Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунологические подходы к изучению полиморфизма системы ингибитора протеаз у приматов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи УДК 575.113:599.829. 578.085.23 (088.8)

Сарсания Канна Шалвовна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ ПОЛИМОРФИЗМА СИСТЕМЫ ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗ У ПРИМАТОВ

14.00.36 - "Аллергология и иммунология"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Институте Экспериментальной Приматологии РАМН и НИИ Физико-химической Медицины МЗ РФ.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор H.A. Дидковский; кандидат биологических наук Е.И. Самильчук.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, академик РАН A.B. Караулов; доктор биологических наук, профессор В.Я. Арион.

Ведущее учреждение - Росийский Государственный Медицинский Университет им. Н. И. Пирогова.

Защита состоится " 3 " I-LD¡1<Я_ 1994 г.

в УУ. оо часов на заседании Специализированного Ученого Совета Д 084.66.02 при НИИ Физико-химической Медицины МЗ РФ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ФХМ МЗ РФ. Автореферат разослан " "I S » C&tf. ГйЛ ЬкА-_ 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

Л.Л. Васильева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Опыт медико-биологических исследований :видетельствует, что данные, полученные на традиционных эксперимен-■альных моделях, т.е. на низших животных, имеют ограниченную ценность 1Ля медицинских экспериментов. В связи с этим особую актуальность федставляют исследования на обезьянах - животных наиболее близких че-ювеку, образующих с ним отряд приматов.

Чаще всего при моделировании заболеваний человека используются )безьяны рода макак. Это обусловлено их относительно невысокой стои-юстью и удобством работы с небольшими животными. Особое значение по-тучили исследования на макак лапундерах, после того как в 1991 году 1сследователями из Вашингтонского приматологического центра было пока-iaHo, что эти животные могут быть инфицированы HIV-1 [Agy et al., L992]. Однако проведение подобных исследования требуют подробной информации по всем показателям ферментных, иммунной и других систем макак, в частности, альфа-1-антитрипсина (ААТ) - как важной системы ингибитора протеаз.

ААТ - основной ингибитор протеаз в сыворотке крови - обнаруживает толиморфность у человека. Локус, контролирующий синтез ААТ, обозначается как Protease ingibitor (Pi), а входящие в него аллели как Pi-сис-гема [Сох et al., 1980]. В исследованиях ААТ можно выделить два аспекта. Первый из них, медицинский, возник в результате обнаружения тесной ассоциации некоторых фенотипов ААТ с заболеваниями человека - прежде всего эмфиземой легких и ювенильныи циррозом печени [Laurell et al., 1963; Sharp et al., 1969]. Другой, биологический, связан с использованием данных о полиморфизме этого белка в работах по молекулярной сис-

тематике и эволюции приматов [Отои> а1.„ 1970; Ие1БЗ а1.. 1973; Иогауа е1 а1., 1977; МеШск et а1.. 1985].

Несмотря на то, что изучению полиморфизма ДАТ макак посвящены ря; исследований [ОтоЬо еХ. а1.. 1970; Могауа е1. а1.. 1977; Киеррегэ е^ а1., 1977; Тапака, 1991], на сегодняшний день остается открытым вопрос о полиморфизме ДАТ у обезьян. Это связано с тем, что данные основывались на электрофоретических картинах и не всегда проводилась идентификация белка.

Известно, что определение ААТ может основываться как на ферментативной активности этого белка, так и на его иммунологической реактивности. Существенным недостатком подхода, основанного на ферментативное активности, является его неспецифичность, так как он регистрирует общую антипротеазную активность, а последняя определяется не только ДАТ, но и целым рядом других антипротеаз (альфа-2-макроглобулин, аль-фа-1-химотрипсин и др.). Поэтому несомненно преимущество иммунологического метода определения ААТ. Для последнего могут служить ыонокло-нальные антитела (МАТ), обладающие строгой специфичностью. Но несмотр.' на значительное сходство ААТ человека и обезьян [КиеррегБ ъХ а1. 1968], между ними существует и отличие. Техническим решением это) проблемы является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих ИА' к антигенной детерминанте и реагирующих с ААТ как человека и обезьян Однако у нас такие МАТ пока на описаны и коммерчески не выпускаются Все это определяет актуальность данного научного исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Получить гибридные клетки, продуцирующие МАТ против антигенной де терминанты ААТ, общей для человека и обезьян и изучить полиморфизм АА у 9 видов макак различного происхождения.

