Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:С-реактивный белок и сывороточный амилоид Р в системе иммунорегуляции

° #

На правах рукописи

ПОЛЕВЩИКОВ Александр Витальевич

С-РЕАКТИВНЫЙ БЕЛОК И СЬШОРОТОЧНЫЙ АМИЛОИД Р В СИСТЕМЕ ИММУНОРЕГУЛЯЦИИ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соисканий ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург -1997

Работа выполнена в научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук и поддержана грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований № 94-04-11776а и № 97-04-48012а.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор П.Г.Назаров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук В.Б.Климович доктор биологических наук Т.П.Сесь доктор медицинских наук А.С.Симбирцев

Ведущая организация: Государственный Научный Центр - Институт иммунологии МЗ РФ

Защита диссертации состоится 15 декабря 1997 г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.23.02 при НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной медицины РАМН.

Автореферат разослан " ^ " ноября 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук профессор

П.Г.Назаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Кооперативные взаимоотношения, возникающие между специфическими и неспецифическими защитными реакциями, составляют одно из важных направлений иммунологических исследований. В последние годы создание и подтверждение теории иммуноцитокиновой регуляции защитных реакций как важнейшего фактора интегративности иммунной системы вывело изучение этой кооперации на новый уровень. Одновременно имеются указания на участие белков пентраксинового семейства в регуляции как неспецифических, так и иммунных реакций. К пентраксинам относятся сывороточные белки неиммуноглобулинового происхождения с пентамерной (обычно гомопентамерной) структурой молекулы. Наибольшее число работ рассматривает роль С-реактивного белка (СРБ) и сывороточного амилоида Р (САР), связанных между собой общим происхождением и сходной структурой молекулы. Как правило, СРБ изучается и анализируется в аспекте острофазовых реакций и установленных иммунорегуляторных потенций , а также его эффектов в отношении фагоцитов крови. Анализ роли САР связан в основном с его участием в формировании амилоидных фибрилл различной локализации. В последние годы объемы исследований САР в мире существенно возросли, что связано с его обнаружением в амилоидных отложениях при болезни Альцгеймера, а также в составе атеросклеротических бляшек. Все это, а также огромный объем мировой литературы по проблемам острофазовых белков, является признаками актуальности данного исследования.

В отечественной литературе объем публикаций по иммунологическим и патофизиологическим аспектам влияний острофазовых белков весьма невелик. Одновременно уже в течение 10 лет полностью отсутствуют экспериментальные работы по цитотропным эффектам САР, его роли в патогенезе многих заболеваний и значимости оценки его уровня. Для отечественной иммунологии представляемая работа является одной из первых попыток анализа механизмов кооперации неспецифических защитных и иммунных взаимодействий сквозь призму взаимодействия СРБ и САР.

Несмотря на многолетнюю историю изучения и описание множества отдельных эффектов СРБ и САР, число обзорно-теоретических работ невелико. Это отражает отсутствие единой точки зрения на коренные иммунобиологические функции СРБ и САР, а в определенной степени - узость дифференциального подхода многих авторов, в течение длительного времени разрабатывающих конкретные точечные аспекты биологии и клинической роли этих белков. В результате для СРБ описано очень большое число эффектов в отношении нейтрофилов, мононуклеарных фагоцитов,

лимфоидных клеток, кровяных пластинок и гораздо меньшее - в отношении ш кооперативных взаимодействий между собой и с другими клеточными v, гуморальными факторами. Что касается САР, то не только механизмы егс взаимодействий с клетками, но и направление эффектов часто представляет собой сплошное белое пятно.

Наконец, актуальность работы определяется и стремительным развитием теоретической иммунологии, в результате которого интерпретация множества полученных до 1992 г. результатов (а их большинство в литературе по СРБ и САР) перестала соответствовать современному состоянию иммунологической теории. Поэтому любая попытка пересмотра и обобщения данных прошлых лет актуальна и важна для дальнейшего прогресса в этой области.

Цель исследования. Целью настоящего исследования явилось раскрытие иммунобиологической роли главных пентраксинов человека - С-реактивного белка и сывороточного амилоида Р - в неспецифических защитных реакциях и общей системе иммунорегуляции.

Задачи исследования.

1) сравнить характер эффектов СРБ и САР в отношении широкого круга функций лейкоцитов крови in vitro;

2) оценить возможность синтеза иммуномедиаторов лейкоцитами крови под влиянием пентраксинов;

3) изучить механизм митогенного эффекта СРБ в отношении лимфоцитов периферической крови;

4) исследовать характер влияния пентраксинов на синтез антител и переключение их классов in vivo и in vitro;

5) изучить индукцию синтеза СРБ в гепатоцитах in vitro самим СРБ и его тафтсиноподобными тетрапептидами;

6) определить значение пентраксинов для адгезии, пролиферации и изменения морфологии фибробластов.

Научная новизна. Основными результатами проведенной работы являются доказательство центральной роли СРБ и САР в кооперации неспецифических и иммунных механизмов на разных этапах защитной реакции и расшифровка роли пентраксинов в общей системе иммунорегуляции и сетевых иммуномедиаторных взаимодействиях.

В ходе работы впервые проведена оценка взаимодействия СРБ и САР с базофильными и эозинофильными гранулоцитами периферической крови. Установлено, что эти белки замедляют дегрануляцию базофилов и, напротив, усиливают секрецию гранул эозинофилов.

Ряд новых эффектов СРБ и САР установлен при изучении их взаимодействия с нейтрофильными гранулоцитами. Впервые показано разнонаправленное действие пентраксинов на адгезию нейтрофилов, когда

СРБ усиливает адгезивность нейтрофилов к субстрату, а САР ингибирует ее. Эти данные, а также не описанные ранее в литературе хематтрактантные свойства СРБ и САР, подтвердили существование рецепторов для этих белков на мембранах нейтрофилов и впервые показали взаимосвязь между рецепторами для САР и адгезионными свойствами нейтрофилов. Также впервые было показано, что под действием СРБ усиливается секреторная дегрануляция нейтрофилов, об интенсивности которой судили по уровню лизосомально-катионного теста, при этом САР не обладает таким свойством. Впервые показан принципиальный факт модуляции уровня иммуномедиаторов в надосадках культур нейтрофилов под влиянием пентраксинов. Установлено, что оба белка повышают содержание IL-6, который в свою очередь индуцирует синтез этих белков в гепатоцитах, а также TNFa, что имеет важную роль в системе контроля и регуляции воспалительного процесса. Показано, что СРБ, но не САР, повышает уровень IL-10 в культурах нейтрофилов, о чем ранее также не упоминалось в литературе. Кроме того, впервые показано отсутствие влияния пентраксинов на уровень IFNa в культурах нейтрофилов.

Результаты изучения эффектов пентраксинов на функции мононуклеарных фагоцитов крови также принесли ряд новых результатов. Подтверждена ассоциация рецепторов для СРБ с рецепторным комплексом FcyRII и впервые показана ассоциация рецептора для САР с CRI рецептором. Исследовано влияние пентраксинов на кислородный метаболизм мононуклеарных фагоцитов. Полученные результаты подтвердили данные литературы по стимулирующему влиянию СРБ на спонтанный и индуцированный кислородный метаболизм этих клеток. Впервые показано отсутствие влияния САР на спонтанный и его ингибиция индуцированного кислородного взрыва моноцитов. В литературе ранее не содержалось сведений об индукции синтеза IL-6 в мононуклеарных фагоцитах под влиянием обоих пентраксинов.

Впервые доказана реализация митогенного эффекта СРБ в отношении лимфоцитов периферической крови через содержащие фосфорилхолин структуры мембраны или CD-25 антиген лимфоцитов. Также впервые установлен факт конкуренции пентамерного и мономерного СРБ с IL-2 за CD-25 антиген. В литературе ранее отсутствовали сведения о влиянии пентраксинов на синтез лимфоцитами IL-2, IL-4 и IFNa. Показано, что СРБ и САР ограничивают продукцию IL-2 и IFNa, а также продукцию IL-4 стимулированными митогеном клетками. Одновременно найдено, что СРБ усиливает продукцию IL-4 нестимулированными лимфоцитами, а САР не изменяет этот показатель. Также впервые показана возможность индукции :упрессорной активности под действием СРБ и ингибиция NK-клеточной активности под действием САР.

В рамках исследования впервые показана модуляция пролиферацк фибробластов со стороны обоих пентраксинов и тафтсиноподобных пептиде молекулы СРБ, а также влияние этих пептидов на адгезивные свойств фибробластов.

Впервые разработана модель культивирования гепатоцитов in vitro течение 3 и более суток, на которой подтверждены данные литературы возможности индукции синтеза СРБ самим СРБ и его тафтсиноподобным пептидами. Кроме того, в условиях культивирования in vitro подтвержден фак разнонаправленного влияния иммуномедиаторов и тафтсиноподобны пептидов на синтез СРБ, концентрация которого в сыворотке крови нарастае в острую фазу, и трансферрина, концентрация которого, напротив, снижаете при воспалении.

Теоретическая и практическая значимость работы. Работа носи' теоретический характер. Значение полученных данных состоит в раскрыта! роли С-реактивного белка и сывороточного амилоида Р в осуществленш кооперации механизмов специфической и неспецифической резистентности обосновании роли пентраксинов как группы противовоспалительных i иммуносупрессивных медиаторов. Проведенный анализ иммунобиологические эффектов САР и его сравнение с эффектами СРБ позволили установить разную роль этих пентраксинов в ходе защитной реакции. Результаты позволили внести важные дополнения в общую систему цитокиновой сети и регуляцию иммунного ответа, что теоретически обосновывает новый подход к оценке состояния иммунокомпетентных клеток и сывороточных уровней СРБ и САР при широком круге патологий соединительной ткани и амилоидозов различной локализации. В ходе работы разработаны новые модификации метода очистки сывороточного амилоида Р из сыворотки крови, позволяющие повысить выход белка и его чистоту. Предложена модель культивирования гепатоцитов in vitro, которая может найти широкое применение в экспериментальных и клинико-иммунологических исследованиях, а также при тестировании новых лекарственных препаратов.

Положения, выносимые на защиту.

1. СРБ и САР являются компонентами системы гуморальных посредников между кровью и рыхлой соединительной тканью в осуществлении защитных и репаративных процессов. Эти пентраксины модулируют функции всех лейкоцитов крови и фибробластов рыхлой соединительной ткани.

2. На начальных этапах защитной реакции СРБ вызывает активацию и мобилизацию клеточных факторов неспецифической защиты. Одновременно СРБ осуществляет контроль остроты воспаления. САР также является компонентом системы отрицательных обратных связей, обеспечивая ограничение процесса воспаления и его контроль.

3. Пентраксины сдерживают развитие иммунного ответа, тормозя переключение классов синтезируемых антител.

4. Тафтсиноподобные пептиды молекулы СРБ участвуют в регуляции функций фибробластов и гепатоцитов. Эти пептиды модулируют синтез острофазовых белков в печени.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 1 Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи-Дагомыс, 1989), 9 Международном симпозиуме по атеросклерозу (Иерусалим, 1991), 1 съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата, 1992), симпозиуме "Пептидные биорегуляторы - цитомедины" (Санкт-Петербург, 1992), конференции "Критерии и методы оценки жизнеспособности тканей в раневом процессе" (Санкт-Петербург, 1993), симпозиуме "Нейроиммунология на пороге XXI века" (Санкт-Петербург, 1993), 3-м Международном симпозиуме "Иммунные последствия травмы, шока и сепсиса" (Мюнхен, 1994), на научной конференции "Здоровье и болезни человека на пороге XXI века" (Москва,1994), 2-й летней международной школе по иммунологии имени Дж.Хамфри (Пущино, 1994), Всероссийском симпозиуме "Проблемы иммунологии в оториноларингологии" (Санкт-Петербург,1994), конференции "Кроветворение и физиологические функции иммунной системы организма" (Санкт-Петербург, 1995), конференции молодых физиологов и биохимиков России (Санкт-Петербург, 1995), 1(Х1) Международном совещании и школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996), 4-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 1996), совещании по проблемам апоптоза (Москва, 1996), XXXIII Международном конгрессе по физиологическим наукам (Санкт-Петербург, 1997). Фрагменты работы также докладывались на заседаниях городского общества иммунологов (1988, 1989, 1995, 1997), конференциях профессорско-преподавательского состава Санкт-Петербургского государственного университета (1997) и Ветеринарной академии (1991, 1992), конференциях молодых ученых и специалистов НИИЭМ РАМН.

Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии НИИЭМ РАМН 19 сентября 1997 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 70 печатных работ, в том числе 3 обзора литературы, 32 статьи и 35 тезисов.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 8 глав, в которых приведены данные литературы, сводка использованных материалов и методов и результаты собственных исследований, их обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 280 страницах текста, включающего 76 рисунков и 39

таблиц. Библиографический указатель содержит 414 источников, из которых 74 принадлежит отечественным авторам и 340 -зарубежным.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследования проводили на выделенных моно- и полинуклеарах периферической крови 107 доноров. Для изучения влияния пентраксинов на первичный иммунный ответ использовали 45 самцов мышей линии СБА. Для характеристики взаимодействия СРБ и САР с фибробластами исследования проводили на клетках линии мышиных фибробластов L929. При моделировании острофазного ответа in vitro получали первичную культуру гепатоцитов крысы породы Wistar. Все животные были получены из питомника РАМН "Рапполово".

С-реактивный белок был любезно предоставлен Л.К.Берестовой (НИИ вакцин и сывороток, Санкт-Петербург). Белок выделяли из асцитной жидкости больных опухолями яичников с помощью ионообменной хроматографии на целюлозе DE-32 или DE-52. Концентрация электрофоретически и иммунохимически гомогенного СРБ составляла около 1 мг/мл по методу Лоури. Степень иммунохимической чистоты препарата контролировали для каждой партии СРБ. Она составляла не менее 99%. Белок хранили до использования в цитратном буфере при рН 6,2 с добавлением 0,01% азида натрия при 4°С в стерильных условиях. Перед использованием СРБ диализовали против 1000-кратного объема 0,15 М раствора NaCl при 4°С в течение 16-18 ч. Для получения мономерной формы белка нативный пентамерный СРБ (пСРБ) выдерживали в растворе НС1 на 0,14 М NaCl при рН 2,0 в течение 1 мин с последующим восстановлением реакции среды до нейтральной. В работе также использовали тафтсиноподобные пептиды из молекулы СРБ: TKPQ (Глп4-тафтсин), TKPL (Лей4-тафтсин), GKPR (Гли'-тафтсин) и тафтсин (TKPR), синтезированные путем твердофазного синтеза НПО "Вектор" (г.Новосибирск). Лиофилизированные пептиды хранили при -18°С. Пептиды растворяли в 0,14 М растворе NaCl, забуференном фосфатами, рН7,2-7,4 (ЗФР), устанавливая концентрацию 100 мкг/мл, и хранили в фасовках по 0,1 мл при -18°С до использования.

Сывороточный амилоид Р был выделен и охарактеризован В.М.Чмелевым (ВНИИ растениеводства РАН, Санкт-Петербург), которому автор выражает искреннюю благодарность. Белок получали из донорской плазмы, предварительно освобожденной от липопротеидов путем ультрацентрифугирования. На первом этапе выделения белка использовали аффинную хроматографию на Sepharose 4В. На втором этапе сравнивали

результаты ультрафильтрации через мембраны ХМ-100 (чистота препарата около 80%), гель-фильтрации на Ультрагеле АсА-34 (чистота препарата около 90%) и гель-фильтрации при средних давлениях (ВЭЖХ) на Superose-12 (чистота выделения более 98%). Последний метод, впервые использованный для выделения САР, был избран основным методом получения препарата.

Для идентификации полученного белка использовали нативный электрофорез, электрофорез в денатурирующих условиях, изоэлектрофокусирование и аминокислотный анализ. Все полученные характеристики (молекулярные массы нативной молекулы (около 250 kD) и мономера (24-25 kD), изоэлектрическая точка (pi около 5,7-5,8) и аминограмма) полностью соответствовали данным литературы для САР. Белок не давал перекрестных реакций с антисыворотками к сывороточным иммуноглобулинам человека, СЗ компоненту комплемента и С-реактивному белку. Также отрицательный результат был получен и в Limulus-тесте на наличие бактериальных эндотоксинов.

Для изучения влияния пентраксинов на гранулоциты периферической крови использовали следующие методы витральной работы. Влияние на базофилы (Бф) и эозинофилы (Эо) оценивали по дегрануляции клеток в ответ на внесение ЭБ, ЕА- и ЕАС-эритроцитов. Влияние СРБ и САР на адгезивность нейтрофилов (Нф) изучали по методу N.Yakuwa и соавторов (1989), в ходе которого адгезию Нф к пластиковой поверхности и коллагеновой подложке определяли по окрашиванию адгезировавших клеток кристалл-виолетом с последующей экстракцией красителя и оценке оптической плотности раствора. Для оценки влияния пентраксинов на хемотаксис Нф использовали метод миграции клеток под агарозой. При изучении влияния СРБ и САР на фагоцитарную активность Нф и Мф в качестве объектов фагоцитоза использовали ЭБ, ЕА- и ЕАС-эритроциты. Изменения кислородного метаболизма Нф под действием пентраксинов определяли в НСТ-тесте при классическом микроскопическом учете и в автоматизированной модификации, а мононуклеарных фагоцитов (Мф) - только в автоматизированном НСТ-тесте. Влияние пентраксинов на уровень лизосомально-катионных белков Нф оценивали методом микроскопического учета после окрашивания клеток раствором прочного зеленого, а активности миелопероксидазы - в цветной ферментативной реакции, результаты которой выражали в единицах оптической плотности (ед. ОП). Уровень синтеза РНК в Нф и транспорт аминокислот определяли с использованием меченых 3Н-уридина и 3Н-аминокислот соответственно. Уровень цитокинов в надосадках культур гранулоцитов или Мф определяли в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием коммерческих наборов на эти медиаторы (IL-lp, TNFa, IFNa), либо в биотесте (IL-6).

При характеристике взаимодействия пентраксинов и лимфоидны; клеток оценивали влияние СРБ и САР на спонтанный и митоген индуцированный митогенез (ФГА и PWM), на супрессорную активность Т лимфоцитов (методом радиометрического учета) и на активность ИК-клето! (в цитотоксическом тесте с использованием линии К 562). Также исследовал* влияние этих белков на синтез иммуномедиаторов в культурах мононуклеаро! (IL-ip, IL-2, IL-4, IL-6, TNFa, IFNa) и на продукцию иммуноглобулинов А М, G, Е под действием PWM in vitro.

Для изучения влияния СРБ и САР на первичный иммунный ответ мышам СБА вводили по 100 мкг/мышь СРБ в пентамерной или мономерной формах, САР, либо их комбинаций на фоне иммунизации 5»108 ЭБ. На 5-е сутки после иммунизации в реакции гемагглютинации определяли титр общих гемагглютинирующих AT к ЭБ, титр IgM и IgG к ЭБ, число IgM- и IgG-антителообразующих клеток (АОК) в реакции локального гемолиза в геле и гемолитическую активность комплемента (в единицах СН50).

При изучении влияния САР, СРБ и его тафтсиноподобных пептидов на морфологию фибробластов (Фб) линии L929 использовали гистологические методы и световую микроскопию, о пролиферации Фб судили по включению 3Н-тимидина через 48 и 72 ч культивирования, для оценки их влияния на адгезию Фб использовали тот же метод, что и при изучении адгезивных свойств Нф.

При моделировании острофазного ответа in vitro использовали культуру гепатоцитов крыс, а продукцию СРБ и трансферрина определяли методом cellELISA через 24, 48 и 72 ч после начали культивирования. Автор искренне благодарит к.м.н. Е.Я.Адоеву, которая выполнила основную часть исследований по этому разделу.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ПЕНТРАКСИНЫ И ГРАНУЛОЦИТЫ. Базофилам и эозинофилам принадлежит важная роль в запуске и контроле воспаления, поэтому в рамках исследования впервые была проведена оценка взаимодействия СРБ и САР с этими клетками. В табл.1 приведены результаты, характеризующие соотношение дегранулированных и недегранулированных форм Бф и Эо после инкубации с различными концентрациями белков в течение 1 ч. При совместном действии с ЭБ СРБ незначительно повышает процент дегрануляции Бф, но снижает его при действии с ЕА-системой. При всех концентрациях СРБ ответ на ЕАС-систему состоял в дополнительном усилении дегрануляции. САР, действуя с любыми тест-эритроцитами, во всех концентрациях снижал долю Бф с признаками дегрануляции. При частотном

анализе показателей ИД для СРБ и САР различия в характере их влияния на Бф оказались достоверными. Приведенные результаты также свидетельствуют,

Таблица 1

Показатели Индекса Дегрануляции (ИД) базофилов и эозинофилов при различных концентрациях СРБ и САР, п=14 по каждой точке.

Белки и их концентрации, мкг/мл ЭБ ЕА ЕАС

Бф Эо Бф Эо Бф Эо

0 (контроль) 0,79 0,77 1,00 1,11 0,87 1,40

СРБ 1,0 0,73 0,83 0,60 1,00 1,25 1,12

10,0 1,00 1,94 2 0,92 1,27 2,17 1,71

100,0 1,07 0,79 0,88 1,33 1,20 1,00

САР 1,0 0,71 1,36 0,76 1,16 0,60 0,67

10,0 0,52 2 1,36 0,75 1,33 0,73 1,21

100,0 0,62 1,39 0,86 1,29 0,53 1,63

Примечание: Ъ- различия с контролем достоверны по критерию Ъ для р<0,05.

2,5 2,0 1,5 4 1,0 0,50,0

Рис.1. Влияние СРБ п САР на хемотаксис нейтрофилов.

Горизонтальная черта -спонтанная миграция Нф (принята за единицу), п=97. По оси абсцисс: 1-СРБ, 10 мкг/мл; 2 - СРБ, 100 мкг/мл; 3- САР - 10 мкг/мл; 4 - САР, 100 мкг/мл (п=26 по пунктам 1-4); 5 - ЛПС, 80 мкг/мл, СРБ и САР отсутствуют; 6 - миграция к ЛПС в присутствии 100 мкг/мл СРБ; 7 - миграция к ЛПС в присутствии 100 мкг/мл

САР (п=25 по пунктам 5-7). По оси ординат - значение Показателя Хемотаксиса. Здесь и далее по тексту * - различия с контролем достоверны по I критерию Стьюдента при р<0,05; ** - при р<0,01 (для №7 - различия достоверны с №5).

я о

0

1

Е

0 х д

1

я

(3 *

о с

7

что в отсутствие острофазовых белков в контроле при переходе от ЭБ к ЕАС-эритроцитам доля измененных форм Эо возрастала от 0,77 до 1,40. Добавление в культуры СРБ и САР приводило к росту фагоцитарной активности и усилению дегрануляции Эо. Следовательно, как СРБ, так и САР в целом

повышали число измененных Эо, что можно рассматривать как проявление противовоспалительной активности.

Одновременно при оценке влияния СРБ и САР на продукцию 1Ь-4 гранулоцитами (вероятнее всего, базофилами) не удалось обнаружить достоверных отличий от контроля, хотя в целом оба белка незначительно повышали её.

На рис.1 приведены результаты оценки влияния пентраксинов на миграционную активность Нф. Из приведенных результатов видно, что нативный пентамерный СРБ является хематтрактантом для Нф. Максимальный эффект связан с концентрацией СРБ 10 мкг/мл (ПХ=1,77, р<0,01) и ослабевает при переходе к 100 мкг/мл (ПХ=0,92). САР также проявил свойство привлекать Нф; при этом его эффект не зависел от дозы препарата (ПХ для 10 и 100 мкг/мл САР равен 1,73 и 1,71 соответственно, р< 0,05 в обоих случаях). На рис.1 также представлены результаты, характеризующие влияние пентраксинов на миграцию Нф, индуцированную бактериальным ЛПС (столбцы 5-7). В отсутствие пентраксинов Нф перемещаются к лунке с ЛПС в 2,68 раза быстрее, чем к лунке с культуральной средой. При внесении к клеткам СРБ до конечной концентрации 100 мкг/мл показатель ПХ снижается до 1,60, а при внесении САР в тех же условиях - до 0,58, что означает достоверную ингибицию миграционной способности Нф, индуцированной ЛПС (р<0,05). Таким образом, связывание лигандов с рецепторами Нф для СРБ и САР важно для миграционной активности Нф, но следствием такого связывания становится ее ингибиция.

Прикрепление Нф к субстрату является обязательным условием проявления их биологической активности. Из данных табл. 2 видно, что СРБ достоверно стимулирует прикрепление Нф к пластику в концентрации 100 мкг/мл, повышая адгезивность на 25% (р<0,001). Одновременно САР в концентрации 10 мкг/мл ограничивал адгезивность клеток, уменьшая ее на 12% (р<0,01). Разнонаправленный характер влияния СРБ и САР в этом тесте подтверждается частотным анализом.

Таблица 2.

Влияние СРБ и САР на адгезию нейтрофилов, единицы ОП, п> 72.

Финальные концентрации белков, мкг/мл СРБ САР

Х±5 %% Х + Б %%

0 (контроль) 0,147 ±0,004

1,0 0,143 ±0,006 -2,7 0,140 ±0,006 -4,8

10,0 0,154 + 0,007 +4,8 0,129 ±0,006 ** -12,2

100,0 0,183 ±0,009 *** +24,5 0,140 ±0,007 -4,8

Результаты указывают, что СРБ усиливает адгезивность нейтрофилов к пластику на 25%, а САР ослабляет ее на 12%. Модуляция адгезии была связана

прежде всего с влиянием через рецепторы еще не адгезировавших, находящихся в суспензии Нф, при локализации пентраксинов в растворе, а не на пластике.

