Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Иммунологический фенотип лимфоцитов периферической крови при патологии женской репродуктивной системы

РГБ ОД

1 з МАЙ 1996

на' прайаЫ рукописи

1Я5ТЕЛИЦЛ ИГОРЬ САНУИЙОВИЧ

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ФЕНОТИП ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ПАТОЛОГИИ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМА

14.00.14 - онкология

АПТОРПФВРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1996 г.

работа выполнена в лаборатории экспериментальной диагностики опухолеП (руководитель - доктор медицинских наук, профессор А.ю.Барышников) Онкологического научного центр? им.Н.Н.Влохина (д:..лектор - академик РАМН К.Н.Трапезников)

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор А.п.Барышников доктор медицинских наук К.И.Жордания

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В.П.Латягин доктор медицинских наук, профессор Т.И.Булычева

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт

онкологии имени П.Д.Герцена ИЗ России,

г.Москва

Зашита состоится 1996 г. а ч. >|4

заседании слециализировадноро у^вцоро Совета (К 001.17.01) Онкологч^ескорр нЭУЧНоро центра РАМН (115470, Москва, Каширское ш. 2^).

С диссертацией НРТЧО ознакомиться с библиотеке Онкологического научного центра РАМН

Автореферат разослан "_"_1996

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета доктор медицинских наук, профессор

В.С.Турусов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Дкятуальносаь темы:

Программированная клеточная смерть '(апоптоз) впервые была описана болое 20 лет назад морфологическими методами. Однако в последние годы интерес к этой проблеме резко возрос благодаря открытию гона клеточной смерти и онкогенов его регулирующих.

Нормальная соматическая .«летка, выполнившая свою функцию, или лишние дифференцирующиеся клетки погибают вследствие активации апоптоза. Апоптсз - физиологическая смерть, 3 результате активации процесса клеточной смерти происходит Фрагментация ДНК и клетка разваливается на маленькие апоптотичес^ие тельца. При этом окружающие клетки не страдают. Апоптоз регулируют онкогены р53 и Ьс1-2.

Недавно идентифицирована на поверности клетки молекула Газ(АРО-1/С1)95), опосредующая апоптоз, и ее лиганд. Моноклоналкные антитела . (МКА) к этому антигену индуцируют апоптоз в антиген-положительных клетках, с помощью МКА Раз(АРО-1/С095)-антиген был обнаружен в ряде нормальных и опухолевых клеток.

Показано, что МКА индуцируют апоптоз в тимоцита. в в- и Т-клаточных лимф'омах, карциноме толстой кишки, глиобластоме и меланоме. Циклогексемид усиливает апоптотическое действие МКА.

Полагают, что МКА против АРО-1 антигена в сочетании с химиопрепаратами будут применяться в терапии злокачественных новообразований.

В настоящее время в клинике применяются иммунокоррегируклдие препараты, усиливающие противоопухолевое действие химиотерапии. Это реоферон, препараты тимуса, опухоленекротический фактор, интерлейкин-2 и др. Эти препараты способны влиять на процесс программированной клеточной смерти, усиливая или ингибируя его.

Однако в литература отсутствуй сведения об экспрессии Fas(APO-l/CD95) антигена на лимфоцитах периферической крови В норма и при различных заболеваниях, при активации и угнетении иммунной системы организма. .Поэтому являемся актуальным изучение экспрессии Раз(APO-1/CD35) антигена на лимфоцитах периферической крови в норме и при злокачественных и доброкачественных заболеваниях.

В связи с. этим, целью диссертационной работы било изучение экспрессии Fas(APO-1/CD95) антигена у здоровых доноров и при доброкачественных и злокачественны:: гинекологических заболеваниях.

В соотвесгоии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1.Изучить экспрессию Fas(APO-l/CD95) антигена на лимфоцитах периферической крови здоровых женщин.

2.Изучить экспрессию Fa3(AP0-l/CD95) антигена на лимфоцитах периферической крови Сольных раком яичника.

3.Исследовать экспрессию Fas(APO-l/CD95) антигена на лимфоцитах периферической кропи ракой матки.

4.Определить экспрессию Fa3(APO-l/CD95) антигена на лимфоцитах периферической крови больных миомоЛ матки.

5.Изучить экспрессию Fas(APO-1/CD95) антигена на лимфоцитах периферической крови Сольных кистой яичника.

6.Изучить экспрессию Fas(APO-1/CD95) антигена но лимфоцитах периферической крови больных хроническим аднекситом.

7.Определить экспрессию Fas(APO-1/CD95) антигена на лимфоцитах периферической крови у беременных.

в.Характеризовать субпопуляции лимфоцитов, . экспрессируюших Fas(АРО-1/CD95)- антиге н.

9. Научить состояние иммунного статуса и возможность его коррекции у женщин в послеродовом периоде.

Наушшт копнена:

Впервые изучена экспрессия Fas(APO-1/CD95) антигона, опосредующего апоптоэ, на лимфоцитах периферической крови у больных доброкачественными и злокачественными заболеваниями женских половых органов. Впервые обнаружена корреляция повышения экспрессии Fa3(APO-l/CD95) антигона и повышения экспрессии активаиионних антигенов CD25 (рецептор интерлейкина-2) и CD71 (рецептор трансферрина). Впервые показана, что Fas(APO-1/CD95) антиген является новым активашюнным маркером.

