Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Липопротеины плазмы крови: транспортная система для биологически активных веществ и ксенобиотиков

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОМОРФОЛОГИИ

На правах рукописи

Поляков Лев Михайлович

ЛИПОПРОТЕИНЫ ПЛАЗМЫ КРОВИ: ТРАНСПОРТНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И КСЕНОБИОТИКОВ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск -1996

Работа выполнена в Институте биохимии Сибирского отделения РАМН

Научный консультант: Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Л.Е.Пашш

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.КХКуликов доктор медицинских наук, профессор Т.А.Короленко доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Маянская

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Защита состоится «ий- И^с^о//у*-!^ 1996г. в && час. на заседании Диссертационногб совета Д 001.40.01 в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимак;ова, 2; тел.: 83832-32-31-56, факс: 8-3832-32-43-39)

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО

РАМН

Автореферат разослан

Ученый секретарь Совета доктор биологических наук

Е.Л.Лушникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема транспорта биологически активных веществ и лекарственных препаратов с целью увеличения терапевтической эффективности и ограничения побочных эффектов является одной из центральных в современной медицинской биотехнологии. Это связано с тем, что используемые в настоящее время переносчики должны отвечать целому ряду признаков и способствовать решению сложных задач. Во-первых, попадая в организм биологически активные вещества (БАВ) и лекарственные препараты очень быстро разрушаются в печени в системе метаболизма ксенобиотиков, полностью так и не реализовав своего лечебного действия. Во-вторых, у многих людей к лекарственным препаратам развивается лекарственная аллергия и длительное введение их, особенно в больших дозах, оказывается невозможным. В-третьих для лечения ряда патологических состояний (опухолевые процессы, ферментативная, гормональная недостаточность, и т.д.) обязательно необходима доставка лекарственных препаратов непосредственно в клетку, что связано с преодолением клеточного барьера. В-четвертых, эффективные переносчики необходимы для транспорта генетического материала в ядра клеток.

Особое место среди возможных переносчиков лекарственных препаратов занимают липопротеины (ЛП) плазмы крови. После открытия рецептор-опосредованного механизма поглощения ЛП клетками американскими учеными Брауном и Гольдштейном в конце 70-х годов внимание к этим структурам, как потенциальным переносчикам лекарственных препаратов, сильно возросло. Липопротеины представляют собой одну из самых больших групп сложных плазменных белков крови. ЛП впервые были описаны Машбефом в 1929 г. Было показано, что это сложные молекулярные ассоциации, состоящие из белка и липидов. ЛП осуществляют транспорт липидов из мест их всасывания и синтеза в жировые депо или другие органы, а также обеспечивают нормальный об-

мен липидов между кровью и клетками организма. Это, пожалуй, основная роль ЛП.

Однако повышенный интерес исследователей к этим структурам вызван, как оказалось, и другими характерными свойствами, среди которых можно выделить следующие: ЛП осуществляют регуляцию обмена холестерина не только в плазме крови, но и посредством рецепторов внутри клетки; ЛП оказывают влияние на функцию эндокринной системы, в частности, на стероидогенез; ЛП являются одним из регуляторов клеточного иммунитета и, наконец, нельзя не отметить появившиеся в последнее время данные о способности ЛП связывать и транспортировать в клетку некоторые гидрофобные соединения.

Прояснилась роль некоторых внутриклеточных белков в связывании и транспорте ксенобиотиков метилхолантрено-вого ряда (тетрахлордибензодиоксина и бензо(а)пирена). Soues и соавт. (1989) удалось выделить из цитоплазмы рецептор Ah с молекулярной массой 90 кДа и белок 4S, с высокой специфичностью связывающие соединения метилхолантре-нового ряда. Оказалось, что рецептор Ah (aryl hydroxylase receptor) регулирует также индукцию цитохрома Р-450, в частности, форму CYPIA1, метаболизирующую ксенобиотики метилхолантренового ряда в печени и стенке аорты крыс (Thirman е.а.,1994). Предполагается, что многие полициклические соединения на этих первых этапах индукции ферментов микросомальной системы окисления ксенобиотиков связываются с рецептором Ah, затем комплекс переносится из цитоплазмы в ядро.

Несмотря на успехи, достигнутые в изучении внутриклеточных рецепторов для бензо(а)пирена и других ксенобиотиков метилхолантренового ряда, рецепторов для них на поверхности клетки выявить до сих пор никому не удалось. Таким образом, механизм проникновения соединений типа бензо(а)пирена в клетку остается неясным. Остается практически невыясненным вопрос, каким образом такое гидрофобное соединение как бензо(а)пирен транспортируется из легких в клетки печени, сосудистой стенки и других тканей.

Не меньшее внимание исследователей направлено на идентификацию макромолекул, связывающих стероидные гормоны в крови, в надежде выявить специфические метаболические пути доставки и попадания гормонов в клетки. Идентифицировано несколько плазменных белков, которые специфически или неспецифически связывают стероидные гормоны (транскортин, сексстероид-связывающий глобулин, альбумин). Однако так и не удалось выделить мембранные рецепторы для свободных стероидов или же их комплексов с белками, хотя расчетные данные в координатах Скэтчарда свидетельствуют об их существовании на мембранах гепато-цитов (Панин Л.Е.и др., 1992). По-прежнему наиболее популярной на сегодняшний день остается модель простой пассивной диффузии свободного стероида через клеточную мембрану (Рагс1пс1§е, 1981; 1985). Эта модель полностью исключает рецептор-опосредованный механизм проникновения гормонов в клетку.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить роль липопротеинов плазмы крови в транспорте биологически активных веществ и ксенобиотиков в клетки организма.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Изучить динамику и особенности процессов поглощения ЛП различных классов плотности органами и тканями крыс.

2. Изучить внутриклеточное распределение меченных по белковому компоненту ЛП плазмы крови крыс в зависимости от функционального состояния организма.

3. Провести внутриклеточную иммунохимическую детекцию некоторых аполипопротеинов в клетках печени крыс. Для достижения этой задачи необходимо было провести оптимизацию метода твердофазного иммуноферментного определения аполипопротеинов, включая получение соответствующих антигенов и антител, выбор рабочих режимов, а также способов химической обработки биологического материала для более полного выявления антигенных детерминант.

4. Изучить роль ЛП в транспорте биологически активных веществ (стероидные и тиреоидные гормоны).

5. Изучить взаимодействие гидрофобных и гидрофильных ксенобиотиков с ЛП плазмы крови.

6. Показать роль отдельных аполипопротеинов в связывании биологически активных веществ (стероидные гормоны, тироксин) и липофильных ксенобиотиков (бензо(а)пирен). Для этого на изолированных, хроматографически очищенных аполипопротеинах изучить механизмы их взаимодействия с названными лигандами и получить основные физико-химические характеристики белок-лигандного взаимодействия изучаемых комплексов.

7. Используя ЛП в качестве транспортной формы для различных гидрофобных лигандов изучить поглощение и распределение этих лигандов между органами и тканями крыс.

Научная новизна. В опытах in vivo и in vitro впервые показано, что после поглощения меченые белковые компоненты ЛП связываются с различными клеточными структурами: ядрами, митохондриями, лизосомами, микросомами. Отмечалось перераспределение метки в зависимости от функционального состояния организма. В частности, физическая нагрузка снижала поглощение печенью ЛПНП и увеличивала поглощение ЛПВП надпочечниками. Накопление метки наблюдалось в цитозоле и во фракции мелких мембран. Корти-зол увеличивал включение меченых ЛПОНП в митохондрии печени. Адреналин повышал содержание меченых ЛПНП во фракции крупных клеточных мембран и снижал уровень меченых ЛПВП в митохондриях печени.

Выявлена селективность поглощения меченных по белковому компоненту ЛП органами и тканями: из 12 исследованных тканей ЛПОНП больше поглощались печенью, а ЛПВП -надпочечниками. Это позволяет использовать различные классы ЛП для избирательного транспорта лигандов в определенные органы.

Опыты с меченными коллоидным золотом частицами ЛПВП показали, что ЛПВП связываются с рецепторами на

поверхности макрофагов и эндотелиальных клеток печени. При этом, только в макрофагах осуществлялся транспорт ЛПВП-конъюгатов в лизосомы, т.е., по-видимому, именно в этих клетках происходит ферментативная модификация ЛПВП. Эндотелиальные клетки связывают и интернализуют частицы ЛПВП, а также осуществляют их активный транспорт в пространство Диссе печени.

Для проведения иммунохимических исследований выделены и хроматографически очищены апоА-I, В и Е плазмы крови человека и крысы. Полученные специфические антитела к данным белкам показали иммунохимическую гетерогенность апоА-I и В у человека и крысы. Видовой гетерогенности не отмечено для апоЕ, что позволило использовать антитела к апоЕ для исследований как на крысином, так и на человеческом материале.

