавшие вакцину «Дендритная» в адъювантном режиме, были разделены на 2 группы: со временем до прогрессирования (ВДП) <10 мес. (п=13) и с ВДП > 10 мес. (п=10). Оценка иммунологического статуса проведена до вакцинотерапии (точка «0») и после третьей вакцинации (точка «3»). В качестве контроля взята группа здоровых доноров (п=10). У больных с ВДП > 10 мес. иммунный статус не отличался от здоровых доноров. Однако у больных с ВДП < 10 мес. имелись отклонения в показателях иммунного статуса. Так, обнаружено статистически значимое уменьшение СОЗ+ лимфоцитов по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05) и С04+ Т-лимфоцитов, уменьшение иммунорегуляторного индекса (ПРИ) (р < 0,01), увеличение количества НК-клеток (СБ 16) в два раза (р < 0,001), С03+С08+Цитотоксических клеток (р < 0,01), СОЗ+СЭ16+ НК-клеток (р < 0,01) и СБЗ'С016+ НК-клеток (р < 0,05). Таким образом, больные с ВДП < 10 мес. уже до вакцинации имели выраженные изменения в иммунном статусе, которые не изменились в процессе вакцинотерапии. Снижение уровня Т-клеток, С04+ Т-клеток, ИРИ и повышение

СО 16+ НК-клеток можно считать неблагоприятными прогностическими факторами (табл.3).

Таблица 3. Иммунологический статус больных меланомой, получавших вакцину «Дендритная: в адъювантном режиме и у здоровых доноров_

Антигены Процент антигенположительных клеток (Мср±т)

Здоровые ВДП>10 мес ВДП<10 мес

доноры До вакцинации После 3 вакцинации До вакш1нацнп После 3 вакцинации

СОЗ 67,5±5,5 68,7±9,5 68,7±10,3 62,9± 11,5* 60,8±6,5*

СЭ4 45,5±6,2 39,14±7,3 40,2±6,7 35±5,6*** 31,8±4,7***

СБ8 26,9±6 32,3±7,4 28,7±5,2 40,8±4,8 42,6±6,3

ИРИ 1,7±0,4 1,2±0,3 1,4±0,3 0,8±0,2 0,7±0,1

СБ16 16,8±6 24,1±5,8 24,2±6,8 31,6±7,8*** 32,1±7,7***

С020 9,7±3,4 11,78±7,4 11,22±5,6 14,6±7,5 15,5±4,5

СОЗ+СБ4+ 43,1±7,3 38,5±7,3 39,78±6,5 34,3±5,4** 30±4,5**

СБЗ+С08+ 20,8±3,4 27,3±7,1 23,82±4,4 25,2±7,5 28,8±6,2

СОЗ"СБ8+ 6,1±3,5 5±2,6 5,1±2,6 15,5±7,4** 13,8±5,5**

СБ4+С08+ 1,1±1,6 4,5±4,5 2,7±1,7 8,4±7,2 5,9±5,2

СБ8+С016+ 7,4±3,5 6±2,7 6,3±2,9 15,7±6,5 13,3±5,8

С03+С016+ 4,3±1,6 5,05±3,3 4,47±1,3 12,6±6,2** 12,8±6,4**

СОЗ'СО!6+ 12,5±5,2 19,14±6,9 19,5±7,4 18,9±6,3* 19,2±5*

Примечание: *ратта достоверны, р<0.05; **р<0,01: "*р<0,00!; ** ПРИ- жыуноресуляторный индекс

Оценка иммунннного ответа на вакцинацию дендритными клетками методом ЕЫ5ро1

Всего в данный анализ включено 17 больных. Было определено среднее число ИФН-у продуцирующих клеток в каждой точке и проанализировано изменение числа клеток периферической крови, активирующихся в ответ на стимуляцию опухолевым лизатом. Среднее число клеток, продуцирующих ИФН-у, до начала вакцинации составило 0,54 клетки на 100 ООО лейкоцитов

периферической крови. В процессе вакцинации наблюдалось уменьшение числа этих клеток, и лишь к 3 точке число ИФН-у- продуцирующих клеток существенно возросло (до 2,23 клетки на 100 ООО лейкоцитов).

Рисунок 6. Изменение числа клеток, продуцирующих ИФН-у, в процессе вакцинации.

Таким образом, в процессе вакцинотерапии отмечено снижение, а затем рост числа ИФН-у продуцирующих клеток. Мониторинг реактивности кожи

В группе пациентов (п=8), получивших вакцину «Аллоген», изучены 16 биоптатов кожи подлопаточной области. ИГХ-исследования биоптатов кожи подлопаточной области до и после вакцинации в периваскулярных пространствах сосочкового слоя показали достоверное (р<0,05) увеличение количества маркеров Т-клеток CD3 и CD8, В-клеток - CD20 и НК-клеток - CD56. Периваскулярные пространства сетчатого слоя также характеризовались достоверным (р<0,05) увеличением количества CD3, CD8, CD 14, CD56 -клеток. В окружении клеточного состава потовых желез отмечено достоверное (р<0,05) увеличение количества Т-клеток CD3, а для сальных желез отмечено достоверное (р<0,05) увеличение количества Т-клеток CD3 и CD8, а также НК-клеток - CD56.

2,5

точка 0 точка 1 точка 2 точка 3

Исследование цитокипового профиля

В зависимости от режима введения (адъювантный, терапевтический) 62 пациента разделены на группы. Анализ ВДП, проведенный в группах больных, получавших вакцины аутологичную «Дендритная» и «Аллоген» в адъювантном и/или терапевтическом режимах, представлен в табл. 4.

Таблица 4. Время до прогрессирования при применении вакцин «Дендритная» и «Аллоген» в адъювантном и лечебном режимах

Режим применения Группа, вакцина п Время до прогрессирования, мес.

Адъювантный 1 .«Дендритная» 16 46±5

2.«Дендритная» 25 9±1

Терапевтический 3.« Дендритная» 7 3,5±0,5

4. «Аллоген» 14 5,5±1,5

Р <0,001 1-2;3;4

Из таблицы 4 видно, что у больных ВДП терапевтического режима при применении обеих вакцин «Дендритная» и «Аллоген» не превышало 5,5 мес. Больные меланомой адъювантного режима на фоне применения вакцины «Дендритная» в разовых дозах 2-5 млн клеток разделены на 2 подгруппы по величине ВДП: >10 мес. и <10 мес. (табл. 4). Наиболее длительное время до прогрессирования получено у пациентов первой группы, получающих вакцину «Дендритная» в адъювантном режиме. Важно выяснить, почему у половины больных без признаков заболевания прогрессирование наступает до 10 мес. Для выяснения этого феномена проведен анализ основных цитокинов и биомаркеров. Исходный уровень цитокинов в адъювантной группе пациентов (п=41) был изменен до вакцинации (табл. 5) таким образом, что ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-10 были выше нормы, а ИФН-у и ИЛ-12 - ниже нормы. В отдельных подгруппах с различным ВДП показатели практически не отличались от исходного значения, полученного во всей группе, кроме ИЛ-10 и ИЛ-4, где прослеживается тенденция к увеличению в 1,6 (9,3±1,7 против 6,9±1,9 пг/мл) и 1,3 раза (5,6±2,1 против 3,5±0,9 пг/мл). У пациентов на фоне исходно достоверно (р<0,001) повышенного

уровня ИЛ-2 в процессе вакцинации при адьювантном режиме величина показателя остается без изменений, в терапевтическом режиме (вакцина «Аллоген») отмечено достоверное (р<0,01) увеличение средней величины ИЛ-2. Средний показатель исходного уровня ИЛ-12 достоверно (р<0,01) отличался в 1-й и 2-й от 3-й и 4-й групп.

Таблица 5. Исходный цитокиновый профиль у больных с различным ВДП

Режим лечения Вакцина, группа N Содержание, пг/мл (М±т)

ИЛ-2 ИЛ-12 ИФН-у ИЛ-4 ИЛ-10

Адъювант-ный «Дендритная» 1-я группа 16 19,7± 3,2* 78,6± 8,0 12,3± 2,9* 3,5± 0,9 6,9± 1,9

«Дендритная» 2-я группа 25 16,8± 2,5* 77,7± 7,8 12,2± 2,3* 5,6± 2,1 9,3± 1,7

Терапевтический «Дендритная» 3-я группа 7 12,2± 2,5* 138,2± 26,4 6,5± 2,5* 6,5± 2,8 5,6± 0,7

«Аллоген» 4-я группа 13 24,3± 4,1* 112,3± 9,7 34,4± 5,4 12,5± 2,6* 10,4± 2,9

Здоровые доноры 5-я группа 13 М± 0,1* 100,6± 9,8 39,1± 5,9 1,9± 0,6 4,9± 0,5

Р р<0,001 5-1;2;3;4 - р<0,001 5-1;2;3 р<0,001 5-4 -

На этом фоне в процессе вакцинотерапии уровень ИЛ-12 возрастал достоверно (р<0,01) при адъювантной вакцинации «Дендритной» и терапевтической вакцинации «Аллоген» без достоверных изменений в других группах. Анализируя динамику исследуемого цитокина установлено, что изначально низкий уровень ИФН-у в адъювантных группах (р<0,001) в ходе вакцинации не изменился. Изначально низкий уровень ИФН-у (р<0,001) терапевтического режима вакцины «Дендритная» остался без динамики. Терапевтический режим вакцины «Аллоген», изначально приближающийся ] норме, имел тенденцию к уменьшению. Исходно пациенты всех исследуемы: групп имели в З^Ф раза более высокие значения ИЛ-4 по сравнению с группоГ здоровых доноров, особенно в группах терапевтического режима. Не обнаружен»

динамики на фоне вакцинотерапии. Изначально отмечена тенденция к повышению уровеня ИЛ-10 без последующей динамики (табл.6).

Таблица 6. Цитокиновый профиль больных меланомой в процессе адъювантного или терапевтического режимов применения вакцин «Дендритная» и «Аллоген»

Режим Вакцина, п Содержание, пг/мл (М±т)

лечения группа ИЛ-2 ИЛ-12 ИФН-у ИЛ-4 ИЛ-10

«Дендритная» 1 -я группа 16 22,7± 4,1 82,3± 7,8 13,4± 3,4 2,5± 0,4 6,1± 1,4

Адъюван-тный «Дендритная» 2-я группа 25 15,6± 2,4 77,4± 8,4 12,0± 2,3 5,1± 1,7 8,8± 2,0

Терапев- «Дендритная» 3-я группа 7 10,9± 3,2 138,0±2 3,3 6,5± 2,3 4,9± 0,9 6,68± 1,67

тический «Аллоген» 4-я группа 13 32,42± 6,19 173,97± 25,5 26,34± 3,48 8,1±1, 2 8,0± 1,5

Исходный уровнь Б100 в группе адъювантного лечения (п=41) практически не отличался от нормы, а у больных с диссеминированным процессом (п=25) был существенно повышен (табл. 7).