Научно-практическое оначеиие работы: В результата проделанной работы охарактеризован новый-активаиионныЯ маркер - Газ(APO-1/CD95) антиген, который Судет внесен п стандартную панель МКА для оценки иммунного статуса организма. Определение Fas(APO-1/CD95) антигона у больных будет способствовать лучшему пониманию течения заболевания и состаяния иммунного статуса организма.

Апробация работы: полученные результаты доложены на 1 Международном симпозиуме "Роабелитация иммунной системы" (Цхалтубо, 1990 г.), на Межрегиональной научно-практической конференции "Актуальные вопросы клинической иммунологии" (г.Кемерово,1996 г.). Апробация диссертации состоялась на объединенной конференции лаборатории экспериментальной диагностики опухолей, клинико-радиоиммунологической

лаборатории, и отделения гинекологии 17 апреля 1996 г.

Обьем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 95 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 2 глав собственных исследований, обсуждения, выводов. Библиографический указатель включает 116 источников литературы. Диссертация иллюстрирована 19 таблицами и- 21 рисунком. .

Диссертация выполнена □ лаборатории экспериментальной ди агностики опухолей (зав. проф. А.Ю.Барышников) Онкологического научного центра РАМН им. Н.Н.Блохина ( директор - .академик РАМН Н.Н.Трапезникрв) и в Тверском роддоме N2 (главврач - Иванова Р.Д.).

Пути практической реализации:

Внедрение полученных результатов в практику предполагается осуществить следующими путями:

публикация полученных результатов в периодической

печати;

- доклады на научных конференциях

- теоретическое обоснование для применения тох или иных схем терапии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

Моноклональные антитела, для иммунофенотипирования лимфоцитов были использованы МКА 1СО-160 против Раз(АР0-1/С095) антигена« 1СО-ЭО против антигеиа СОЗ, 1СО-86 против антигена 1СО-31 против антигена СОЗ, 1СО-150

против антигена С024, 1СО-92 против антигена С071, 1С0-Ю5 против антигена С025, 1СО-116 против антигена С016 и 1С0-С5М1 против антигена СРПЬ производства НПЦ "МедВиоСпектр". Все эти МКА были разработаны в ОНЦ им. Н.Н.Влохина РАМН.

При постановке непрямой реакции иммунофлуоресценции использовали баранью антисыворотку протяв иммуноглобулинов белой- мыши, меченой ЕГГС ("МедВиоСпектр")предварительно несколько раз адсорбированные лейкоцитами человека для удаления неспацифическо^о связывания.

Реакция поверхностной иммунофлуоресценции.

Непрямая реакция поверхностной иммунофлуоресценции. 500000 клеток инкубировали с 20 мкл МКА в течение 30 мин при

4 С, посла чего клетки дважды отмывали сродоЯ IFA. Затем клетки инк. бировали с 20 мкл F(ab)2 Фрагментов, меченной FITC, 30 минут при 4 С, посла чего дважды отмывали средой IFA и ресуспезировали в PBS, содержащем 1 % формалнн. Реакция двойного мечсния клеток.

Реакцию двойного мочения клеток проводили в два

этапа.

500 ООО клеток сначала окрашивались МКА, меченными FITC. Посла 30-минутной инкубации и двух отмывок средой IFA к клеткам добавляли 3.0 мкл других МКА, меченных фикоэритрином

4

(РЕ). Затем поело 30-минутной инкубации и двух отмывок средой IFA клетки ресуспензировали а PDS, содержащем 1 1 формалин. Прото^но-цитомотрический анализ. Экспр ссию антигенов на клетках определяли в РИФ, которую учитывали на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson). В каждой пробе приобреталось и анализировалось 10000 событий. Анализ реакции при ео постановке на пул клеток цельной крови проводили с использованием гейтов "лимфоцитов", "гранулоцитоЕ", "моноцитов" на основании комбинации светорассеяния и размера клеток. Для изучения экспрессии антигенов на отдельных, субпопуляциях лейкоцитов клетки собирали в "живых1' гейтах, что также способствовало исключению из сбора и анализа эритроцитов, мертвых клеток, а также клеточных обломков и посторонних частиц.

Программное обеспечение . Анализ данных, полученных с «Помощью проточного цитофлуориметра FACScan, проводился с использованием программного обеспечения фирмы Hewlett Packard, комплен_уемого вместе с проточным цитофлуориметром (программы "FACScan" и "Paint-a-Gate"). Статистическую обработку результатов (определение среднего значения, среднего квадратичного отклонения, статистически значимой достоверности результатов, факторный анализ) проводили с " использованием программ "Stat3" и "Factor".

с

Колыша >1 допори.

