Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунологические последствия взаимодействия С-реактивного белка с липопротеинами плазмы

р V Б

1 й Л» «с

РОССШСКАЯ ЛКАДЕННЯ НЕДЮШНСМХ НАУК НАУчно-иса^ЕяовАТЕльааи ИВСТИТУТ

ЭКСПЕРИЯИГГАЛЫЮЯ МЕДИЦИНЫ

ИНКУНОЛОГИЧВОКНЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С РЕАКТИВНОГО БЕЛКА С ЛШОПРОТЕКНАНЯ ПЛАЗИЫ

14.00.16. - алвергояопта в кннгводогкя

А ВТ О Р Е ♦ Е Р А Г

диссертации иа соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукописи

ПЕТРОВ КГОРЬ Владимирович

Санкт-Петербург

Работа выполнена в Нл^чно-исследовательском миститэ эксперввентальной нелицикы РАКН.

ЧдцчнчЛ руководитель! доктор 1"Д1!'.1.иискп1 тел: П.Г.Назаров

Официальные оппоненты! ЗАслуиенишЧ на^ки России»

доктор биологических наук, профессор Р.Я.Поляк, доктор иедимичскиа наук, профессор Я-Б.!*ебрзи.

Ведэдая организация: Саккт-Петербургский педиатрический медицинский иистктут 113 РИ>.

Зашита диссертации состоит Сй "¿7%" У?,.... /г7) 1994 года

в ^-Зчасов на заседании специализированного совета Д 001.23.02 пр» Научно-мсоледовигельсноп имстнтчтё эксперииентальной медицины РАМН <197376, СанЛт-Петербург, цл. акал- И.П.Павлова, 12).

С диссертацией поаио оэнгкоииться с библиотеке НИИЭИ РАМН.

Дг -ореферат рьзсюлан /<£ (¿¿/ы^ 1 гада-

Зченый секретарь спецлэлизирор наго соврта доктор медицинских начи

Л.О•Бурев а

Актуальность проблемы

С-реактивный волок (СРВ) относится к оеяейстжд реактажтов острой фазы воспаления. Его билогаческая роль да конца не выяснена* однако в литераторе имеется достаточно иного данных« свиде-тельствушиих ов иипунорегулят„рно» актаввостя СРВ. Эта давяые ногу т быть сдяиироааны с-ледтииип образом- Одна аз них. более иного-численные« иллястрирцнт яеспецифяческие эффекты СРВ, такие как стжпуляция хеиотаксмол и фагоцитарвой ак гивяосгя, дсиленже кислородного Мсгтаболизяа в лейкоцитах а патогенный эффект в отношении лимфоцитов. Эти эффекты СРВ« безусловно« важны, т.к. показывают вклад СРВ в формирование неспецифяческой резистентности.

Менее яногочисленны сведения о специфических ияяунорегэла-торных эффектах СРВ, связанных с его свойствам лектана- 1л vitro взаимодействие СРВ с некоторым мз его лигаядов, напрааер, о С-полксахарядои клеточной стенка пневмококков < протекает подобно реакции антятен-аптитело! сформированные комплексы актявирчвт комплемент по классическая? пяти iSiege1 et a1>«l<?82>' Впечатлям-«¡им примером специфической ияязморег^латоряой активности СРВ, когда его эффект in vlto подобен эффект пассивно введенных специфических антител, являются эксперименты по влиянию СРВ на пневмококковая инфекция у нишей <На*ауаяа еу al., 1*584)-Если перед заражением летальной дозой живых пневмококков иымая вводила человеческий СРВ, это приводило к двчп последствия*» Во-первых« под-опытныв хшл вывивали, тогда как контрольные гибли. Во-вторых, ч выживиих животных не происходило выработка протектаввых антител к фосформдзолииу - стрчктчрнои-j злеиеятч пневвскоюсового С-подиоа-харида» Эти данные свидетельствуют о тон, что в определенных ситуациях, когда дело касается его лмгандов, СРВ может включаться в специфически» импучорегчляцн».

К чкслч эндогенных лигандев СРВ, последствия связывания о которыми продставляит несомненный клинический интерес как возможное звено о патогенезе атеросклероза! относятся липопротеяиы (De Peer et al.,1982)• Экспериментальные исследования, посвяченные этонп вопросу! весьма немногочисленны и фактически исчерпываются даишти о способности СРВ связываться с липапротеянаяи (ЛИ). При этом спорным остается вопрос, только ли о ГШ низкой и очень низкой плотности связывается СРВ <Се Веег et al.,1482; Поме et al.,l"?84) или также с ЛП высокой плотности {Pontet et al-, 1986).

Вопрос об отношен»* СРВ к икпуниопу и аутоиив^иноиу ответу на ЛП в литераторе совершенно не освемен- Между теи, образован«« ачто-антител к ЛП и Формирование иппуяных копплексов рассиатрввается в ранках аутоияиуннон концепции атеросклероза как одах из основных иеханнзлов атерогеиеза (А>Н-Клилов,19S6,1991> •

В последнее среия внияанхе исследователей привлекает изучение биологических свойств конфорлационных вариантов СРГ, в частности« его свободных субъединич« СРВ циркулирует в виде свободных суб-ъедшниц при некоторых патологических состояниях < йзгаиа1 et al. 11990), по биологическим свойства« суб-адяницы СРВ нередко существенно отдичажтоя от пентаиерного белка (Poteapa et al->1987; А.В.Полевщжксв, 1")Э2; П.Г-Назаров и АР- 11993 > - Роль субъединац СРВ во взаимодействии с ЛП не изучалась >

Цель и задачи исследования

Настоящая работа посвящена изучении взаиподействва СЭЗ и его субъедяянц с лапопротеинаии различных классов 1« VI-(то а «ивуво-логическин последствия!» их взаимодействия в ортавазве- Для этого необходиио выло решить сдедукцне задачи:

1• Изучить взаииодействие СРВ и его субъедивиц с ЛП трех основных классов! очень низкой, низкой и вывела ■ плотности <ЛП0НП, ЛГ*!П и ЛГВП). *

2. Изучить роль СРВ в образовании антител к ЛП и роль ЛП в образовании антител к СРВ в качестве звена патогенеза аутоиииуп-вого заболевания»

Научная новизна

Установлено, что СРВ взаимодействует не только о апо-В содержащими ЛП < ЛПОНП, ЛПНП), но и с ЛПВП, причеи прииерве о одинаковой ни енсмвносты .