У больных меланомой изначально отмечался достоверно повышенный уровень С044 (р<0,001), особенно в группах пациентов терапевтического режима. На фоне вакцинации в группах отмечается тенденция к сохранению уровня маркера, или к увеличению такового (р<0,01) в 4-й группе.

Изначально в подгруппе адъювантного лечения (п=16) с ВДП > 30 мес. уровень Б100 при лечении вакциной «Дендритная» приближался к норме. Во 2 подгруппе адъювантного режима (п=25) с ВДП < 10 мес на фоне исходно высокого значения маркера продолжалось его увеличение (табл.7). У больных терапевтических групп среднее значение Б100 превышало донорское значение, но достоверно только в группе терапевтического режима вакцины «Аллоген»

(р<0,05) и продолжало возрастать в процессе вакцинотерапии (достоверно для 2 " 3-й и 4-й групп, р<0,001)).

Исходный уровень ТСИЙ при показаниях к адъювантному лечению (п=41 практически не отличался нормы, а у больных с диссеминированным процессо] (п=20) снижен. При адьювантном лечении вакциной «Дендритная» уровен маркера оставался прежним, а при терапевтическом режиме имел тенденцию повышению (табл. 7).

Таблица 7. Исходный профиль онкомаркеров у больных с различным ВДП

Режим Вакцина, п Содержание, пг/мл (М±т)

лечения группа Б-100 нг/мл ТОРС СЭ44 нг/мл УЕОР А2

Адъюван «Дендритная» 1-я группа 16 55,9± 3,9 1205,6± 96,9 543,0± 80,9 191,3± 50,2

тныи «Дендритная» 2-я группа 25 97,1± 9,9 1320,7± 126,0 531,6± 52,7 144,8± 27,4

Терапев- «Дендритная» 3-я группа 7 167,7± 54,2 760,9± 159,1 708,0± 115,4 871,7± 370,6

тический «Аллоген» 4-я группа 13 223,3± 41,6 827,5± 97,8 1184,4± 31,8 123,4± 29,4

Здоровые доноры 5-я группа 13 69,4± 9,8 1218,6± 28,6 347,7± 20,5 74,9± 25,2

Р р<0,05 р<0,001

Исходный уровень СБ44 при показаниях к адъювантному лечению (п=41 был в 1,5—1,6 раза выше нормы, а у больных с диссеминированным процессог (п=20) был в 2,0-3,4 раза выше нормы (табл. 7). На фоне вакцинации в группа: отмечается тенденция к сохранению уровня маркера, а в терапевтически: достоверно к увеличению такового (р<0,01).

Исходный уровень УЕОР А2 при показаниях к адъювантному лечениь (п=41) был в 2,0-2,5 раза выше нормы, а у больных с диссеминированнь»

процессом (п=20) имелась тенденция к увеличению маркера от 2,0 до 11,8 раз. Таким образом, пациенты с меланомой по сравнению с группой здоровых доноров, имели изначально тенденцию высокого уровня среднего значения УЕОР-А2, который на фоне вакцинотерапии имел тенденцию к незначительному понижению (табл. 8).

Таблица 8. Профиль онкомаркеров больных меланомой в процессе адъювантного или терапевтического режимов применения вакцин «Дендритная» и «Аллоген»

Режим лечения Вакцина, группа п Содержание, иг/мл (М±т)

S100 нг/мл TGFB CD44 нг/мл VEGF А2

Адъюван-тныи «Дендритная» 1-я группа 16 63,5± 6,4 1211,5± 104,6 500,4± 31,3 180,2± 53,1

«Дендритная» 2-я группа 25 150,1± 16,3 1297,9± 71,1 525,2± 51,2 132,9± 1,9

Терапевтический «Дендритная» 3-я группа 7 535,0± 224,5 1011,3± 148,8 743,6± 120,6 732,6± 354,8

«Аллоген» 4-я группа 13 392,9± 110,9 983,4± 121,1 1314,3± 160,2 117,7± 5,6

Стратегия противоопухолевой вакцинотерапии основана на усилении или включении контроля над распространенным злокачественным процессом путем воздействия различных факторов на иммунную систему организма. Мобилизованные клеточные и гуморальные иммунные реакции являются тем фактором, который выступает в качестве «инструмента» вакцинации. Неоднозначность результатов применения различных типов существующих в мире вакцин приводит к необходимости усовершенствовать стратегию создания вакцин.

Стратегия создания цельноклеточных вакцин подразумевает под собой ряд задач. Первым стратегическим шагом является получение клеточных линий, адаптированных к росту in vitro из образцов опухолевых (меланома) тканей человека, и их характеристика. В ходе данного исследования была проведена адаптация клеток к росту in vitro, выделенных из образцов опухолевой ткани. Получено 19 охарактеризованных стабильных клеточных линий, при

31

кариологическом исследовании которых выявлены значительные хромосомные аномалии генетического аппарата клеток (до 11 на клетку) и различный набор хромосом (триплоидный, тетраплоидный, околодиплоидный). Клеточные линии были разделеные на три группы (высокодифференцированные, умеренно дифференцированные и низкодифференцированные). Умеренно

дифференцированные и низкодифференцированные клеточные линии характеризовались большим объёмом кариологических нарушений и большей экспрессией раково-тестикулярных генов по сравнению с умеренно дифференцированными линиями. Проведенное иммунофенотипирование клеточных линий подтвердило меланомную природу полученных линий: отсутствие лимфоидных (СБЗ и СБ20) и экспрессия дифференцировочных меланомных маркеров (СОбЗ, Ме1апА/МАЯТ1, НМВ45). Исследование экспрессии антигенов гистосовместимости первого и второго класса выявили в одном случае полное их отсутствие на протяжении всех пассажей, а в других случаях - тенденцию к увеличению антигенов гистосовместимости второго класса. Исследование трансплантационного фенотипа (НЬА-антигены I класса гистосовместимости) 19 клеточных линий выявило присутствие на клетках различных антигенов НЬА. Проведенный анализ раково-тестикулярных антигенов и дифференцировочных генов выявил неоднородную картину, а так же продемонстрировал, что количество экспрессирующихся генов РТА и интенсивность их экспрессии коррелирует со степенью дедифференцировки клеток меланомы в клеточных линиях, полученных из метастазов. Полученные клеточные линии, учитывая их уникальность, хранятся в коллекции клеточных культур Института цитологии РАН в г.Санкт-Петербурге. Патентами на изобретение защищены 15 клеточных линий, из них 5 патентов вошли в 100 лучших изобретений России за 2010 г. На основе двух клеточных линий разработаны две противоопухолевые генно-инженерные вакцины, которые в настоящее время проходят клинические исследования. Знание иммунофенотипического профиля открывает возможность подбирать наиболее

комплементарные линии для создания индивидуальных противоопухолевых вакцин из аллогенных клеток.

Дальнейшее совершенствование стратегии создания цельноклеточных противоопухолевых вакцин решало задачу оптимизации объема доклинического и клинического этапов изучения. В исследование вошли вакцины из клеток человека: аутологичные интактная «Дендритная» и модифицированная «Ayтoлoгичнaя/tag-7», аллогенные «Аллоген» и «Мелавак», а также сингенная для мышей «В16/Р10-ГМ-КСФ». В результате было показано, что ни одна из вакцин не проявила клинических и морфологических признаков необратимой токсичности. Это послужило основанием для проведения их клинического изучения или третьего стратегического этапа.

Третьим стратегическим этапом является подготовка документации по клиническим исследованиям и их проведение. Анализ результатов клинического изучения проведен в 2 разделах. В первом оценена безопасность вакцин, различающихся антигенной специфичностью, т. е. аутологичных и аллогенных. Оказалось, что все вакцины, в т. ч. генно-инженерные, идентичны по отсутствию проявлений токсичности у пациентов. Таким образом, доклинический прогноз безопасности вакцин полностью оправдался. Вторым разделом этого этапа является иммунологический мониторинг. На фоне вакцинотерапии исследован цитокиновый профиль пациентов. Отмечено, что у пациентов с меланомой изначально имеется как профиль Т-клеточного ответа (ТЫ) с тенденцией повышенного 1Ь-2 и тенденцией пониженного 1РЫ-у, так и гуморального ответа (ТЬ2) более выраженного в у пациентов с наличием опухолевого процесса.

Важным фактом, позволяющем судить о взаимосвязи иммунологических механизмов иммунокоррекции и ингибирования опухолевого процесса под действием вакцины «Аллоген», является положительная динамика активирующих молекул (гранзим В на СБ16+ клетках, экспрессия СБ25 и ИФН-у на СБ4+ и С08+ клетках) на фоне стабилизации у пациентов с прогрессирующим течением заболевания.

Изучение внутрикожной реакции на введение противоопухолевых вакцин показало увеличение количества иммуннокомпетентных клеток (лимфоидных, ЫК-клеток, дендритных) в участках кожи, незатронутых введением вакцины, что может свидетельствовать об активации иммунной системы организма не только в крови, но и в коже.

Исследование методом ЕЫБро! иммунного ответа у больных меланомой, получающих иммунотерапию дендритноклеточными или генно-модифицированными вакцинами, выявило увеличение числа мононуклеарных клеток периферической крови, синтезирующих ИФН-у в ответ на стимуляцию лизатом опухолевых клеток, использовавшихся для вакцинации, примерно у трети больных.

Таким образом, на основе созданной Коллекции клеточных линий меланомы человека, разработаны дендритноклеточная и генно-инженерные противоопухолевые вакцины. Проведенные доклинические и клинические исследования способствуют выработке стратегического направления противоопухолевой вакцинотерапии, тем самым повышая эффективность лечения онкологических больных.

выводы

1. Субстратом для производства цельноклеточных противоопухолевых вакцин явились 19 клеточных линий меланомы, генерированных из метастатических узлов 68 пациентов; данные линии носили генетически обусловленные различия иммунного и онкофенотипа, коррелировавшими со степенью дифференцировки клеток.