В работе были использованы клетки периферической крови здоровых женщин-сотрудников ОНЦ, полученные во время диспансеризации. Онкологические больные находились на лечении в отделении гинекологии НИИ клинической онкологии ОНЦ РАМН (руководитель -т." проф.- Б.П.Казаченко), гинекологические больные находились на лечении в роддоме N2 г.Тверь (главврач - Иванова Р.Д.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Н ИХ ОБСУЗДЕШШ

Для исследования экспрессии Fas(AP0-1/CD95) антигена использовали МКА ХСО-ХбО, полученные в лаборатории экспериментальной диагностики опухолей НИИ ЭДиТО ОНЦ РАМН Б.Р.Полосухиной и А.».Барышниковым.

Выло обнаружено, что Fas(APO-1/CD35) антиген 'экспрессирован на 23,42+/-2,91 % лимфоцитов периферической крови здоровых женщин <Табл.1) и отсутствовал на гранулоцитах, моноцитах и эритроцитах. При этом, у 24 (72,4 \) доноров процент антиген-положительных клеток колебался в пределах 4 - 28 % (средноо - 16,25 +/-1,4 %)., а у остальных 1 - от 40 до 60 % (среднее - 51,7+/-3,52 (Р< 0,005). Таким образом, .практически здоровые доноры делятся на две статистически различимые подгруппы низко и высоко экспрессирующие Fas (Aí.O-1/CD95) антиген.

Сравнение экспрессии дифференцировочных антигенов на лим фоцитах крови у здоровых женщин в подгруппах, имеющих низкий и высокий уровень Fas(A^O-l/CD95) антигена, не выявило каких-либо статистически значимых различий.

Таблица 1

Экспрессия дифференцировочных антигенов на лимфоцитах крови у здоровых женщин (п=31)

Антиген МКА Антигонположительные клетки (%)

Fas(APO-1/CD95) ICO-160 23,42+/-2,91

CD3 ICQ-90 69,8+/-2,69

CD4 ICO-06 35,58+/-3,4

CD8 XCO-31 32,6Э+/-2,71

CD24 ICO-150 14,14+/-1,87

CD71 ICO-92 8,11+/-1,73

CD25 ICO-105 8,62+/-1,18

CD16 1CO-116 ' 19,73+/-3,18

CDllb ICO-Gtil ' 15,33+/-3,81

CD4/CD8 1,00

Следующим этапом работы явилось изучение субпопуляции лимфоцитов, экспрессирукядих Fas(APO-1/CD95) антиген. Так как высокая экспрессия Fas(APO-1/CD95) антигена на клаа:!гах донора встречается достаточно редко, нами были выбраны в качестве модели лимфоциты больных множественной миеломой, на которых Fas(APO-1/CD95) антиген высоко" эколрессирован (Е.Р.Полосухина и др.,1996). Было обнаружено, что Fa3(APO-1/CD95) антиген был экспрессирован на 1/3 СИЗ-положительных Т-лимфоцитах периферической крови (Рис.1). Fas(AP0-1/CD9S) антиген был обнаружен на небольшой

Двойное окрашивание лимфоцитов больного множественной миеломой МКА 1СО-1бО и 100-90 аг.Й-СБЗ

Двойное окрашивание лимфоците» больного множественной ииелом^й МКА 1СО-1бО н 1СО-31 эдШ-СОЗ

Двойное окрашивание лимфоцитов больного множественной •шеломов МКА1СО-160 и 1СО-86 апЯ-С04

О

и

м

16°..........1*2.....14>.....'Л»

пл-н\я.1-»и1»м —>

ГССЫбОР

Двойное окрапшЕаине лкмфощггоз больного мкожсстоекксй ыиеломой МКА 1СО-160 и гшЙ-СШ9

ы

£н

О!

1=) о

!

а

Щр"'

■ Щ?

субпопуляции CDS-положительной т-супрессорной/цитотоксической субпопуляцк!« лимфоцитов. В то же время, половина клеток CD4-положительной т-хелперной/индукторной субпопуляции лимфоцитов содержала Fa3(APO-1/CD95) антиген. Почти все В-лимфоциты крови экспрессировали Fas(AP01/CD95) антиген.

Обнаружение высокой экспрессии Fas(APO-1/CD95) антигена на лимфоцитах периферической крови 27 % практически здоровых женшин позволило нам сделать предположение, что это является-следствием каКих-либо хронических заболеваний или физиологических состояний, сопровождающихся иммунными реакциями, В пользу этого предположения указывают данные по обнаружению Fa3(APO-1/CD95) антигена на активированных лимфоцитах и у больных с аутоиммунными заболеваниями. [Miyavaki Т et al., 1992; Uohara Т. et al., 1992; Massaia M. et al., 1995]. В связи с этим, нами была исследована экспрессия Fas(APO-1/CD95) антигена на лимфоцитах крови женщин больных хроническим аднекситом.

Было обнаружена, что лимфоциты больных хроническим аднекситом сильно экспрессировали Fas(APO-1/CD95) антиген ' -43,9+/-7,5 % (Табл.2). Следует подчеркнуть, что низкий уровень экспрессии был только у 2 пациентов (10,5 и 27,8 %)-, тогда как у остальных восьми больных высокий - 31. - 79 г, причем из них у 3-х было рыявлеио 31 - 37' % Fas-положительных клеток, а у 5 - более 50 %. Различия в частоте низкого и высокого уровня по сравнению с донорами была статистически значимо.