С целью выявления скрытых антигенных детерминант апоА-I в частицах ЛПВП предложен новый метод химической обработки биологических образцов с использованием диметилсульфоксида.

Проведена характеристика и иммунохимическая идентификация цитоплазматического пула апоА-I в гепатоцитах крыс. Методом иммуноэлектроблоттинга в цитоплазме выявлена изоформа с молекулярной массой порядка 31,5 кДа, которая является предшественником внутриклеточного синтеза этого белка, т.н. препроапоА-I. Другая полоса по элек-трофоретической подвижности близко соответствовала зрелой форме апоА-I. Впервые показано присутствие двух белковых фракций с молекулярными массами около 26 и 23 кДа, являющихся, по всей вероятности, продуктами лимитированного внутриклеточного протеолиза.

Показано присутствие белков, иммунохимически идентичных апоА-I, в хроматине ядер печени крыс. АпоА-1-иммунореактивность выявлялась во фракции суммарного хроматина, транскрипционно неактивного хроматина, тран-скрипционно активного хроматина и ядерного матрикса. Удельная апоА-1-иммунореактивность транскрипционно активного хроматина и ядерного матрикса была вдвое выше,

чем суммарного и транскрипционно неактивного хроматина. С помощью иммуноэлектроблоттинга обнаружено две фракции белка: первая фракция - с молекулярной массой, соответствующей апоА-1 (28,3 кДа); вторая фракция - с молекулярной массой около 14 кДа. Первый белок присутствовал в транскрипционно активном хроматине и ядерном матриксе. Второй белок - только в транскрипционно неактивном хроматине. Предполагается определенная роль аполипопротеи-нов в поддержании хроматина в транскрипционно активном состоянии, а также участие аполипопротеинов в транспорте в ядро некоторых биологически активных веществ и ксенобиотиков.

Впервые подробно изучен целый спектр биологически активных веществ и ксенобиотиков, способных связываться и транспортироваться с ЛП. Это стероидные гормоны, тироксин, дигидроальпренолон, цитохалазин, актиномицин Д, бензилпенициллин, бензо(а)пирен, бензантрацен .

Для доказательства возможности селективной доставки лигандов к органам и тканям-мишеням использовали меченый тритием бензо(а)пирен, а также такие естественные ли-ганды как меченые углеродом холестерин и эфир холестерина (холестерин-олеат). Данные подтвердили результаты о возможной селективной доставке лигандов с ЛПОНП в печень, а с ЛПВП - в надпочечники.

Установлено, что ЛПВП являются основной транспортной формой холестерина и прегненолона в митохондрии надпочечников крыс. В опытах с нагруженными неэстери-фицированным холестерином и прегненолоном ЛПВП впервые показано, что, во-первых, гидрофобные лиганды в составе ЛП проникают в отдельные субклеточные структуры, а именно: в митохондрии и микросомы; во-вторых, переносимые с ЛП лиганды включаются в метаболический процесс клетки и осуществляют регуляторное влияние. Эффект проявлялся при инкубации надпочечников в присутствие АКТГ.

Обнаружено, что третий подкласс ЛПВП обладает более выраженным стимулирующим эффектом на стероидогенез по сравнению со вторым подклассом ЛПВП. Этот подкласс и

необходимо использовать в качестве транспортной формы для селективной доставки лигандов в надпочечники и, по-видимому, в яичники.

Теоретическая и практическая значимость. Внесен важный вклад в понимание механизмов проникновения липофильных ксенобиотиков в клетку. Результаты исследования позволили сформулировать гипотезу о том, что липофильные ксенобиотики и некоторые вещества гормональной природы проникают в клетку посредством рецепторно-обусловленного эндоцитоза в составе липопротеиновых комплексов.

Новый способ химической обработки биологического материала с целью более полного выявления скрытых антигенных детерминант оказался пригоден для изучения внутриклеточной локализации аполипопротеинов, а также для определения концентрации аполипопротеинов в самых различных биологических средах.

Впервые с помощью данного метода удалось оценить состояние почечного барьера у здоровых людей и у больных с почечной патологией . Присутствие в моче больных с хроническим пиелонефритом как апоА-1, так и апоВ важно не только для прогноза тяжести состояния, но также для диагностики и оценки эффективности лечения.

Предложен простой и удобный метод оценки связывания гидрофобных соединений с липопротеинами плазмы крови или с любыми другими транспортными белками. Метод позволяет количественно оценить характер взаимодействия ли-ганд-белок.

Совокупность полученных фактов свидетельствует о перспективности использования липопротеинов и их белковых компонентов в качестве транспортных форм для биологически активных веществ и лекарственных препаратов в клинических и экспериментальных исследованиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. После интернализации не все аполипопротеины подвергаются обязательной лизосомальной деградации, часть из них взаимодействует с другими клеточными структурами (ядрами, митохондриями, микросомами и цитозолем) и уча-

ствует в регуляции метаболических процессов. На распределение аполипопротеинов между клеточными структурами оказывает влияние функциональное состояние организма.

2. Предложенный метод для иммуноферментного определения аполипопротеинов пригоден для количественной оценки последних в плазме крови, моче, клетках, субклеточных структурах и другом биологическом материале. Метод может использоваться для решения как теоретических, так и клинических задач.

3. В ядерной фракции гепатоцитов крыс присутствует белок, по электрофоретическим свойствам и иммунохимически идентичный апоА-I. Удельная апоА-1-иммунореактивность транскрипционно активного хроматина и ядерного матрикса вдвое выше, чем суммарного и транскрипционно неактивного хроматина.

4. АпоА-1-иммунореактивностью в ядрах обладают две фракции белка: первая - с молекулярной массой, соответствующей зрелой форме апоА-1 (28,3 кДа); вторая - с молекулярной массой около 14 кДа. Первый белок присутствует в транскрипционно активном хроматине и ядерном матриксе, второй белок - только в транскрипционно неактивном хроматине.

5. Липопротеины плазмы крови связывают и транспортируют в клетки организма различные по структуре соединения, такие как бензо(а)пирен, бензантрацен, актиномицин Д, ци-тохалазин, стероидные и тиреоидные гормоны.

6. Основным белком, связывающим бензо(а)пирен в ЛП-частицах является аполипопротеин В.

7. Аполипопротеин A-I проявляет достаточно высокий аффинитет по отношению к тироксину и стероидным гормонам.

8. Комплексы гидрофобных лигандов с ЛП могут использоваться для их направленного транспорта не только в органы и ткани организма, но и в отдельные клеточные структуры. Переносимые с ЛП лиганды включаются в метаболический процесс клетки и осуществляют регуляторное влияние.

Апробация материалов диссертации. Материалы работы докладывались на III Всесоюзном симпозиуме "Структура, биосинтез и превращение липидов в организме животного и человека" (Ленинград, 1978), IV Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1979), Всесоюзной конференции "Структура и функции лизосом" (Новосибирск, 1980), III Всесоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 1982), IV Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Киев,1983), Всесоюзной конференции "Медиаторы иммунного ответа в эксперименте и клинике" (Горький,!983), V Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987), Всесоюзной конференции "Здоровье человека в Сибири" (Новосибирск, 1989), IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989), X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Гродно,1990), 8 Международной конференции по органической и биоорганической химии (Рига, 1991), IV Всесоюзной конференции "Люминесцентный анализ в биологии и медицине" (Москва, 1992), XII Международном конгрессе фармакологов (Монреаль, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 53 научные работы, из них 30 статей в центральных журналах. Получено 2 авторских свидетельства на изобретение:

1) А/с № 1506671 "Способ введения биологически активных веществ в организм животного" (Панин Л.Е., Поляков Л.М., Розуменко A.A.);

2) А/с № 1737340 "Способ определения апопротеина A-I в сыворотке крови (Поляков Л.М., Потеряева О.Н., Панин Л.Е., Загребельный С.Н.)

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит 294 страницы машинописи, из них собственно текст - 231 страница. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. В списке литературы приведены 35 отечественных и 450 иностранных источников.

Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института биохимии РАМН.

Автор выражает глубокую благодарность за консультативную помощь и поддержку "на всех этапах выполнения работы академику РАМН Панину Льву Евгеньевичу.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выделение липопротеинов сыворотки крови проводили методом препаративного ультрацентрифугирования (Hatch, Lees, 1968).

2. Делипидирование липопротеинов. Делипидирование проводили охлажденной смесью хлороформ-метанол (1:1) с последующей многократной отмывкой эфиром.

3. Для очистки и выделения отдельных аполипопротеинов использовали традиционную и жидкостную хроматографию высокого давления.

4. Электрофорез аполипопротеинов в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (Laemmli,1970).

5. Определение белка (Lowry, 1951) проводили с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина "Serva" (ФРГ).