2. Технология трансфицирования клеточных линий привнесенными новыми генами (tag-7 и ГМ-КСФ), совмещенная с последующей технологией обработки дендритных клеток опухолевым лизатом (антигенной загрузкой), позволили создать и охарактеризовать по доклиническим и клиническим показателям 4 цельноклеточные вакцины: 2 аутологичные («Дендритная» и «Аутологичная/^-7») и 2 аллогенные («Аллоген» и «Мелавак»),

3. Разработанные вакцины показали себя безопасными в доклинических исследованиях. Вакцины не проявляют острой, хронической токсичности и туморогенности. В результате 1-й фазы клинического изучения по критериям безопасности и специфической активности для 2-й фазы изучения рекомендованы вакцины в разовых дозах: «Дендритная» 2-5 млн клеток; «Аутологичная/tag?» 10-20 млн клеток; «Аллоген» 5-40 млн клеток и «Мелавак» 1-60 млн клеток.

4. Побочные эффекты вакцинации пациентов с меланомой проявлялись в виде ранних кратковременных и обратимых осложнений: локальной гиперемии (64%), общей гипертермии (26%).

5. Исходный статус пациентов с меланомой независимо от распространенности процесса характеризуется достоверно повышенным маркером Т-клеточного ответа (ТЫ) по ИЛ-2 (р<0,001) и сниженным ИФН-у (р<0,001); повышенным онкомаркером CD44 (р<0,001) и сниженным TGFB в терапевтических группах (р<0,001) с последующим достоверным повышением ИЛ-12 (р<0,01) во время вакцинации.

6. Проведение иммунологического мониторинга эффективности вакцин предусматривает контроль экспрессии активационных антигенов, оценку

гранзим содержащих и ИФН-у продуцирующих клеток, определение цитокиного профиля и онкомаркеров сыворотки крови, НКТ-клеток.

7. Стратегия создания цельноклеточных вакцин заключается в осуществлении последовательных действий: 1) получении стабильных перевиваемых клеточных линий; 2) детальной характеристики этих линий по генетическим и иммунологическим параметрам (с целью досконального определения опухолеассоциированных антигенов и аллелей антигенов гистосовместимости); 3) стабильной трансфекции клеток отобранными генами; 4) доклиническому изучению безопасности вакцин; 5) юридической валидации клинических исследований; 6) оценке клинической безопасности; 7) оценке индукции иммунного ответа при вакцинации.

Список работ, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК РФ Михайлова, И.Н. Клинические испытания аутологичной вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных геном tag-7. / И.Н. Михайлова, Л.В., Демидов, А.Ю. Барышников., О.С Бурова., Л.Ф. Морозова, Г.Ю. Харкевич, Т.Н. Палкина., A.A. Козлов., A.A. Вайнсон., З.Г. Кадагидзе., Т.Н. Заботина., а!а. Буркова, М.Б. Дорошенко, С.А. Хатырев, Д.А. Носов, A.M. Гарин., С.А.Тюляндин, C.JI. Киселев, С.С. Ларин, Г.П. Георгиев // Сибирский онкологический журнал. -2005.-№ 1 (13).-С. 23-27.

Михайлова, И.Н. Клеточные линии меланомы - основа для создания противоопухолевых вакцин. / И.Н. Михайлова, М.И. Лукашина, А.Ю. Барышников, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, Т.Н. Палкина, A.A. Козлов, В.А. Голубева, Е.А. Черемушкин, М.Б. Дорошенко, Л.В. Демидов, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, Г.П. Георгиев // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. - 2005. -№ 7. -С. 37-40.

Михайлова, И.Н. Первая фаза клинических испытаний противоопухолевой геномодифицированой вакцины. Оценка иммунного статуса. / И.Н. Михайлова, К.А. Барышников, О.С. Бурова, М.И. Лукашина, А.Л. Смирнова, H.H. Петенко, И.А. Утяшев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т.5, №3. - С. 51-54.

Смирнова, A.B. Исследование роли экспрессии молекул HLA I и II классов в активации лимфоцитов / A.B. Смирнова, М.И. Лукашина, И.Н. Михайлова, Л.В. Демидов, Е.В. Огородникова, Л.Ю. Арустумян, К.Д. Никитин, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т.6., № 1. -С. 8-14.

Михайлова, И.Н. Вакцинотерапия метастатической меланомы с использованием дендритных клеток: клиническое исследование I/II фазы / И.Н. Михайлова, H.H. Петенко, Г.З. Чкадуа, Л.Ю. Вишнякова, Е.В. Огородникова, Е.А. Черемушкин, К.С. Титов, С.А. Хатырев, Т.К. Харатишвили, К.А. Парсункова, М.Д. Алиев, А.Ю. Барышников, Л.В. Демидов // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - № 2 - С. 39-43.

6. Михайлова, И.Н. Экспрессия раково-тестикулярных антигенов в клетк. меланомы человека. / И.Н. Михайлова, Д.А. Ковалевский, О.С. Бурова, В./ Голубева, Л.Ф. Морозова, Е.С. Воронина, И.А. Утяшев, Г.С. Аллахвердян, С Субраманиан, Т.Т. Кондратьева, Е.А. Черемушкин, C.JI. Киселев, JI.B. Демидо] А.Ю. Барышников, Р.Ш. Бибилашвили // Сибирский онкологический журнал. 2010. -№ 1(37).-С. 29-39.

7. Михайлова, И.Н. Внутрикожная клеточная реакция на фоне вакцинотерапи меланомы кожи. / И.Н. Михайлова, П.К. Иванов, H.H. Петенко, К.А. Барышнико! Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, Е.А. Черемушкин, С. Субраманиан, Г.З. Чкаду; А.Ю. Барышников, Л.В. Демидов // Российский биотерапевтический журнал. 2010. - Т.9, № 1.-С. 63-67.

8. Михайлова, Т.В. Сравнение уровня экспрессии HSP70 на клеточных линия меланомы. / Т.В. Михайлова, М.А. Барышникова, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозов; И.Н. Михайлова, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. 2010,-Т.9, № 1.-С. 43-47.

9. Михайлова, И.Н. Динамика цитокинов у больных с диссеминированно меланомой в ходе вакцинотерапии аллогенными опухолевыми клетками. / ИТ Михайлова, К.А. Парсункова, И.В. Евсегнеева, Л.Б. Краснова, К.А. Барышнико] Е.А. Черемушкин, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, A.B. Караулов, С.Л. Киселев, Л.Б Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. Т.8, № 4. - С. 13-16.

10. Михайлова, И.Н. Экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов первичной меланоме кожи человека. / И.Н. Михайлова, Д.А. Ковалевский, Я.Е Вишневская, И.А. Утяшев, В.А. Голубева, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, ЕJ Черемушкин, Т.Т. Кондратьева, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышнико! Р.Ш. Бибилашвили // Вестник РОЩ им. Н.Н.Блохина РАМН. - 2010. -Т.21, № ? -С. 52-65.

11. Манина, И.В. Доклинические исследования иммунотерапии меланомы кожи помощью цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF / И.В. Манина, Н.М. Перетолчина, Н.С. Сапрыкина, A.M. Козлов, И.1

Михайлова, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. -2010.-№3.-С. 14-19.

Манина, И.В. Перспективы применения антагониста Н2-гистаминовых рецепторов (Циметидина) в качестве адъюванта биотерапии для лечения меланомы. / И.В. Манина, Н.М. Перетолчина, Н.С. Сапрыкина, A.M. Козлов, И.Н. Михайлова, К.И. Жорданиа, А.Ю. Барышников // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2010. - № 4. - С. 10-17.

Бармашов, А.Е., Оценка специфического противоопухолевого иммунитета методом ELISpot у больных, получающих вакцину «Мелавак». / А.Е. Бармашов, К.Д. Никитин, И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, А.Н. Иншаков, К.А. Барышников, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. -Т.9, № 3. - С.37-40.

Михайлова, И.Н. Метод ELISpot для оценки иммунного ответа на противоопухолевые вакцины на основе аутологичных дендритных клеток, нагруженных опухолевым лизатом / И.Н. Михайлова, К.Д. Никитин, H.H. Петенко, И.А. Утяшев, К.А. Парсункова, М.А. Рубцова, Г.З. Чкадуа, К.А. Барышников, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал.-2010. -Т.9, № 4.-С. 55-60.

Голубцова, Н.В. Изменение сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса, у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии. / Н.В. Голубцова, И.Н. Михайлова, В.В. Новиков, К.А. Барышников, Н.Б. Преснякова, Е.В. Огородникова, H.H. Петенко, К.А. Парсункова, О.С. Бурова, Г.З. Чкадуа, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.9, № 3. - С. 41-45.

Голубцова, Н.В. Прогностическое значение сывороточных уровней растворимых молекул HLA I класса и антигена CD8 у больных диссеминированной меланомой. / Н.В. Голубцова, И.Н. Михайлова, В.В. Новиков, К.А. Парсункова И.В. Самойленко H.H. Петенко, Е.В. Огородникова В.Н. Тазаев, Е.А. Черемушкин, К.А. Барышников, Е.В. Коржевская, Н.Б.

Преснякова, Г.З. Чкадуа, JI.B. Демидов, А.Ю. Барышников // Российск биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.9, №4. - С. 103-106.

17. Mikhaylova, I.N. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell lines. /1. Mikhaylova, D.A. Kovalevsky, L.F. Morozova, V.A. Golubeva, E.A. Cheremushk" M.I. Lukashina, E.S. Voronina, O.S. Burova, I.A. Utyashev, S.L. Kiselev, L. Demidov, R.Sh. Beabealashvilli, A.Y. Baryshnikov // Melanoma Res. - 2008. - О 18(5):303-13, 11.

Патенты

1. Патент на изобретение №2287575, РФ. «Клеточная линия mel Р. используем для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышник А.Ю., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Демидов Л..В., Палкина Т.Н., Козлов A.N Ларин С.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В.; опубл. 20.11. 2006. Бк №32.

2. Патент на изобретение № 2287578, РФ. «Клеточная линия mel К< используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова ИЛ Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Демидов Л.В., Козлов А.1\ Ларин С.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В.; опубл. 20.11. 2006. Бк №32.

3. Патент № 2287577, РФ. «Клеточная линия mel II. используемая для получен противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозо Л.Ф., Бурова О.С., Демидов Л.В., Лукашина М.И., Ларин С.С., Георгиев Г.1 Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В.; опубл. 20.11. 2006. Бюл. № 32.