На поверхностях ЭБ, ЕА или ЕАС-эритроцитов отсутствуют типичные лиганды СРБ или САР. Поэтому эффекты пентраксинов в отношении фагоцитоза этих объектов не связаны с опсонизацией, но отражают их влияние на уровне мембраны Нф. На основании анализа средних значений по 16 донорам не удалось выявить какого-либо влияния со стороны этих белков на процесс поглощения различных тест-эритроцитов. Однако результаты проведенного частотного анализа косвенно указывают на связь рецептора для СРБ, но не САР, на Нф с рецепторным паттерном FcyR.II.

Полученные результаты указывают на значимую роль С-реактивного белка и сывороточного амилоида Р в регуляции кислородного метаболизма Нф (табл.3).

Таблица 3

Влияние СРБ и САР на кислородный метаболизм (КМ) Нф, ед. ОП, X п>48 по каждой точке.____

Белок и его концентрация спонтанный КМ стиму лир ов анный 20 мкг/мл ЛПС стимулированный опсонизированны м зимозаном

0 (контроль) 0,164 ±0,004 0,230 ±0,010 0,370 ±0,013

СРБ 1,0 0,168 ±0,007 0,239 + 0,017 0,299 ±0,012**

10,0 0,173 ±0,006 0,237 ±0,016 0,293 ±0,013***

100,0 0,190 ±0,006 *** 0,268 ±0,018* 0,303 ±0,021 **

САР 1,0 0,167 ±0,004 0,232 ±0,016 0,301 ±0,011 ***

10,0 0,172 ±0,005 0,233 ±0,015 0,340 + 0,013

100,0 0,181 ±0,006* 0,253 ±0,016 0,284 ±0,014***

Приведенные в табл.3 данные показывают, что как СРБ, так и САР способны достоверно усиливать продукцию активных форм кислорода в нестимулированных Нф. Свободные от бактериальных ЛПС СРБ и САР повышают продукцию активных форм кислорода на 15,8% (р<0,001) и 10,4% (р<0,05). При совместном действии пентраксинов с ЛПС СРБ сохраняет способность к дополнительной стимуляции респираторного взрыва и вызывает в концентрации 100 мкг/мл дополнительный прирост продукции супероксиданиона на 16,5% (р<0,05). САР при совместном действии с ЛПС утрачивает способность к костимуляции. Однако при добавлении пентраксинов в культуры Нф, стимулированных мощным индуктором кислородного взрыва - опсонизированным зимозаном - характер действия эбоих белков меняется, и они снижают продукцию активных форм кислорода в активированных Нф (СРБ - на 18-20% в концентрациях 10-100 мкг/мл, САР - на 23,4% в концентрации 100 мкг/мл, р<0,001 в обоих случаях). Следовательно,

при стимуляции продукции О2 СРБ оказывает более выраженное влияни чем САР, а при ингибиции кислородного взрыва, напротив, эффект САР бот заметен, чем эффект СРБ. В ходе частотного анализа разнонаправленны характер влияния СРБ на нестимулированные и стимулированные зимозано Нф полностью подтвердился (X2 = 7,77, р<0,05). Одновременно этот критери не подтвердил разнонаправленного влияния САР, что, вероятн! свидетельствует о противовоспалительном характере влияния этого белка, ходе частотного анализа ни для СРБ, ни для САР не было обнаружен зависимости в характере эффектов от пола или возраста доноров.

Рис.2. Влияние СРБ и САР и

показатель JIKT нейтрофилов.

По оси абсцисс: 1 - контр о л (ЗФР), 2 - пСРБ, 3 - мСРБ, 4 - CAI Концентрации всех белков равн] 100 мкг/мл. По оси ордина: значение СЦК. Число наблюдени по каждой точке равно 12.

На рис.2 представлены результат] лизосомально-катионного теста нейтрофилах и влияние на него белков острой фазы. Пентамерный : мономерный С-реактивный белок и сывороточный амилоид Р понижаю значение среднего цитохимического коэффициента с 1,63 в контроле до 1,31 1,27 и 1,40 соответственно. Из данных литературы известно, что в норм значение СЦК составляет в среднем 1,50 ± 0,07. Мономерный СРБ вызывае наиболее заметное снижение среднего цитохимического коэффициента, слабе влияет пСРБ, а действие сывороточного амилоида Р, хотя и имеет ту ж направленность, носит недостоверный характер. Результаты оценю активности МП представлены на рис.3. Ни пСРБ, ни САР достоверно и изменяли активность МП. Достоверное снижение уровня МП, локализованно! в Нф, происходило лишь под действием мСРБ. Внесение СРБ и CAP i культуры нейтрофилов вызывало достоверный прирост включения 3Н уридина, что трактуется как признак активации этих клеток . Результата приведены в табл.4.

В табл.5 приведены результаты оценки уровня иммуномедиаторов i культурах гранулоцитов., более 95% которых составляли Нф. В ходе работь проводили оценку уровней тех медиаторов, возможность синтеза которых i Нф была показана ранее другими авторами. Результаты оценки уровш иммуномедиаторов в культурах гранулоцитов показывают, что уже с первые минут воспалительной реакции выделяются медиаторы, усиливающие

Рис.3. Влияние СРБ и САР на активность миелопероксидазы

нейтрофилов.

По оси абсцисс: 1 - контроль (ЗФР), 2 - пСРБ, 3 - мСРБ, 4 - САР. Концентрации всех белков равны 100 мкг/мл. По оси ординат: единицы ОП. Число наблюдений по каждой точке равно 155.

Таблица 4

Влияние СРБ и САР на включение 3Н-уридина в нейтрофилы, имп/мин.

Концентрации белков, мкг/мл СРБ САР

X±s | ИС Х± s | ИС

0 (контроль) 312 ±17

ФГА (12,5 мкг/мл) 1066 ±69

1,0 582 ±66 *** 1,87 430 ±32 ** 1,38

10,0 489 ±69 *** 1,57 525 ±44 *** 1,68

100,0 414 ±43 ** 1,33 525 ±72 *** 1,68

Примечание: ИС - индекс стимуляции включения 3Н-уридина. Число наблюдений по каждой опытной точке - не менее 32, в контролях - 66.

Таблица 5.

Уровни различных медиаторов в супернатантах культур Нф в присутствии белков острой фазы воспаления (БОФ), п = 16 по каждой точке.

Медиаторы и единицы измерения Концентрация БОФ СРБ САР

IL-ip, пг/мл 0 661 ± 33

ФГА 727 ± 36 *

1,0 633 ± 32 642 ± 30

10,0 1297 ±75*** 664 ± 33

100,0 1076 ±92** 475 ±33 **

IL-6, Ед/мл 0 37 ±2

ФГА 80 ±4 ***

1,0 84 ± 4 *** 80 ±6 ***

10,0 86 ±4 *** 100 ±5 ***

100,0 110 ±9*** 120 ±6 ***

TNFa, пг/мл 0 164 ±8

ФГА 180 ±8

1,0 176 ±8 346 ± 16***

10,0 214+ 10* 226 ±10*

100,0 276 ±13* 234+ 11 *

IFNa, пг/мл 0 126 ±2

ФГА 133 ± 13

1,0 116±6 133 ±7

10,0 122 ±2 123 ±4

100.0 !!2 ± 16 118 ± 4

синтез острофазовых белков. Существенно, что сами СРБ и САР, влияя на Нф, стимулируют выброс IL-6 и IL-1(3, которые в свою очередь обеспечивают синтез новых порций пентраксинов в печени, т.е. формируется петля усиления синтеза БОФ, лишний раз подтверждающая их важную роль в защитных реакциях и отражающую высочайший уровень согласованности в осуществлении неспецифических защитных и иммунных реакций.

ПЕНТРАКСИНЫ И МОНОНУКЛЕАРНЫЕ ФАГОЦИТЫ. Результаты оценки фагоцитарной активности Мн/Мф в присутствии СРБ или САР свидетельствуют об отсутствии выраженного влияния пентраксинов на данный показатель. Одновременно данные частотного анализа и частичная ингибиция фагоцитоза ЕАС-эритроцитов со стороны САР указывают на ассоциацию рецептора для САР с CR1 - рецептором СЗЬ, что показано впервые. СРБ, но не САР, при действии на Мн, усиливал эндоцитоз красителя (табл.6), и этого эффекта не было отмечено для Нф. Вероятно, уровень эндоцитоза красителя, не опосредованного специальными рецепторами, отражает скорость оборота плазматической мембраны и может рассматриваться как ещё один показатель активации клетки. Не случайно уровень эндоцитоза красителя коррелировал с продукцией Мн/Мф активных форм кислорода ( г = 0,802 ± 0,267, р< 0,05).

Таблица 6

Влияние СРБ и САР на поглощение частиц красителя Мн/Мф, единицы ОП.

Финальные концентрации белков, мкг/мл СРБ САР

X + s %% X±s %%

0 (контроль) 0,071 ± 0,001

1,0 0,069 ±0,001 -2,8 0,070 ±0,001 -1,4

10,0 0,071 ±0,001 0 0,070 ±0,001 -1,4

100,0 0,082 ±0,001*** + 15,5 0,065 ±0,001** -9,2

Примечание: Число наблюдений в опыте - по 36, в контроле -72.

Таблица 7

Влияние СРБ и САР на кислородный метаболизм мононуклеарных фагоцитов, ед.ОП, п = 120 по каждой точке._

БОФ и его концентрация Спонтанный КМ КМ, стимулированный опсонизированным зимозаном

X ± s %% X ± s %%

0 (контроль) 0,073 + 0,002 - 0,084 + 0,002 -

СРБ 1,0 0,069 ±0,002 -5 0,081 ±0,002 -4

10,0 0,072 ± 0,002 -1 0,081 ±0,003 -4

100,0 0,093 ±0,003 *** +27 0,097 ±0,003 *** + 15

САР 1,0 0,071 ±0,002 -3 0,086 ± 0,003 + 2

10,0 0,069 ±0,002 -5 0,082 ±0,003 -2

100,0 0,069 ± 0,002 -5 0,073 ±0,002*** -13

В табл.7 приведены данные, характеризующие влияние СРВ и САР на кислородный метаболизм мононуклеарных фагоцитов. Только СРВ, но не САР, вызывает усиление продукции активных форм кислорода в Мн/Мф, повышая в концентрации 100 мкг/мл продукцию активных форм кислорода на 27% (р<0,001). Кроме того, СРВ, действуя на Мн/Мф в присутствии опсонизированного зимозана, сохраняет свои провоспалительные свойства и усиливает продукцию 02-на 15% (р< 0,001). САР в концентрации 100 мкг/мл, как и в случае Нф, уменьшает продукцию супероксиданиона на 13% (р<0,001). Частотный анализ позволяет также сравнить эффекты СРВ и САР в отношении мононуклеарных фагоцитов и Нф. Установлено, что эффекты СРБ в концентрации 100 мкг/мл как наиболее демонстративной для спонтанного кислородного метаболизма обеих групп фагоцитов достоверно не различались (X2 = 3,51, р>0,05), однако они различались для зимозан-стимулированного метаболизма, когда в случае Мн СРБ сохранял провоспалительные свойства, в то время как характер эффектов СРБ в случае Нф менялся на противоположный = 6,02, р<0,05).

Напротив, характер влияния САР на Нф и Мн различался в случае спонтанного метаболизма, когда САР содействовал усилению продукции активных форм кислорода нейтрофилами, а для мононуклеарных фагоцитов не изменял этот показатель (JJ = 12,82, р< 0,01), но не различался для индуцированного зимозаном кислородного метаболизма, когда в обоих классах лейкоцитов САР ингибировал кислородный взрыв = 0,31, р» 0,05).

Кроме того, найдена достоверная корреляция между уровнем продукции Ог~ в Мн и продукцией ими IL-ip (r=0,647 ± 0,220, р<0,05). Одновременно уровень кислородного метаболизма не коррелировал с продукцией мононуклеарными фагоцитами IL-6, TNFa и IFNa.

В рамках работы было проведено изучение влияния пентраксинов на продукцию шести иммуномедиаторов мононуклеарами периферической крови, главными продуцентами трех из которых (IL-ip, IL-6, TNFa) являются Мн/Мф (табл.8). Из данных таблицы видно, что СРБ в концентрации 100 мкг/мл усиливал продукцию IL-1 (5 нестимулированными мононуклеарными фагоцитами с 750 пг/мл до 981 пг/мл, т.е. на 31% (р<0,01), хотя концентрации 1,0 и 10,0 мкг/мл также обеспечивали некоторый прирост ( + 11%, р>0,05 и: + 14%, р<0,05). САР максимально обеспечивал прирост на 14% при концентрации 10 мкг/мл (р>0,05), а при концентрациях 1,0 и 100,0 мкг/мл в его присутствии продукция IL-ip реально не отличалась от контроля. В культурах мононуклеаров, стимулированных 12,5 мкг/мл ФГА-Р, СРБ в концентрациях 10,0 и 100,0 мкг/мл сохраняет способность к стимуляции продукции IL-lp in vitro (р<0,05 и р<0,01 соответственно). САР при тех же условиях не влияет на

продукцию 1Ь-1р, а при концентрации 100 мкг/мл несколько понижает ее (на 3,1%, р>0,05).