Впервые научено взаимодействие суб-ьединиц СРь с ЛИ а показано, что '-убъединицы иогут взаимодействовать с тремя кд. саки ЛП более интенсивно, чей патаввый пентапер СРВ, причеи для этого взаимодействия не обязательны ионы кальция. До настоящего вреяели этот Ьопроо иаучев не был•

Впервые обяаруиев ■ исследован в эксперименте Фгтолен образования антител к СРВ при илпунизации липопротеидая» и

образования антвтел к ЛП при иалдяяаацяа С^В» №»ледшаа механизм этого фенокена и установлено ч*у и ггтг ооио>*« копт лежач ¡, как вэаяводеиствие СРВ о ЛЯ» пршлвямр* ыпелвлякв новые? антигенные свойства« так а идиота»-авггеюдяотввичвек»» реакции«

При исоледованая второго леханнзяа развитая этьго явлена» -- антаиднотамнческого- показано«что аятпдвотипаческае антитела к одному на этих двух лигандов( образчвмиеся в процессе виненного отчета, яалямтся правыми ант»телаии ко второяя дигаа-дч- Выявлено« что антнмдиотипические антитела к ЛП взавво-деаствуит с СРВ« причем СРБ индуцирует ах образование»

Теоретическое значение раватм-

Теоретическое значение работы сааоаао о обнаруае-нмеи вош закономерностей вэавводействая одного иа ванных {■акторов воспалительного процесса- СРБ о дмполротеаваяи in vitro и in vivo и образования аитидипопротеидиых антител а аутоантител в ответ на введение СРЕ.

Полученные данные вносят вклад в развитие предатавде-нил о н&ханизяах Формирования ацтояяиужпых реакций и роди рг>актанта воспаления - СРВ в индукции антител к липопротеа-нза, налянцихся одяии из главных факторов патогенеза атеросклероза •

Осноэнив положения, выносимые на оащмту:

1. С-реактивньгл белок, а также его свободные субиедини-ци ваааиодействамт со всели трем» основными классами липол-ротеаиоа. АПОНП» АПНП л ЛПВП, причьа взаимодействие суб-ъеда-ниц с ЛП) в отличие от натмвного бедка« не зависит от ионов кальция.

2. Иммунизация лабораторных животных ЛП вызывает образование антител к СРВ» а ияяунизация С-реактнвнын белков приводят образована» антмгел к ЛП- При ипнуниэации СРБ ов-разумтея аутоантит&ла к ЛП*

3. Образование антител к ЛП при инпунизации СРВ и образованно антител к СРБ при иикунаэации ЛП связано с антиидао-тмпичееккя пеханизнон.

- 4 -Апробация работы*

Основные положения работы Пк—мставлялись на 62-и Конгрессе ЕАЭ < Европейского общества по изучении атеросклероза) в Иерусаииие, Израиль» 5-9 сентябре 1993 года« на 13-о Пел-..ународкоп копгр.-зсе по клинической хивша в Мельбурне« Австралия( 14т19 ноября 1993 года! на научной конференции отдела ипяуиолотки НИИЭИ РАИН-

По материала» диссертации опубликовано три работы'

Стру;стара и о&ьеи диссертации.

Диссертация состоит яо введения« обсюра литературы, *а-тегчалов и негодов, результатов собственных исследований» с'оуиденыя полученных результатов■ выводов» списка использованной литературы и вкличает 115 страниц г лаияописиого текста> 22 таблкдо>» а 11 рисунков- Список попользованной литературы включает 105 работ» из них 89 работ иностранных авторов •

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ИАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ С-реактнвный белок ( СРБ) бы выделен и либеэно предоставлен наи Л.К-Берестовой (ВИИ вакцин и сывороток, Санкт-Петербург). Источникам СРБ была асцитическав жидкость больных с опухолями яичников. Для получения суб-'диииц СРБ, пентаиерный СРБ дассо-ииировали нислотини методой <Ро1евна а1., 1978)- Липопроте-ииы тр I классов (/ШИП, АЯОНП и ЛПВП > выделали в лавораторим липопротеинов отдела биохнляии КИИЭП РАМН (руководитель - доктор иедицинских наук А-Д.Денисенко) препаративных ультрацент-рифугированиеп плазкы крови человека ним иивотных, свободной от хылоиикрои, в центрифуге 1.-8 Йе квап. В опытах использовали диагностическую антнсыворткосла против СРБ человека в аппу-лах по * ял производства предприятия биопрепаратов НИИ вакцин и сывороток (Санкт-Петербург). Кроме кгперчеохон ослиной ан-тн-СРБ сыворотки испольоовали кроличьи антисыворотки х т-?нта-иернапу и яононернОяу СРБ <п- я и-СРЕ» соответственно) полученное наии. Кроне того - исгюльаовалм нышиные имтисыворотки к

выявить вцаиподействие СРВ о ЛП-ЭБ, не сопровождавшееся агглютинацией- Исследование взаимодействия СРВ о ЛП производили в среде« содериацей ионы кальция, и в бескальциевой среде*

Для определения наличия у мышей плазматических клеток, вы-рабатываицих аутоантитела к собственным ЛП» использовали реакции локального гемолизе в геле по Ерне. 3 качестве индикаторных использовали эритроциты барана, нагруженные ЛП кыъш.