4. Патент № 2287576, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel II используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.1 Барышников А.Ю. Морозова Л.Ф., Бережной А.Е., Козлов A.M., Ларин С.С Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В.; опубл. 20.11. 2006. Бюл. № 32.

5. Патент № 2360963, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Ml используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.1

Барышников А.Ю., Демидов JI.B., Киселев C.JL, Бурова О.С., Морозова Л.Ф.; опубл. 10.07. 2009. Бюл. № 19.

Патент № 2363734. РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Si. используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф.; опубл. 10.08. 2009. Бюл. № 22.

Патент № 2364624. РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Cher. используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф.; опубл. 20.08. 2009. Бюл. № 23.

Патент № 2373280. РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Gus. используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф; опубл. 20.11. 2009. Бюл. № 32.

Патент № 2373279. РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Ch. используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф.; опубл. 20.11. 2009. Бюл. № 32.

Патент № 2390556. РФ. 27 мая 2010. «Клеточная линия меланомы человека mel Z. используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Самойленко И.В.; опубл. 27.05. 2010. Бюл. № 15.

Патент № 2008151673. РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Ksen. используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Барышников К.А.; опубл. 20.06. 2010. Бюл. № 17.

Патент № 2390557. РФ. 27 мая 2010. «Клеточная линия меланомы человека mel Bgf, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Самойленко И.В.; опубл. 27.05. 2010. Бюл. № 15.

13. Патент № 2402602. РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Rae, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов JI.B., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф.; опубл. 27.10. 2010. Бюл. № 30.

14. Патент № 2402603, РФ. «Клеточная линия меланомы человека mel Me, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Барышников К.А.; опубл. 27.10. 2010. Бюл. № 30.

15. Патент № 2402604, РФ. «Клеточная Линия меланомы человека mel Н, используемая для получения противоопухолевых вакцин». / Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В. Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф.; опубл. 27.10. 2010. Бюл. № 30.

Тезисы конференций, конгрессов и симпозиумов

1. Михайлова, И.Н. Активная специфическая иммунотерапия меланомы и рака почки вакциной tag7. I фаза клинического изучения. / И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, A.M. Козлов, Л.В. Демидов, Г.Ю. Харкевич, С.А. Тюляндин, A.M. Гарин, Д.А. Носов, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, А.Ю. Барышников, Г.П. Георгиев // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Москва, 17-20 марта 2002. Российский биотерапевтический журнал. - 2002. - Т. 1, № 2. — С. 133.

2. Михайлова, И.Н. Вакцина tag7. I фаза клинического изучения. / И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, A.M. Козлов, Л.В. Демидов, Г.Ю. Харкевич, С.А. Тюляндин, A.M. Гарин, Д.А. Носов, З.Г. Кадагидзе, A.A. Буркова, Т.Н. Заботина, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, А.Ю. Барышников, Г.П. Георгиев // I Всероссийская научно-практическая конференция «Биотерапия рака». Москва, 1820 июня - 2002. - № 30. - С. 63-64.

3. Mikhaylova, I. Autologous tag7 modified anti-cancer vaccine: preliminary study of Phase. I clinical trial. /1. Mikhaylova, L. Morozova, O. Burova, T. Palkina, A. Kozlov, A. Wainson, Z. Kadagidze, T. Zabotina, S. Khatyrev, K. Jordania, D. Nosov, S.

Tulandin, A. Garin, L. Demidov, A. Barishnikov, S. Kiselev, S. Larin, G. Georgiev // European Society of gene therapy. 11th Annual Congress, Edinburg, UK, November 1417. - 2003. Abstract book. P. 95.

Бережной, A.E. Получение стабильной линии клеток меланомы человека, секретирующей ГМ-КСФ. / А.Е. Бережной, С.С. Ларин, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, И.Н. Михайлова, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Российский биотерапевтический журнал. - 2005. — №1. — С. 6.

Михайлова, И.Н. Кариологические исследования клеточных линий меланомы кожи человека / И.Н. Михайлова, Е.С. Воронина, Н.М. Дышева, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, Е.А. Черемушкин, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 21-24 марта 2006. Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т.5, № 1. - С. 5.

Михайлова, И.Н. Клеточные линии меланомы. / И.Н. Михайлова, Д.А. Ковалевский, О.С. Бурова, М.И. Лукашина, Л.Ф. Морозова, В.А. Голубева, H.H. Петенко, Е.А. Черемушкин, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, Г.П. Георгиев, Р.Ш. Бибилашвили // Материалы V Симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний». Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2006. - Т.5, № 4 - С. 15.

Михайлова, И.Н. Вакцинотерапия диссеминированной меланомы геномодифицированными клетками. / И.Н. Михайлова, О.С. Бурова, М.И. Лукашина, Л.Ф. Морозова, И.А. Утяшев, H.H. Петенко, К.А. Барышников, П.В. Иванов, К.А. Парсункова, Е.А. Черемушкин, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Материалы 15-ой Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» 22-26 мая 2006. Санкт-Петербург. Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье». - 2006. — Т.10, № 2. - С.25.

Mikhaylova, I.N. Gene modified tumor cell based vaccine therapy of advanced melanoma. / I.N. Mikhaylova, O.S. Burova, M.I. Lucashina, L.F. Morozova, U.A. Utyashev, N.N. Petenko, K.A. Barishnikov, P.V Ivanov, K.A. Parsunkova, E.A.

Cheremushkin, L.V. Demidov, A.U. Barishnikov // 8th International Biological Therapy of Cancer, Dresden. - 2006. - June 21-24.

9. Огородникова, M.B. Экспрессия маркеров апоптоза на клеточных линиях меланомы. / М.В. Огородникова, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, И.Н. Михайлова, Л.В. Демидов, A.IO. Барышников, Ю.В. Шишкин // Материалы VIII Всероссийского научного Форума с международным участием. Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге. 27-30 сентября - 2004. - С. 368-369.

10. Mikhaylova, I.N. Autologous dendritic cell based of melanoma. / I.N. Mikhaylova, C.Z. Chkadua, A.A. Borunova, N.N. Petenko, K.A. Parsunkova, N.V. Balatskaya, E.A. Cheremushkin, K.S. Titov, B.K. Krasnova, Z.G. Kadagidze, L.V. Demidov, A.U. Barishnikov // 8-th International Biological Therapy of Cancer - 2006. - June 21-24. -Dresden.

11. Михайлова, И.Н. Растворимая форма CD44 в сыворотке пациентов с диссеминированной меланомой кожи. Онкология сегодня. Успехи и перспективы. / И.Н. Михайлова, Л.В. Демидов, Н.Н. Петенко, Г.З. Чкадуа, К.А. Парсункова, Л.Б. Краснова, С.Г. Кузьмин, Г.Н. Ворожцов, А.Ю. Барышников // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Труды КОД МЗ РТ. - Т. 9. -Казань. - 2006. - С. 166-167.

12. Mikhaylova, I.N. Serum CD44 in advanced melanoma patients. / I.N. Mikhaylova, L.V. Demidov, N.N. Petenko, K.A. Parsunkova, N.V. Balatskaya, L.B. Krasnova, S.G. Kuzmin // 6-th ISREC Conference on Cancer Research. - 2006. - October 11-13. -Lausanne. - Switzerland.

13. Парсункова, K.A. Динамика уровней ИЛ-2 и ИФНу в сыворотке крови при диссеминированной меланоме. / Парсункова К.А., Михайлова И.Н., Краснова Л.Б., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н., Барышников А.Ю.// Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва 24-26 марта 2007. - Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - С. 61.

14. Парсункова, К.А. Динамика уровней цитокинов в сыворотке крови при диссеминированной меланоме./ К.А. Парсункова, И.Н. Михайлова, И.В.

_>сегнеева, И.А. Гандурина, Л.Б. Краснова, С.Г. Кузьмин, Г.Н. Ворожцов, H.H. етенко, А.Ю. Барышников // Актуальные вопросы онкологии. Материалы 1учно-практической конференции с международным участием, 23-24 апреля )07. - Элиста. - С. 30-31.

Балацкая, Н.В. Состояние антиоксидантной системы у больных меланомой ши. / Н.В. Балацкая, К.А. Парсункова, H.A. Гольдина, И.А. Гандурина, Л.Б. раснова, С.Г. Кузьмин, Г.Н. Ворожцов, H.H. Петенко, И.Н. Михайлова, А.Ю. арышников // Актуальные вопросы онкологии. Материалы научно-практической энференции с международным участием, 23-24 апреля. - 2007. - Элиста. - С. 31-

Михайлова, И.Н. Повышение экспрессии активационных маркеров и зеличение содержания лимфоцитов в коже при вакцинотерапии препаратом шоген. / И.Н. Михайлова, К.А. Барышников, О.С. Бурова, П.К. Иванов // Тезисы <. Международной конференции молодых онкологов. - 2008. - С. 15. Ковалевский, Д.А. Экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов при пределении степени дифференцировки клеток меланомы кожи. / И.Н. [ихайлова, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, В.А. Голубева, Е.С. Воронина, Е.А. еремушкин, И.А. Утяшев, Г.С. Аллахвердян, H.H. Петенко, Т.Т. Кондратьева, .Л. Киселев, Л.В. Демидов, Р.Ш. Бибилашвили, А.Ю. Барышников // Сборник гатей международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". 2009. - Пущино. - С. 55-58.

Ковалевский, Д.А. Экспрессия раково-тестикулярных генов при определении ифференцировки клеток меланомы кожи. / Д.А. Ковалевский, И.Н. Михайлова, .Ф. Морозова, О.С. Бурова, В.А. Голубева, Е.С. Воронина, Е.А. Черемушкин, .А. Утяшев, Г.С. Аллахвердян, H.H. Петенко, Т.Т. Кондратьева, С.Л. Киселев, .В. Демидов, Р.Ш. Бибилашвили, А.Ю. Барышников // Материалы VIII сероссийской научно-практической конференции «Отечественные ротивоопухолевые препараты» Москва 21-22 апреля 2009. Российский иотерапевтический журнал. - 2009. - Т.8, № 2. - С. 64.

19. Парсункова, К.А. Цитокиновый профиль на фоне вакцинотерапии у больных диссеминированной меланомой. / К.А. Парсункова, И.Н. Михайлова, H.H. Петенко, Г.З. Чкадуа, А.Ю. Барышников, Л.В. Демидов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Опухоли кожи и мягких тканей». - 2009. - 3-4 сентября Санкт-Петербург. - С. 31-34.