Таблица 8

Влияние СРВ и САР на продукцию 1Ь-1р, 1Ь-6 и ТОТа мононуклеарами периферической крови, п £ 18 по каждой точке, А - интактные клетки, Б - при стимуляции ФГА.

Медиатор и единицы измерения Концентрация БОФ СРБ САР

А Б А Б

1Ь-1Р, пг/мл 0 750 ± 37 1013 ± 51 750 ± 37 1013 ± 51

1,0 810 ±47 1171 ±58 728 ± 36 1013 ±74

10,0 854 + 43* 1424 + 71 * 921±146 1013 ± 101

100,0 981 ±49** 1551 ±77** 823 ± 47 981 ±49

1Ь-6, Ед/мл 0 280 ±17 660 ±31 280+ 17 660 ±31

1,0 720 ± 36 *** 660 ±29 540 ± 27 *** 640 ± 26

10,0 750 ±48 *** 800 ±40* 720 ±136*** 860 ±43*

100,0 740 ±39*** 920 ±76** 760 ± 97 *** 900 ± 74 **

тара, пг/мл 0 264 ± 12 3576 ±166 264 ± 12 3576±166

1,0 584 ± 127* 3250 ±151 363 ± 17* 3632±169

10,0 542 ± 160* 3344 ±155 398 ± 56 * 3584 ± 97

100,0 632 ± 58 ** 2905 ±135* 432 ± 80 * 3520±17

СРБ и САР достоверно усиливают продукцию 1Ь-6 уже начиная с концентрации 1,0 мкг/мл, что способствует усилению синтеза самих этих белков (табл.8). При митогенной стимуляции как СРБ, так и САР в концентрациях 10-100 мкг/мл сохраняют способность усиливать продукцию 1Ь-6 в культурах мононуклеаров периферической крови (р< 0,05 и р<0,01 соответственно). Возможно, это отражает двойственный характер эффектов самого 1Ь-6, который обладает как про-, так и противовоспалительными потенциями, поэтому сам обнаруженный факт усиления синтеза 1Ь-6 как Нф, так и Мн/Мф можно трактовать двояко, в том числе и как проявление противовоспалительных эффектов этого медиатора. Оба пентраксина достоверно усиливали продукцию П^Ра в культурах, нестимулированных митогеном, в концентрациях 1-100 мкг/мл. Средний прирост продукции ТЛЕа под действием СРБ составил 2,3 раза (р<0,05), под действием САР - 1,5 раза (р<0,05). Следовательно, пентраксины усиливали не только продукцию 1Ь-6, но и ТОТа, который по данным литературы ослабляет синтез СРБ, индуцированный 1Ь-1р и 1Ь-6 и , вероятно, не влияет у человека на синтез САР. Таким образом, при действии пентраксинов одновременно закладываются как путь усиления их продукции, опосредованный 1Ь-1р и 1Ь-6, так и путь негативной регуляции, опосредованный "ШИсх (табл.8).

В условиях митогенной стимуляции СРБ в высоких концентрациях (100 мкг/мл) достоверно снижал уровень ТЬТа в надосадках культур от 3580 пг/мл

до 2900 пг/мл, т.е. на 19% (р<0,05). В случае САР влияния на продукцию TNFa в культурах митоген-стимулированных мононуклеаров не выявлено (минимальное значение 3520 пг/мл при концентрации 100 мкг/мл, т.е. снижение на 1,7%, р>0,05).

Таким образом, характер эффектов СРВ в отношении мононуклеарных фагоцитов имеет в целом провоспалительную направленность. В концентрации 100 мкг/мл он повышает уровень продукции супероксиданиона без других стимуляторов на 27% (р<0,001), а при совместном действии с опсонизированным зимозаном, который относится к мощным стимуляторам кислородного метаболизма фагоцитов, дополнительно усиливал продукцию Ог" на 15% (р<0,001). Одновременно СРВ усиливал продукцию иммуномедиаторов, при этом усиление продукции IL-1 и IL-6 имело место как при действии на интактные, так и стимулированные клетки, а TNFa - только при действии на интактные клетки.

Характер влияния САР на мононуклеарные фагоциты определить однозначно довольно трудно. С одной стороны, САР не усиливает спонтанный кислородный метаболизм Мн/Мф и ослабляет его при индукции опсонизированным зимозаном, снижает интенсивность эндоцитоза, достоверно не изменяет продукции IL-1 как в интактных, так й стимулированных клетках и, а с другой - всегда усиливает продукцию IL-6 и повышает уровень TNFa в супернатантах от интактных, но не стимулированных культур. И все же, вероятно, направление эффектов САР можно оценить как противовоспалительное, так как сам IL-6 может рассматриваться и как про-, и как противовоспалительный цитокин.

ПЕНТРАКСИНЫ И ЛИМФОЦИТЫ. СРВ является слабым митогеном только при сохранении пентамерной структуры молекулы. Достоверный митогенный эффект связан только с СРВ в концентрациях 10-100 мкг/мл, когда СРВ усиливает включение 3Н-тд в 2,1 и 2,7 раза соответственно (табл.9). В диапазоне изученных концентраций САР усиливал включение 3Н-тд в 1,5 раза , однако его эффект не зависел от дозы белка и не подтверждался статистически (средний уровень включения для САР 320 имп/мин при контроле 213 имп/мин). Различия в направлении эффектов между СРВ и САР были подтверждены в ходе частотного анализа, при котором также показано наличие несомненного митогенного эффекта СРВ у 27 из 30 обследованных доноров и только в 3 случаях митогенный эффект отсутствовал.

Для изучения механизма митогенного эффекта СРВ использовали его различные лиганды, связывание которых с СРВ было опосредовано сайтом связывания главного лиганда - фосфорилхолина (ФХ) (С-полисахарид, липопротеиды высокой, низкой и очень низкой плотности) или происходило без участия этого сайта (N-aueran-D- галактозамин). Результаты, приведенные

на рис.4, свидетельствуют, что ингибиция митогенного эффекта СРБ имела место только в случае его лигандов, блокировавших сайт связывания ФХ. Митогенность СРБ почти полностью отменялась свободным С-полисахаридом клеточной стенки пневмококков, который чрезвычайно богат ФХ. Кроме того, ингибирующий эффект ЛП возрастал в ряду ЛПОНП-ЛПНП-ЛПВП по мере

Таблица 9

Влияние СРБ и САР на спонтанную и митоген-индуцированную пролиферацию лимфоцитов, имп/мин, 18 по каждой точке.________________

Митоген и его концентрация, мкг/мл Концентрация БОФ СРБ САР

Х±5 ис Х±в ИС

Без митогена 0 213 ±12

1,0 330 ±62 1,55 316 ±126 1,48

10,0 442 ±53 *** 2,08 315 ±56 1,48

100,0 568 ± 59 *** 2,67 323 ± 39 1,52

ФГА-Р, 12,5 мкг/мл 0 6177 ±338 [29,01

1,0 5863 ± 374 0,95 6257 ± 399 1,01

10,0 6212 ± 361 1,01 6171 ±403 1,00

100,0 5832 ± 484 0,94 6029 ±477 0,98

Р\УМ, 2 мкг/мл 0 2953 ±295 [13,91

1,0 2994 ±408 1,01 2004 ±215 0,68

10,0 3233 ±368 1,10 2230 ±231 0,76

100,0 3332 ± 232 1,13 1671 ± 219 (2) 0,57

ИС

Примечание: (X)- различия с контролем достоверны по критерию Ъ для р<0,05. ■ индекс стимуляции.

Рис.4. Ингибиция

митогенного эффекта С-реактивного белка

соединениями, содержащими фосфорилхолни.

По горизонтальной оси: включение 3Н-тд лимфоцитами по сравнению с эффектом 100 мкг/мл СРБ в %%. По вертикали: 1- интактные клетки;

2 - СРБ, 100 (принято за 100%);

3 - СРБ (100) + С-полисахарид (100); 4 - СРБ (100) + ЛПОНП (10); 5 - СРБ (100) + ЛПНП (10); 6 - СРБ (100) + ЛПВП (10); 7 -

СРБ (100) + М-ацстил-В-галактозамшг (100). Все финальные концентрации выражены в мкг/мл. Число наблюдений по каждой точке равно 18. ** -различия с контролем (столбик № 2) достоверны при р<0,01; *** - при р<0,001.

увеличения содержания богатых ФХ фосфолипидов в молекулах ЛП. Одновременно другой лиганд СРБ - К-ацетил-О-галактозамин - даже при концентрации 100 мкг/мл, что составляло 2000-кратный избыток по отношению к СРБ в молярном соотношении, не влиял на взаимодействие через ФХ-сайты и не отменял митогенный эффект СРБ. Следовательно, митогенный эффект СРБ может быть основан на пентамерности его нативной молекулы и сшивке ФХ-содержащих группировок плазмалеммы лимфоцитов, что ведет к кэппингу, эндоцитозу и активации клеток.

Одновременно было показано, что митогенный эффект СРБ может реализоваться через CD25 -антиген- рецептор IL-2, за который мономерный и пентамерный СРБ дозозависимо конкурировали с rIL-2 человека и с анти-CD25- мкАТ ИКО-105.

Из данных на табл.9 также видно, что ни С-реактивный белок, ни сывороточный амилоид Р не оказывали влияния на индуцированную ФГА пролиферацию лимфоцитов периферической крови человека. При стимуляции митогеном лаконоса установлено, что СРБ в концентрациях 10 и 100 мкг/мл незначительно усиливал включение 3Н-тд на 9% и 13% соответственно (р>0,05 в обоих случаях). САР, напротив, в концентрации 100 мкг/мл снижал включение метки на 30%. Характер эффектов пентраксинов в отношении PWM-индуцированной пролиферации лимфоцитов коррелировал с характером их влияния на уровень ряда иммуномедиаторов в супернатантах. Обнаружены достоверные корреляционные зависимости между уровнем пролиферации под действием PWM и уровнями IL-2 ( г = 0,768 ± 0,185 , р<0,01), TNFa(r = 0,746 + 0,192,р<0,01) и IFNa(г = 0,620±0,227,р<0,05).

Метод оценки активности Т-супрессоров с современных позиций, вероятно, правильнее было бы именовать методом оценки уровня экспрессии цитокиновых рецепторов. Из данных рис. 5 видно, что

Рис.5. Влияние СРБ и САР на супрессорную активность мононуклеарных фагоцитов.

По оси ординат - % супрессии. 1 - спонтанные супрессоры (80 наблюдений), 2 - ФГА-супрессоры (80), 3 -СРБ- супрессоры (52), 4 -САР-супрессоры (64). * -различия со спонтанными супрессорами достоверны при р<0,05; ** - при р<0,01.

50 -40 30 20 -10 -0

**

+—'- I ' • I 1-M

12 3 4

*

формирование супрессорной активности было связано со стимуляцией лимфоцитов либо ФГА, либо СРВ (р<0,05), но не САР. Эти результаты хорошо согласуются с результатами оценки митогенного действия СРВ и САР. СРВ несомненно является митогеном для Т-лимфоцитов и вызывает экспрессию определенных рецепторов, что приводит к формированию небольшой, но достоверной супрессорной активности. САР, который не является митогеном для лимфоцитов периферической крови, не вызывает процесса активации лимфоцитов и не индуцирует образования новых рецепторов, соответствующих бластной форме, что приводит к отсутствию супрессорной активности у лимфоцитов, инкубированных в присутствии САР.

7000-1 6000500040003000200010000

Рис.6. Влияние СРВ и САР на активность NK-клеток.

По оси абсцисс: концентрации белков в мкг/мл; по оси ординат -включение 3Н-тд

клетками-мишенями линии К562, имп/мин. Белые столбики эффекты СРБ, черные столбики - эффекты САР. Горизонтальная черта - уровень включения 3Н-тд

мишенями в отсутствие NK-клеток. Число

наблюдений по каждой точке равно 33.

Приведенные на рис.6 результаты показывают, что СРБ в диапазоне концентраций 1-100 мкг/мл не оказывает влияния на функцию NK-клеток. Одновременно САР в концентрации 100 мкг/мл достоверно снижает активность NK-клеток на 12%. В ходе частотного анализа была подтверждена разная направленность эффектов СРБ и САР в отношении NK-клеток (ft2 = 10,30, р<0,01). Данный результат не был ранее описан в литературе.