Данные обрабатывали с помощью методов параметрической статистики .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ Проверка чистоты СРВ и ЛП с помоиь» днскэлектрофореза в столбиках агарозы, электрофореза в полиакрилаииднои ге*е, зонального электрофореза на полосках ацетата целлмлозы тк сказала, что суб-ьединкцы СРВ и пентанерный CPS не содержим! ^«полните ль кыгс белковых фракций и мигрировали с разлмчь"< ;чдвии-ностъ» •

Чтобы показать отличие СРВ от апопротеявов СИ

человека был проведен электрофорез в ПААГ в де«»<г* * t киуишиз условиях« Вря этом СРВ распадается на S идентичных субъединиц массой 21,5 кДа, а ЛП - на гпопротемны- На рис•1 видно, что оубкедиямцы СРВ не содержали дополнительных белковых вргхцмй а мигрировали в области, примерно соответствуйте* паркеру о массой кДа• В этой же области мигрировала апопротемкы ЛПВП. Бедки о меньшей молекулярной массой не разделилась И нитрировали од чин фронтом- Кроне того на рио»1 видно, что СРВ ив содержал высокомолекулярных примесей типа ano В> В иПНП и ЛПОНП ana В практически остались на старте»

Чтобы ече надеинее убедится в отсутс~виа апо-В содержащих белков в СРВв был проведен минуяоблотпкг с перенесением белков о геля на нитроцеллюлозу и окраской аити- .по В сывороткой. Этот метод так не показал отсутствие апо В содержащих белков в СРВ' (рио. 1) .

При электрофорезе ЛПВП и СРВ на пластинках агарозы фиряы ВесЪаал, который проводили параллельно на двух пластан..ах (одну скрашивали на белки« другум на липиды), СРВ мигрировал в области/^-глобулинов, а ЛПВП в области^- глобулинов.

• Препараты СРВ были ясоледовани на наличие апо В-содержашах ЛП такие о пспоиы* реакции ториокеиия пассивной reh irrлптина-ции. Пра этой использовали систему, вклмчамчум эритроциты 6а-

- а -

ЛДОНП и АПНП чедавека( получают» двукратной янутрябряшввой иммунизацией ншем СБА дипопротея&аяа в дооах от 1 до 100 икг на ьивотное- Ноноспецаоческш сыворотка кроликов против лв-попротеинов трех классов (ЛП1Ш, ЛПОНП и ЛПВП) человека« любезно предоставленные сотрудницей НИИЭМ РАИН к*6-н- старшин научных сотрудником Л.С-Косинкой) были подучены двукратной иилунязаия-ен о п^^венениен ад-ьнванта фрейнда* Крол-чьи антияднотипя-ческне сыворотки к ЛП трех классов < ЛПНП, ЛПОНП и АПВПI человека были и любезна предоставлены нем Л-С-Косицкои. Она выли получены путем нжиуинзацин кроликов гаина-глобулжнон, выделенный из иоиоспецифическях антисыворсток кроликов против ЛП человека.

Для анализа СРВ я ЛП мсподьсовали электрофоретяческяе а иммунологические методы и их сочетания. Из эдектрофорятвчееквх «I годов применяла: дк>-эсэдектроФорез • столбиках агарозы, во-налыох'1 электрофорез на пластинках ацетата челдмозы, эдекро-Форез белков в ЛААГ о добавленяев дадецилоульфата Не, ржя, ия-нуноблотниг и ракетный ияиуяоэдекрофореа• Эти исследования проводами совяеотно о отделан биохимии КИИЭМ РАНЯ, Санкт-Петербург.

Взаимодействие СРВ я ЛП иооледовали о пояомью иииунот^р-яентиого метода ШфМ). Предварительно подоврала оптиялльные уодовмя сорбция ЛПНП, ЛПОНП я АПВЦ па 96-дувочные планшеты ио полихлорвинила фирмы "Т» »етЧек"« доза ЛП ■ рН среды), используя бычин сывороточный альбумин в качестве блокирующего агента-Связывание СРВ или его оуб'ъедиинц проявляли о пояоцью ослиной антисыворотки к СРВ, источенной ЛПОНП, белка А, меченного пе-роксндазой хрена, я снеси о-феямдеядяаяяна о перекисью водорода- Интенсивность окраски определяли фотояетричеокм на компараторе оптическом микропроцессор, он "КОИП" ила "Цпкеу" в двухволновон режиме• результаты вира* зли в единицах оптической плотности (ед.ОП).

Кроме того, взаимодействие СРВ и ЛП исследовали с понашью реакция пассивной геиагтдмтинации ( РОГА) о использованием бараньих эритроцитов нагруженных ЛПНП, ЛПОНП н ЛПВП о поноыыв хлорида хрома- О степени взаимодействия /111 и СРВ суди, л по титру агглютинации нагруженных эритроцитов» При отсутствии агглютинации эритроциты отмывали о поноигью трехкратного цеитри-фугкрсюанья и обрчботыпали ангисывороткой к СРВ* Это позволяло

- »о -

Наши данные укаоывапт на то« что ФЧ-специфнчжые сайты« от которых зависит взаимодействие с фоофолмпидани ЛП, ^ молекулах свободных суб-ьединнц СРБ открыты« чей и объясняется независимость их связывания о /Ш от кальция.

Различия в проявлениях взаимодействия с ЛП пентаперного СРВ и его свободных субъединиц доставляют предположить и водее активнун роль последних в процессах петаболизиа« клиренса а депозиции ЛЛ, в которых участвует этот белок» Поскольку освобождение субъедиыиц СРВ повет сопутствовать состоянии воспаления - как локальное или общее явление« - нояно думать, что воспалительны? процессы чреваты усилением колплексообраооваиня нежду субтюдииыцаии СРБ и ЛП и возможностью отлоа^нии комплексов в тканях и стенках кровеносных сосудов.