20. Парсункова, К.А. Сравнительный анализ содержания S100, CD44, TGF Ь2, VEGFA в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой на фоне вакцинотерапии. / К.А. Парсункова, И.Н. Михайлова, И.В. Евсегнеева, H.H. Петенко, A.B. Караулов, К.А. Барышников, А.Ю. Барышников, Г.З. Чкадуа, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, Г.Н. Ворожцов // Материалы VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - 2009. - 10-11 ноября Москва.-С. 178-181.

21. Манина, И.В. Экспериментальные исследования иммунотерапии меланомы кожи с помощью цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF. / И.В. Манина, Н.С. Сапрыкина, A.M. Козлов, И.Н. Михайлова // Материалы Межрегионального форума «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии - междисциплинарные проблемы». 27-30 сентября 2010. Санкт-Петербург Российский аллергологический журнал. - 2010. — №1 (1). - С. 176-177.

22. Манина, И.В. Изучение применения методов комбинированной терапии меланомы кожи в эксперименте. / И.В. Манина, Н.С. Сапрыкина, Н.М. Перетолчина, И.Н. Михайлова, A.M. Козлов // Материалы XIV Российского онкологического конгресса. Москва 23-25 ноября 2010. - С. 256-257.

Подписано в печать 16.03.12 Формат 60x84/16.

Бумага офисная «БуеизСору». Тираж 100 экз. Заказ № 364

Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

Актуальность темы

Заболеваемость меланомой в последние десятилетия характеризуется неуклонным ростом. На момент обращения до 40% больных имеют диссеминированный процесс, требующий применения химиотерапии, после которой 5-летняя выживаемость не превышает 5%. При генерализованных формах меланомы основным методом лечения является лекарственный с использованием химио- и иммунотерапии. Среди различных средств и методов имммунотерапии меланомы клиническое применение нашли препараты а-2Ь-интерферона. Эффективность консервативного лечения достигает 50%, однако улучшения общей выживаемости достичь не удается. Иммунотерапия применяется при иммуногенных видах опухолей (меланоме, раке почки, немелкоклеточном раке легкого), способных в некоторых случаях к спонтанной регрессии. Предполагают, что механизм спонтанной регрессии связан с активацией эффекторов иммунной системы, в частности, Т-лимфоцитов, распознающих и убивающих опухолевые клетки благодаря экспрессии на их поверхности опухолеассоциированных антигенов [Ваип^аейпег Р., е1 а1., 2011].

Перспективы развития иммунотерапии меланомы связывают с созданием новых селективных методов, основанных на достижениях молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии.

Одним из таких методов является вакцинотерапия, включающая различные модификации клеточной технологии, среди которых лучшие терапевтические характеристики имеют генно-инженерные и дендритные вакцины. Главная цель иммунотерапии меланомы - увеличение у пациентов популяции СЭ8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), способных убивать опухолевые клетки [8Ьапкег А., е1 а1., 2009]. Антигенный материал, используемый для создания таких вакцин, может быть в виде цельных опухолевых клеток (аллогенных или аутологичных) или специфических антигенов, РНК, протеинов или пептидных эпитопов, рестриктированных по первому или второму классу гистосовместимости [Heimburg-Molinaro J., et al., 2011]. В экспериментах и в клинике изучаются подходы, использующие аутологичные меланомные клетки, трансфицированные геном интерлейкина-12 (ИЛ-12), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-4 (ИЛ-4) и др. Вакцины на основе ауто- и аллогенных опухолевых клеток, модифицированных указанными генами, проходят клинические испытания [Soiffer R., et. al., 2003; Maio M., et. al., 2002]. Помимо изучения таких вакцин в монорежиме, как правило, в последние годы их комбинируют с адъювантами, которые представлены цитокинами или нагруженными дендритными клетками, инициирующими иммунный ответ презентацией антигенных эпитопов к Т-лимфоцитам [Zhang H.L., et al., 2011]. Механизм действия вакцин связан с презентацией дендритными клетками опухолеассоциированных антигенов Т-клеткам пациента [Nencioni A., et al., 2004]. Чаще всего используется одна-две антигенные детерминанты с целью достичь монотаргетного контакта вакцины с мишенью, что важно, прежде всего, для уменьшения некоторых побочных эффектов. Однако, по аналогии с цельноклеточными антибактериальными вакцинами, более эффективное их применение определяет большее число присутствующих в них антигенов [Geier D., et. al., 2002].

Для лечения диссеминированной меланомы кожи монотаргетная стратегия создания вакцин пока себя не оправдывает в силу поликлональности опухоли, а также быстрой селекции клонов. Селекция является следствием не только скорости пролиферации, но и влияния микроокружения. Профиль экспрессии опухолеассоциированных антигенов чрезвычайно разнообразен, что требует мультитаргетных контактов с эффекторами для запуска программы клеточной гибели. Для осуществления этого актуально создание коллекции культур клеток меланомы, презентирующих различные опухолеассоциированные антигены. Созданная, в результате данной работы, Коллекция клеточных культур меланомы является источником вакцин, направленных на различные антигенные детерминанты и способных использовать максимальное число клеток-мишеней у разных пациентов на разных этапах роста и метастазирования опухоли. Таким образом, создание Коллекции клеточных линий, их последующая трансфекция, проведение доклинических и клинических исследований определяют стратегию разработки цельноклеточных вакцин, что является актуальным как решение важной проблемы иммунотерапии меланомы.

Цель исследования. Разработать стратегию создания цельноклеточных антимеланомных вакцин. Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать из опухолевого материала больных клеточные линии меланомы с экспрессией различных опухолеассоциированных антигенов.

2. На основе клеточных линий меланомы, трансфицированных генами ГМ-КСФ и tag7, разработать новые цельноклеточные аутологичные и аллогенные вакцины.

3. Изучить основные доклинические характеристики новых вакцин.

4. Оценить безопасность применяемых вакцин у больных меланомой.

5. Для оценки специфической активности определить динамику иммунологических показателей в процессе вакцинотерапии.

6. На основе доклинического и клинического изучения сформулировать алгоритм стратегии создания новых цельноклеточных вакцин.

Научная новизна

Впервые в России из метастазов меланомы кожи человека от 68 пациентов, проходящих лечение в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, получены и охарактеризованы по основным биологическим, иммунологическим, молекулярным и морфогенетическим параметрам 19 клеточных линий.

Получены и наработаны для доклинических и клинических испытаний клеточные линии меланомы человека mel Р и mel Kor, трансфицированные генами tag7 или ГМ-КСФ соответственно. Проведены доклинические исследования цельноклеточных геномодифицированные вакцин «Аллоген» (из клеточной линии mel P/tag7) и «Мелавак» (из клеточной линии mel Ког/ГМ-КСФ), показавшие их безопасность. Обнаружена взаимосвязь между динамикой клеточного ответа - снижением числа натуральных киллерных Т-клеток (НКТ-клеток) и прогрессированием процесса. Анализ раково-тестикулярных антигенов и дифференцировочных генов, подтвердивший неоднородность изученных линий клеток и вакцин, позволил установить корреляцию между интенсивностью экспрессии генов раковотестикулярных антигенов (РТА) и степени дедифференцировки клеток в полученных из метастазов клеточных линиях меланомы. На основе результатов доклинического и клинического изучения разработан алгоритм оптимизации создания новых цельноклеточных вакцин из культур опухолевых и дендритных клеток больных меланомой. Научно-практическая значимость

Создана Коллекция культур клеток меланомы из 19 новых оригинальных клеточных линий - субстрат для создания новых цельноклеточных противомеланомных вакцин. 15 новых линий клеток меланомы защищены патентами РФ, 5 из них вошли в 100 лучших изобретений РФ за 2009 г. На основе дендритных и меланомных клеток созданы 3 новые цельноклеточные геномодифицированные и нативные вакцины, предназначенные для лечения онкологических пациентов. Разработан иммунобиохимический мониторинг вакцинотерапии с использованием модифицированных вакцин. Результаты данной работы могут быть использованы как в области фундаментальных, так и прикладных исследований. Полученные данные способствуют углубленному пониманию биологии опухолевой клетки и механизмов её взаимодействия с иммунной системой. Данные о фенотипе опухолевой клетки (разнородная экспрессия антигенов гистосовместимости, костимулирующих молекул) и информация на уровне генов и антигенов дополняют фундаментальную базу знаний, лежащих в основе конструирования новых вакцин и их оптимизации путем соответствующих модификаций.

Прикладное значение выполненной работы заключается в создании Коллекции полноценно охарактеризованных культур клеток, готовых к созданию на их основе цельноклеточных противоопухолевых вакцин. Подтверждением прикладного характера исследований является разрешение МЗиСР РФ на проведение клинических исследований вакцин на основе дендритных и опухолевых клеток, трансфицированных генами Ха.%-1 и ГМ-КСФ [№371-373 от 06.08.08; №282 от 218.06.10 и №286 от 21.06.10]. Основные положения, выносимые на защиту

• создана Коллекция опухолевых клеточных линий меланомы с различной экспрессией антигенов;

• созданы и охарактеризованы по основным доклиническим и клиническим показателям 4 новые цельноклеточные вакцины: 2 аутологичные («АутологичнаяДа§-7», «Дендритная») и 2 аллогенные («Аллоген», «Мелавак»);

• доклинические токсикологические исследования исследуемых вакцин показали их безвредность для человека;

• стратегия мониторинга клинического изучения цельноклеточных вакцин у больных меланомой направлена на контроль цитокиного профиля, НКТ-клеток и числа синтезирующих ИФН-у мононуклеарных клеток периферической крови.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. Субстратом для производства цельноклеточных противоопухолевых вакцин явились 19 клеточных линий меланомы, генерированных из метастатических узлов 68 пациентов; данные линии носили генетически обусловленные различия иммунного и онкофенотипа, коррелировавшими со степенью дифференцировки клеток.

2. Технология трансфицирования клеточных линий привнесенными новыми генами (tag-7 и ГМ-КСФ), совмещенная с последующей технологией обработки дендритных клеток опухолевым лизатом (антигенной загрузкой), позволили создать и охарактеризовать по доклиническим и клиническим показателям 4 цельноклеточные вакцины: 2 аутологичные («Дендритная» и «Аутологичная/tag-?») и 2 аллогенные («Аллоген» и «Мелавак»).

3. Разработанные вакцины показали себя безопасными в доклинических исследованиях. Вакцины не проявляют острой, хронической токсичности и туморогенности. В результате 1-й фазы клинического изучения по критериям безопасности и специфической активности для 2-й фазы изучения рекомендованы вакцины в разовых дозах: «Дендритная» 2-5 млн клеток; «Аутологичная/tag?» 10 - 20 млн клеток; «Аллоген» 5-40 млн клеток и «Мелавак» 10-60 млн клеток.