В исследуемую панель иммуномедиаторов, помимо IL-ip, IL-6 и TNFa, входили также IL-2, IL-4 и IFNa, главными продуцентами которых являются лимфоциты (табл.10). Из результатов биологического тестирования уровня IL-2 на клетках Независимой линии CTLL-2 следует, что ни СРБ, ни САР не вызывают продукции IL-2 без митогенной стимуляции. При стимуляции ФГА повышается уровень IL-2 в контроле с 1 Ед/мл до 250 Ед/мл (табл.10). СРБ в диапазоне концентраций 1-100 мкг/мл достоверно снижает уровень IL-2 в

супернатантах : при концентрации 1,0 мкг/мл - на 35,4% , при концентрации 10,0 мкг/мл - на 51,0% , при концентрации 100,0 мкг/мл - на 38,4%. Влияние

Таблица 10

Влияние СРВ и САР на уровень 1Ь-2, 1Ь-4 п П^а в надосадках культур мононуклеаров периферической крови, А- без митогенной стимуляции, Б-при митогенной стимуляции.

Медиатор и единицы измерения Концентрация БОФ СРБ САР

А Б А Б

1Ь- 2 пг/мл 0 0±0 245 + 17 0±0 245 ±17

1,0 0±0 158 + 11 ** 1±1 214 ±15

10,0 0±0 120 + 8 *** 0 ±0 219 ±18

100,0 1± 1 151 + 26* 0±0 113 ±28***

1Ь-4, пг/мл 0 9 ± 1 19±4 9 ± 1 19 ±4

1,0 20 ± 4 11 ±2 22 ±8 13 + 4

10,0 20 ±6 13 ±2 16 ± 3 13 ± 3

100,0 24±2 * 8 + 0* 14 ± 2 9± 1 *

1Ш а, пг/мл 0 118 ± 6 148 ± 12 118 ± 6 148 ±12

1,0 103+12 116± 18 107 ±4 118 ±20

10,0 107 ±9 115 + 4 * 101+3* 115±6 * :

100,0 106 ±6 109 + 7* 104 ±5 130 ±5

САР наиболее заметно в концентрации 100 мкг/мл, когда он снижает уровень 1Ь-2 в супернатантах на 54,0% . Спонтанная продукция 1Ь-4 была очень низкой и составляла не более 8-10 пг/мл. Внесение в культуры СРБ или САР изменяло уровень продукции этого медиатора в сторону его повышения: максимально до 23 пг/мл в случае СРБ в концентрации 100 мкг/мл, что, однако, достоверно различалось с контролем (р<0,05), и до 16-20 пг/мл в случае САР при концентрациях 1-10 мкг/мл. При дальнейшем повышении концентрации САР до 100 мкг/мл уровень свободного 1Ь-4 в супернатантах снижался до 14 пг/мл. При совместном действии с митогеном лаконоса СРБ и САР в концентрации 100 мкг/мл достоверно снижали продукцию 1Ь-4 до уровня нестимулированных клеток (р<0,05), при этом достоверное ингибирующее влияние на митогенез при стимуляции Р\УМ оказывал только САР. Из данных табл.10 видно, что обследованные доноры обладали сравнительно высоким уровнем спонтанной продукции 1РЫа (118 пг/мл), а при стимуляции его уровень возрастал до 148 пг/мл. При влиянии на нестимулированные клетки как СРБ в концентрации 100,0 мкг/мл, так и САР в концентрации 10,0 мкг/мл достоверно снижали продукцию 1РКа (р<0,05). При стимуляции ФГА наблюдали зависимость характера эффектов СРБ и САР от митогена, когда как СРБ, так и САР в концентрациях 10-100 мкг/мл достоиерип ппнижягти продукцию ТРЫп на 20-26% (р<0.05).

Таблица 11

Влияние СРБ и САР на продукцию иммуноглобулинов in vitro, мкг/мл, п>18 по каждой точке._

Класс Ig Концентрация БОФ, мкг/мл без митогенной стимуляции при стимуляции PWM

СРБ | САР СРБ | САР

IgG 0 255 + 62 494 ±74

1,0 143 ±80 127 ±94 71 ±17*** 77 ±19***

10,0 447 ±221 253 ± 76 80 ± 14*** 120 ±43 ***

100,0 203 ±18 181 ±35 70 ± 28 * 60 ±18***

IgM 0 9 ± 4 35 + 4

1,0 17 ± 5 14 ± 4 8 ± 3 *** 8 ±2***

10,0 33 ±7** 17 ± 5 10±3*** 9 ±6 ***

100,0 19 ±6 17 ± 7 9±4*** 8 ±2***

IgA 0 9 ± 5 9±4

1,0 20 ±7 14 ± 3 9±2 9 + 3

10,0 44 ±7*** 19 ±7 11 ±2 9±2

100,0 23 ±6 21 +6 10 ±2 9± 3

IgE 0 0 ± 0 1,8 ±0,4

1,0 0±0 0 ±0 1,8 ±0,2 1,4 ±0,2

10,0 0±0 0±0 0,6 ±0,3 1,5 ±0,1

100,0 0,7 ±0,1 0 ± 0 0±0 1,4 ±0,2

Влияние пентраксинов на продукцию иммуноглобулинов разных классов оценивали в надосадках культур мононуклеаров после 96 ч инкубации при стимуляции Р\УМ или без неё (табл.11). СРБ и САР не изменяли синтеза в культурах нестимулированных митогеном мононуклеаров, а при стимуляции клеток Р\УМ в концентрациях 1-100 мкг/мл достоверно подавляли синтез (р<0,001). Одновременно пентраксины достоверно ингибируют синтез ^М в стимулированных Р\¥М культурах, однако в отличие от случая с ^О, СРБ в концентрации 10 мкг/мл повышал синтез ^М в культурах нестимулированных мононуклеаров (р<0,05). Полученные для lgA данные несколько отличаются от изложенных выше; Во-первых, стимуляция Р\УМ не обеспечивает прироста синтеза IgA, во-вторых, только СРБ в концентрации 10,0 мкг/мл, действуя на нестимулированные клетки, достоверно усиливает продукцию IgA в 4,9 раза от контроля (р<0,001). САР также обеспечивает прирост уровня 1§А (максимально при концентрации 100 мкг/мл в 2,3 раза) (р>0,05). Появление ^Е наблюдали при действии 100 мкг/мл СРБ на нестимулированные митогеном клетки, что совпадает с усилением синтеза 11,-4 в нестимулированных клетках под действием СРБ в той же концентрации. Под действием Р\¥М уровень ^Е возрастал до 1,8 нг/мл, при этом оба пентраксина вызывали снижение уровня ^Е в супернатантах: СРБ при концентрации 100 мкг/мл полностью отменял продукцию ^Е, а САР снижал ее до 1,4-1,5 нг/мл. СРБ является митогеном для лимфоцитов и его действие может реализоваться

как через содержащие фосфорилхолин структуры мембраны, так и через связывание CD-25, который в низкой плотности всегда имеется на мембране лимфоцитов даже вне активации. Одновременно СРБ не усиливает продукции IL-2 в клетках без митогенной стимуляции. Тем самым получает объяснение механизм митогенного действия СРБ в отношении лимфоцитов. Наиболее вероятно, что СРБ в пентамерной форме вызывает кластерообразование на мембране и последующий эндоцитоз кластера, что приводит к выходу лимфоцита из Go-периода и прохождению одного митотического цикла. Этот процесс сопровождается активацией лимфоцитов и экспрессией на их мембранах большего количества рецепторов для различных иммуномедиаторов, о чем косвенно свидетельствуют данные по оценке супрессорной активности лимфоцитов, где СРБ вызывал достоверный прирост супрессорной активности на 23,4%. Этому же способствует и влияние СРБ на мононуклеарные фагоциты, также имеющиеся в культуре, когда СРБ усиливал спонтанную, а также митоген-индуцированную продукцию IL-1(3, TNFa и IL6. Тем самым СРБ возвращает Т-лимфоциты (а по данным литературы именно они связывают СРБ) в клеточный цикл и может принимать участие в их предактивации. Обращает на себя внимание и то обстоятельство, что объектами действия СРБ, по-видимому, являются ТхО, ибо этот белок вызывает и синтез IL-4 нестимулированными Т-клетками, что, по литературным данным, приводит к дифференцировке ТхО в Тх2. Следовательно, СРБ, действуя на Т-лимфоциты, создает предпосылки развития ответа по гуморальному пути, что соответствует природе самого СРБ, повышение уровня которого происходит главным образом при бактериальных инфекциях.

Однако роль СРБ на ранних этапах ответа не ограничивается описанными моментами. Судя по результатам влияния СРБ на продукцию иммуномедиаторов, он ограничивает содержание IL-2 в надосадках культур. Тем самым создаются условия для ограничения пролиферации Txl, главным ростовым фактором которых является этот медиатор. Это указывает на лимитирующую роль СРБ в пролиферации Txl и может составлять важный механизм сдерживания иммунного ответа в период острого воспаления, когда в очаге поражения открыто и может быть процессировано очень большое число аутоантигенных детерминант. На сдерживание активности Т-хелперов также указывают данные по ингибиции продукции IFNa, также связанного с клеточным вариантом ответа.

Что касается САР, то практически все полученные данные указывают на его важную роль в создании отрицательных обратных связей, в сдерживании иммунного ответа. Сюда относятся отсутствие собственного митогенного действия, ослабление пролиферации лимфоцитов, индуцированной PWM,

неспособность к генерации супрессорной активности лимфоцитов, снижение активности NK-клеток, ослабление продукции IL-2 и IL-4 иптактными и стимулированными клетками, ингибиция синтеза IFNa, а также его эффекты в отношении мононуклеарных фагоцитов и секретируемых ими медиаторов.

Логичным представляется предположение, по которому в ходе иммуногенеза роль пентраксинов состоит в сдерживании иммунологических реакций на период острой фазы воспаления, когда открыты и доступны для распознавания и процессирования аутоантигенные детерминанты. Путь блокады, в котором как раз и могут принимать участие пентраксины, может состоять в сдерживании иммуногенеза (но не его отмене) и максимальной стимуляции неспецифических защитных реакций, что дает возможность клиренса воспалительного очага гранулоцитами и фибробластами и подтверждается приведенными данными. К тому же пентраксины могут обеспечивать экранирование наиболее уязвимых аутоантигенных структур.

Выдвинутое положение полностью подтверждается данными по синтезу иммуноглобулинов in vitro. Как СРВ, так и САР в физиологических концентрациях во всех случаях ослабляют продукцию иммуноглобулинов классов А, М, G и Е, индуцированную PWM. При этом сам СРБ в концентрации 10 мкг/мл достоверно усиливает продукцию IgM без митогенной стимуляции. Представляется вероятным, что механизм этой стимуляции синтеза IgM может быть похожим на механизм развития тимус-независимого иммунного ответа, когда СРБ вызывает перекрестную сшивку рецепторов В-лимфоцитов и запускает продукцию IgM. Как известно, при таком механизме стимуляции В-клеток класс синтезируемых АТ не переключается и не запускаются механизмы гипермутации, резко повышающие специфичность секретируемых АТ.

ПЕНТРАКСИНЫ И ПЕРВИЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ. Во всех изложенных в этом разделе экспериментах самцы мышей линии СВА были разделены на 6 групп (табл.12). Все белковые препараты вводили животным в количестве 100 мкг/мышь в объеме 100 мкл.

Титр общих гемагглютинирующих АТ к 5*108 Эб на 5-е сутки был сходным во всех группах. При этом во всех опытных группах значения титра АТ были выше, чем в контроле. Максимальный титр АТ был отмечен в группе 6, животные которой получали комбинацию САР и мономерного СРБ (9,5 ± 0,3 против 8,2 ± 0,7 в контроле). Однако результаты по суммарному титру АТ не могут дать полного представления о характере влияний пентраксинов на процесс иммуногенеза in vivo. Для изучения соотношения антител классов IgM и IgG к ЭБ, которые составляют подавляющее большинство АТ при ответе на этот антиген, использовали классический метод, основанный на разрушении

связей между _)'-цепью и мономерами 1яМ, что приводит к утрате пентамерности ^М и его способности вызывать агглютинацию (табл.12).

Таблица 12.

Соотношение долен и ^С аитител в титрах гемагглютинирующих АТ мышей обследованных групп.

Группа общий титр титр 1(>М титр 1йС

-l0g2 %% -Iog2 %% -l0g2 %%

1 -контроль 8,2 100 2,2 27,7 5,8 72,5

2- пСРБ 8,8 100 3,1 35,6 5,6 64,4

3- мСРБ 8,7 100 3,1 36,9 5,3 63,1

4- САР 8,3 100 3,2 35,6 5,8 64,4

5- пСРБ+САР 9,0 100 3,5 40,2 5,2 59,8

6- мСРБ+САР 9,5 100 3,4 38,2 5,5 61,8

Одинаковый суммарный титр гемагглютинирующих АТ обеспечивается разными соотношениями 1дМ и антител у мышей исследуемых групп. В контроле титр ^М был наименьшим (2,2 ± 0,4), в то время как почти во всех группах, получавших пентраксины, титр 1§М достоверно превосходил показатель контроля. Самый высокий титр ^М (и соответственно самый низкий титр ^С) был связан с группами, получавшими оба пентраксина. В группе 5 он составил 3,5 ± 0,5 (р<0,05), в группе 6 - 3,4 ± 0,2 (р<0,01). Высокий титр ]£М по сравнению с контролем обеспечивали и введенные по одиночке пентраксины. Пентамерный СРВ сохранял титр ^М равным 3,1 ± 0,2 (р<0,05), а САР - равным 3,2 ± 0,3 (р<0,05). Соответственно в этих группах снижалась доля в титре гемагглютинирующих АТ (табл.12). Полученные результаты указывают, что как СРВ в обеих формах, так и САР и их комбинации достоверно тормозят переключение классов синтезируемых АТ, понижая тем самым специфичность иммунного ответа.