Полученные данные позволяют рассматривать суб-педкница СРВ как потенциальный атерогенныи фактор, обладающий более яоцной антмлилопротеиновой активность» по сравнен«» с гативныи ^.РВ-

Основыые закономерности вэаинодействия СРВ о Ш1 была подтверждены с поноыыо М<рМ« специально адаптированного для этой цели. Кроне того« зтки методом было подтверждено« что в связывании с ЛП участвуют фХ-специ^ачные сайты СРБ.

Таким образои« результаты ИфП и РПГА в целоя привели к одинаковому выводу« который состоит в тон« что: 1> С-реактивней белок взаимодействует не только с ано В-солераавшяи ЛП (ЛПОНП а ЛПНП>, но и о ЛПВП« 2) ионокеры СРБ не отличамтся в этой отношении принципиально от пентаверной формы и« так ве как пектанер, способны взаимодействовать со всели тремя классами ЛП.

В следующей серим опытов пышем сВА двукратно иммунизировали С-реакчивиыи белкой (100 гост/пышь« в/6) или инлуннын комплексом, сформированный СРБ и ослиными антителани к СРВ. В каждом случае материал вводила с ПАф и без него. Контрольные иыши получали ЧГГ мл* оабуференный «$иииолагический раствор (ЗФР> . - также с ПАф а без. На 22 сутки у мыыей исследовали спектр антител к нескольким антигенам- Из табл. 3 видно, что после введения ОЗ1 наряду с антителами к СРБ, у пыыей появлялись антитела к ЛП. Анти-ЛП антитела выявлены ко есен трем классая ЛП человека - ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП« а такае к бетам пре-бета-ЬП кы-ын. Потно такие видеть« 1-го условия индукции АТ к ЛП человека и ау™о-ДТ к ПП пыын отличаются. При запуске- первых СРБ э»Фек-

п-СРБ ЛП -ЭВ ОТ1ШВй/х| пооде чй'О яшж^бБроолай б рдбсрвппз Р А 2В ®— дением антисывсрогкк к СРВ« ы» рвегврвмвамзт о коагпадльяавшя ЛП-ЭБ. Реаулъта-гь-, приввдваны® » оаадечгадьатаи1 о

тон« что п-СРБ в В5Х еду чаев связывается а ЛП, »то с*шш»м

ТаЗлииа 2.

Частота связывания п-СРБ с ЛИ м ЗС, происходящего вея апгдати-нацмм ЛП-эритроовтов, и имоиоап омш-иям от ионов кальция •

Класс липо- В присутст- Вао

протеидов вия иовов иовов Всего

на ЭВ кальция кальция

АПОИП 2/2 2/3 4/5

«ПНИ о п 0/1 »/3

ЛПОИП/ЛПНП 2/2 О/! 3/3

ЛПВП 2/2 О/1 2/3

Всего 6/7 2/6 В/13

85,7К 33,3* 66. 7%

¡зависит от ионов кальция и харштерюягго отсутствием избирательности к классу ЛП.

Сравнение подученных данных о данмыжи литературы воэпоино днш> в той части, которая касается пентаиериого СРВ • Здесь ложно констатировать совпадение наших результатов с выводами« к которых пришли другие авторы относительно зависимости взаи-иодейстиия СРБ с ЛП от иомов кальция, и в части взаимодействия п-СРБ не только с бета- и пре-бета-ЛП, но и с аль*а-/Ш-

Взаимодействие с ЛП хонокерной Форяы СРВ в литературе не освецено- Этот вопрос подмят нави впервые- Результаты мсподъ-аиваннмх методов приводят к одному и тому хе выводу: суб-ьедя-ницы ие требумт присутствия ионов кальция, ней отличаится от мативного СРБ, и могут рассматриваться как универсальный, кальций-независимый лигаыд для всех основных классов ЛП.

Из литературы известно, что моим кальция ие принимает непосредственного участия в реакции СРБ с ЛП, а лиыь являится кофактирон, подулируицим конфориацшо молекулы СРБ таким образом, что она приобретает способность к взаииодейотвии с /\П>

ях п-СРВ реагировал о ЛПОНП о присутствии ионов кальция« Иная картина наблидалась с и-СРВ, и здесь овратиамт на себя внимание три обстоятельства: а) значительно более высокая чаотота реакций ЛП с иСРВ (33 случаев из 13, или 77,8«; табл.1>; б) отсутствие какой-либо избирате«>ности к классу ЛП и в) независимость взаимодействия от ионов кальция• нСРВ реагировал приблизительно о одинаковой частотой о ЛПОНП, ЛПНП ч ЛПВП как в присутствии ионов кальция, так и без него (либо в присутствии ЭЯТА)•

Таблица 1

Взаимодействие СРВ с липолрогеииами (по данным ~>ПГД) -

Класо липо-протеинов форма СРВ!

пСРВ МСРВ

Са без Св Са беа Са

ЛПОНП Л1ГЯП АПОНП/ЛПНП ЛПВП 2/5 0/10 О/Ю 0/11 нд 0/3 0/1 0/11 5/6 3/& 2/2 10/13 1/1 3/3 1/2 10/12

В о е г о ! ЛПОЯП*ЛПНП 2/13(13,3*) 0/24 < 0«) ЛПВП 0/1 0/11(0«) 0/9(8В,9«) 16/22(72,7*) 1/2(30,0)1) 10/12(83,3«)

все классы: 2/16(12,3*) 0/33(0«) 2/31 (3,9«) 4/11(81,8«) 26/34(76,3«) 33/43 (77,8«)

Примечание к табл•1. В числителе - число опытов, в которых п-СРВ или и-СРБ взаимодействовали о ЛП-ЭБ, в знаменателе -число проведенных опытов; "нд"- нет данных*

Контролен в описанных опытах служили ЭБ, не подвергавшиеся наг&лзке липопротеинаии• Ни п-СРВ, ни п-СРБ не аггАктировали их* Т.о., Феномен агглютинации препаратами СРВ эритроцитов, нагруженных ЛП, специфичен в отношении ЛП. В тех случаях! когда СРВ не агглютинировал ЛП-ЭВ, прореагыропавмие с п- или

рана, нагруженные через хлорал эсроя* смесь» ЛПОНП ш ЛПНД чело-

перенос на ннтроцелдило-зиуи мембрану

обработка ан-тнсывороткой к апо В

123 4 5 1 2 3 4 3 -

А В

Рис.1. Схема ннмунобдотикга СРВ и дипопратеннов человека. А - Электрофорез в ПААГ, окраска на бедок; В - Перенос белков на нитроцелдидоэиум мембрану, окраска антисывороткой к апо В!