4. Побочные эффекты вакцинации пациентов с меланомой проявлялись в виде ранних кратковременных и обратимых осложнений: локальной гиперемии (64%), общей гипертермии (26%) .

5. Исходный статус пациентов с меланомой независимо от распространенности процесса характеризуется достоверно повышенным маркером Т-клеточного ответа (Thl) по ИЛ-2 (р<0,001) и сниженным ИФН-у (р<0,001); повышенным онкомаркером CD44 (р<0,001) и сниженным TGF Ь2 в терапевтических группах (р<0,001) с последующим достоверным повышением ИЛ-12 (р<0,01) во время вакцинации.

6. Проведение иммунологического мониторинга эффективности вакцин предусматривает контроль экспрессии активационных антигенов, оценку гранзим содержащих и ИФН-у продуцирующих клеток, определение цитокиного профиля и онкомаркеров сыворотки крови, НКТ-клеток.

7. Стратегия создания цельноклеточных вакцин заключается в осуществлении последовательных действий: 1) получении стабильных перевиваемых клеточных линий; 2) детальной характеристики этих линий по генетическим и иммунологическим параметрам (с целью досконального определения опухолеассоциированных антигенов и антигенов гистосовместимости); 3) стабильной трансфекции клеток отобранными генами; 4) доклиническому изучению безопасности вакцин; 5) юридической валидации клинических исследований; 6) оценке клинической безопасности; 7) оценке индукции иммунного ответа при вакцинации.

3. Заключение

За прошедшие десятилетия в литературе широко освещаются проблемы вакцинотерапии. Раскрытие молекулярной идентификации антигенов и механизмов опухолевого иммунитета способствовало развитию научного направления и создания клинических препаратов противоопухолевых вакцин: пептидных, ДК, вирусных, ДНК, цельноклеточных и др. Использование вакцин- наиболее стандартный способ активации иммунной системы. Это могут быть вакцины аутологичной, аллогенной природы; инженерные вакцины, экспрессирующие иммуностимуляторные цитокины (ИЛ-2, ИЛ-4, Г-КСФ или стимулирующие молекулы (В7.1, В7.2) и др.). Главной целью вакцинотерапии является увеличение С08+ ЦТЛ, способных убивать опухолевые клетки через опухоле-ассоциированные антигены, рестректированные по антигену гистосовместимости I класса (НЬА-1 класса) или праймирования СЭ4+ хелперных Т-клеток, играющих ключевую роль в контроле иммунного ответа.

К настоящему времени проведены сотни клинических исследований, позволивших комплексно оценить результаты вакцинотерапии в монорежиме или в сочетании с другими методами лекарственного лечения (химиотерапией, гормононотерапией, оперативного лечения и пр.). Несмотря на некоторые достижения, нерешенной остается проблема эффективной иммунокоррекции как опухолевого процесса, так и недостатков других видов лечения с целью максимального ингибирования злокачественного роста. Подбор субстрата (вид вакцины, количество опухолевых антигенов, антигенов гистосовместимости, трансфекция генами и др.) и проведение вакцинаций (совместно с ХТ, гормонотерапией, хирургией и т.д.) остается актуальным. При этом клинические исследования, в основном, проводятся за рубежом. В России исследования доклинические и, особенно, клинические немногочисленны и проходят, как правило, в пилотном режиме из-за отсутствия четкой юридической рекламации для клеточных технологий.

Общий взгдяд на возможности современной биотерапии солидных опухолей с анализом перспективности только аутологичных вакцин раскрывает, соответственно, решение лишь части проблемы, касающейся противоопухолевой вакцинотерапии. Использование аутологичных вакцин на основе опухолевых клеткок действительно имеет некоторые преимущества, но лишь в упрощенной процедуре разрешения клинических испытаний [Балдуева И.А., 2008]. По сути, создание аутологичной вакцины существенно отодвигает начало лечения, так как для ее получения необходимо не только организационное решение, но, прежде всего, обеспеченность клиники лабораторным комплексом, позволяющим выполнить все технологические процедуры. Использование готовых к употреблению аллогенных клеток (Коллекция клеточных культур) дает возможность предоставить любому пациенту охарактеризованные по основным фармакологическим свойствам клеточные линии в виде субстрата вакцины. Рациональные подходы к проведению доклинического исследования, а также к адекватному мониторированию клинического наблюдения за результатами вакцинотерапии также стоят на повестке дня. В частности, недостаточно проработанным является существующий мониторинг на основании только иммунологического статуса, что создает предпосылки для изучения других методов контроля эффективности вакцинотерапии (Е118ро1, цитокиновый профиль).

Приходится констатировать, что существующая стратегия разработки и создания противоопухолевых вакцин, несмотря на солидную фундаментальную базу и отдельные примеры поступления на фармацевтический рынок России импортных препаратов, далека от оптимальной. Она ниже возможностей современного научного кадрового потенциала страны и не может удовлетворить потребности большого числа онкологических пациентов. Таким образом, следует выделить те факты, с которыми связаны возможности оптимизации существующей стратегии.

Анализ тематической литературы, посвященной фундаментальным и клиническим аспектам терапевтического и побочного действия противоопухолевых вакцин, дает такую возможность. Ясно, что совершенствование технологии получения из разных источников или усиления иммунореактивности вакцины за счет использования субстрата (антигена) и адъюванта (цитокина) не позволяют кардинально изменить клинический ответ.

Модификация диагностических приемов путем стратификации пациентов для подбора соответствующего гаплотипа вакцины, интенсификация терапевтической схемы за счет начала лечения в более ранние сроки после удаления основной массы опухоли, преодоление иммуносупрессии за счет изменения опухолевого микроокружения и восстановления системной иммунной дисфункции, как показывают исследователи разных стран, мало результативны.

Однако лучшие из имеющихся результатов так или иначе связаны с сочетанным и усиленным контактом иммунного препарата и опухоли, а иногда и организма. Этот путь может быть наполнен новым содержанием, благодаря созданию Коллекции культур клеток наиболее иммуногенных опухолей в качестве основы для разработки цельноклеточных противоопухолевых вакцин. Для соответствия высоким требованиям оптимизации терапевтического эффекта вакцин они должны иметь набор разнообразных антигенов и проявлять значимый иммунобиологический эффект в условиях неповрежденной или депрессированной различными специфическими противоопухолевыми воздействиями иммунной системы организма. Поскольку такие культуры предназначены для клинических испытаний, все доклинические кандидады должны иметь необходимые общебиологические характеристики, необходимые для получения разрешения на клинические испытания.

Учитывая вышеизложенное, можно заключить, что разработка эффективных противоопухолевых вакцин остается актуальной, как для международной, так и Российской науки и практики. Оптимизация стратегии разработки и создания цельноклеточных вакцин является одним из рациональных путей достижения реальных результатов их применения в онкологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Характеристика клеточных линий 1.1. Культивирование опухолевых клеток

Образцы тканей были получены от 68 больных с диагнозом метастатическая меланома кожи, путем хирургического удаления подкожных очагов или метастатических лимфоузлов. Для выделения достаточного количества клеток минимальный объем материала составлял около 300 мг или 8 мм . Фрагмент опухоли освобождали от окружающей ткани и доставляли в лабораторию погруженными в транспортную среду: RPMI 1640 с 10% инактивированной сывороткой эмбрионов крупного рогатого скота (ТЭС), 1% HEPES и антибиотиком гентамицином (10 мг/мл). Помещение образца в транспортную среду производилось в течение не более пяти минут с момента выделения опухолевой ткани, (в противном случае возрастает количество нежизнеспособных клеток в полученных образцах). Опухолевую ткань разделяли механически на фрагменты объемом 2-3 мм в среде RPMI-1640 с антибиотиком, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли в камере Горяева по стандартной методике, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS.

Клетки 1x106 засевали в среде RPMI 1640, содержащей 15% ТЭС, 2 мл L-глутамина, 1% HEPES, 10 мг/мл гентамицина, комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar, США) площадью 25 см в 5 мл среды. Температура культивирования 37°С. Монослой клеток формировался через 3-4 дня. При посевной концентрации 70-100 тыс./мл монослой формировался без смены среды на 2-3-и сутки. Клетки снимали с использованием стандартного раствора Версена. Для длительного хранения клетки подвергали криоконсервации. Через 15 пассажей получали стабильно растущие клеточные линии, фенотип которых был исследован иммуноцитохимическим и иммунофлуоресцентным методами.

1.2. Криоконсервация и создание коллекции клеточных культур

Для длительного хранения клетки консервировали путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендировали в криоконсерванте следующего состава: 70% питательной среды КРМ1 1640, 20% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота и 10% ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры 1°С/мин до -25°С, перенос на -70°С и далее в жидкий азот (~196°С). Размораживание быстрое при 37°С. После добавления 10 мл бессывороточной среды клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл той же среды, но содержащей 10% эмбриональной л сыворотки, после чего переносили в культуральный флакон площадью 25 см . По включению трипанового синего жизнеспособность клеток после размораживания составляла 90%.

Начиная с первого пассажа (первичные культуры), культуры меланомных клеток замораживали в процессе культивирования на разных пассажах и на стадиях выхода в клеточную линию. Таким образом, были сформированы посевной и рабочий банки культур клеток различных вариантов меланомы. Запас клеток, заложенных на хранение в качестве рабочего и посевного банков, приготовлен на одном пассаже из одного клеточного пула, полученного путем субкультивирования.

1.3. Цитоморфологическое исследование

Для морфологического анализа клетки выращивали в ростовой среде на предметных стеклах, помещенных в чашки Петри. После образования монослоя на 3-4-е сутки стекла фиксировали и окрашивали по методу Лейшмана. Анализ проводили под световым микроскопом с увеличением X 40 и X 100.

1.4. Иммунофенотипическое исследование

Клетки по 5x105 инкубировали с 20 мкл МКА в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего 10 мин отмывали в 1 мл PBS при 1500 об/мин. К осадку клеток добавляли 20 мкл вторичных антител, конъюгированных с FITC, и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. После этого клетки дважды отмывали в 1 мл PBS в тех же условиях, осадок ресуспендировали в 200 мкл 1% раствора формалина и анализировали на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Beckton Dickinson).