6. Антисыворотки к отдельным аполипопротеинам получали путем подкожной иммунизации кроликов в разные точки спины.

7. Двойная радиальная иммунодиффузия (Ouchterlony, 1958).

8. Твердофазный иммуноферментный анализ выполнялся методом непрямого тИФА (Lin, 1986). В качестве стандартов использовались калибровочные сыворотки с известным содержанием апоА-1 (0,93 г/л) и апоВ (0,76 г/л) фирмы "Calbiochem" (США), а также препараты апоА-I, В и Е, полученные лично автором.

9. Иммуноблоттинг (Tovey,1987).

10. Дот-анализ (Hawkers, 1982) или метод "пятенного" ИФА.

11. Метод культивирования клеток печени (Seglen,1973). Работа выполнялась ведущим научным сотрудником лаборатории молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий к.б.н. Усыниным И.Ф. и научным сотрудником к.б.н. Харьковским A.B..

12. Выделение ядерных структур из гепатоцитов печени крыс (Gottesfield е.а.,1976).

13. Йодирование ЛП выполняли йодмонохлоридным методом (Bilheimer е.а.,1972).

14. Субклеточное фракционирование проводили методом дифференциального центрифугирования (De Duve е.а., 1955).

15. В опытах in vivo меченые ЛП крысы вводили в одну из хвостовых вен.

16. Опыты с перфузией печени крыс частицами ЛПВП, конъюгированными с коллоидным золотом, выполнены совместно с Усыниным И.Ф. и Провоторовым Г.В.

17. Распределение меченых лигандов между отдельными фракциями ЛП в опытах in vitro изучали методами ультрацентрифугирования, гель-фильтрации, равновесного диализа и диск-электрофореза. Радиоактивность измеряли на жидкостном счетчике "Mark-Ill" (США).

18. Количественную оценку образования биоконъюга-тов бензо(а)пирен-ЛП проводили методом целлюлозных дисков, разработанным с непосредственным участием автора (Поляков Л.М., Часовских М.И., Панин Л.Е.,1991).

В экспериментальных исследованиях использовались крысы линии Вистар. Полученные результаты проанализированы с применением t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования на животных с внутривенным введением йодированых ЛП, показали, что ЛП, введенные в кровяное русло интенсивно поглощаются различными органами и тканями (табл.1). Нами определялась радиоактивность 12 тканей и все без исключения поглощали меченые ЛП. Однако была выявлена и определенная селективность поглощения. Так из общего количества введенных в кровь ЛПОНП 44,4% поглощались печенью и только 5,1% - остальными органами и тканями. При внутривенном введении ЛПНП картина была несколько иной. В печени было обнаружено 26,7% радиоактивности, а в других органах и тканях - 17,5%. Высокое поглощение ЛПВП надпочечниками и яичниками можно объяснить тем, что эти эндокринные органы используют холестерин сосудистого происхождения для синтеза стероидных гормонов.

Скорость обмена ЛП в организме достаточно высока, что отражается на скорости поглощения их органами и тканями. Так для ЛПВП максимальное поглощение их сердцем, почками, надпочечниками, жировой тканью, мышцами, селезенкой и костным мозгом наблюдалось уже через 30 мин после внутривенного введения. Для печени, легких, яичников, тимуса и лимфатических узлов максимум поглощения приходился на 6 часов. Через 12 часов количество радиоактивной метки значительно снижалось во всех исследуемых тканях. Это означает, что через 12 часов (а период выведения для апоЛП крыс не превышает 10 часов) происходит глубокая деградация ЛП в тканях и метка выводится из клеток в виде |251-тирозина, первоначально находящегося в белковом компоненте ЛП. ^

Механизм рецепторного проникновения ЛП в гепатоциты в настоящее время не вызывает сомнения. Однако не исключено, что ЛП могут проникать в гепатоциты и через синусо-идные (эндотелиальные и купферовские) клетки по типу везикулярного транспорта ЛПНП через эндотелий аорты. Для

подтверждения этого предположения были проведены опыты с перфузией печени крыс частицами ЛПВП, конъюгировэнными с коллоидным золотом.

Таблица 1 . Поглощение йодированных ЛП различными органами и тканями крыс через 30 мин после внутривен-_ного введения (имп/мин на 1 мг ткани)_

Органы и ткани ЛПОНП ЛПНП ЛПВП

Печень 10,2 (44,4) 144,2 (26,7) 46,7 (7,05)

Легкие 1,1 (0,66) 25,8 (0,64) 21,3(0,43)

Сердце 0,6(0,18) 20,1 (0,25) 21,8(0,22)

Почки 1,3 (1,03) 66,2 (2,24) 34,1 (0,94)

Надпочечники 2,3 (0,08) 103,7(0,14) 127,3(0,14)

Яичники 1,6(0,07) 51,7(0,07) 50,3 (0,07)

Жировая ткань 0,3 (2,04) 1,3(0,41) 1,9(0,49)

Мышцы 0,2(11,2) 4,0(8,11) 3,5 (5,74)

Селезенка 1,6(0,37) 53,2 (0,50) 30,4 (0,34)

Тимус 0,5 (0,06) 12,2 (0,07) 6,0 (0,03)

Костный мозг 2,0 - 34,2 - 29,1 -

Лимфатические

узлы 1,0 - 21,5 - 11,8 -

Плазма крови 219(38,2) 5768(41,8) 7673 (45,3)

Примечания. В скобках приведена общая радиоактивность

(в %) от введенной дозы. Радиоактивность плазмы крови дана в расчете на 20 мкл. Число животных в каждой группе равнялось 6.

При электронно-микроскопическом исследовании срезов печени после перфузии при 4°С было установлено, что гранулы конъхогатов коллоидного золота с ЛПВП находились на поверхностных плазматических мембранах купферовских макрофагов и эндотелиальных клеток синусоида. Собранные в кластеры частицы обычно были сосредоточены в области окаймленных ямок. Интернализации конъюгатов не наблюдалось. Через 15 мин перфузии печени средой с температурой 37°С гранулы конъюгатов появлялись не только в об-

ласти окаймленных ямок, но и в многочисленных эндосомах купферовских макрофагов и эндотелиальных клеток. Через 30 мин перфузии частицы ЛПВП появлялись уже в лизосо-мах купферовских макрофагов. Конъюгаты располагались по периферии органелл. Содержащие гранулы конъюгата электронно-прозрачные эндосомы были более полиморфны, чем лизосомы. Эндотелиальные клетки содержали гранулы только в обычных эндоцитозных везикулах. На срезе в таких эндосомах обнаруживалось от 3 до 12 частиц. Отмечались многочисленные везикулы, вскрывающиеся в пространства Диссе, в сторону гепатоцитов.

Дополнительные исследования с меченными радиоактивным йодом ЛП также подтвердили, что в печени поглощение ЛП идет как паренхимными, так и непаренхимными клетками (табл.2).

Таблица 2. Поглощение йодированных ЛП гепатоцитами и синусоидными клетками через 30 мин после внутривенного _введения_

Объект исследования ЛПОНП ЛПНП ЛПВП

Гепатоциты (Г) 125 + 13 74 + 4 7+1

Синусоидные клетки (СК) 645 + 28 303 + 31 97 + 13

Отношение СК/Г " 5,6 + 0,7 4,3 + 0,4 14,4 + 2,1

Примечание: поглощение 1251-ЛП выражено в% х10-4от введенной дозы на 1 мг клеточного белка; п = 6.

В ранние сроки (через 30. мин после введения) меченные йодом ЛП (в расчете на 1 мг клеточного белка) активнее поглощались непаренхимными элементами. Наиболее активно непаренхимные клетки печени поглощали меченые ЛПВП. Через 6 часов радиоактивность в синусоидных клетках снижалась в 1,8 раза, а в гепатоцитах возрастала почти в 3 раза.

Эти результаты также позволили предположить, что проникновение ЛПВП в гепатоциты может осуществляться путем межклеточного переноса из синусоидных клеток. Возможно, что для индукции рецепторов ЛПВП на гепатоцитах

необходима пороговая концентрация модифицированных макрофагами частиц ЛПВП или их отдельных белковых фрагментов (апоА-1). Не исключено, что обмен основного белкового компонента ЛПВП начинается в непаренхимных клетках, а заканчивается в гепатоцитах.

В настоящее время в литературе доминирует представление о том, что ЛП после поглощения их клетками рецептор-опосредованным механизмом подвергаются полной деградации во вторичных лизосомах (Вго\уп,ОоШ81ет, 1979; 1985). В экспериментах с внутривенным введением крысам йодированных ЛП, действительно, наибольшее количество метки обнаруживалось в лизосомальной фракции (табл.3). Но вместе с тем, значительная радиоактивность найдена и в других клеточных структурах: ядрах, митохондриях, микросомах, в крупных и мелких клеточных мембранах.