1 - паркеры: а - 66 кДа, в - 43 кДа. в - 24 кЛа;

2 - ЛПОНП! 3 - лпнп; 4 - лпвп; 3 - СРВ.

века« к ноноспецифическую анти-апо В сыворот-су. Свободные ЛСГОНП ингибировади аггдитикацим вплоть до 27 кг/ид, тогда как СРВ не влиял на реакции даже в максимальной исоладованной концентрации 1 иг/ид-

Таким образен • комплекс элекгрофоретических и иммунологических иетодов позволил показать« что препарат СРВ не содержит примесей ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП•

Следумцей задачей работы было сравнительное исследование взаимодействия п-СРБ и и-СРВ с сывороточными ЛП основных классов, т.к. имеющиеся в литературе сведения по этому вопросу касаются только пентаиера СРВ, а сведения о реакциях о ЛП субъединиц СРВ отсутс"эа»т. Для изучения взаимодействия СРБ-ЛП использовали реакции пассивной геиагглмтинации и реакции преципитации в видной фазе* Изучено 12 препаратов СРВ в п- и и-форме, по 6 препаратов ЛПК.1 и ЛПОНП и 2 препарата ЛПВП• Опыты с одниим и теми ие реагентами повторяли по 2-3 раза* В табл.1 даны обобщенные результаты по изучении взаимодействия различных препаратов п-СРБ и п-СРЕ с ЛП трех классов в РПГА■ Как видно из этих данных, нативный СРВ взаимодействовал с ЛП лишь в двух опытах из 51 (т.е. в случаев). В обоих случа-

тивен только в свободно« виде (даже без ПАф), но не в виде иммунного комплекса. Это означает» что в иммунном комплексе какие-то существенные детерминанты СРВ, по-видимому 1 закрыты. Для образованна ауто-йТ к ЛП мыши, напротив! СРВ предпочтителен именно в виде иммунного комплекса. Это может объясняться необходимость» дополнительной стимуляции иммунной.системы мыым через Рс-рецепторюш механизм для преодоления барьера иммунологической толерантности к ауто-антигенаи• Нужно отметить, что выявление у ныыей ауто-АТ к ЛП представило известную трудность <в РПГА ауто-АТ не выявлялись, хотя их удалось обнаруиять в РСК1 табл■3). Это можно объяснить тем, что ауто-АТ связывамтся о ЛП в крови мышеи м в свободном виде могут быть обнаружены лишь в случае их избытка, как, вероятно, и было при иммунизации мышей СРВ в составе инауиного комплекса. Более детально »

чолроо об аутоаятит^лах рассмотрен ниже.

Таблица 3.

Рпертуар антител, индуцированных у милей СВА введением очищенного СРВ ( РПГА, РТПГА)•

Иммуни- Уровни антител ( 1од2 титра) к антигенам:

зация

СРВ ЧГГ /мЮИП ЛПШ1 ЛПВП ЛПм 1дк 1до ЭБ

СРВ 0 0 12,Ох 1,0х 0 о 0 О

СРБ+ПАЧ 0 0 10,8+0,5 1 1 ,Ох 3,3х 3,3х 0 0 0

ик 0 0 0 О 0 3,3х о 0 0

ИК+ПАф 10,3+0 0 0 О 0 4, ах о с о

мгг 0 0 0 О о о 0 о о

ЧГГ ПАф 0 9,3+0 0 "о о о 0 о о

ЗфР 0 0 0 0 0 о 0 0 о

ЗфР ♦ ПАф 0 0 0 о 0 0 0 0 о

Примечание, х Пулы сывороток. ЛПШ1, ЛПОНП и АПВП - АП человека. ЛПм - смесь ЛПОНП и ЛПНП ныией СВА ■ Iд.;, 1чо - иммуноглобулины кролика и осла, сосгтг; ~тственно. Антитела к ЛП мыши вмяв л, лы в РСК. ИК - мннуниый комплекс СРВ с ослиными антителами к СРВ (преципитат) ЧГГ - человеческий гамма-глобулин. 3<№ -забуференныи Физиологический раствор. ЭБ - эритроциты барана. ПА? - полный адмланг Орейилв •

- 12 -

Учитывая иитогенность пеитаперного СРВ « полеченный (■наши ШФаиш антител к ЛП под влияние« ваедеавя CPS иоаяо выдо связать о полккдонадьныи механизмом активации imiUHot оястекы. Чтобы проверить это предполо>ение, в сыворотках вышей, получавших инъекции CPБ» были мсодедованы антитала к другая ан-тягенаа. Как видно из табл.3, антител к таичп аиткгекая, как ияяунагдоГудины человека, кролика я осла« а также к зрвтроцитаи варана« СРВ не индуцировал• Это отавит под сомнение возможность действия СРВ как лоликлонального активатора« а результата других опытов« приведенные ниже, на нам взгляд« нскдичавт этот пев

хшпая>

ТаЗлица 4»

Кндукиив у ятей СВА антител к ЛП введением лентавера СРВ и aro оубиедикиц.