Сравнение экспрессии других дифферанцирсвочных антигенов на лимфоцитах больных хроническим аднекситом показало ста^стически значимое повыиение процента CD4-положительных клеток с 35,5 4 до 53,1 % (Р < 0,05). В связи с чем иммунорегуляторный индекс увеличился с 1,08 до 1,24. Содержание Т-клеток (CD3+) но изменилось. Увеличение CD8-положитольных супрессорных/цитотокснчоскнх клеток было статистически не значимо (Р > 0,05) (Табл.2). У больных

Таблица 2

Экспрессия дифференцировочных антигенов на лимфоцитах крови больных хроническим аднекситом и здоровых женщин

Антиген МКА Антигенположительные клетки (i)

Больные Доноры Р

Fas(APO-1/CD95) ICO-160 43,9+/-7,5 23,42+/-2,91 < 0.02

CD3 ICO-90 74,6+/-4,9 69,8+/-2,69 > 0.05

CD4 ICO-86 53,1+/-4,1 35,58+/-3,4 < 0.05

CD8 ICO-31 • 42,5+/-7,0 32,69+/-2,71 > 0.05

CD24 ICO-150 17,8+/-3,1 14,14+/-1,87 > 0.05

CD71 ICO-92 19?5+/-3,6 •8,11+/-1,73 < 0.01

CD25 1СО-Ю5 17,6+/-3,8 .8,62+/-l,18 < 0.05

CD16 . ICO-116 28,ú+/-5,3 19,73+/-3,18 > 0.05

CDIlb ICO-GM1 26,0+/-3,3 15,33+/-3,81 < 0.05

CD4/CD8 1,24 1,08

хроническим аднекситом было увеличено содержание лимфоцитов, экспрессирующих актиеационныа антигены С07х (рецептор трансферрина) и CD25 (рецептор интерлеЯкина-2) (Табл.2),. а также было увеличено содержание НК-клаток, типнрованных по экспрессии антигена CDllto (Р < 0,05)-

Таким образом, иммунный, статус у больных хроническим аднекситом можно охарактеризовать как активированный, т.к. у ншс повышено содержание Т-хелпарных лимфоцитов,

активированных клеток (CD71+, CD25+) и Ж-клеток. Сотояние активации иммунной системы у этих пациентов сопровождается повышением экспрессии молекулы, опосредующей апоптоз;

Следующий этапом'нашей р боты было изучение экспрессии

i

Fas(APO-1/CD95) антигена на лимфоцитах периферической крови больных миомой матки. Исследование проведено на клетках'периферической крови 14 пациентов. Выло обндружено.

что лимфоциты больных высоко сильно экспрвссировали Раз(АРО- • 1/С095) антиген - 42,55 +/-5,84 % (Табл.3). Следует подчеркнуть, что низкий уровень экспрессии был только у 3 (21,4 %) пациентов (8 - 21,2%), тогда как у' остальных 11 больных высокий - 32 - 71 Различие в частоте низкого и высокого уровня по сравнению с донорами была статистически значимо.

Сравнение экспрессии других дифференцировочных -антигенов на-лимфоцитах больных миомой матки выявило сильный дисбалланс в иммун'Лой системе по сравнению со здоровыми женщинами.. Практически, только содержание СОЗ-положитальных клеток было одинаковым (Табл.3). Во всех других популяциях было статистически значимое повышенно процента антиген-, положительных клеток.

Таблица 3

Эксйрессия дифференцировочных антигенов на лимфоцитах крови у больных миомой матки • и здоровых женщин

Антиген МКА Антигенположительные клетки Больные Доноры (%) " Р

Раз(APO-1/CD95) ХСО-160 23,42+Z-2,91 < 0.02

CD3 ХСО-90 69,8+/-2,69 > 0.05

CD4 IC0-86 35,58+/-3,4 < 0.05

CD3 IC0-31 32,6Э+/-2,71 < 0.01

CD24 ICO-150 25,4+/-3,2 14", 14 + /-1, 87 < 0.01

CD71 ICO-92 26,5+/-3,7 8,11+/-1,73 0.001

CD25 1СО-Ю5 30,0+/-Э,9 8,62+/-1,18 0.001

CD16 ICO-116 37,0+/-Зг8 19,73+/-3,18 0.001

CDllb ICO-G?n 40,9+/-3,8 15,33+/-3,81 0.001

CD4/CD8 1,05 1,08

У больных этой группы было статистически значимо „величено содержан i т-хелперов и т-супрессоров по сравнению с донорами. Однако иммунорегуляторнмй индекс был одинаковым. Выявлено увеличение в-лимфоцитов, типированных * по экспрессии антигена CD24. У больных миомой матки было резко увеличено содержание :> лимфоцитов, окспрессирующих

активационные антигены CD71 (рецептор трансферрина) и CD25 (рецептор интерлейкина-2) (Табл.3).