Таблица 3. Влияние физической нагрузки на внутриклеточное распределение в печени крыс |251-ЛП после их внутривенного введения (имп/мин на 1 мг белка)

Субклеточные ЛПОНП ЛПНП ЛПВП

фракции контроль опыт контроль опыт контроль опыт

Гомогенат 165+29 165+39 342+64 246+38 201+36 230+55

Крупные м-ны 240+42 142+21 84+11 57+14 136+29 134+21

Мелкие м-ны 203+36 148+35 167+37 172+36 180+35 200+39

Ядра ^ 119+19 122+26 137+14 102+20 95+56 191+94

Митохондрии 392+70 170+85 669+213 497+128 291+43 321+41

Лизосомы 324+41 269+84 899±196 634+81 355+61 378+53

Микросомы 229+46 166+64 422+109 320+86 271+17 275+57

Цитозол 68+17 125+50 276+53 188+24 171+24 175+30

Примечание. Число животных в каждой группе равно 6.

Физическая нагрузка не изменяла общего поглощения ЛПОНП печенью, о чем свидетельствует радиоактивность гомогената. Однако распределение метки среди клеточных структур отличалось от контроля. В большинстве исследованных фракций уровень радиоактивности понизился за ис-

ключением цитозола, в котором количество радиоактивной метки увеличилось в 2 раза. Поглощение ЛПНП печенью крыс при интенсивной физической нагрузке в целом снижалось. Наблюдалось снижение радиоактивности гомогената, а также отдельных клеточных структур. С другой стороны, поглощение печенью ЛПВП при плавании возрастало. Это проявлялось в некотором увеличении радиоактивности гомогената, а также отдельных клеточных фракций. Особенно характерным было накопление метки в ядрах.

Обнаруженные различия в локализации белковых компонентов ЛП позволили предположить, что их пути внутриклеточного метаболизма и деградации отличаются друг от друга. Данные указывают также на возможность взаимодействия отдельных аполипопротеинов с субклеточными структурами.

Одним из подходов для изучения путей проникновения ЛП в клетку, их последующей внутриклеточной локализации является применение иммунохимических методов с использованием специфических антител к отдельным аполипопротеи-нам или даже их фрагментам. Аполипопротеины выделяли из делипидированных ЛП методами как традиционной хроматографии, так и жидкостной хроматографии высокого давления ('ЪКВ", Швеция).

На рис. 1 представлены результаты очистки апоА-1, а на рис.2 - апоВ и апоЕ. Выделенные апоА-1, апоВ и апоЕ не содержали примесей других белков. АпоВ мигрировал в геле двойной полосой в виде своих основных форм: В-100 и В-48.

Идентификацию антител проводили методом двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. Антитела к апоА-I человека давали одну полосу преципитации с сывороткой крови и с изолированным апоА-1 человека (рис.3). Отсутствовала преципитация с апоВ и ЛПНП человека, БСА и плазмой крови крыс. Высокая специфичность антител была также показана с помощью иммуноблоттинга. Полученные результаты свидетельствуют об иммунохимической гетерогенности аполипопротеинов человека и крысы.

Рис.1 Рис.2

Рис.1. Электрофоретический контроль хроматографи-ческой очистки апоА-1 человека. 1 - низкомолекулярные белки-стандарты; 2 - изолированный апоА-1; 3 - суммарные белки ЛПВП человека.

Рис.2. Электрофоретический контроль хроматографи-ческой очистки апоВ человека. 1 - изолированный апоВ; 2 -апоЕ; 3 - суммарные белки ЛП человека.

Рис.3. Определение специфичности антител против апоА-1 /гч человека с помощью двойной

- ^ радиальной иммунодиффузии

Л по Оухтерлони. В центре - ан-

\3к_/ титела к апоА-1 человека; 1 -

?) ^ апоВ человека; 2 - ЛПНП че-

ловека; 3 - бычий альбумин; 4 - плазма крови человека; 5 апоА-1 человека; 6 - плазма крови крыс.

В процессе работы по иммунохимической детекции белковых компонентов ЛП нам пришлось столкнуться с определенными трудностями. Дело в том, что не все эпитопы апоА-1 присутствуют на поверхности ЛПВП, большая часть их скрыта липидным окружением. Для выявления скрытых антигенных детерминант наиболее эффективным является способ химической обработки проб тетраметилмочевиной (КогкшкДисИ, 1983). В своей работе мы использовали вещества, сходные с тетраметилмочевиной (ТММ) как по химическому строению, так и по предполагаемому действию на конформацию белков в растворе: диметилформамид (ДМФА), формамид (ФА) и диметилсульфоксид (МегБО). Наилучшие результаты были получены с пробами, обработанными ТММ, а также диметилсульфоксидом (рис.4).

Важно отметить, что диметилсульфоксид не вызывал агрегации и преципитацию апоВ. При обработке им проб плазмы , крови человека иммунохимическое выявление апоВ не отличалось от контрольного варианта, в то время как

Рис.4. Влияние различных способов обработки плазмы крови человека на выявление апоА-1. Представлены кривые титрования плазмы, обработанной диметилсульфоксидом (1), тетраметилмочевиной (2), диметилформамидом (3), формамидом (4), нагреванием до 53° С (5) и без обработки (6).

10 100 1000 В • * о « (кг)

обработка проб ТММ снижала процент открытия апоВ в два раза. Предлагаемый способ упрощает методику определения аполипопротеинов, позволяет измерять апоА-1 и апоВ в одних и тех же разведениях проб.

Данный способ обработки проб использовался нами для иммунохимической детекции аполипопротеинов в различных биологических средах человека и крысы. В частности, для количественного определения апоА-1 и апоВ у жителей г.Новосибирска (разовые доноры). Группы составляли 20 мужчин и 21 женщина в возрасте от 21 до 50 лет, без изменения липидных показателей плазмы крови. Полученные нашим методом результаты соответствовали данным других лабораторий, использующих методы тИФА.

Высокая чувствительность данного метода позволила его применить для выявления и количественного определения аполипопротеинов в биологических средах и жидкостях организма, в которых данные белки содержатся в нанограммо-вых количествах. Среди них можно назвать лимфу, а также мочу. Так у здоровых лиц в моче полностью отсутствовал апоВ, а апоА-1 выявлялся в следовых количествах (около 3 нг на одну ячейку планшета), что практически находится на пределе чувствительности метода. У больных с диагнозом хронический пиелонефрит в моче были обнаружены как апоА-1, так и апоВ. Причем содержание апоА-1 в 117 раз превышало содержание данного белка в контрольной группе. В моче больных появлялся и такой крупный белок, как апоВ (1,5 мг/л). Появление в моче крупномолекулярного белка (молекулярная масса апоВ свыше 500 кДа) свидетельствует о серьезных нарушениях клубочкового и канальцевого отделов нефрона. Это особенно важно в клинике не только для прогноза тяжести состояния, но также для диагностики и оценки эффективности лечения.

В частности, методом иммуноцитохимии нами идентифицирован апоА-1 в ворсинках тонкого кишечника крысы. АпоА-1 локализовался только в зрелых, всасывающих клетках тонкого кишечника. В отличие от апоЕ отсутствовало диффузное распределение апоА-1 на срезах ворсинок, а также

в криптальном эпителии. Кроме того, была приведена предварительная характеристика и иммунохимическая идентификация цитоплазматического пула апоА-1 печени крыс. Методом иммуноэлектроблоттинга в цитоплазме выявлена изоформа с молекулярной массой порядка 31,5 кДа, которая, является внутриклеточным предшественником этого белка, т.н. препроапоА-1. Другая полоса по электрофоре-тической подвижности близко соответствовала зрелой форме апоА-1. Впервые обнаружено присутствие двух белковых фракций с молекулярными массами .около 26 и 23 кДа, являющихся, по всей вероятности, продуктами лимитированного внутриклеточного протеолиза.

Следует заметить, что в процессе работы у нас появилось достаточно оснований предполагать, что ЛП или их белковые компоненты играют определенную роль в структурной и функциональной организации хроматина эукариот. Материалом для исследования был суммарный хроматин, фракция репрессированного или транскрипционно неактивного хроматина (ТНА), транскрипционно активный (ТА) хроматин, а также ядерный матрикс. Результаты дот-анализа показали, что апоА-1-иммунореактивность присутствует во всех ядерных фракциях: суммарном, ТНА, ТА и ядерном матриксе. Количественная оценка апоА-1-иммунореактивности во фракциях хроматина осуществлялась с помощью тИФА. Содержание апоА-1 (апоА-1-иммунореактивности) в суммарном хроматине составило 60 нг/мг белка, во фракции репрессированного хроматина - 52 нг/мг белка, а в ТА хроматине - почти вдвое выше. Самой высокой она была в ядерном Матриксе - 110 нг/мг белка. Обнаружение высокой апоА-1-иммунореактивности в ядерном матриксе также чрезвычайно важно, ибо сегодня последний рассматривается как место РНК-транскрипции или репликации ДНК.