ЗАДАЧИ:

1.Получить высокоспецифические моноклональные антитела к общей лтигенной детерминанте ААТ человека и обезьян.

2.Исследовать распространение различных фенотипов и частот алле-гей ААТ у макак, происходящих как из мест естественного обитания так и южденных в неволе.

3.Доказать реальность обнаруженных аллелей в семейном анализе.

4.Изучить мнкрогетерогенность исследуемого бежа с последующим гммунологическим проявлением.

5.Определить перекрестную реактивность полученных МАТ в отношении 1АТ разных родов и видов приматов, а также разных аллельных вариантов шутри одного рода.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Автором впервые получены МАГ к общей антигенной детерминанте человека и обезьян. Полученные МАТ являются уникальными, т.к. они секре-гируют антитела, реагирующие с высокой эффективностью с ААТ как чело-зека, так и обезьян. Подобных штаммов в научной и патентной литературе тока не описаны и получены впервые.

МАТ против ААТ человека, полученные ранее за рубежом и у нас, выпускаются рядом фирм. Однако, в отличие от МАТ, полученных в данной работе, они не охарактеризованы в отношении их реактивности с ААТ обезьян, что существенно ограничивает их использование в экспериментах яа обезьянах.

В настоящем исследовании впервые изучен полиморфизм ААТ у многих видов макак с использованием ранее не применявшихся подходов: изоэ-

лектрофокусирование (ИЭФ) в полиакриламидном геле в сочетании с иммунологической идентификацией ААТ и семейный анализ.

Особый интерес представляют исследования, касающиеся обезьян известного происхождения, т.е. рожденных в питомниках. Для этого были использованы данные зоотехнического архива питомников обезьян института экспериментальной патологии и терапии ШЭПиТ, г.Сухум). Эти данные легли в основу проведения семейного анализа. Последний позволил подтвердить впервые реальность выявленных аллелей. Применение метода ИЭФ позволило постулировать существование новых аллелей у исследованных макак, которые не обнаруживались при традиционном подходе, т.е. электрофорезе в кислом крахмальном геле.

Тот факт, что большинство аллелей Р1яас, идентифицированных с помощью ИЭФ, являются видоспецифичными , изменяют существующее представление об общности аллелей Р1гаас для различных видов макак.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Результаты данной работы несомненно представляют практический интерес. Так, новые данные о частотах аллелей ААТ обезьян, разводимых 1 неволе, могут использоваться в популяционно-генетических исследовани ях, работах по молекулярной систематике и эволюции приматов, а такж при контроле скрещивания обезьян.Уточненные частоты аллелей в природ ных популяциях обезьян могут быть использованы в последующем для оцен ки генетического расстояния между различными видами макак и времене их дивергенции.

Полученные МАТ могут применяться с высокой эффективностью дл определения ААТ как человека так и обезьян. Это позволяет отказатьс от дорогих импортных поликлональных антисывороток и отечественных низ кого качества.

Гибридомы, продуцирующие МАТ, депонированы во Всесоюзной коллек-ии клеточных культур (Институт цитологии АН СССР, г.Ленинград), (За-вка N4865393/13 (094966), получено авторское свидетельство на изобре-ение под N1756352 и опубликовано в бюллетени "Открытия. Изобретения", 31. 1992).

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ Количественное определение ААТ с помощью МАТ внедрено в практику 1итомников обезьян ИЭПиТ для контроля за состоянием обезьян во время IX акклиматизации. Предложена модифицированная версия Pimac-системы, источающая 18 аллелей, вместо описанных ранее пяти вариантов. Результаты исследования используются в лаборатории иммунологии и биотехнологии для конкретных экспериментальных и научных исследованиях.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Впервые получены гибридомы, продуцирующие МАТ к общей антигенной детерминанте ААТ человека и обезьян, позволяющие использовать их в конкретных экспериментальных и клинико-иммунологических исследованиях.

2.Перекрестная реактивность МАТ определяется их направленностью к "древней" консервативной детерминанте ААТ приматов, сохранившейся в процессе эволюции этого отряда.