Аналогичным образом, было резко увеличено содержание NK-клеток, типированных- по экспрессии антигенов CDllb и CD16 (Р < 0,001) (Табл.3).

Таким образом, иммунный статус у больных миомой матки можно охарактеризовать как активированный, а. к. у них повышено содержание Т-хелпетэных лимфоцитов, активированных клеток (CD71+, CD25+) и NK-клеток. Сошояние активации иммунной системы у этих пациентов сопровождается повышением экспрессии молекулы, опосредующей апоптоз. Следует отменить тот факт, что у всех больных миомой матки, независимо от экспрессии Fas(APO-1/CD95) антигена было увеличено процентное содержание активационных антигенов и NK-клесок.

Следующим этапом нашей работы было изучение экспрессии Fas(APO-1/CD95) антигена на лимфоцитах .периферической крови больных кистой яичников. Исследование проведено 'на клетках периферической крови ? пациентов. Было обнаружено, что лимфоциты больных также высоко экспрессировали Fas(АРО-1/CD95) антиген - 49,28+/-8,9 % (Табл.4). Следует подчеркнуть, что низкий уровень экспрессии был только у 1 (14,2-%) из 7 женщин, тогда как у остальных б больных вмсокий - 31 - 72 Различие р частоте низкого и высокого уровня по сравнению с. донорами была статистически значимо. Сравнение экспрессии других диффе^енцировочных антигенов на лимфоцитах больных кистой яичников выявило сильный янсбалланс с иммунной системе по сравнению со здоровыми женщинами. Как и i

случай с миомой маши, только содержание СОЗ-положитальных клеток было одинаковым (Табл.4). Во всех других популяциях было статистически значимое повышение процента

антигенположи5:ельных клеток (Табл.4). У больных этой группы было статистически значимо увеличено содержание т-хелперов и Т-супрессоров по сравнению с донорами, хотя иммунорагуляторных индекс был одинаковым. Выявлено увеличение В-лим$ош«тов, типированных по экспрессии антигена С02А. У больных кистой яичников было резко увеличено содержание лимфоцитов, экспрессирукицих активационные антигены С071 (рецептор трансферрина) и С025 (рецептор интерлейкина-2) (Табл.4). Аналогичным образом, было резко увеличено содержание НК клеток, типированных по экспрессии антигенов СИНЬ и С016 (Табл.4).

Таблица 4

Экспрессия дифференцировочных антигенов на лимфоцитах

крови у больных кистой яичников и здоровых женщин

Антиген МКА Антигенположительные клетки (*)

Вольные Доноры Р

Fas(APO-1/CD95) IC0-160 49,2+/-8,9 23,42+/-2,91 < 0.01

CD3 IC0-90 63,2+/-11,5 69,8+7-2,69 > 0.05

CD4 ICO-86 49,6+/-3,3 35,58+/-3,4 < 0.01

CD8 IC0-31 48,б+/-5,0 32,б9+/-2,71 < 0.01

CD24 IC0-150 26,7+/-3,2 14,14+/-1,87 <0.001

CD71 ICO-92 27,б+/-5,3 8,11+/-1,73 < 0.001

CD25 ICO-105 34,3+/-5,1 б,62+/-1,18 < 0.001

CD16 ICO-116 45,1+/-8,9 19,73+/-3,18 < 0.01

CDllb 1CO-GM1 35,9+/-б, 0 15,33 + /-3,81 * 0.01

CD4/CD8 1,02 1,08

таким образом, иммунный статус у больных кистой яичников можно охарактеризовать как активированный, т.к. у' них повышено содержание ' Т-хелперных лимфоцитов, активированных клеток (CD71+, CD25+) и NK-клеток.» Сотояние активации иммунной системы у этих пациентов сопровождается повышением экспрессии молекулы, опосредующей апоптоз.

. . Так как нормально протекающая беременность является одним из вариантов физиологического - состояния женского организма, которое по данным литературы и наших собственных исследований связано со значительными изменениями иммунного статуса, мы исследовали экспрессию антигена ■ опосредующего апоптоз, и субпопуляции иммунокомпетентных клеток у 22 беременных женщин со сроком свременности до 14 недель. Было обнаружено, что лимфоциты больных также сильно

экспрессировали. Fas(APO-1/CD95) ' антиген - 44,7+/-4,7 % (Табл.5). Низкий уровень экспрессии был только у 4 (22,7 4) из 22 беременных женщин, , тогда как у остальных 18 - высокий: 31 - 84 Различие в частоте низкого и высокого уровня по сравнению с донорами была статистически значимо, сравнение экспрессии других дифференцировочиых антигенов на лимфоцитах беременных женщин выявило состояние активации иммунной системы: было пасьшено содержание CD4+ Т-хелперной популяции, повышение процента лимфоцитов, экспрессируюпшх активационг1ые антигены, и повышение количества NK-клеток. (Табл. 5). Содержание Т-клеток, Т-супрессрных/цитотоксических лимфоцитов и В-клеток не отличалось от группы здоровых доноров.