Главная информация была получена с помощью имму-ноблоттинга (рис.5). Оказалось, что в хроматине ядер гепато-цитов крыс присутствуют два белка иммунологически идентичные апоА-1: один из них с молекулярной массой 28 кДа,-

другой - с молекулярной массой около 14 кДа. Первый белок по электрофоретической подвижности соответствовал апоА-I. Он присутствовал во фракции ТА хроматина и в ядерном матриксе. Второй, низкомолекулярный белок, присутствовал только в ТНА хроматине. По-видимому, это продукт лимитированного протеолиза апоА-1. Где происходит про-теолиз сказать трудно. Полученные результаты интересны с точки зрения анализа условий, создающих или поддерживающих транскрипционно активную конформацию хроматина независимо от того, обусловлено ли это собственно апо-липопротеинами или лигандами, которые они переносят в ядро.

Рис.5. Выявление апоА-1-иммунореактивности во фракциях хроматина методом им-муноблоттинга: 1 - ТНА хроматин; 2 - апоА-1 крыс; 3 -ядерный матрикс; 4 - ТА хроматин; 5 - низкомолекулярные белки-стандарты.

В последнее время у ЛП обнаружены новые, ранее неизвестные свойства, связанные со способностью ЛП связывать и транспортировать многие гидрофобные и гидрофильные лиганды. Изучение этих "неспецифических" свойств ЛП и явилось основной целью нашего исследования. Взаимодействие стероидных гормонов с отдельными классами ЛП, мы изучали с использованием самых различных методов: ультрацентрифугирования, гель-фильтрации, флуоресцентной спектроскопии и равновесного диализа.

Внутрибрюшинное введение крысам меченных тритием гшококортикоидов показало, что уже через 30 мин 15% кор-

1 2 3 4 5

тикостеронаи 18% кортизола было связано с ЛП. В опытах in vitro процент связанных с ЛП-фракциями стероидов был еще выше. При этом основная часть метки была "свободной" и находилась во фракции белков инфранатанта. Другие доказательства возможности транспорта стероидов с ЛП получены с помощью хроматографии. Совпадение объемов выхода меченого кортикостерона и ЛПВП свидетельствует о возможности комплексообразования между гормоном и ЛП частицей. Количественная оценки связывания стероидных гормонов с ЛП проводилась методом равновесного диализа (табл.4).

Таблица 4. Константы ассоциации для ЛП при взаимодействии их с кортикостероном и кортизолом_

Классы ЛП Кортикостерон Кортизол

ЛПОНП ЛПНП ЛПВП (0,8+0,1) х Ю-'' М-' (0,1+0,04) х Ю-« М-| (0,9+0,2) х 10-7 М-' (0,5+0,1) х 10-7 М-' (0,4+0,1) х Ю-7 М-' (0,8+0,1) х Ю-7 м-'

Примечание. В таблице приведены средние значения 5 измерений. В опытах с кортикостероном использовались ЛП плазмы крыс, а в опытах с кортизолом - человека.

Анализ взаимодействия ЛП со стероидными гормонами показал их достаточно высокое связывание с частицами ЛПВП, в которых основным белковым компонентом является апоА-1. В связи с этим, методом гель-фильтрации была показана возможность связывания кортикбстерона с изолированным апоА-1. Инкубация апоА-1 со 100-кратным избытком немеченого лиганда почти на половину сокращала связывание метки, а в присутствии 1000-кратного избытка немеченого кортикостерона, связывания меченого гормона практически не наблюдалось.

Константа ассоциации кортикостерона с апоА-1 оказалась несколько ниже, чем с нативными частицами ЛПВП. Это, по всей вероятности, обусловлено удалением липидов, которые необходимы для стабилизации структуры белка и

поддержания в нем определенных конформационных взаимоотношений, придающих ему свойства поверхностно-активного соединения.

Как и для стероидов молекулярные механизмы различных гормональных проявлений тиреоидных гормонов все это время объясняла гипотеза "свободных гормонов", утверждающая, что биологической активностью обладает только фракция "свободных гормонов". Однако в самое последнее время получены экспериментальные доказательства проникновения в клетку тиреоидных гормонов при помощи белковых переносчиков. Оказалось, что эти новые белки не являются фрагментами уже известных тироксин-связывающих белков, а представляют собой компоненты универсальной липопротеиновой транспортной системы.

Нам представляется, что различные Т-гСвязывающие белки, выполняют каждый свою, свойственную только ему, функцию по направленному транспорту тиреоидных гормонов в отдельную специфическую ткань или клетку. Для решения вопроса о роли липидного и белкового компонента ЛП в связывании гормонов щитовидной железы необходимо прежде всего иметь в наличии высокоочищенные и активные аполипопротеины.

После инкубации с меченым тироксином суммарные ЛП человека (с!<1,21 г/мл) подвергали хроматографическому разделению на колонке (1,6 х 100 см) с сефарозой СЬ-2В. Меченый Т4 элюировался двумя основными пиками (рис.6). Первый основной пик совпадал с объемом выхода ЛПВП, а второй пик соответствовал объему выхода свободного гормона. На фракции ЛПОНП и ЛПНП приходилось не более 5% радиоактивности. Интересно отметить, что основная часть меченого Т4 связывалась с подфракцией ЛПВПз, а не с ЛПВШ. Различия в связывании Т4 между ЛПВШ и ЛПВПз обусловлены, как мы полагаем, особенностями состава белков и полярной фосфолипидной оболочки.

Отмечена зависимость связывания от температуры. Повышение температуры даже до 40° С приводило к более чем 50%-ному снижению выхода радиоактивности с белком. Ком-

плексообразование несколько уменьшалось при 4° С, однако при этом комплексы отличались наибольшей устойчивостью. Кроме того, связывание носило обратимый характер. Введение в систему после достижения состояния равновесия избыточного количества (10 6 - Ю-7 М) немеченого Т4 приводило к вытеснению меченого гормона из комплексов с ЛПВП.

2 х

0.6

ш 0.4

5

X л л

„ о.з

я

о 0.2

<=; и о с

0.1

20 40 60 80 100 120 140 160 МЛ

Рис.6. Связывание меченого тироксина с фракциями ЛП плазмы крови человека. Колонка: сефароза СЬ-4В (1,6 х 100 см). Элюент: 0,05 М Трис/Ац, рН 8,0, 5 мМ ЭДТА. Сплошная линия - поглощение белка при 280 нм. Пунктирная линия - радиоактивность.

Видовых различий в связывании Та с ЛПВП мы не обнаружили. ЛПВП крыс также связывали Т4. Инкубация в течение 30 мин показала, что за это время происходило насыщение связывающих участков на частицах ЛПВП и достигалось состояние равновесия. Комплексы ЛПВП-Т4 были до-

статочно устойчивы и не разрушались в процессе взаимодействия с гранулами сефадекса.

Взаимодействие Т4 с ЛП сопровождалось тушением флуоресценции триптофана. Наибольшее снижение флуоресценции в точке эквимолярности отмечено для фракции ЛПВПз (70%). Несколько менее выраженным было снижение флуоресценции для ЛПВП2 (53%) и для изолированного апоА-1 (42%). Тушение флуоресценции нами было отмечено и для ЛПНП (28%). Наблюдаемое тушение флуоресценции в частицах ЛПВП и апоА-1 свидетельствует также о поверхностной локализации Т4-связывающих центров в белковом домене, конформационно связанным с поверхностным полярным липидным монослоем. Кроме того, эти результаты говорят о том, что липидный компонент ЛПВП вносит собственный вклад в механизм комплексообразования Т4 с частицами ЛПВП.

Таблица 5. Константы ассоциации и количество связывающих мест на ЛП при взаимодействии их с тироксином

Классы ЛП к,гг (М-') х 10б Число мест связывания

ЛПВПз 50 5

ЛПВШ 3,6 3

АпоА-1 6,45 1

Примечание. Приведены средние значения 3 измерений.

На основании полученных кривых тушения флуоресценции были рассчитаны константы ассоциации и количество мест связывания (табл.5). Молекулярные массы ЛПВШ, ЛПВПз и апоА-1 принимались за 3x105, 2x105 и 2,8x104 дальтон, соответственно. Как и для стероидных горомонов константа ассоциации комплексов апоА-1-тироксин оказалась несколько ниже, чем для комплексов ЛПВП-тироксин. Близкую константу ассоциации для белка 66 кДа получили Опта1сН с сотр.(1986). По их данным она составила 8,5x106 М-'.

В следующем разделе работы предстояло изучить связывание с ЛП одного из самых распространенных гидрофобных ксенобиотиков метилхолантренового ряда - бензо(а)пирена.