Таблица 13

Общее число аитителообразующих клеток на селезенку мышей разных групп.

Группа масса селезенки, мг число IgM-AOK число IgG-AOK общее число АОК

1 110,4±4,1 31989 ±2378 20916 ±4983 52905 + 6877

2 144,0 ±6,0 *** 48430± 10801 31894 ±6900 80324 ±2515**

3 140,0 + 8,9* 47021 ±6699 22075 ±3128 69096 ± 8022

4 133,3 + 8,1 * 68090 ± 4855 *** 29284 ±2052 97374 ±7561 **

5 132,6 ±3,6 ** 66504 ±6789*** 30331 ±3215 96835 ± 11705**

6 154,3 ±9,2** 51829 ± 10785 27548 ± 5927 79377±16688

Результаты оценки числа прямых (^М-АОК) и непрямых (^в-АОК) аитителообразующих клеток приведены в табл.13. Из приведенных данных видно, что в контроле общее число АОК наименьшее по сравнению со всеми другими группами. Наиболее число АОК отмечено в группе 4 ( + 55% от контроля, р<0,05), и в группе 5 (+47% от контроля). Во всех опытных группах прирост общего числа АОК происходил за счет повышения числа 1§М-АОК,

но не IgG-AÓK, число которых во всех группах оставалось примерно одинаковым и достоверно не отличалось от контроля.

Число IgG-AOK, напротив, было наибольшим в контроле, где мыши не получали пентраксинов, и снижалось во всех экспериментальных группах. В контроле IgG- АОК составляли 40,3% от общего числа АОК на 106 ядерных спленоцитов, в то время как в группе 2 оно составляло 38,2%, в группе 6 -34,6%, в группах 3 и 5 по 31,4% и в группе 4 - 30,4% от общего числа АОК.

Следовательно, в ходе первичного иммунного ответа к тимус-зависимому антигену (ЭБ) пентраксины существенно изменяют характер реакции иммунной системы. Они не влияют на общий титр антител, но изменяют соотношение гемагглютинирующих AT классов IgM и IgG (за счет торможения переключения класса синтезируемых AT) в пользу IgM. Одновременно присутствие пентраксинов вело к увеличению числа АОК.

Результаты оценки роли пентраксинов, полученные в данном исследовании in vivo, полностью согласуются с результатами оценки их иммунобиологических эффектов in vitro и с полученными ранее результатами, особенно это касается данных по пролиферации, продукции иммуномедиаторов и синтезу иммуноглобулинов. Пентраксины не изменяют эффективности иммунного ответа - это один из самых важных выводов из результатов этого раздела, который основан на сходной продукции гемагглютинирующих антител к ЭБ. Вместе с тем, они тормозят рост специфичности иммунного ответа, что прямо следует из достоверно разного числа IgM- и IgG-AOK в селезенках мышей разных групп, а также из разных уровней циркулирующих AT этих классов.

ПЕНТРАКСИНЫ И ФИБРОБЛАСТЫ. Главный результат проведенных исследований состоит в доказательстве факта модуляции пентраксинами и продуктами их ограниченного протеолиза функций фибробластов. Впервые показано, что в разных концентрациях пентраксины и пептидные фрагменты СРБ усиливают пролиферацию Фб L929 и изменяют морфологию этих клеток (рис.7). Одновременно СРБ и САР связываются с рецепторами ФБ, вовлеченными в процесс их адгезии, и свободные пентраксины угнетают адгезивность Фб L929 (табл.14).

Таблица 14

Влияние конформационных вариантов СРБ и САР на адгезию фибробластов Ь929 к покрытой коллагеном поверхности, ед. ОП, п>8.

Белки 1,0 мкг/мл 10,0 мкг/мл 100,0 мкг/мл

ед. ОП | %% ед. ОП | %% ед. ОП | %%

0 0,654 ±0,016

пСРБ 0,800 ±0,012*** +22 0,795 ±0,043 ** +22 0,615 + 0,073 -6

мСРБ 0,728 ±0,015* + 11 0,718 ±0,013* + 10 0,620 ±0,074 -5

САР 0,730 ±0,022* + 12 0,710 + 0,033 +9 0,425±0,109 ** -35

Рис.7. Влияние СРВ и САР на включение 3Н-тд фибробластами через 48 ч после начала культивирования. По оси абсцисс: концентрации белков, по оси ординат - включение 3Н-тд, имп/мин. Серый столбик - контроль, белый

- влияние пентамерного СРБ, черный - влияние САР. Число наблюдений по каждой точке равно 8. *

- различия с контролем достоверны при р<0,05 по критерию t Стьюдента.

При этом остается открытым вопрос об идентичности этих сайтов связывания пентраксинов на Фб и их рецепторов на лейкоцитах крови. Повышение концентрации СРБ в сыворотке крови и его пептидов в очаге воспаления блокирует проникновение и прикрепление новых Фб в очаге до тех пор, пока очаг не очищен от обломков собственных клеток и проникших прокариотов и в нем поддерживается кислая реакция среды, вызывающая распад СРБ на мономеры и ограниченный протеолиз молекул пентраксинов. Эту же функцию блокады проникновения Фб в очаг может выполнять и свободный САР сыворотки, который уже в концентрации 10 мкг/мл, составляющей всего 15-20% от значения нормы, эффективно ингибирует адгезию Фб, связываясь с их рецепторами, и их закрепление в очаге воспаления. Принимая во внимание роль САР в адгезии и пролиферации Фб, можно предположить, что отложения САР вокруг воспалительного очага имеют целью ускорение пролиферации Фб и синтеза ими компонентов межклеточного матрикса, что и приводит в конечном счете к изоляции очага.

МОДЕЛИРОВАНИЕ ОСТРОФАЗНОГО ОТВЕТА ГЕПАТОЦИТОВ IN VITRO. Главный итог этого раздела состоит в экспериментальном подтверждении индукции синтеза С-реактивного белка самим СРБ (рис. 8) и в доказательстве модуляции печеночного синтеза СРБ его тафтсиноподобными последовательностями (рис.9). Кроме того, впервые создана модель, основанная на первичной культуре гепатоцитов, которая сохраняет свою жизнеспособность и адекватно реагирует на различные медиаторные сигналы в течение по меньшей мере 3 суток.

Под влиянием пентамерного СРБ человека продукция СРБ гепатоцитами крысы возрастала в 2,57 раза. Наиболее вероятно, что этот

1600012000800040000

эффект белка в отношении гепатоцитов не был прямым. Скорее всего, он опосредован медиаторными каскадами, и прежде всего, 1Ь-1 и 1Ь-6, которые могут синтезироваться купферовскими клетками печени.

Рис.8. Влияние экзогенного СРБ на синтез СРБ in vitro.

По оси абсцисс: 1 - контроль (интактные гепатоциты), 2 кондиционированная среда № 2 от стимулированных ЛПС мононуклеаров (12 пг/мл IL-lp и около 20 Ед/мл IL-6 в финальном разведении), 3 кондиционированная среда № 1 от стимулированных ФГА мононуклеаров (200 пг/мл IL-ip, 50 Ед/мл IL-2, 70 пг/мл IL-6 и 200 пг/мл TNFa в финальных концентрациях), 4- пентамерный СРБ человека, 50 мкг/мл. По оси ординат -единицы ОП. Горизонтальная черта - сорбция антисыворотки против СРБ к пластику. Число наблюдений по каждой точке равно 6. *** - различия с контролем достоверны согласно критерию t Стьюдента при р<0,001.

Рис.9. Влияние тафтсина и тафтсиноподобных пептидов из молекулы СРБ на синтез СРБ гепатоцитами in vitro , 24 ч инкубации.

По оси абсцисс: 1 - контроль, 2 -кондиционированная среда № 1, 3 -Гли'-тафтсин, 4 - Лей4-тафтсин, 5 -Глн4-тафтсин, 6 - тафтсин. По оси ординат - единицы ОП. Черные столбики- пластик, серые столбики-коллагеновая подложка.

Горизонтальная черта - сорбция антисыворотки против СРБ к пластику. Число наблюдений по каждой точке равно 8, в контроле -12. ** - различия с контролем достоверны при р<0,01; *** - при р<0,001.

Сам факт модуляции синтеза СРБ его пептидными фрагментами имеет принципиально важное значение. Полученные экспериментальные доказательства подтверждают гипотезу о системном характере их действия. В целом все тафтсиноподобные пептиды СРБ обеспечивают сходную амплитуду прироста его синтеза, однако наибольший эффект все же связан с N-концевым Гли'-тафтсином. Не исключено, что через изменения характера протеолиза молекулы СРБ фагоциты (и, главным образом , нейтрофилы) могут оказывать влияние на уровень синтеза СРБ. Ранее большинство биологических эффектов сиязывяли с С-концевыми последовательностями СРБ. Появление Гли!-

тафтсина возможно лишь при полной фрагментации молекулы в условиях острого воспаления.

Учитывая противоположное направление изменения сывороточных концентраций СРБ и трансферрина в острую фазу воспаления, важной представляется обнаруженная обратная корреляция между уровнем синтеза СРБ и Тф гепатоцитами под влиянием тафтсиноподобных пептидов в условиях культивирования на пластике (г= -0,635 ± 0,145, р<0,05). Следовательно, реакция гепатоцитов на медиаторы кондиционированных сред и на пептиды носит физиологический характер.

Таким образом, результаты свидетельствуют о важной роли тафтсиноподобных пептидов молекулы СРБ в модуляции синтеза острофазовых белков и о возможности синтеза СРБ in vitro под влиянием самого СРБ. Разработанная методика культивирования гепатоцитов адекватно воспроизводит физиологические изменения в уровнях синтеза положительных и отрицательных острофазовых белков и может быть использована в практике экспериментальной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. На основании литературных данных и материалов, изложенных в этой работе, обобщенный сравнительный анализ которых приведен в табл.15, представляется наиболее вероятным, что самым многообещающим направлением дальнейших исследований может стать изучение роли пентраксинов в предотвращении реакций аутоиммунитета во всех тканях и органах. И для этой концепции уже существуют веские основания.

1) стремительный рост сывороточных концентраций СРБ уже с первых часов воспалительной реакции;

2) роль СРБ и САР как молекул-дворников, в функции которых входит, к примеру, солюбилизация ДНК - одного из потенциальных аутоантигенов;

3) экранирование других потенциальных аутоантигенов, всегда вовлеченных в реакции острой фазы: липопротеидов, фибронектина, ламинина, структур матрикса рыхлой соединительной ткани и т.д. При связывании с ними СРБ и САР фактически приобретают роль "пластыря", закрывающего эти структуры от дальнейшего изменения и процессирования;

4) стимуляция неспецифических реакций, обеспечивающих клиренс очага воспаления;

5) торможение, но не отмена реакций гуморального иммунитета;

6) изменение специфичности иммунного ответа как за счет идиотап-антиидиотипических взаимодействий, так и за счет экранирования определенных эпитопов;

7) повышение уровней пентраксинов в крови при всех аутоиммунных патологиях и экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний,

наличие прямой корреляции между сывороточными концентрациями пентраксинов и тяжестью таких патологий.

Таблица 15

Обобщенный сравнительный анализ биологических эффектов пентраксинов (по литературным и оригинальным данным).