Для реакции поверхностной иммунофлуоресценции использовали следующие антитела: IC090 (CD3 -Т-клетки), IC0180 (С020-В-клетки), ICO-53 (HLA-ABC-антиген гистосовместимости I класса), ICO-1 (HLA-DR-антиген гистосовместимости II класса), ICO-218 (HMW-меланомодифферен-цировочный антиген) (НПЦ МедБиоСпектр, РФ). А также CD86 (ко-стимулирующая молекула), CD80 (ко-регулятор активированных CD86 Т-клеток) и CD34 (маркер гемопоэтических стволовых клеток, экспрессированный на эмбриональной и нервной ткани) (Caltag, UK).

1.5. Иммуноцитохимическое исследование

Цитопрепараты из полученных клеточных линий фиксировали, промывали в PBS 5 мин и затем блокировали эндогенную пероксидазу 3% раствором перекиси водорода в течение 20 мин. Полученные образцы промывали в двух сменах PBS 10 мин и инкубировали с 1% раствором БСА 20 мин при комнатной температуре. После этого избыток раствора удаляли, на не промытые образцы наносили первичные антитела и проводили инкубирацию в течение ночи при низкой температуре (+4°С). Затем образцы промывали в трех сменах PBS. Для визуализации реакции применяли систему LSAB+Detection System (Dako Corp) согласно инструкции. Выявление ферментативной активности (Streptovidin Peroxidase) проводили с помощью АЕС (3-amino-9-ethylcarbazole containing hydrogen peroxide, stabilizers, enhancers, and antimicrobial agent), докрашивали гематоксилином. Подсчет проводили в областях с максимальным окрашиванием на 200-300 опухолевых клеток, используя микроскоп "Axiolab" (ZEISS, Германия). Для цитологического анализа клетки меланомных линий выращивали в ростовой среде на предметных стеклах, помещенных в чашках Петри. Мазки окрашивали по методу Лейшмана.

Для иммуноцитохимического исследования использовали следующие антитела: CD63 (меланомный маркер, используется для идентификации меланоцитных опухолей), MelanA/MART-1 (маркер дифференцировки меланоцитов), НМВ45 (маркер дифференцировки меланоцитов, используется для идентификации меланоцитных опухолей), Tyrosinaza (маркер дифференцировки меланоцитов, определяет биосинтез меланина) (Novocastra Laboratories Ltd., UK). Экспрессию всех исследованных маркеров наблюдали в цитоплазме клеток с различной интенсивностью окрашивания. Отсутствие окрашивания или слабое окрашивание принимали за негативную реакцию, окрашивание со средней и сильной интенсивностью считали положительной реакцией.

1.6. Кариотипическое исследование

Цитогенетические препараты готовили по стандартной методике [Dracopoli N.C., et al., 2004] с модификациями. Колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл вводили в культуральные флаконы за 1,5 ч до начала фиксации. После окончания колхицинизации клетки снимали со стенки флакона с помощью раствора Версена (1 мин), затем - 0,25% раствором трипсина. После инкубации с трипсином в течение 3-7 мин в термостате при 37°С клетки отставали от дна флакона. Для нейтрализации действия трипсина добавляли 3 мл эмбриональной сыворотки, а затем среды DMEM до 15 мл. Полученную суспензию клеток центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость отбирали.

Для гипотонизации в пробирки добавляли 0,55% раствор КС1 и инкубировали в термостате при 37°С в течение 8-12 мин. Для остановки гипотонизации перед центрифугированием в пробирки добавляли 3-5 капель фиксатора, состоящего из метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Пробирки центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Фиксацию проводили стандартным способом, трижды меняя фиксатор (метанол и ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1). Клеточные суспензии раскапывали на охлажденные влажные стекла.

Высушенные препараты окрашивали с использованием GTG-метода (G-bands by trypsin using Giemsa). Препараты обрабатывали 10-20 с в растворе трипсина, а затем обрабатывали свежей порцией красителя Гимза на фосфатном буфере в течение 1-2 мин. Затем краску смывали холодной проточной водой, и сушили препарат на воздухе. Для каждой культуры анализировали не менее 15 метафаз. Анализ препаратов проводили согласно международной номенклатуре ISCN [Shaffer L.G., et al., 2005]. Препараты анализировали под световым микроскопом с иммерсионным объективом. 1.7. Исследование экспрессии генов на уровне мРНК с помощью ОТ-ПЦР

В опухолевых клетках исследовали экспрессию 5 дифференцировочных антигенов меланомы (ДАМ) (MLANA, TYR, SILV, S100В) и 15 раково-тестикулярных генов семейств GAGE; MAGE; BAGE и NY-ESO-1, а также контрольных генов HLA-G, HLA-E и GAPDH. Суммарную РНК из культур опухолевых клеток меланомы выделяли с применением кислого фенола, гуанидина тиоционата (NH2C(=NH)NH2 HSCN) и аммония тиоционата (NH4SCN) в соответствии с Protocol #РТ3231-1 (CLONTECH, США). Использовали реактивы фирмы Sigma-Aldrich, США). Для выделения суммарной РНК использовали 1x106 опухолевых адгезивных клеток или такое же количество суспензионных клеток (mel Gi). Опухолевые клетки разрушали добавлением денатурирующего буфера непосредственно в культуральном флаконе с клетками, но без культуральной среды, или добавлением к осадку суспензионных клеток, полученному после центрифугирования. РНК из гомогената экстрагировали последовательным добавлением кислого фенола (рН=4,0) и хлороформа и изопропанолом. Описанную процедуру выполняли дважды. Последовательности нуклеотидов ген-специфических праймеров были выбраны при помощи программы ОН99 фирмы «Техноген» (РФ) и синтезированы на фирме «Синтол» (РФ) и получены из лаборатории генной инженерии НИИ ЭК ФГУ РКНПК Росмедтехнологий. Последовательность мРНК была получена из баз данных UniGene и AceView Национального Центра Биотехнологической Информации США {National Center for Biotechnological Information, NCBI).

Определение степени гомологии нуклеотидных последовательностей полученных ампликонов против геномной и мРНК последовательностей проводили при помощи программы BLAST на сервере http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Для гена глицеральдегид-3 фосфат дегидрогеназы использовали праймеры CLONTECH (Mountain View, США). Для реакции обратной транскрипции использовали обратную транскриптазу М-MLV и реактивы фирмы Promega, США. Результаты анализировали методом электрофореза.

Фотографии гель-электрофореза продуктов ПЦР были оцифрованы при помощи программы ImageQuant (Molecular Dynamics, США). Полученные цифровые значения интенсивности полос продуктов ПЦР по величинам интенсивности ранжированы следующим образом: «О» - фоновое значение от О до 50, «1» - малая интенсивность от 51 до 699, «2» - средняя интенсивность от 700 до 1299, «3» - высокая интенсивность >1300.

1.8. Определение HLA-фенотипов I класса антигенов гистосовместимости

Для определения аллелей HLA-A,B,C в лунки планшета Терасаки раскапывали типирующие сыворотки к антигенам, затем суспензию клеток (2

4x106) по 1 мкл в лунку и инкубировали 30 мин при 22°С в термостате. По истечении срока инкубации в каждую лунку добавляли 5 мкл кроличьего комплемента с последующей инкубацией 1 час при 22°С в термостате. После чего добавляли 5% раствор эозина по 3 мкл на 3-5 мин. Реакцию останавливали 37% формалином по 6 мкл в лунку (рН=7,2). Типирование клеточных линий проводили набором сывороток антилейкоцитарных HLA-A,B,C (Межрегиональный центр иммунодиагностики и гистотипирующих реагентов, ЗАО Гисанс, г. Санкт-Петербург).

1.9. Микробиологическое обследование клеточных линий

Методом молекулярного исследования клеточные линии обследованы на CMV, ВИЧ, гепатит В и С, вирус папилломы человека, Mycoplasma species, Herpes В virus; микробиологическими исследованиями на бактерии и грибы.

2. Характеристика цельноклеточных вакцин 2.1. Общие сведения

Методики приготовления цельноклеточных вакцин описаны в главах, посвященных результатам собственных исследований. В исследование включены пять оригинальных вакцин, одна - дендритноклеточная, две модифицированы геном tag-7, а две - геном ГМ-КСФ:

По общей схеме, описанной ниже, получали 5 видов цельноклеточных вакцин: Вакцины аутологичные человеческие

1. «Дендритная», получена из нагруженных опухолевым лизатом дендритных клеток больных меланомой

2. «АутологичнаяА^7», генноинженерная, получена из метастатических, трансфицированных геном tag7 клеток больного меланомой

Вакцины аллогенные человеческие

3. «Аллоген», генноинженерная, получена из клеточной линии меланомы человека mel Р, транзиторно трансфицированных геном tag7,

4. «Мелавак», генноинженерная, получена из клеточной линии меланомы человека mel Kor, стабильно трансфицированных геном ГМ-КСФ

Сингенная мышиная

5. B16F10/TM-KCO, генноинженерная, получена из культуры клеток мышиной меланомы B16F10, трансфицированной геном ГМ-КСФ (клон BG)

Все клинические исследования вакцин выполнены в рамках Протоколов, утвержденных Ученым советом НИИ КО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (пилотные исследования) и/или МЗиСР РФ. Для клинической апробации выбраны 4 вакцины «Аутологичная/tag-?», «Аллоген», «Мелавак» и «Дендритная», часть из которых изучена ранее по доклинической программе [Киселев C.JI, и соавт, 2000; Бережной А.Е, и соавт, 2006]. Для доклинического изучения геномодифицированной ГМ-КСФ вакцины «Мелавак» получена сингенная для мышей трансфицированная вакцина, путем стабильной трансфекции клеток мышиной меланомы B16F10, трансфицированной мышиным геном ГМ-КСФ. 3. Доклинические исследования вакцин

Доклиническое изучение безвредности прошли две вакцины «Аллоген» и «Мелавак», предназначенные для внутрикожного применения. Исследования на животных проведены при однократном внутрикожном, подкожном и/или внутрибрюшинном введении вакцин. Глубина внутрикожного введения составляла 1-3 мм. Объем раствора на одно место введения >0,1 мл для кроликов, 0,02-0,04 мл для крыс и 0,05 мл для мышей. Для исключения туморогенности исходные клеточные линии обеих вакцин подвергали ионизирующему облучению на гамма-установке «Стебель-ЗА» с мощностью дозы 5 Гр/мин с достижением летальной дозы для клеток 100 Гр, контролируемой стандартной дозиметрией.