Рис.7. Процентное распределение меченного тритием бензо(а)пирена между ЛП плазмы крови крыс после ультрацентрифугирования

Пйлпонп

Добавление 3Н-БП к плазме крови крыс и последующее ультрацентрифугирование показали, что основная часть меченого БП связывалась с ЛП-фракциями и только 22,7% оставались в инфранатанте (рис.7). Наибольшая радиоактивность обнаружена во фракции ЛПВП, в ЛПОНП она была почти вдвое ниже и меньше всего радиоактивности содержала фракция ЛПНП. Это понятно, поскольку у крыс ЛПВП представляют собой основную транспортную форму жира, а фракция ЛПНП составляет не более 10-15%.

После ультрацентрифугирования комплексы меченый БП-ЛП были подвергнуты гель-фильтрации на сефадексе в-25. Пик радиоактивного БП совпадал с объемом выхода фракции ЛП. Соотношение метки в ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП после гель-фильтрации практически не изменилось, хотя отмечалось некоторое уменьшение радиоактивности, вероятно, за счет сорбции 3Н-БП гранулами сефадекса.

Распределение среди ЛП плазмы крови крыс бензилпени-циллина, бензантрацена и бензо(а)пирен представлено на рис.8. Этим же методом было изучено распределение между

ЛП-фракциями плазмы крови человека цитохалазина и акта номицина Д (рис.9).

Рис.8. Распределение меченных тритием бензилпенициллина, бензантрацена и бензо(а)пирена между фракциями ЛП плазмы крови крыс после ультрацентрифугирования

59,9

Бензил пенициллин Бвшантрацен Банзо(а)лир«н

акшюмицитД \ЕЩ|у4рш<1фтФ1Жппашь11фсшч£шва<а пхге угътрацтари}$гарсвашя

14пскалазж Длта/однД

В примере с использованием ЛП в качестве транспортной формы гидрофобного лиганда мы взяли меченный тритием бензо(а)пирен. Комплексы ЛП и бензо(а)пирена вводили в одну из хвостовых вен. Поглощение бен-зо(а)пирена органами и тканями при использовании в качестве носителей ЛП различных классов плотности существенно отличалось между собой (табл.б).

После введения бензо(а)пирена в составе ЛПОНП наибольшее количество метки было обнаружено в печени, затем в надпочечниках и почках. Слабое поглощение метки отмечалось в сердце и селезенке. Обращает на себя внимание высокое накопление бензо(а)пирена надпочечниками, особенно при использовании ЛПВП. Этот факт вполне понятен, так как в надпочечниках крыс для синтеза стероидных гормонов используется холестерин ЛПВП. Кроме того, имеются данные, что преимущественное связывание меченого хлордекона с ЛПВП обеспечивает его накопление в надпочечниках и семенниках - органах, наиболее подверженных токсическому воздействию чужеродных соединений (Soine е.а.,1982). Наличие высокой радиоактивности в печени объясняется ведущей ролью этого органа в катаболизме ЛП и переносимых ими различных лигандов.

Таблица 6. Поглощение меченого бензо(а)пирена органами и тканями крыс через 30 мин после внутривенного введения в составе ЛП (радиоактивность в имп/мин на 1 мг ткани

Органы и ткани ЛПОНП ЛПНП ЛПВП

Печень 27,9 + 4,1 25,9 + 2,6 40,8 + 9,5

Легкие 6,6+ 1,6 5,9 + 1,0 9,6+ 1,1

Сердце 3,1 +0,1 2,5 + 0,2 2,3 + 0,7

Селезенка 1,9 + 0,3 3,7 + 0,5 5,9+1,0

Почки 11,5 + 2,0 9,1 + 1,0 26,3 + 3,8

Надпочечники 24,7 + 2,3 29,1 + 3,7 47,5 + 9,5

Тимус 4,1 +0,9 3,8 + 0,4 6,4+ 1,3

Жировая ткань 5,2 + 0,8 5,1 +0,7 6,8 + 1,1

Примечание: число животных в каждой группе равно 5.

Следует отметить высокий уровень бензо(а)пирена в почках, особенно при использовании в качестве транспортной формы ЛПВП. Это подтверждается работами VanT Hoft и Van Toi (1985), в которых показана важнейшая роль почек в катаболизме апоА-I и апоЕ, входящих в состав ЛПВП. По имеющимся данным, у крыс 39% пула апоА-I катаболизирует в почках (Glass е.а.,1983).

Для изучения возможности селективной доставки биологически активных веществ к органам и тканям-мишеням также были использованы вполне естественные лиганды: меченные углеродом холестерин и эфир холестерина (холестерин-олеат). Эти данные подтвердили полученные в предыдущей серии опытов результаты о возможной селективной доставке лигандов с ЛПОНП в печень, а с ЛПВП - в надпочечники. Кроме того, эти результаты определили наш выбор на ЛПВП как на основной транспортной форме холестерина и прегненолона в митохондрии надпочечников крыс (рис.10).

Ric.10. Продукция корткосгерона надпочечникам* крьс при иапользсвании ЛПВП в качестве гереносчиксв неэстерифодфовашэго хстесгерина и препкногюна (мкг на 100 мг ткани в час)

Конфет» АКТГ

Из представленных данных следует, что использование в качестве носителей неэстерифицированного холестерина и пре-гненолона ЛПВП увеличивало их доставку в митохондрии надпочечников, что также проявлялось при стимуляции сте-роидогенеза с помощью АКТГ.

Дополнительная информация нами была получена о том, какой из подклассов ЛПВП предпочтительнее использовать в качестве транспортной формы холестерина для стероидогенеза. Из полученных данных следует, что третий подкласс ЛПВП обладает более выраженным стимулирующим эффектом на стероидогенез по сравнению со вторым подклассом ЛПВП. Этот подкласс и необходимо использовать в качестве транспортной формы для селективной доставки лигандов в надпочечники и, по-видимому, в яичники.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена селективность поглощения меченных по белковому компоненту ЛП органами и тканями: из 12 исследованных тканей ЛПОНП больше всего поглощались печенью, а ЛПВП - надпочечниками. Поглощение ЛП тканями менялось в зависимости от функционального состояния организма. Физическая нагрузка снижала поглощение печенью ЛПНП и увеличивала поглощение ЛПВП.

2. Меченные коллоидным золотом ЛПВП связываются с рецепторами на поверхности МФ и эндотелиальных клеток печени. При этом, только в МФ осуществлялся транспорт ЛПВП-коныогатов в лизосомы, т.е. именно в этих клетках происходит ферментативная модификация ЛПВП. Эндотели-альные клетки печени связывали, поглощали частицы ЛПВП, а также осуществляли их активный транспорт в пространства Диссе печени.

3. Одним из путей проникновения ЛПВП в гепатоциты является межклеточный перенос их из синусоидных клеток. Обмен основного белкового компонента ЛПВП начинается в непаренхимных клетках, а заканчивается в гепатоцитах. Воз-

можна передача меченого лиганда от непаренхимных клеток к гепатоцитам.

4. После поглощения ЛП клетками меченые белковые компоненты ЛП обнаруживаются во многих субклеточных структурах: ядрах, митохондриях, лизосомах й микросомах. Значительные количества метки присутствовали также в ци-тозоле клетки, крупных и мелких мембранах. Результаты указывают на возможность взаимодействия аполипопротеи-нов о клеточными структурами.

5. Распределение метки между клеточными структурами зависит от функционального состояния организма. В надпочечниках физическая нагрузка увеличивала поглощение ЛПВП. Накопление метки наблюдалось в цитозоле и во фракции мелких мембран. В опытах in vitro кортизол увеличивал включение меченых ЛПОНП в митохондрии печени. Адреналин повышал содержание меченых ЛПНП во фракции крупных клеточных мембран и снижал уровень меченых ЛПВП в митохондриях печени. Обнаруженные различия в локализации белковых компонентов ЛП позволили заключить, что пути внутриклеточного метаболизма апоЛП, а также деградации их отличаются друг от друга.

6. Получены и хроматографически очищены человеческие и крысиные апоА-I, апоВ и апоЕ. С помощью специфических антител показана иммунохимическая гетерогенность аполнпопротеинов человека и крысы.

7. С целью выявления скрытых антигенных детерминант апоА-I в частицах ЛПВП предложен новый метод химической обработки образцов плазмы с использованием диме-тилсульфоксида. Метод позволяет использовать одни и те же разведения проб для последующего количественного определения апоА-I, В и Е. Проведенная оптимизация метода позволила также применить его для количественного определения аполнпопротеинов в лимфе, моче и других биологических жидкостях и средах организма.