Клетки и их функции СРБ САР

данная работа литература данная работа литература

БАЗОФИЛЫ

дегрануляция и нд нд

продукция 1Ь-4 п?) нд 14?) нд

ЭОЗИНОФИЛЫ

дегрануляция т нд т нд

НЕЙТРОФИЛЫ

Хемотаксис

а)хематтрактантные свойства Т (сильнее мСРБ, чем пСРБ) нд 1- нд

б)индуцированный хемотаксис 4 ф нд

Адгезия Т нд 4- нд

Фагоцитоз

а) опсонический эффект нд т нд Т(для ДНК)

б) фагоцитоз без опсонизации = = - -

в) эндоцитоз красителя = нд нд

Кислородный взрыв

а) спонтанный Т Т (в виде мономера) Т (слабо) нд

б) индуцированный нд

ЛКТ нд = нд

Активность МП = нд = нд

Синтез РНК нд т нд

Транспорт АК = нд — нд

Продукция медиаторов

а) 1Ь-1Р т нд = нд

б) 1Ь-б т нд г нд

в) тара т нд т нд

гИ^а = нд - нд

МОНОНУКЛЕАРНЫЕ ФАГОЦИТЫ

Фагоцитоз

а) опсонический эффект нд т нд =

б) фагоцитоз без опсонизации = = нд

в) эндоцитоз красителя т нд нд

Кислородный взрыв

а) спонтанный 1- Т - нд

б) индуцированный т t I нд

Туморицидность нд t НД нд

Миграция нд нд нд

Продукция медиаторов

a) IL-ip Т t 4, — нд

IL-la нд t нд нд

IL-lra нд t нд нд

б) IL-6 t нд t нд

в) TNFa

интактные Мн t t T нд

стимулированные Мф t НД = нд

г) IL-8 нд t нд нд

д) TGF3 нд t нд нд

Моноцитопоэз нд t 4. нд нд

ЛИМФОЦИТЫ

Спонтанный митогенез т t = нд

ФГА-митогенез II -> — 1

PWM-митогенез = I 1 4-

СКЛ нд I нд нд

Ответ на PPD нд I нд 4-

Активность супрессоров ? t = нд

Активность NK-клеток = = нд

Антителогенез in vitro 1 I 1

Продукция медиаторов

IL-2 1 НД i нд

IL-4 без стимуляции t НД = нд

IL-4 при стимуляции i нд i нд

IFNa 1 нд I нд

КООПЕРАЦИЯ В ИММУННОМ ОТВЕТЕ

Общий титр AT — t = нд

Титр IgM t НД f нд

Титр IgG I НД нд

Число IgM-AOK t НД t нд

Число IgG-AOK I I i 1

Масса селезенки t t t нд

Активность комплемента = НД = нд

ФИБРОБЛАСТЫ

Адгезия

а) свободный белок u НД t4- нд

б) сорбированный белок t НД r нд

в) свободные пептиды u n 4

Пролиферация t нд t нд

ГЕПАТОЦИТЫ

Синтез СРБ 1 ж 1 нд нд

| Синтез Тф

нд

нд

нд

Примечание: Т - стимуляция; 4 - подавление; - разнонаправленность эффектов ( обычно в зависимости от концентрации); = - отсутствие эффекта; (?) -предварительные данные; нд- данные отсутствуют.

При этом разделение функций между СРБ и САР также выглядит вполне логичным: СРБ стимулирует неспецифические реакции и сдерживает развитие реакций иммунитета в острую фазу, и СРБ вместе с САР тормозят как неспецифические, так и иммунные реакции при завершении защитной реакции и переходе к репарации. В случае хронизиции процесса САР обеспечивает временную или постоянную изоляцию очага за счет участия в формировании и стабилизации амилоидных фибрилл, а СРБ снижает остроту воспаления. Однако ни СРБ, ни САР не способны остановить реакции аутоиммунитета, они могут лишь снизить их остроту и минимизировать их последствия для организма. Баланс и распределение функций между СРБ и САР зависят от структуры соединительных тканей того или иного организма и распространенности в них лигандных для СРБ или САР группировок. Более того, при смене структуры РСТ с возрастом, по всей вероятности, параллельно изменяется и профиль острофазовых белков, что имеет место у детей в возрасте 4-6 лет.

Главная перспектива этой работы видится в проведении широкомасштабной проверки выдвинутой концепции на реальном клиническом материале, особенно у детей и больных аутоиммунными заболеваниями соединительных тканей. Конкретной задачей является исследование роли идиотип-антиидиотипических взаимодействий в развитии аутоиммунных поражений соединительных тканей на фоне молекулярной мимикрии со стороны патогенов, например, Streptococcus haemolyticus А, а также изучение места острофазовых белков в блокаде этого процесса. Несмотря на давнюю историю вопроса о роли инфекций в аутоиммунных реакциях, он не теряет своей актуальности, о чём свидетельствует повсеместный рост инфицированности гемолитическим стрептококком и частоты постинфекционных осложнений. В связи с получением новых теоретических данных о биологии острофазовых белков и их взаимодействии со структурами РСТ, вновь актуальной становится задача количественной оценки уровней СРБ и САР у детей в возрасте до 4 лет, 4-6 лет и старше 6 лет по сравнению со взрослыми в норме и при аутоиммунной патологии соединительных тканей (системная красная волчанка, ревматоидный артрит и ювенильный ревматоидный артрит, другие коллагенозы различной локализации).

ВЫВОДЫ

1. С-реактивный белок и сывороточный амилоид Р человека участвуют в регуляции функций лейкоцитов крови всех классов, фибробластов рыхлой соединительной ткани и гепатоцитов человека. Характер эффектов в большинстве случаев не зависит от пола и возраста.

2. В интактных нейтрофилах СРВ усиливает миграционную активность, адгезивность, кислородный метаболизм, секреторную дегрануляцию, синтез РНК и продукцию медиаторов (IL-ip, IL-6 и TNFa). В стимулированных нейтрофилах СРВ вызывает ингибицию миграции и снижает уровень кислородного метаболизма. СРВ не изменяет активности миелопероксидазы, характера транспорта меченых аминокислот и продукции IFNa.

3. Сывороточный амилоид Р, действуя на интактные нейтрофилы, усиливает кислородный метаболизм, синтез РНК и продукцию IL-6 и TNFa. САР угнетает способность к адгезии, индуцированные хемотаксис и кислородный метаболизм. САР не влияет на уровень лизосомально-катионных белков, активность миелопероксидазы, характер транспорта меченых аминокислот, уровень продукции IL-1 (3 и IFNa.

4. При действии на большинство изученных функций мононуклеарных фагоцитов периферической крови (эндоцитоз красителя, спонтанный и индуцированный кислородный метаболизм, продукция IL-ip, IL-6 и TNFa) СРВ обладает стимулирующим влиянием. САР снижает уровень эндоцитоза красителя и стимулированного кислородного метаболизма, не изменяет уровней спонтанного кислородного метаболизма и продукции IL-lp и усиливает секрецию IL-6 и TNFa. Оба пентраксина не изменяют характера фагоцитоза эритроцитов барана, ЕА- и ЕАС-эритроцитов.

5. СРВ митогенен для интактных лимфоцитов периферической крови человека. Его влияние реализуется через содержащие фосфорилхолин группировки плазмалеммы или С025-антиген, за который пентамерный и мономерный СРВ конкурируют с IL-2. СРВ не изменяет пролиферации лимфоцитов, индуцированной ФГА или митогеком лаконоса, а также активности NK-клеток, но вызывает рост супрессорной активности.

6. САР не обладает митогенным эффектом в отношении интактных лимфоцитов периферической крови, не изменяет характера ответа на ФГА, но снижает пролиферацию лимфоцитов, индуцированную митогеном лаконоса, и ограничивает активность NK-клеток. САР не индуцирует супрессорной активности лимфоцитов.

7. СРВ и САР снижают продукцию in vitro IL-2, IFNa и IL-4 (при митогенной стимуляции), а также ингибируют синтез иммуноглобулинов. СРВ усиливает продукцию IL-4 без митогенной стимуляции, а САР не влияет на нее.

8. В ходе первичного иммунного ответа на эритроциты барана СРВ и САР, а также их сочетания не изменяют общий титр гемагппотинирующих антител in vivo, но способствуют повышению доли IgM-антител и снижению доли IgG-антител. СРВ и САР тормозят переключение классов синтезируемых антител, наращивая число IgM-антителообразующих клеток и снижая число IgG-антителообразующих клеток.

9. СРВ и САР дозозависимо модулируют адгезивность фибробластов линии L929, усиливая ее при концентрации 1 мкг/мл и ингибируя при концентрации 100 мкг/мл. СРВ и САР стимулируют пролиферативную активность фибробластов. * Аналогичными эффектами обладают тафтсиноподобные пептиды молекулы СРВ.

10. В культуре гепатоцитов крысы С-реактивный белок индуцирует синтез С-реактивного белка. Аналогичным эффектом обладают тафтсиноподобные пептиды молекулы СРВ и тафтсин. Указанные пептиды усиливают синтез СРВ и ослабляют синтез трансферрина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Обзоры литературы

1. Полевщиков A.B., Назаров П.Г. Иммуноцитотропные эффекты С-реактивного белка // Иммунология,- 1993.- № 4.- С.6-10.

2. Полевщиков A.B. Лектины в защитных реакциях хордовых животных // Иммунология,-1996.-№ 1.-С.48-56.

3. Полевщиков A.B. Лектины в защитных реакциях беспозвоночных // Журнал общей биологии.-1996,- Т.57, № 6,- С.718-739.

Оригинальные статьи

4. Куликов В.В.,Иваненко А.И., Назаров П.Г., Полевщиков A.B., Киселев О.И., Яцук С.Л. Обнаружение активности интерлейкина-2 и фактора роста В-лимфоцитов в спинномозговой жидкости больных с различными поражениями центральной нервной системы // Физиология человека,- 1988,- Т. 14, № б.- С. 922 - 926.

5. Жидков К.П., Федорова Л.А., Назаров П.Г., Полевщиков A.B. Динамика показателей бласттансформации лимфоцитов крови в процессе гемосорбсции у больных язвенной болезнью // Гематол. трансфузиол,-1992.- №3.- С. 15-17.

6. Полевщиков A.B., Назаров П.Г. Влияние С-реактивного белка и нейтрофилов на митоген-индуцированную пролиферацию лимфоцитов человека // Иммунология,- 1992,- № 6,- С.37-39.

7. Полевщиков A.B., Назаров П.Г, Влияние С-реактивного белка на кислородный метаболтзм и активность миелопероксидазы нейтрофилов.// Акт. вопр. ветеринарии." Тез. науч. конф. СПб.Вет.Ин-та,- Спб, 1992.- С.35-36.

8. Полевщиков A.B., Назаров П.Г., Берестовая Л.К. Влияние С-реактивного белка на синтез РНК и белка в нейтрофилах // Вопр. мед. химии.- 1993.- Т.39, № 1.-С.43-45.

9. Полевщиков A.B., Назаров П.Г. Усиление кислородного метаболизма фагоцитов крови человека под действием тафтсиноподобных пептидов из молекулы С-реактивного белка // Бюл. эксперим. биол. мед.,- 1993.- Т.115, № 1.- С. 55-56.

10. Кучевская Е.В., Полевщиков A.B., Назаров П.Г. Оценка влияния С-реактивного белка на нейтрофилы крупного рогатого скота. II Акт. вопр. ветеринарии.: СПб, 1993,-С.40-41.

11. Полевщиков A.B., Кучевская Е.В., Назаров П.Г. Взаимодействие С-реактивного белка и моноцитов периферической крови крупного рогатого скота II Акт. вопр. ветеринарии.: СПб, 1993.- С.61-62.

12. Полевщиков A.B. Болезнь Альцгеймера как острофазная реакция в центральной нервной системе II Нейроиммунология на пороге XXI века,- Спб., 1993-С. 133-138.

13. Назаров П.Г., Полевщиков A.B. Цитокинная функция С-реактивного белка II Клин, эксперим. асп. клет. сигнализации.- М., 1993.- С.53-54.

14. Полевщиков A.B., Назаров П.Г. Обнаружение сходной с С-реактивным белком детерминанты на мембранах эритроцитов.// Клин, эксперим. асп. клет. сигнализации.- М., 1993,- С.58-59.

15. Назаров П.Г., Полевщиков A.B. Роль рецептора интерлейкина 2 в реализации митогенного действия С-реактивного белка на лимфоциты // Вестник РАМН.- 1993.- № 9,- С.13-17.

16. Полевщиков A.B., Кучевская Е.В., Зайкова Я.С., Корлякова O.E., Назаров П.Г. Новые подходы к оценке функциональной активности фагоцитов крови крупного рогатого скота. // Ветеринария.- 1993.- № 9.- С. 47-51.

17. Назаров П.Г., Полевщиков A.B., Берестовая JI.K., Петров И.В., Пономаренко В.В. Характеристика антигенных и цитотропных свойств свободных субъединиц С-реактивного белка // Бюлл. эксперим. биол. мед..- 1993,- Т.116, № 12,-С.609-611.

18. Полевщиков A.B., Назаров П.Г., Берестовая JI.K. С-реактивный белок модулирует адгезивную и биоцидную активность нейтрофилов // ЖМЭИ.- 1994,- №1,-С. 69-72.

19. Полевщиков А.В.,Назаров П.Г. Тафтсиноподобные пептиды из молекулы С-реактивного белка как модуляторы пролиферации лимфоцитов. // Вопр. мед. химии.-1994.- Т.40, № 1.-С.4-7.

20. Огурцов Р.П., Пузырева В.П., Ковалева И.Г., Киселева Е.П., Полевщиков A.B., Назаров П.Г. Влияние экспериментальной гиперлипидемии на некоторые физиологические показатели системы иммунитета. II Пат. физиол. эксперим. тер.-1994.- №2.- С.5-8.