Все доклинические исследования выполнены на различных видах лабораторных животных в рамках действующих требований [Приказ МЗиСР РФ от 23.08.2010 г. N 708н «Об утверждении правил лабораторной практики»] и в соответствии с разрешением Росздравнадзора МЗиСР РФ [Перечень организаций и учреждений, осуществляющих проведение доклинических исследований (ДИ) лекарственных средств (ЛС) от 27.01.2011].

Лабораторных животных получали из сертифицированных питомников РФ или из разведения РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Все животные были здоровы, животные из питомников имели ветеринарный сертификат качества и состояния здоровья. Качество здоровья животных разведения РОНЦ гарантировано конвенциональными условиями разведения. Разведение, содержание, проведение экспериментов и умерщвление лабораторных животных проводились в виварии РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН в соответствии с действующими регламентами РФ.

Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, изложены в следующих документах: "Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей" (ЕЭС, Страсбург, 1985); [Ланималогия, 1993, т.1, с.29]; Требования Хельсинкской декларации и Всемирной медицинской ассоциации (2000 г) и Рекомендации, содержащиеся в Директивах Европейского сообщества (86/609 ЕС), Приложении к приказу министра здравоохранения СССР 755 от 12.08.1977 и Приказе Минсельхоза РФ 490 от 05.11.2008 "Об утверждении правил проведения лабораторных исследований в области ветеринарии". 3.1. Изучение специфической иммунологической активности Иммунизация мышей

Эксперименты проведены на мышах линии С57В1/6 (гаплотип Н-2Ь) 8-12 нед. возраста массой тела 20-25 г из питомника «Столбовая» РАМН. Группы мышей составляли по 8 особей. Клетки вакцины B16F10/GM-CSF из криохранилища отмывали от криоконсерванта последовательно бессывороточной средой ДМЕМ и 0,9% раствором натрия хлорида, осаждали при 1000 об/мин и ресуспендировали в 0,9% растворе натрия хлорида.

Клетки меланомы B16F10 получили из коллекции культур клеток РОНЦ и выращивали in vitro в стандартных условиях. Иммунизацию здоровых мышей

5 6 7 вакциной B16F10/GM-CSF проводили в трех дозах 10J - 10 - 10' клеток в 100 мкл 0,9% раствора хлорида натрия однократно подкожно в область левой подмышечной впадины с помощью инсулинового шприца за 7 дней до инокуляции клеток меланомы В16F10. Оценка специфической активности

Оценку специфического иммунологического эффекта цельноклеточной вакцины B16F10/TM-KCO проводили в профилактическом режиме, определяя влияние вакцины на имплантационные, кинетические характеристики и способность к диссеминации метастазирующей в легкие меланомы B16/F10 у мышей линии С57В16. Культуру клеток мышиной меланомы линии B16F10 использовали при стандартной 100% прививочной дозе 105 клеток на мышь, которую имплантировали подкожно в область правой подмышечной впадины. Влияние на имплантационную способность опухоли

Оценку имплантационной способности клеток B16F10 под действием вакцины проводили по прививаемости опухолей и по длительности латентного периода выхода опухолей под кожей у мышей. О прививаемости B16F10 судили по числу мышей с опухолями в исследуемых группах на срок выхода 100% опухолей у мышей контрольной группы. С этой целью ежедневно животных обследовали на наличие опухолей в области введения клеток. О длительности латентного периода судили по сроку выхода всех опухолевых узлов в группе контроля и в исследуемой группе. Достоверное уменьшение прививаемости или пролонгирование латентного периода считали признаком снижения имплантационной способности клеток В16Р10 и положительным ответом на вакцинацию. Дозу клеток, вызвавшую 50%-ную задержку времени выхода опухолей под кожей считали, соответственно, средней эффективной дозой (ЕД50) этого эффекта и использовали для изучения других показателей специфической активности вакцин. Пересчет доз клеток для человека осуществляли с использованием коэффициентов поверхности тела человека и животных [Ргепе1сЬ ЕЛ., е1 а1., 1966]. Влияние на кинетические параметры опухолевого роста

Для оценки кинетических параметров роста опухолевых узлов в организме мышей вакцинировали в дозе ЕД50. Формирующиеся пальпируемые опухоли измеряли дважды в неделю и расчитывали объем опухоли по формуле У=0тахх01х(Т)тах/2), где Отах - максимальный диаметр, а Б] - диаметр, перпендикулярный Отах. По разнице средних объемов опухолей (Уср) в исследовательской группе и группе контроля без воздействия рассчитывали стандартный показатель торможения роста опухоли (ТРО) [Трещалина Е.М., и соавт., 2005].

Влияние на метастатическую активность опухоли

Для оценки метастатической активности опухоли в организме вакцинированных мышей рассчитывали стандартный показатель торможения роста метастазов (ТРМ) и выживаемость мышей с метастазами под действием ЕД50. О выживаемости судили по срокам гибели животных и по стандартному показателю увеличения продолжительности жизни (УПЖ), который рассчитывали по средней продолжительности жизни (СПЖ) в исследовательской группе и группе контроля без воздействия [Зуева Е.П., и соавт., 2005.].

Статистическую достоверность показателей специфической активности вакцин рассчитывали по методу АЫОУА. Определение шансов возникновения признака и расчет доверительных интервалов выполнены с помощью пакета программ STATISTICA. 3.2. Изучение безвредности

При доклиническом исследовании безвредности вакцин «Аллоген» и «Мелавак» выполнено изучение общей и локальной токсичности с оценкой иммунотоксичности, пирогенности и туморогенности, а также проведением патоморфологических исследований внутренних органов животных [Михайлова JI.M. и соавт., 2005; Верстакова O.JL, 2010; Гуськова Т.А., 2010; Березовская И.В., 2010; Иванова A.C., и соавт., 2010; Методические указания №РД-42-28-10-89, М., МЗ РФ, изд. Официальное, 1989; Трещалина Е.М., и соавт., 2012].

Вакцина «Мелавак» изучена с использованием всех стандартных показателей безвредности, рекомендованных для медицинских иммунобиологических препаратов. При изучении безвредности вакцины «Аллоген», которая оказалось близкой по специфической активности к вакцине «Мелавак», использована сокращенная программа с целью возможной оптимизации объема доклинических исследований вакцин подобного типа. Лабораторные животные

Исследования выполнены на 85 гибридных мышах-самцах BDF/ или Fi2 массой тела не менее 18 г из питомника «Столбовая» РАМН; 60 неинбредных крысах-самцах массой тела 170-250 г и 37 иммунодефицитных мышах-самках Balb/c nude из разведения РОНЦ; 42 кроликах породы «Шиншилла» массой тела 1,7-2,2 кг из ФГУП «Опытно-производственное хозяйство «Манихино» и 104 морских свинках-самках альбиносах массой тела 240-250 г из питомника ГУНЦ Биомедицинских технологий «Филиал Андреевка» РАМН.

Гистологическому исследованию подвергнуты участки головного мозга, сердца, легких, печени, почек, мочевого пузыря, желудка, тонкой и толстой кишки, селезенки, тимуса, лимфатических узлов брыжейки, паховых лимфатических узлов (регионарных и контралатеральных), семенников, надпочечников, поджелудочной и щитовидной железы, костного мозга, а также кожи с места введения вакцины или физиологического раствора. Материал фиксировали в 12% нейтральном формалине, подвергали общепринятой гистологической обработке для получения парафиновых срезов толщиной 5 микрон. Депарафинированнные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопию готовых микропрепаратов проводили на микроскопе Carl Zeiss, Jena (Германия).

Статистическую обработку результатов доклинического изучения безвредности проводили с помощью компьютерой программы «Статграф». 4. Клинические исследования вакцин

Для получения разрешения МЗиСР РФ на проведение клинических исследований новых оригинальных цельноклеточных вакцин на основании результатов доклинических исследований подготовлен стандартный комплект документов.

Разрешенные клинические испытания вакцин выполнены в соответствии с Протоколами в отделении биотерапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (зав. проф. Демидов J1.B.) с соблюдением стандартов GCP (Good clinical practice). Соответственно требованиям МЗиСР РФ для медицинских иммунобиологических препаратов проведены пилотные клинические исследования и открытые исследования I фазы и начата II фаза. Задачи отдельных клинических фаз касались изучения безопасности и эффективности вакцин, определению дозовых характеристик выявленных эффектов и оценки перспективности применения вакцин у онкологических пациентов.

Общая характеристика больных

В клиническое исследование включены 148 больных с метастатической меланомой III-IV ст., проходивших лечение в РОНЦ им. Н.Н.Блохина в 19992010 гг. Больные были разделены на две группы. Первая группа из 68 больных представляла собой доноров опухолевого материала, из которого получены новые клеточные линии - субстрат для разработки вакцин. Вторая группа включена в клинические исследования безвредности и эффективности вакцин и состояла из 80 больных, среди которых 41 женщина и 39 мужчин в возрасте от 21 до 78 лет.

Все пациенты подписали информированное согласие. Часть больных второй группы (п=39), ранее получавших комплексное лечение (хирургическое, иммунотерапевтическое и химиотерапевтическое), была включена в Протокол I фазы на фоне прогрессирования заболевания. Другой части больных этой группы (п=41), вакцину назначали на фоне стабилизации процесса.

Для выявления показаний к применению конкретного режима введения вакцины всем больным до начала лечения проводили стандартное клиническое обследование, включающее физикальное обследование, клинический и биохимический анализы крови, рентгенографию органов грудной клетки, ЭКГ, УЗИ органов брюшной полости (забрюшинных и периферических л/у, послеоперационных рубцов), КТ или МРТ органов грудной и брюшной полости (по показаниям) и оценку иммунологического статуса. Аналогичное обследование проводили больным в процессе и после окончания лечения для оценки результатов изучения вакцины. При проведении исследования действие вакцины каждой оценивали при эскалации дозы. Число больных, получавших разные дозы вакцин, представлены при описании результатов лечения. Методика введения вакцины

При проведении исследования вакцину вводили пациентам внутрикожно в область плеча, лопаточной, паховой или пупочной области в 2-10 точек, находящихся в непосредственной близости от регионарных лимфатических коллекторов. Инъекции вакцин повторяли многократно, кратность повтора описана в разделе результатов собственных исследований. Вакцины изучены в различных режимах применения больным: терапевтическим считали введение вакцины при наличии опухолевого процесса, адъювантным считали введение вакцины при отсутствии признаков опухолевого процесса.

В таблице 8 представлена характеристика больных, вид и дозы вакцин, режим применения.