8. Проведена предварительная характеристика и иммунохимическая идентификация цитоплазматического пула апоА-I печени крыс. Методом иммуноэлектроблоттинга в

цитоплазме выявлена изоформа с молекулярной массой порядка 31,5 кДа, которая является внутриклеточным предшественником этого белка, т.н. препроапоА-1. Другая полоса по электрофоретической подвижности близко соответствовала зрелой форме апоА-1. Обнаружено присутствие двух белковых фракций с молекулярными массами около 26 и 23 кДа, являющихся, по всей вероятности, продуктами лимитированного внутриклеточного протеолиза.

9. Показано присутствие белков, иммунохимически идентичных апоА-1, в хроматине ядер печени крыс. АпоА-1-иммунореактивность выявлена во фракции суммарного хроматина, транскрипционно неактивного хроматина, тран-скрипционно активного хроматина и ядерного матрикса. Удельная апоА-1-иммунореактивность транскрипционно активного хроматина и ядерного матрикса была вдвое выше, чем суммарного и транскрипционно неактивного хроматина.

10. С помощью иммуноэлектроблоттинга во фракциях хроматина обнаружено два белка: первый - с молекулярной массой, соответствующей апоА-1 (28 кДа); второй - с молекулярной массой около 14 кДа. Первый белок присутствовал в транскрипционно активном хроматине и ядерном матриксе. Второй белок - только в транскрипционно неактивном хроматине.

11. Установлено, что ЛП плазмы крови связывают и транспортируют стероидные гормоны. При комплексообра-зовании ЛП-стероид принимают участие белковые компоненты, причем стероид адсорбируется на поверхности ЛП-частицы. Одним из белков, связывающих стероидные гормоны, является ап'оА-1, на котором находится 11 посадочных мест.

12. ЛП плазмы крови связывают тироксин и могут выполнять роль его транспортной формы в организме. Наиболее высокое сродство к тироксину обнаружено для частиц ЛПВПз. В процессе комплексообразования ЛП-тироксин принимает участие белковый компонент ЛП. Главным белком, связывающим тироксин, является апоА-1, на котором находится одно посадочное место.

13. Показано взаимодействие ксенобиотиков метилхолан-тренового ряда - бензо(а)пирена и бензантрацена с ЛП плазмы кров!^. Разработан простой и удобный в исполнении метод оценки связывания гидрофобных соединений с белками и ЛП плазмы крови - метод целлюлозных дисков.

14. В связывании ЛП бензо(а)пирена основная роль принадлежит апоВ. Используя ЛП в качестве транспортной формы бензо(а)пирена показано поглощение и селективное распределение этого лиганда между органами и тканями крыс. Одним из основных путей проникновения бен-зо(а)пирена в клетку является В/Е-рецепторный путь.

15. Селективная доставка биологически активных веществ к органам и тканям-мишеням показана с использованием естественных лигандов: меченных углеродом холестерина и эфира холестерина (холестерин-олеат). Данные подтверждают возможность селективной доставки лигандов с ЛПОНП в печень, а с ЛПВП - в надпочечники. Это дополнительно определило выбор ЛПВП как основной транспортной формы холестерина и прегненолона в митохондрии надпочечников крыс.

16. В опытах с "насыщением" ЛПВП предшественниками стероидогенеза (неэстерифицированным холестерином и пре-гненолоном) показано, что, во-первых, гидрофобные лиганды в составе ЛП проникают в отдельные субклеточные структуры, а именно: в митохондрии и микросомы; во-вторых, переносимые с ЛП лиганды включаются в метаболический процесс клетки и осуществляют регуляторное влияние.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Панин Л.Е., Поляков Л.М. Изучение взаимоотношений между глюкокортикоидной функцией коры надпочечников и липопротеидами сыворотки крови// Бюл. эксперим. биологии и медицины,- 1976,- N. 10.- С. 1202-1204.

2. Панин Л.Е., Нечаев Ю.С., Поляков Л.М. Использование циркадных ритмов для анализа взаимоотношений между уровнем глюкокортикоидов в крови и активностью

ферментов глюконеогенеза в печени и почках крыс//Вопр.мед.химии.-1977. -N.2.-0.159-165.

3. Поляков Л.М. О возможной регуляторной роли липо-протеидов на стероидогенез в надпочечниках//В сб.: Физиология и патология процессов адаптации человека.- 1977.-С.124-128.

4. Поляков Л.М., Панин Л.Е. Регуляция липопротеидами стероидогенеза в надпочечниках крыс// Матер. III Всесоюзного симпозиума "Структура, биосинтез и превращение ли-пидов в организме животного и человека"- Ленинград, 1978.-С.67.

5. Панин Л.Е., Поляков Л.М. Механизм регуляции стероидогенеза в надпочечниках липопротеидами сыворотки крови// Бюл. эксперим.биологии и медицины.- 1979.- Т.88.- N.9.-С.267-269.

6. Поляков Л.М. Участие липопротеидов сыворотки крови в связывании и транспорте стероидных гормонов//Тез.1У Всесоюзного биохимического съезда - Москва, 1979.- Т.З.-С.68-69.

7. Поляков Л.М. Связывание различных стероидов липопротеидами сыворотки крови// В сб.: Современные аспекты физиологии, адаптации и патологии- Новосибирск, 1979.-С.31-34.

8. Третьякова Т.А., Поляков Л.М. Роль липопротеидов сыворотки крови в регуляции углеводного обмена в печени крыс в условиях напряжения// В сб.: Современные аспекты физиологии, адаптации и патологии- Новосибирск, 1979.-С.35-38.

9. Поляков Л.М., Войцеховская Е.Э., Биккина М.М. Влияние кортизола и адреналина на связывание меченых 125.1-липопротеидов лизосомами печени крыс// В сб.: Структура и функции лизосом- Новосибирск, 1980.-С.143-144.

10. Поляков Л.М. Влияние липопротеидов сыворотки крови на стероидогенез в надпочечниках//В сб.: Механизмы адаптации гомеостатических систем при действии на организм субэкстремальных и экстремальных факторов- Новосибирск, 1980.- С.78-87.

11. Панин JI.Е., Поляков Л.М., Войцеховская Е.Э., Бик-кина М.М. Влияние кортизола, адреналина и АКТГ на поглощение и внутриклеточное распределение меченных по белку липопротеидов тканями печени и надпочечников крыс// Цитология,- 1981.-N.11.-С.1257-1263.

12. Поляков Л.М., Гизатулин З.Я., Панин Л.Е. Прямое спектрофотометрическое определение кортикостероидов на тонкослойных хроматограммах// Лаб.дело.- 1981.- N.4.-С.225-228.

13. Поляков Л.М., Гизатулин З.Я., Панин Л.Е. Использование метода прямого спектрофотометрирования для количественного анализа кортикостероидов на тонкослойных хроматограммах// Пробл. эндокринол.- 1981.- Т.24.- N.3.-С.74-77.

14. Поляков Л.М., Войцеховская Е.Э., Панин Л.Е. Внутриклеточный метаболизм йодированных липопротеидов в тканях крыс// Тезисы докладов III Всесоюзной конференции по патологии клетки- М., 1982.-С.142.

15. Поляков Л.М., Панин Л.Е. Связывание клеточными мембранами липопротеидов сыворотки крови// Тезисы докладов IV Всесоюзного симпозиума по биохимии липидов-Киев, 1983.- С.87-88.

16. Панин Л.Е., Поляков Л.М. Особенности поглощения липопротеидов плазмы крови иммунокомпетентными органами у крыс// В сб.: Медиаторы иммунного ответа в эксперименте и клинике - Горький, 1983.-С.104.

17. Поляков Л.М., Панин Л.Е., Войцеховская Е.Э. Поглощение и внутриклеточное распределение липопротеидов в надпочечниках крыс при физической нагрузке// Пробл. эндокринол,-1984.- Т.ЗО.- N.4.- С.60-63.

18. Поляков Л.М., Панин Л.Е. Поглощение липопротеидов плазмы крови стероидпродуцирующими органами у крыс// Пробл.эндокринол.- 1985,- Т.31.- N.4.- С.72-75.

19. Панин Л.Е., Усынин И.Ф., Поляков Л.М. Поглощение йодированных липопротеидов плазмы крови субпопуляциями гепатоцитов и синусоидными клетками печени крыс// Вопр. мед.химии.- 1986.-Т.32,-N.4.-C.106-110.

20. Панин JI.Е., Поляков Л.М. Липопротеиды: состав, структура, свойства// Бюлл. СО АМН СССР.- 1987.- N.3.-С.22-30.

21. Поляков Л.М., Панин Л.Е., Розуменко A.A. Связывание гшококортикоидов липопротеидами сыворотки крови//Деп.ВИНИТИ,- 1987.- № 4.-б/о 365.

22. Панин Л.Е., Соколова М.В., Усынин И.Ф., Поляков Л.М. Влияние липидов на функциональное состояние имму-нокомпетентных тканей// Тез .докладов V Всесоюзного симпозиума по биохимии липидов Алма-Ата, 1987.- С. 115-116.