3. Впервые выявлены 18 новых вариантов ААТ, причем большинство из этих аллелей имеют видовую специфичность. Обнаружено, что ААТ проявляет как низкий мономорфизм у м.резусов, м. бурых, так и высокий полиморфизм у м.лапундеров и м.яванских.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работ доложены на Всесоюзной

конференции молодых ученых и медиков (Бакуриани, 1987 г.). Республиканской конференции молодых ученых Абхазии (Пицунда, 1989 г.), 2-й Международной конференции по использованию лабораторных животных в медико-биологических исследованиях (Москва, 1990 г.). Международной конференции по биотехнологии (Рига, 1991 г.).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из которых - одна в международном издании.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, пяти глав собственных наблюдений с обсуждением результатов, выводов и библиографического указателя. В диссертации имеется таблиц, рисунков. Текст изложен на страницах. Указатель литературы состоит из источников: - зарубежных и - отечественных наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы

Основными материалами для настоящего исследования были:

1) Обезьяны: м. резусы (M. mulatta) - 228 из Вьетнама, 220 рождены в питомнике обезьян ИЭПиТ (Fl, F2, F3) и являются в основном потомками обезьян, привезенных из Индии; н. лапундеры (m. nemestrina) - 104 из Индии, Малазии и Вьетнама, 130 рождены в питомнике (Fl, F2); м. яванские (m. fascicularis) - 160 из Индонезии, 174 рождены в питомнике (F1) и являются потомками обезьян из Индонезии; м. бурые (m. arctoi-des) - 38 из Таиланда, 36 рождены в питомнике (F1) (потомки обезьян из Тайланда); м. ассамские (га. assamensis) - 13 (из них - 6 из Китая, 7 -из Вьетнама); м. японские (m. fuscata) - 6 из Японии; м. магот (т. sylvana) - 8 (4 из них получены из зоопарков гг. Ростов-на-Дону и

Харькова, происхождение неизвестно); м. китайский (m. sínica - 1 (из зоопарка г. Ростова-на Дону, происхождение не известно); м. черный (М.nigra) - 3 (из г. Ростова-на-Дону, происхождение неизвестно).

Длительное хранение сьвороток осуществлялось в жидком азоте.

2) Мышиные клетки перевиваемой культуры.

3) Гипериммунная сыворотка против ААТ человека.

В работе использованы коммерческие антисыворотки против иммуноглобулинов человека, кролика, мыши, меченные пероксидазой "Вэлкам", "Калбиохем", "Дако".

Для культивирования основной культуры X63-Ag8.653 использовали среду RPMI-1640, 199 с добавкой 8-20% телячьей эмбриональной сыворотки; культуры инкубировали при +37°С в атмосфере с 5% С0г.

Методы исследования:

Получение гибридом:

1) Иммунизация мышей.

2) Слияние проводили с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000. После слияния клетки распределяли по ЗхЮ5 кл/лунку в 96-луночные пластинки в присуствии кормушек - перитонеальных клеток нормальных мышей (5000 кл/лунку). Отбор гибридных клеток осуществляли с помощью селективной среды ГАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Просмотр клеток проводили на 5-7 сутки под инвертированным микроскопом.

3) Квазиклонирование. После выявления первично-положительных гибридом проводили квазиклонирование - рассев по 5 кл/лунку.

4) Клонирование проводили методом предельных разведений - 1 кл/лунку, не менее трех циклов.

5) Получение препаративных количеств МАТ. Мышам BALB/c, за 7-10

до этого обработанных приставом (0,5 мл/мышь, внутрибрюшинно), вводили по 106 клеток гибридом. Асцитные жидкости, содержащие до 10 мг/мл МАТ, отбирали через 21 день.

Идентификацию гибридом, продуцирующих антитела требуемой специфичности проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для каждого антигена подбирались оптимальные сенсибилизирующие дозы и условия адсорбции на твердую фазу. В качестве последней использовали 96-луночные пластины для ИФА ("Линбро", "Дайнатек") из полистирола и поливинилхлорида, в лунки которых вносили ААТ (2 мкг/мл, 100 мкл/лунку). Затем в лунки вносили исследуемые культуральные жидкости в разведении 1:5 (100 мкл/лунку) и инкубировали в течение 1 ч при +37°С. После трехкратной отмывки в каждую лунку вносили 100 мкл коньюгата -антисыворотку против иммуноглобулинов мыши, меченную пероксидазой (1:1000 с 1% обезжиренного сухого молока. Инкубацию с коньюгатом вели при +37°С в течение 1 ч. После 5 промывок в лунки вносили по 100 мкл раствора субстрата - ортофенилдиамина / Н20г (рН 6.0). инкубацию с субстратом вели в темноте при +37°С, обычно в пределах 10-30 минут (обеспечивая максимальную разницу между положительным и отрицательным контролями). Реакцию останавливали 1м серной кислотой (25 мкл/лунку). Окраску (А492) замеряли с помощью спектрофотометра Мультискан ("Флоу лэбороториз"). В каждую постановку включались контроли: положительный, отрицательный, коньюгата. Исследование каждого образца дублировалось.