Икнуни-оацня я Уровни антител (1оу2 титров ) к антигекакг

к ЛЯ человека к ПСРБ С>

п-СРВ ♦ ПА« 13,3 * О,4 3,5 « 1,2

■-СРВ + ПА« Í 12,2 ♦ о,а 2,2 •» 1 «4

3W> ПА« 9 О 0

Пользуясь тем « что в отличие от .дативного пент первого СРВ« его свободные сиб-ьединииы не обдадамт митогенностыо (П-Г-Назаров и соавт.,1993)« иы сравнили з*4ект п- и н-форкы СРВ при введении мышам и кроликам. Как следует из табл.4, п-СРБ и и-СРВ не отличается по способности индуцировать иммунный ответ на ЛП. Пооле введения ныиа.< п- и м-СРБ уровень АТ к снеси АПОНП я ЛПНП был практически одинаков.

Сходные результаты получены и на кроликах, что показано в табл-3. Как пентаиер СРВ« так и его субъединяиы индуцировали синтез АТ к дилолротеинаи« однако повышения уровня антител к таким антигенам« как эритроциты барана ОБ) и карднолипину <КЛ> при этом не происходило. Т.о.« и у кроликов, получивших СРВ« признаки по л «клопа ль ной «активации иммунной системы отсутствовали. И хот« м- и п-СРБ отличались в антигенном отношении) что проявлялось избирательность» антител, индуцированных

Табдяца 3-

Индукция антител к липопротеинам у крол>..сов, инмуниэиро-ванных С-реактивным белкси человека.

ММ кроликов Иммуноген Уровень АТ к указанный аитагевая до ■ после ияпуиаоацам (татр >

п-СРВ до после и-СРВ до после ЛПч до после КЛ } ЭВ до тюле!до посла

■911/1 •911/2 911/3 911/4 в-СРВ п-СРБ п-СРВ п-СРВ 0 32 0 480 О 7680 0 3840 0 1*920 0 480 0 19 0 10 2 4ВО 0 2360 0 3840 О 3840 0 0 0 О 0 о 0 о 0 0 о о 0 С -0 ' 0

кавдым из них, к "своему" ипнуногеиу, это почт и® аправюдаэоь на тиувноа ответе к ЛИ. вровень антвтвл к N1 но оааве®д от «ронш антител к м- ала п- СРВ (табд.З). Т.о., котюАвшв сва»-та па шаш а кроликах» проведенные о цеды* аиаснипа ролы вя-тогек.ностм СРВ в индуцируемом этим бедкоп ответе иа ЛПо поаэо-ляет ^акимчить, что нитогенность СРВ и ее оледствие - лодикдо-нальная активация иммунной системы - не являмтся решаюя «акторов в процессе индукции антител к дапопротеиная под млаянаея С-реактивного белка.

Для животных« получавших СРВ, было характерно появление циркулирующих антител« реагирукиих о ЛП разного валового проаохож-дення. Так« у кроликов, иммунизированных препаратаии певтавер-ного СРВ или его оубиединицаяи« выявлены антитела к ЛП человека и мыши« а также к ЛП сивого кролика, прячея асе эти -¡нтитела, вк/мчая ауто-йТ, удавалось регистрировать в РПГА. В табл.6 приведены титры антител этих аивотных к ЛП человека, пыыи и кролика- Последние представляет собой не что иное, как а'лоаитчтеяа, а их присутствие в сыворотках а высоких титрах свидетельствует о том, что они не связаны антигеном по причине избытка по отношении к ауталогичныи ЛП. факт наличия аутоантя-тел указывает на то, что индуцируенын С-реактивнын белкой

иммунный ответ к липопротеинам является« no существу,

Таблица 6•

Антитела к ксеногенныи ЛИ и аутоантитеда к липопротеинаи в сыворотках кроликов, иммунизированных С-реактивяыв бедкой (РОГА)

ММ кроликов Иммунизация Обратные титры антител к ЛП!

человека кролика мыши

911/1 »СРВ 4В0 480 30

911/2 нСРБ 2360 2S60 3840

911/3 пСРБ 3840 >00 80

911/4 пСРВ 3840 20480 960

аутоиммунный процессом« До начала иммунизации антитела к ЛП у всех этих животных отсутствовали ( см• табл• 5 >.

В сыворотках кыией, .получивших СРВ» при использовании РПГА аутоантитеда к ЛП не выявлялись, а в РСК выявлялись в низких титрах (табд.З). Очмтывая, однако, что в аналогичных условиях у кроликов аутоантитеда к ЛП формировались (табл» 6)< неудачи о мышиными сыворотками, вероятнее всего, следует объяснять тем, что mm прсдуцирумт такие ауто-АТ в пеныннх количествах, к s сыворотке они находятся в связанном состоянии за счет взаимодействия о собственными ЛП.

Подобный фгиоиея набдидается у человека, В сыворотках больных атеросклерозом выявление аутоантител представляет известные труднооти: они обнаруживаются крайне редко и в низков титре. Дли решения вопроса os аутоантителах к ЛП у кыией нами был использован метод локального гемолиза в геле по Ерне. Мышей СВА, самок, иммунизировали в/б, двукратно. При первой иммунизации одной группе вводили ЛПОНП человека <100 ккг/кышь) в смеси о ПАФ- Контролен олужили ныии, который вводили ЗфР о ПАф. Повторную иииунизацшв проводили через неделя тем же антигеном в в тон же количестве без ад-ьнванта. Материал от животных исследовали через 8 дней: сыворотки - в серологических реакциях, клетки селезенки - в реакции локального гемолиза по Ерне- Эритроциты барана предварительно нагружали ЛПОНП человека или ЛПОНП от сингенных мышей СБА, Результаты опытов показа-

ли, что при иммунизации мшей СРВ образуются антитела как к липопротеинап человека, так н к липопротемиаи яымж. При этап s селезенке шшей присутствовали клетки образуй и)ие антитела к ЛП обоих видов Igtl к IgC классов. Сыворотки этих яышей были исследованы в РПГА с ЗБ, нагруженными ЛП человека ■ мыши< В сыворотках аутоантител к ЛП обнаружено не было» Это говорит о правильности предположения о связывании аутоантител о лжпопро-геинанин в процессе инлунного ответа к СРВ. В то же вреня у пышен, иннунизированных ЛП, антитела к АЛ человека выявлялась в 93Х случаев, антител* к ЛП кыим - в 25Х случаев.