23. Поляков Л.М., Панин Л.Е. Обмен йодированных апо-протеинов между липопротеидами различных' классов у крыс// Тез. докладов V Всесоюзного симпозиума по биохимии липидов -Алма-Ата, 1987.-С. 109-110.

24. Панин Л.Е., Поляков Л.М., Розуменко A.A., Биушкина Н.Г. Транспорт стероидных гормонов липопротеидами сыворотки крови// Вопр.мед.химии.-1988.-T.34.-N.5.-С.56-58.

25. Провоторов Г.В., Усынин И.Ф., Глазырин А.Л., Поляков Л.М. Поглощение комплексов коллоидного золота с липопротеидами высокой плотности синусоидальными клетками изолированной печени крыс// Тез. докладов Республиканской конференции "Проблемы гистофизиологии соединительной ткани"- Новосибирск, 1989.-С.170-171.

26. Панин Л.Е., Поляков Л.М., Розуменко A.A. "Способ введения биологически активных веществ в организм животного"//A.c. № 1506671 от 8 мая 1989г.

27. Потеряева О.Н., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Иммуно-ферментный анализ апопротеинов A-I и В в плазме крови// Материалы Всесоюзной конференции "Здоровье человека в Сибири"- Новосибирск, 1989.- T.II.-C.22-24.

28. Панин Л.Е., Колпаков А.Р., Добронравоза О.Н., Поляков Л.М. К механизму влияния аполипопротеинов на структурно-функциональные свойства митохон-дрий//Тез.докладов IV Всесоюзного съезда патофизиологов-Кишинев, 1989.-С.626.

29. Поляков Л.М., Потеряева О.Н., Панин Л.Е., Загре-бельный С.Н. Твердофазный иммуноферментный анализ

апопротеина A-I в сыворотке крови человека// Лаб.дело.-1990.- N.6.- С.11-14.

30. Поляков Л.М., Кузьменко А.П., Потеряева О.Н., Скрыль Г.Ш., Панин Л.Е. Апопротеин A-I-иммунореактивность во фракциях хроматина и ядерном мат-риксе гепатоцитов крыс// Тез.докладов X Всесоюзного симпозиума "Структура и функция клеточного ядра"- Гродно, 1990.-С.149.

31. Панин Л.Е., Часовских М.И., Поляков Л.М. Характеристика связывания и транспорта бенз(а)пирена с липопро-теидами сыворотки крови// Бюл.эксперим.биологии и медицины,- 1991.- Т. 111.- N. 1.- С.31 -33.

32. Поляков Л.М., Потеряева О.Н., Панин Л.Е. Определение апопротеина A-I методом иммуноферментного анализа// Вопросы мед. химии,-1991.-T.37.-N.1.-C.89-92.

33. Иванова Н.Г., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Взаимодействие липопротеинов сыворотки со стероидными гормонами// Укр.биохим.журн.-1991.-Т.63.-М.З.-С.103-105.

34. Поляков Л.М., Панин Л.Е. Внутриклеточное распределение меченых липопротеидов в тканях крыс при физической нагрузке/Щитология.-1991 .-Т.ЗЗ.-С. 32-37.

35. Поляков Л.М., Часовских М.И., Панин Л.Е. Оценка связывания бензо(а)пирена липопротеидами сыворотки крови методом бумажных дисков// Укр.биохим.журн.-1991.-T.63.-N.1.-С.101-104.

36. Поляков Л.М., Потеряева О.Н., Панин Л.Е. Определение апопротеина В методом твердофазного иммуноферментного анализа// Лаб.дело.-1991.-1Ч.9.-С.24-26.

37.Ivanova N.G., Polyakov L.M. Interaction of steroid hormons with the blood sérum apo(lipo)proteins// Proc.8-th Conférence of Organic and Bioorganic Chemistry- Riga, 1991-P.159.

38. Chasovskikh M.I., Polyakov L.M. Rôle of apolipoprotein В in the benzo(a)pyrene transport// Proc.8-th Conférence of Organic and Bioorganic Chemistry- Riga, 1991-P. 160.

39. Душкин M.И., Поляков Л.M., Долгов A.B. Эстерифи-кация холестерина в тканях и изменение апопротеинового

спектра в плазме крови крыс при воздействии автоокислен-ного холестерина// Вопр.мед.химии.-1991.-Т.37.-М.5.-С...

40. Панин Л.Е., Поляков Л.М., Усынин И.Ф., Кузьменко А.П., Потеряева О.Н. Иммунохимическая идентификация апопротеина A-I в хроматине ядер гепатоцитов крыс// Биополимеры и клетка.-1992.- T.8.-N.2.-C.44-49.

41.Поляков Л.М., Потеряева О.Н.Данин Л.Е., Загре-бельный С.Н. Способ определения апопротеина A-I в сыворотке крови//А.с. № 1737340 от 1 февраля 1992 г.

42. Панин Л.Е., Поляков Л.М., Кузьменко А.П., Потеряева О.Н., Скрыль Г.Ш. Обнаружение апопротеин A-I-иммунореактивности в хроматине ядер гепатоцитов крыс// Биохимия.- 1992,- Т.57.- N.6.- С.826-831.

43. Поляков Л.М., Часовских М.И., Панин Л.Е. Использование флуоресцентной спектроскопии для оценки взаимодействия бензо(а)пирена с липопротеинами кро-ви//Материалы IV Всесоюзной конференции "Люминесцентный анализ в биологии и медицине"- Москва, 1992-С.66.

44. Биушкина Н.Г., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Оценка глюкокортикоидсвязывающей способности липопротеинов сыворотки крови методами флуоресцентной спектроскопии// Материалы IV Всесоюзной конференции "Люминесцентный анализ в биологии и медицине"- Москва, 1992-С.66-67.

45. Панин Л.Е., Биушкина Н.Г., Поляков Л.М. Количественная характеристика взаимодействия липопротеинов сыворотки крови со стероидными гормонами// Бюл. экспе-рим.биологии и медицины.- 1992.-Т. 112.-N.7.-C.34-36.

46. Поляков Л.М., Часовских М.И., Панин Л.Е. Липопро-теины - уникальная транспортная система для ксенобиотиков и биологически активных веществ// Успехи современной биологии.-1992.- Т.112.- N.4.- С.601-608.

47. Душкин М.И., Корнюш Е.А., Поляков Л.М., Дмит-риенко Г.И., Юнонина Г.А., Крылова И.Н. Биосинтез липи-дов и метаболизм нативных и ацетилированных липопротеи-дов низкой плотности в макрофагах, стимулированных зи-

мозаном in vivo и in vitro// Биохимия.- 1992.- T.57.-N.8.-C.l181-1191.

48. Провоторов Г.В., Усынин И.Ф., Поляков J1.M., Гла-зырии А.Л. Рецептор-опосредованный эндоцитоз комплексов коллоидного золота с липопротеинами высокой плотности синусоидальными клетками изолированной печени крыс// Цитология,-1993,- Т.35.-N.l 1/12.-С.42-45

49. Polyakov L.M., Chasovskikh M.I., Panin L.E. The role of apolipoprotein В in the binding of benzo(a)pyrene: physico-chemical characteristics of interaction// Can.J.Physiol. Pharmacol.- 1994.-V.72.-Suppl.l.-P.590.

50. Usynin I.F., Panin L.E., Tsyrendorjiev D.D., Khar'kovski A.V., Polyakov L.M., and Mayanski D.N. Inhibitory effect of high density lipoproteins (HDL3) on lipopolysaccharide-induced production of reactive oxygen intermediates by rat Kupffer cells// In: Cells of the Hepatic Sinusoid (Eds. E.Wisse, D.L. Knook, K.Wake), Rijswijk, Netherlands, 1995,P.158.

51. Усынин И.Ф., Цырендоржиев Д.Д., Харьковский A.B., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние плазменных липопротеи-нов и аполипопротеина A-I на липополисахарид-индуцированную продукцию реактивных метаболитов кислорода купферовскими клетками крыс// Биохимия.- 1996.-Т.60.-В.2.-С.261-266.

52. Тузиков Ф.В., Панин Л.Е., Тузикова Н.А., Поляков Л.М. Применение метода малоуглового рентгеновского рассеяния для оценки структурных изменений в липопротеинах высокой плотности// Биологические мембраны.-1996.-Т. 13.-N.1.-C.71-78.

53. Polyakov L.M., Chasovskikh M.I., Panin L.E. Binding and transport of benzo(a)pyrene by blood plasma lipoproteins: the possible role of apolipoprotein В in this process// Bioconjugate Chemistry.- 1996.- V.7. N.4.- P.396-400.

/I

__

Соискатель Л.М.Поляков