Таким образом, иммунный статус у беременных женщин со сроком беременности до 14 недель, можно охарактеризовать как активированный, т.к. у них повышено содержание Т~ хелперных лимфоцитов, активированных клеток и NK-клеток. Сотояние активации иммунной системы у этих женщин также сопровождается повышением экспрессии молекулы, опосредующей апоптоз. С другой стороны, содержание "Г-клеток, Т-

супрессрных/цитотокагчас* га лимфоцитов ,. и В-клетох .не отличалось от группы здсровых доноров.

таблица 5

Экспрессия дифференцировочных антигенов на ' лимфоцитах крови у беременн тс женщин и доноров

Антигон МКА Антигенположительные клетки (%)

Беременные Доноры Р

Fas(APO-1/CD95) IQO-160 44,7+7-4,7 23,42+/-2,91 < 0.02

CD3 ICO-90 71,6+/-2,6 69,8+/-2,69 > 0.05

CD4 ICO-86 44,7+/-2,9 35,58+/-3,4 < 0.05

CD8 ICO-31 38,0+/-3,3 32,69+/-2,71 > 0.05

CD24 ICO-150 19,4+/-2,8 14,14+/-1,87 > 0.05

CD71 ICO-92 21,5+/-2,6 8,11+/-1,73 < 0.001

CD25 ГС0-105 19,1+/-2, 6 8,62+/-1,18 < 0.001

CD16 ICO-116 28,0+/-2,6 19,73+/-3,18 < 0.05

CDllb ICO-GMl 29,9+/-2,9 15,33+/-3,81 < 0.01

CD4/CDQ 1,17 . 1,08

Выяснив уровни экспрессии Fas(APO-1/CD95) антигена на лимфоцитах периферической крови здоровых женшин, больных хроническим аднекситом и доброкачественными заболеваниями, состояние их иммунной системы, мы перешли к изучению этих показателей у больных раком яичников, раком матки. Было обнаружено, что. лимфоциты больных раком яичника экспрессировали Fas(APO-l/ CD95) антиген на уровне здоровых доноров- 24,76+/-5,0 4 (Табл.6). Следует подчеркнуть, что 'низкий уровень экспрессии был у 7 (70 %) из 10 плциентов. Различие в частоте низкого и высокого уровня по сравнению с донор ли но было статистически значимо.

таблица 7

Экспрессия дифференцировочных антигенов на лимфоцитах крови у больных раком яичников и здоровых женщин

Антиген МКА Антигенположительные клетки tfsf

Больные Доноры Р

Fas(APO-1/CD95) ICO-lfiO 24,7+/-5,0 23,42+/-2,91 > 0.05

CD3 ICO-90 62, 5+/-6, 3 69,8+1-2,69 > 0.05

CD4 ICO-86 36,8+/-5,8 35,58+/-3,4 > 0.05

сов ICO-31 50,1+/-6,6 32,69+/-2,71 < 0.02

CD24 ICO-150 14,2+/-2,2 .14,14+/-1,87 > 0.05

CD71 ICO-92 10,0+/ 2,5 8,11+/-1,73 > 0.05

CD25 ICO-105 8,4+/-1,4 8,62+/-1,18 > O.05

CD16 ICO-116 15,8+/-3,6 19,73+/-3,18 > 0.05

CDllb ICO-GM1 26,7+/-7,2 15,33+/-3,81 > 0.05

CD4/CD8 0,73 1,08

Изучение иммунного статуса у больных раком яичников выявило нарушение в соотношении хелперных и супрессорных клеток, которое было равно 0,73 по сравнению с 1,09 в донорской группе. Это вызвано резким повышением супрессорных клеток до 50.1%. Нарушений в процентном содержании других субпопуляций, в том числе л активированных лимфоцитов, не выявлено (Табл. б).'

таким образом, иммунный статус у больных раком яичников можно охяоактериэовать как супрессивный вследствие повышения субпопуляции CD8-положительных

супрессорных/цитотоксических клеток. У больных отсутсвует активация иммунокомпетентных клеток и повышение экспрессии Fas(APO-1/CD95) антигена.

Таблица 7

Экспрессия диффэронцировочных антигенов на лимфоцитах крови у больных раком'тела матки (п*10) и здоровых женщин (п—31)

Антиген МКА Антнгенположительныа клетки (t)