21. Полевщиков A.B. Способ определения концентрации секреторного иммуноглобулина АII Клин. лаб. диагностика.-1994.- № 3.- С.38.

22. Полевщиков A.B., Рязанцев C.B. Простой способ определения концентрации секреторного иммуноглобулина А // Проблемы иммунологии в оториноларингологии.-СПб, 1994.-С.102-103.

23. Назаров П.Г., Берестовая JI.K., Полевщиков A.B. Значение взаимодействия С-реактивного белка и липопротеидов плазмы для пролиферации лимфоцитов.// Иммунология,- 1994,- №4.-С. 15-17.

24. Полевщиков A.B., Киселева Е.П. Метод автоматизированного учета НСТ-теста // Клин. лаб. диагностика,-1994,- №4,- С.27-29.

25. Полевщиков A.B. Роль белков острой фазы в защитных реакциях соединительных тканей // Актуальные вопросы ветеринарии. Вып. 121.-Спб.,1994,-С.92-93.

26. Адоева Е.Я., Степанова Т.П., Полевщиков A.B. Изучение синтеза трансферрина и ферритина в стимулированных гепатоцитах // Цитология.-1994.-Т.36, №6.- С.509-510.

27. Полевщиков A.B., Козлов C.B., Старикова Э.А. Влияние белков острой фазы воспаления на адгезивность и пролиферацию фибробластов II Актуальные проблемы ветеринарной медицины.-СПБ.,1995.-С.65-68.

28. Киселева Е.П., Полевщиков A.B., Берестовая Л.К., Назаров П.Г. Регуляция кислородного метаболизма лейкоцитов крови человека С-реактивным белком. // Физиология человека,- 1995.-Т.21.-№2.-С. 122-128.

29. Пузырева В.П., Огурцов Р.П., Полевщиков A.B., Ковалева И.Г., Назаров П.Г., Киселева Е.П. Межлинейные различия иммунореактивности при экспериментальной гиперлипидемии у мышей CBA/CaJ и C57B1/6J. // Лабораторные животные.- 1995.-Т.5, № 2,- С.90-98.

30. Старикова Э.А., Полевщиков A.B., Козлов C.B. Влияние белков острой фазы воспаления на морфологию фибробластов L 929 // Актуальны проблемы ветеринарной медицины.- вып.124.- СПб.,1995.-С.28-30.

31. Назаров П.Г., Виташенкова Н.В., Киселева Е.П., Полевщиков A.B., Бутюгов A.A., Берестовая Л.К. Влияние С-реактивного белка и его субъединиц на цитотоксический эффект фактора некроза опухолей а в отношении фибробластов линии L929// Цитология.- 1996.- Т.38, № 7,- С. 742-750.

32. Полевщиков A.B., Назаров П.Г., Козлов C.B., Галкина Е.В., Берестовая Л.К. Регуляция функций нейтрофилов крови С-реактивным белком и сывороточным амилоидом Р // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова.- 1996.-

Т.82, № 8-9,- С. 67-72.

Тезисы докладов

33. Полевщиков A.B., Козлов C.B. Электрофоретическое обнаружение синтеза С-реактивного белка лимфоцитами периферической крови II Мат. 1 Всес.съезда иммунологов.М.: 1989,-т. 1.- С.94.

34. Polevschikov A.V., Nazarov P.G., Ljubimov Ju.A., Sofronov B.N. C-reactive protein or cross-reactive determinant is expressed by erythrocytes // Allergologie.- 1989.-Sondernum. Abstr..-P. 65-66.

35. Полевщиков A.B. Назаров П.Г. С-реактивный белок вызывает активацию нейтрофилов //Актуальные проблемы ветеринарной медицины.- Л.:1991.-С.75-76.

36. Полевщиков A.B., Назаров П.Г. Человеческий С-реактивный белок, его мономеры и пептидные фрагменты являются хематтрактантами для нейтрофилов.// Тез. 1 съезда иммунологов России. -Новосибирск, 1992,- С. 370.

37. Пузырева В.П., Огурцов Р.П., Киселева Е.П., Полевщиков A.B., Назаров П.Г. Экспериментальная гиперлипидемия вызывает синдром иммунодефицита, связанный с нарушением дифференцировки иммунокомпетентных клеток.// Тез. 1 съезда иммунологов России. -Новосибирск, 1992.- С. 389.

38. Назаров П.Г., Полевщиков A.B. Тафтсиноподобные пептиды из молекулы С-реактивного белка модулируют митогенную активность лимфоцитов человека // Пептидные биорегуляторы -цитомедины,- Спб,1992.- С. 107.

39. Полевщиков A.B., Назаров П.Г. Влияние синтетических пептидов из молекулы С-реактивного белка на кислородный метаболизм фагоцитов крови человека // Пептидные биорегуляторы -цитомедины.- Спб,1992.- С.117-118.

40. Полевщиков A.B., Назаров П.Г. Взаимодействие С-реактивного белка (СРБ) с липопротеинами плазмы отменяет митогенность СРБ для лимфоцитов человека // Мат.междунар.симп.по аллергологии и клин, иммунологии,- Алма-Ата, 1992,- Т.2.- С.218.

41. Огурцов Р.П., Пузырева В.П., Полевщиков A.B., Назаров П.Г., Киселева В.П. Структурно-функциональные особенности мембран лимфоцитов в условиях экспериментальной гиперлипопротеинемии // Мат.междунар.симп.по аллергологии и клин, иммунологии,- Алма-Ата, 1992.- Т.2 .- С.233.

42. Nazarov P.G., Polevschikov A.V. C-reactive protein is an endogeneous regulator of oxygen metabolism in human neutrophils. II Abstr. 1st Int. Congr. Immunorehabilitation.- Tshaltubo, 1992,- P.52-53.

43. Polevschikov A.V.,Nazarov P.G. Synthetic peptides from C-reactive protein molecule: novel modulators of phagocytic function of neutrophils and monocytes.// Abstr. 1st Int. Congr. Immunorehabilitation.- Tshaltubo, 1992,- P.57.

44. Nazarov P.G., Berestovaya L.K., Polevschikov A.V. C-reactive pretein (CRP) mitogenicity and its reversal by CRP subunits and CRP ligands.// Abstr. 8th Int. Congr.Immunol..- Budapest, 1992.-P.518.

45. Ogurtsov R.P., Puzyreva V.P., Kisseleva E.P., Polevschikov A.V., Nazarov P.G. Immunodeficiency and impairment of lymphocyte differentiation induced by experimental hyperlipoproteinemia in mice.//Abstr. 8th Int. Congr.Immunol..- Budapest, 1992.- P.685.

46. Киселева Е.П., Полевщиков A.B., Берестовая JI.К., Назаров П.Г. С-реактивный белок стимулирует окислительный взрыв в фагоцитах. // Факторы гуморальн. и клеточн. иммунитета при разл. физиол. и патол. состояниях. -Челябинск, 1992,- С.46-47.

47. Полевщиков А.В., Назаров П.Г. Роль тафтсиноподобных продуктов протеолиза С-реактивного белка в индукции синтеза интерлейкина-1 моноцитами // Акт. вопр. ветеринарии,- Спб, 1992,- С. 36.

48. Полевщиков А.В., Назаров П.Г. Роль С-реактивного белка в репаративных процессах в соединительной ткани // Критерии и методы оценки жизнеспособности тканей в раневом процессе.- СПб, 1993.- С.61.

49. Полевщиков А.В., Назаров П.Г. Наличие иммуноактивных пептидов в молекуле С-реактивного белка человека и животных // Новые фарм. средства в ветеринарии. -СПб, 1993.-С.45-46.

50. Polevschikov A.V., Nazarov P.G., Kisseleva Е.Р., Berestovaya L.K. C-reactive protein normalizes oxygen metabolism of human neutrophils. // Eur. J. Allergy Clin. Immunol.- 1993,- Vol.48, №16,- P.55.

51. Nazarov P.G., Polevschikov A.V. C-reactive protein (CRP) mimics IL-2 action and employes IL-2 receptors // Lymphokine and Cytokine Res.- 1993.- Vol. 12, № 5,- P.400.

52. Adoeva E., Polevschikov A.V., Stepanova Т., Diakonov I. Modelling of acute phase responce in rat hepatocyte cultures // Intensive Care Medicine.-1994.-Vol.20, Suppl.l.- P.98.

53. Полевщиков А.В. Место иммуноцитотропных эффектов С-реактивного белка в общей концепции воспаления // Тез. докл. Научной конф-ции молодых ученых, посвященной 50-летию Академии Медицинских Наук.- М.,1994.-С.122-123.

54. Polevschikov А/V/. Nazarov P.G. Is C-reactive protein a factor of multicellularity ? // Abstr. 12th Eur. Immunol. Meet.- Barcelona, 1994.-P.28.

55. Nazarov P.G., Ogurtsov R.P., Denisenko A.D., Polevschikov A.V. Can C-reactive protein substitute for B-100 receptors and IL-2? // Abstr. Int. Conf. "Regulation of Cytokine Activity for Therapeutic Development."

Washington, 1994.-P.250.

56. Nazarov P.G., Butyugov A.A., Polevschikov A.V., Kozlov S.V., Berestovaya L.K. Bacterial toxins as factors directly affecting the biological activity of cytokines and C-reactive protein.//Abstr. 9th Int. Congr. Immunol. -San Francisco, 1995.- P. 122.

57. Polevscikov A.V., Kozlov S.V., Nazarov P.G. Serum amyloid P (SAP) but not C-reactive protein (CRP) abolishes fibroblast adhesion and proliferation.// Abstr. 9th Int. Congr. Immunol. -San Francisco, 1995,- P. 122.

58. Полевщиков A.B., Галкина E.B. Влияние С-реактивного белка (СРБ) и сывороточного амилоида Р (САР) на кислородный метаболизм и уровень лизосомально-катионных белков нейтрофилов человека // Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций.-СПб..1995.-С.41.

59. Полевщиков А.В., Назаров П.Г. Роль пентраксинов в филогенезе защитных реакций.// Тез. докл. 1(Х1) Междунар. совещ. по эволюц. физиологии,- СПб, 1996.- С. 182-183.

60. Полевщиков А.В., Галкина Е.В., Назаров П.Г. Роль белков острой фазы (БОФ) в организации матрикса и защитных реакциях в рыхлой соединительной ткани (РСТ) // Морфология.- 1996.- Т. 109, № 2,- С.80.

61. Nazarov P.G., Butyugov А.А., Polevschikov A.V. Different consequences of interac-tion of interferons with streptoly-sin O: neutralization of the toxin by IFN-y and augmentation by IFN-a.// Eur. Cytokine Network.- 1996.-Vol.7, № 3,- P.502.

62. Kisseleva E.P., Polevschikov A.V., Nazarov P.G. Comparison of microscopic and spectrophotometric methods for assessment of superoxide anion production in human granulocytes.// XVI Int. Congr. Clin. Chem.- London (Wembly), 1996,- P. 234.

63. Полевщиков A.B., Галкина E.B., Романович А.Э., Назаров П.Г. Сравнительный анализ влияния СРВ и САР на миграцию нейтрофилов (Нф) II Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях.-Челябинск, 1997.- С.121-122.

64. Полевщиков А.В., Галкина Е.В., Рпоманович А.Э., Берестовая JI.K., Чмелев В.М., Назаров П.Г. Роль СРБ и САР в модуляции кислородного метаболизма нейтрофилов (Нф) // Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях.-Челябинск, 1997.- С.122-123.

65. Галкина Е.В., Галкин В.Э., Полевщиков А.В., Назаров П.Г. Условия взаимодействия С-реактивного белка (СРБ) и сывороточного амилоида Р (CAP) in vitro // Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях.-Челябинск, 1997,- С. 31-32.

66. Polevschikov A.V., Ryazantsev S.V. CRP and CAP in Otorhinolaryngology II Abstr. XVI ORL World Congress.- Sydney, 1997,- P.298.

67. Butyugov A.A., Nazarov P.G., Isakov D.V., Polevschikov A.V. Consequences of interaction of interferons alpha, beta and gamma with streptolysin О // Abstr. XXXIII Intern. Congress of Physiol. Sciences.- St.-Petersburg.- L095.10.

68. Polevschikov A.V., VekovischevaO.Yu., Ogurtsov R.P., Zvartau E.E. The immune response and social status in mice: the role of opioids // Abstr. XXXIII Intern. Congress of Physiol. Sciences.- St.-Petersburg.- L095.20.

69. Polevschikov A.V., Nazarov P.G., Galkina E.V., Chmelev V.M., Berestovaya L.K. C-reactive protein (CRP) and serum amyloid P (SAP) modulate cytokine production in vitro // Immunology Letters.-1997.- Vol.56, № 1-3.- P.352.

70. Polevschikov A.V., Nazarov P.G., Galkina E.V., Ogurtsov R.P., Chmelev V.M. Serum amyloid P (SAP) but not C-reactive protein (CRP) abolishes NK-cell activity // Immunology Letters.-1997.- Vol.56, № 1-3.- P.383.