Таким образом, введение С-реактавного белка вызывг"?т э животных аутоиммунный ответ против ссботвеяных шопротевпяд сопровождающийся появлением в селезенке ш>етсж-«я*жтедвЩ10дя-центов, а в сыворотке - циркулиружмих аутоаитгат«.;:.. Раз-.лчза пежду кроликами и мышами, касамцжеся обяаруаевяв гжчваляшк аутоантител в сыворотке, можно объяснить различивши в уровге их продукции и степени связывания циркулирующим аутоантмгеааям»

Одной из причин появления у хивоткых под вдшянаев СЗ>Б антител, реагирующих о ЛП человека, могло баггь азпгганвоо сходство /Ш имиунизмруеиых животных о ЛП человека а эододствяэ этого образование аутоантител, способные к паргаретгои реахца-ем с ЛП других видов. Для лрпверкм этого предподояешвя баш •>соле»оваиы перекрестные реакция между ЛП человека, нише я кролика о применением двух методов: РПГА и РГПГД- Данные табл-7 пэкаоыэамт, что пуд мышиных аятисывороток к ЛП человека взаино-действует с ЛП человека я кролика, не взаимодействуя о ЛП пиши. В то не вйена кроличья антисыворотка к ЛПОНП человека реагирует а ЛП человека и мыши, но не реагирует о гомологичными кроличьими ЛП« Т.о., серологическое сходство меядд ЛП человека, кролика и нышв дейо-вотельно яяеет место.

В целом, полученные данные подтв"зрждамт наме предположение г том, что а--тоимяумный ответ, вызываемый у животных введением СРВ, сопровождается продукцией антител к различным эпя-топан аутоиогичных липопротеинов, в топ числе и к такия, которые идентичны или сходны у данного животного с другими иявот-иыям и человеком. Аутоантитела к уникальным детерминантам ЛП, присушил только данному виду, по-видимому, связываются в организме животного илбыткон аутоантитена <в наиих опытах это чаче

Таблица 7.

Перекрестные реакции антм-ЛП сывороток о ляпопротеинами различного видового происхождения (обратные титры РПГА).

Антисыворотки Вид ЛП на эритроцитах

АО человека АП 1ШШ АП кролика

кьши к АЛ человека кролик« против ЛП человека морок-св. против ЛП кролика* 1280 204800 0 0 6400 0 480 0 2560

Примечание' «Препарат любеоно предоставлен д.м. н. А.Д■Денисенко i отдел биохимии Института экспериментальной медицины РАМН, СП6-

и полнее происходило у кшеи>, тогда как антитела к перекрест-нореагирумчин детерминан.а* остаются несвязанными я могут быть выявлены в сыворотке серологическим! нетодааи. Этот жехавмзя

Таблица В-

Антитела к СРВ человека ш сыворотках яыыей, мяяунизаро-ваыных ШЯ>

Иммунизация Предварительное аведение СРВ Уровень AT <1од2)

к СРВ к ЛП

/ШИП ♦ ПА» АПНП * ПА« ♦' 4,7 » 1,8 6,0 «■ 1,2 12,4 * 0,5 13,6 + 0,4

позволяет объяснить, почему после введения СРВ у животных циркулируют антитела к лнпопдотеинап чужого вида.

В следумиеи серии опытов была изучена возможность обратного процесса - индукция антител к СРВ введением липопротеи-лов. ffcfliieft СБА двукратно иммунизировали в/6 ЛПНП человека в дозе 10 ккг/яышь с ПАф. Результаты (табл.8) показали, что введение чистых ЛПНП <без СРБ1 приводит к появденн» антител как к

ЛП, так и к СРБ, причем уровень антител к СРВ лишь незначительно возрастает» если впесте с инъекцией ЛП животные получали СРБ. Было установлено, что при двукратной иммунизации нишей ЛП человека антитела к СРБ появлялись I начиная с дозы ЛП 1 пкг на мыыь.

Такин образом, пожно констатировать, что введение животным очиценного человеческого С-реактивного оалка приводит к индукции спектра антител к лмпопротеинам. Эти антитела реагируит. во-первых 1 с -■ииопротемнапи всех трех классов, во-вторых, - о ЛП разного видового происхождения. С другой стороны, введение жыеотнып липопротеинов человека индуцирует обратный процео -образование антител, реагирующих о СРВ.

Один из механизмов этого феномена может быть объяснен "шлепперной" функцией чужеродных ЛП и СРВ, в основе которой "•ежит сродство ЛП >; СРБ друг к другу» Например, при введении животным ксеиогенного СРВ этот белок связывается с ЛП нмнуяизи-руеиог ^ животного и тем самым модифицирует их структуру, придавая липопротеипам аутоамтигенность* Это приводит к развитии инлунного ответа одновременно на чужой СРВ и модифицированные собственные ЛП. По этой схеме, по видииону, идет развертывание иммунологнчески^. реакций и при введении жжвотяыи ЛП человека. У мышей, в отличие от человека и кролика, С-реактмвныЛ белок в норне содержжтся в крови в высокой концентрации, повышаясь в острой Фазе воспаления незначительно <в 1,5-4 раза). В случае иммунизации ничей человеческим ЛП это обстоятельство может способствовать быстройу комплексировапм» ЛП с СРБ мыши о индукцией иммунного ответа на оба компонента.

Вместе с тек,не может быть ясхличен а другой механизм перекрестной индукции антител к ЛП С-реактивным белком и наоборот | - антиидиотипический•

Что касается ЛП другого видового происхождения, то АТ к сщ после введения СРВ выявлянтся у мыией я кроликов за счет антигенного сходства этих ЛИ между собой и. перекрестной реактивности акги-ЛП антител с ЛП аэных видов.