Вольные Доноры Р

Fas(AFO-1/CD95) ICO-160 27,7+/-4,4 23,42+/-2,91 > 0. 05

CD3 ICO-90 48,1+/-11,2 69, 8+/-2,69 > 0. 05

CD4 ICO-86 31, Э+/-5, 8. 35,58+/-3,4 > 0. 05

CDB ICO-31 33,5+/-7,1 32, 69-f/-2, 71 > 0. 05

CD24 ICO-150 13,2+/-3,4 14,14+/-1,87 > 0. 05

CD71 ICO-92 10, 7+/-3,2 8,11+/-1,73 > 0. 05

CD25 1СО-Ю5 7,5+/-2,7 8,62+/-1,18 > 0. 05

CD16 ICO-116 20,7+/-5,0 19,73+/-3,18 > 0. 05

CDllb ICO-GM1 26,Э+/-7,1 15, 33+/-3,81 > 0. 05

CD4/CD8 0,95 1,08

У больных аком матки .било обнаружено, что лимфоциты экспрэссировали Fas(APO-1/CD95) антиген на. уровне здоровых доноров и больных раком яичника - 27,7+/-4,4 I (Табл.7). Частота распределения больных по группам с низкой и высокой степенью экспрессии Раз(APO-1/CD95) антигена отличалась как от здоровых доноров, так и от больных в других группах: низкий уровень экспрессии был у 44,4 4 пациентов. Различие в частоте низкого и высокого уровня по сравнению с донорами не было статистически значимо. Изучение иммунного статуса у больных раком тола латки не выявило нарушений в уровне субпопуляция иммуноксмпотантных клеток, эа исключением уменьшения количества CD3-положительных клеток, которое, однако, не было статистически значимым (Табл.7).

Таким образом, иммунный статус у больных раком матки можно охарактеризовать как супрессивный вследствие' повышения субпопуляции' CD8-положительных

супрессорных/цитотоксических клеток. У больных отсутсвует активация иммунокомпетентных клеток и повышение экспрессии Fas(APO-1/CD95)антигена.

. Экспрессия антигена Fas(APO-l/CD95) по результатам всех исследований коррелировала с экспрессией активаиионных антигенов CD71 и CD25 (г=0,05 и »0,52).

В другом разделе работы мы ставили целью сравнить показатели иммунного статуса у здоровых женщин после нормальных родов и у родильниц, относящихся к группе риска по развитию гнойно-септической патологии, а также оценить динамику иммунологических и клинических параметров у больных лактационным инфильтративным маститом при'включении иммуномодулятора тактивина в комплексную терапию.

Обследовано 145 жениин в возрасте от 18 до 39 лет, в том числе 30 здоровых небеременных (1-я группа), 35 здоровых родильниц после физиологических родов (2-я группа), 15 родильниц после патологических родов (затяжные роды, безводный период более 12 часов, травмы мягких родовых путей, кровопотеря, превышающая физиологическую, ручное

обследование матки) - 3-я группа. 20 родильниц с хроническими воспалительными заболеваниями в анамнезе (хронический пиелонефрит, хронический тонзиллит, хронический бронхит и др.(4-я группа), 5-ю (опытную)группу составили 45 больных лактационным инфильтративным маститом в первые сутки поступления в стационар. 32 больным сразу же наряду с общепринятым лечением назначили тактивин подкожно по 1,4 мкг.'кг на ночь до окончательного рассасывания инфильтрата (инфильтратов). Контролем служили 13 пациенток, получавших обычную терапию без Тактивина.

При сравнении иммунологического фенотипа Лимфоцитов здоровых родильниц (2-я группг.; и здоровых небеременных

женщин (1-я группа* гмечается существенное снижение экспрессии всех йсследусмьгх антигенов. Такжо значительно (р< 0,001) снижено отношанио хелперно'/индукторной субпопуляции к супресорно/цитотоксической (иммунорегуляторной индекс). В 3-й и 4-й группах, т.е. у родильниц с повышенным риском развития гнойно-септической патологии, угнетение иммунной системы выражено ещэ больше по сравнению со 2-й группой. Особенно заметно снижение содержания С03+ -Т-лимфоцитов и хелперов/индукторов (СЭ4+). В 3-й группе, у родильниц после осложненных родов повышено (27,5 % по сравнению с 23 % во 2-Я группе) содержание лимфоцитов супрессорно-цитотоксической субпопуляции (СОЭ +), снижена до 17,54 экспрессия НЬА-ОК-детерминант и достоверно ниже иммунорегуляторный индекс, что указывает на угнетение иммунной системы.

У больных лактационном инфильтративным маститом в день поступления в стационар (5-я группа) резко снижено по сравнению со 2-й группой С04 + ША-0Д+ -клеток, наблюдается самый низкий коэффициент С034+/С08+ (0,78+0,15). При сравнении показателей 5-й и 3-й групп отмечается сходство по таким важным параметрам, как иммунорегуляторный индекс, содержание НЬА-ОИ+-клеток.

После лечения тактивином иммунологические показатели значительно различаются . В опытной группа, получавшей в составе лечения Тактивин, все показатели достоверно отличаются от исходных, вмосте с тем ни один из показателей клеточного иммунитета не имеет достоверных отличий от таковых у здоровых набеременных' женщин (1-я группа). В контрольной группе, не получавшей Тактивина, отмеченно существенное, но менее значитепьное повышение С04+-клеток, ША-ОГНлимфоцитов и •воличоние индекса С04+/С08+, хотя возрастает процент С08+-клеток по сравнению с ,исходным до лечения и тем самым увеличивается разрыв по этому показателю с 1-й группой (р<0,001).

У Сольных, получавших Тактивин, рассасывание инфильтрата ускорилось на 33,:, I, нормализация лейкоцитарной' формулы - на 36,7 4. Существенно раньше вернулись к норме и биохимические показатели: С-реактнвный белок - на 27,7 4, общий белок - на 25 4. Курсовая доза антибиотиков снизилась на 23,3 4, продолжительность лечения-на 26,4 4. В опытной трупе не было случаев перехода процесса в гнойную форму, а в контрольной это явление отмечено у 7,7 % женщин.

Таким образом, в связи с описанными достоверными изменениями иммунного статуса у женщин, относящихся к группе риска, и у больных лактационным йнфильтративным маститом можно предположить, что иммунная система играет определенную роль в предрасположенности к острым инфекционный заболеваниям в послеродовом периоде. Положительная динамика иммунологических и _ клинических показателей у больных маститом, получавших в комплексном лечении иммуномодулятор Тактивин, также свидетельствует в пользу данного предположения и делает целесообразным дальнейшее изучение особенностей иммунной системы у родильниц, поиск средств и .методов воздействия па нее с целью профилактикии лечения гнойно-септической патология юслеродового периохэ.

ВЫВОДЫ

1. У здоровых женщин Fas (AP0-T7CD95) антиген ■экспрессирован на 23,42+/-2,©1 I лимфоцитов периферической крови. По уровню экспрессии практически здоровые доноры можно разделить на две статистически различимые подгруппы низко и высоко экспрессируюшие Fas(APO-1/CD95) антиген. Низкая экспрессия антигена выявляется у 75 % лиц, а высокая у 25 4. Fas(APO-1/CD95) антиген представлен

на части CD3-, CD4-, CD8-, СШЭ-положитольных клеток.

2. Лимфоциты больных хроническим аднекситом сильно экспрессировали Fas(APO-1/CD95) антиген - 43,9+/-7,5 ». Повышение зкспрессии антигена было у 80% пациентов. У больных хроническим аднекситом было увеличено содержание лимфоцитов, экспрессирующих активационные антигены CD71 (роцептор трансферрина) и CD25 (рецептор интерлейкина-2), и NK-клеток.

3. Пваышение экспрессии Fas(APO-1/CD95) антигена обнаружено у 80 больных миомой матки. Иммунный статус у больных миомой матки можно охарактеризовать как

активированный, т.к. у них повышено содержание Т-хелперных лимфоцитов, активированных, лимфоцитов и NK-клеток.

4. У болысах кистой яичников иммунная система организма находится в активированном .состоянии, которое

сопровождается у 86 4 больных повышением экспрессии молекулы, опосредующей апоптоз.

5. Иммунный статус у беременных женшин со сроком беременности до 14 недель можно охарактеризовать как активированный, т.к. у них повышено содержание Т-холпорных лимфоцитов, активированных клеток и NK-клеток, а также Fas(APO-1/CD95) аьгигена.

б. У больных раком яичников иммунная система угнетена вследствие повышения субпопуляции С08-положительных супрессорных/ци.тотоксических клеток. У больных отсутсвует активация иммунокомпетонтных клеток и повышение экспрессии Fas(APO-1/CD95) антигена.

7. У больных раком матки лимфоциты экспрессировали Fas(APO-1/CD95) антиген на уровне здоровых доноров и больных раком яичника - 27,7+/-4,4 I. Частота распределения больных по группам с низ? эй и высокой степенью экспрессии Fas(APO-1/CD95) антигена отличалась как от здоровых доноров, так и- от больных в других группах: низкий уровень экспрессии был у 44,4 %.

0. Fas(APO-1/CD95) антиген являе'тся новым активаиионным

маркером, я.к. выявлена корроляцил между экспрессией Fas(APO-1/CD95) антигена и активациошшх антигенов CD25 и' CD71 (г-0.55 и 0.52).

9. У' здоровых родильниц отмечается существенное снижение экспрессии ' всех исследованных антигенов, которое

усугубляется патологическими родами, хроническими воспалительными заболеваниями и острой ' инфакционной патологией в послеродовом периоде.

отмечается выраженный иммунологический и клиничосиИ эффект Тактивина о комплексном лечении лактационного инфильтративного мастита.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕШ ДИССЕРТАЦИИ

1. Особанности иммунного статуса у женщин а^ послеродовом периоде. Применение Т-активина в комплексном лечении ла^тоционного инфильтративного мастита/Нетелица И.С., Метелица Л.С., Барышников А.Ю., Штефанчук И.Р., Кадагндзе З.Г. Иммунология.- 1991.- N4.- С.47 - 50.

2. Иммунологические . аспекты применения Тактивина в комплексном лечении лактационного мастита./ Метелица Л.С., Метелица U.C., Штефанчук И.Г., Барышников А.Ю., Кадагидэо З.Г. Тез.докл.межд. симп."Роабелитация иммунной системы". Цхалтубо. 1990.С.86.

3. Показатели иммунного статуса у больных гинекологическими заболеваниями/ Метелица И.С., Лазарева Н.И., Чинарева И.В., Лукашина М.И., Садяхина Н.П., Бурова O.e., Полосухина Е.Г., Шишкин Ю.В., Барыиников А.Ю. Тезисы докладов межрегнонарной конференции "Актуальные вопросы клинической иммунологии", г. Кемерово.1996.- С.67 - 69.