V шгыная сродство СГБ к ЛН, можно было предполагать, что СРБ ивь'рт илиотипическ ь овиность и с антителами к бета-липопроте-*»чц. Длч проверки предположения о наличии у С-реактжвиого белка 1Нгигс-нкых дечерлиу нт, обши'х с антителами А лилопротеинам I II. ко-реаг>^ -»го ндхотипа I, была использована антии-

даотшическаа антисыворотка (ЙИА) I подученная иниуназацтей кроликов гавиа-гдобудинон из антисыворотки к ЛПНП человек*. АИД N66 была получена и любезно предоставлена мая к-б.н- о.н-с. Л.С.Косицкой (отдел иннунологин ИЭИ РАНН>> Оценку ее специфичности проводили с ишшльэоеаниеи РГА» РОГА а РГПГА.

Таблица 9.

Взаимодействие СРВ о антиидиотипическинв антителами-< аити-анти-ЛПНП)

Исоледуеиые Серологи- Наличие взаимо- Титр

антигены ческая действия АИА с АИА

реакция сказанными Аг

ЛПОНП РПГА - 0

ЛПНП РИГА - 0

ЛПВП РПГА - 0

АТ к ЛПОИП РТПГА - 0

АТ к ЛПНП РТПГА ♦ 1:ю

АТ к ЛПВП РТПГА - 0

Я-СРВ РТПГА 1:64

эв РГА - о

Как показывает табл.9, антиидмоткпическая сыворотка эффективно ингибировала РПГА, когда аггдмтчвирувцин агентов эритроцитов барака« нагруженных смесь» ЛЛОНД и ЛПНП человека, был и-СРВ. Это свидетельствует о той 1 что СРВ (по крайней вере, его оуб-ъединиць»> несет идиотия, сходный о иднотмпом антител к ЛПОНП. Такии с^бразон, полученные данные свидетельствуют о наличии у СРВ антагенкых наркеров, об^их с антителаяи к бета-АП. т.е о наличии у СРВ перекрестно-реагируииего идиотина антител к ЛП.

Одной из задач работы было изучение вопроса, индуцирует ли СРВ образование антител, которые являются антииднотипическини по отноиенки к анти-ЛП антителам- Исследование проведено на мышах СВА, сыворотки которых исследовали на наличие антиадао-типических антител по способности блокировать антитела к ЛП в РТПГА. Результаты показали, что введение СРВ сопровождается индукцией антиидиотипических антител.

Такии образом> введение СРВ вызывает комплекс иммунологи-

Список работ, опдйдштмшх по те не диссертация •

1. Назаров П.Г•«Полевиаков А-В.,Берестовая Л.К.«Петров И.В.

Пояояарен.чо В.В. Характеристка антигенных ■ цмтотропных свойств С-реактивного бедка.// Ваддетевь эксперияеитадьвой био-догни ■ педицкны. -1993.-П16,1.12.-С.609-611.

2- Nazaro-» P.C-, KossitsVaya L.S., Petrov I.V., Berestovaya L.K., Oenisenko A-D. Antibodies to plasma lipoproteins induced by C-reactive protein.//Abstr.62nd EAS Congress« Jerusalea, 1993, P.90.

3« Nazarov P-e-, PetTOV I.V., Kossitslcaya L.3., Berestovaya L-K., Den 1eenVo A.D. Evidence for a possible role of C-reactive protein (CRP) la a regulatory circuit controlling iввелоlogical reactions to pi asna lipoproteins < LP).//XV Intern. Congr. of Clin- Chea., Mov. 14-19, 199^, Melbourne, Australia, P.343.

ческих последствий, сопровождавшихся продукцией антител к ЛП а соответствующих антжиднотипнческих автжтел■ 8а основания подученных результатов к данных литературы пожне реконструировать последовательность реакций в ствет на введение СРВ-Сначала возникают антитела к самому СРВ , среди которых додана Выть популяция, специфичная к перекрестно-реагнружиеиу идиотипу СРВ. Благодаря сходству этого идиотипа с идиотипои антител к ЛП, эта часть анти-СРВ антител оказывается носителев аитвждиотяхш-чеекмх свойств и может вступать во взаиводействие как о антителами к ЛП соответствтлилего идиотипа (1п VI то, если таковые имеются в организле, и ¡л ч^ро), так и с иикуЕсконпете ткикл клеткани, несущими ооответствуяций ждиотап яа озспх рецепторах- Воздействие на иииунокоипитевткые клетки Емгмвает егхдикцию нового иммунного ответа о продукцией штатах к МВ» иогя-тжвных по данному идиотипу• Воссоздавав этой шеодедоватгелъ-ноогя в эксперименте дело будущего, однако основные Факты -СРВ-зависимая продукция антжтед я антмиджотисически^. ьатител к ЛП - аргументированы полученными данными.

Обсуадая значение подученных данных для ватологии человека! иозно предполагать, что антиидиоткпяческий вехашивш кндук-цвы антител к лкпопротежиам С-реахтаиша белков маш возюо-вен г острой фазе воспалытелъиих реакций, сопровождавшейся <>истр..х и значительным подменой уровня СРВ в крови*

ВЫВОДЫ

1. С-ре. стивкыи белок и его сув-ьединкцы фосфоржлхо-лин-специфично овязывамтся с липопротежнамж трех основных классов (иозкой, очень низкой ж высокой плотности), ■ обладаит адагатнпок антжтед к липппротеинам.

2« С-реактввнын белок и липопротгчны при введевии животным вызывают образование антител в антжждиотжпвчеоких автжтел друг к другу.

3- Антилипипротеиновые антитела, образующиеся в ответ па введение С-реактивного белка, являются аутоантитедаии к липоп-ротеинам исследуемого жжвотного-

4- С-реактнв1шй белок является фактором, индуциружижм аутоиммунные реакции против липопротеинов•