Изоэлектройокусирование (ИЭФ) проводили на пластинах полиакрила-мидного геля (ПААГ) в градиенте рН 4-5, создаваемом амфолинами пр* следующих параметрах: максимальное значение напряжения - 2000 В, силг тока - 25 мА, мощности - 25 Вт; температура - +7°С; время разделения -4 ч (из них 1ч- префокусировка); электродные растворы - 1М Н3Р04 (анод) и 1М глицин (катод). Белки окрашивали Кумасси Е-250.

Иммунологическую идентификацию полос ААТ (иммуноблоттинг) осу-(ествляли на нитроцеллюлозной мембране (после переноса на нее с ПА-iT-пластинки белков, разделенных при ИЭФ) с помощью антисыворотки про-■ив ААТ человека (производство "Sigma" (США)) в разведении 1:50 и со-:тветствующего антиглобулинового пероксидазного коньюгата ("Dakko", 1ания) в разведении 1:500. В качестве хромогенного вещества использо-;али о-дианизин.

Реакция радиальной иммунодиффузии (РРИД). Конечная концентрация нтисывортки в геле составляла 2%, диаметр лунок - 2мм, срок инкубации 16-48 часов. Размеры кольца пропорциональны количеству ААТ, и при аличии стандартного раствора этого белка рассчитывали содержание ААТ исследуемых сыворотках.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК. ПРОДУЦИРУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЬЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА ЧЕЛОВЕКА И ОБЕЗЬЯН.

В экспериментах на обезьянах, важное преимущество МАТ - направле-зсть к одной антигенной детерминанте - может оказаться существенным эепятствием для использования МАТ против ААТ человека, поскольку эта ;терминанта может у ААТ макак отсуствовать. Действительно несмотря на тчительное сходство ААТ человека и обезьян, между ними существует ¡ачительное отличие, что выявляется как в различной перекрестной им-гнологической реактивности, так и в разнообразии электрофоретических фиантов. Решением этой проблемы стало получение штамма гибридных шток, продуцирующих МАТ против антигенной детерминанты ААТ, общей

- и -

для человека и обезьян.

Штамм получают следующим образом:

Мышей линии ВАЬВ/с иммунизировали очищенным препаратом ААТ человека по следующей схеме: 100 мкг ААТ в полном адьюванте Фрейнда в/мы-шечно в две задние лапы; через 28 дней 4 ежедневных введения (в/брю-шинно. в/венно) по 100 мкг ААТ в забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР). На следующий день после последней иммунизации проводили слияние, процедура которого включала следующие этапы. Спленоци-ты, полученные путем гомогенезирования селезенки в среде 199, помещали в центрифужную пробирку и отстаивали в вертикальном положении в течение 10 мин, затем 9/10 суспензии переносили в пластиковую центрифужную пробирку, заполняли ее до 40 мл средой 199, однократно отмывали в среде 199 и суспендировали в среде 1?РМ1 1640 (10 кл/мл). Параллельно ми-еломные клетки ( линия Х63-А§. 8.653) трижды отмывали средой 199 и также суспендировали б среде ИРМ1 1640 в той же концентрации. Спленоциты (108клеток) и миеломные клетки (2x10) смешивали в пластиковой центрифужной пробирке, заполняли средой 1?РМ1 1640, тщательно суспендировали и центрифугировали при 800 об/мин в течение 10 мин. Супернатант удаляли практически " насухо", осадок разрыхляли постукиванием пальцем о дно пробирки и по каплям в течение 1 мин добавляли к клеточному осадку 50%-ный раствор полиэтиленгликоля 6000. Нижнюю часть пробирки опускают в водяную баню (37°С) на 1,5 мин, постоянно встряхиавя ее вращательными движениями. Слияние останавливали разбавлением средой НРН1 1640 - в течение первых 30 с вносили 1 ил среды, в следующие 30 с еще 3 мл среды и затем в течение 1 мин около 15 мл среды. Далее пробирку заполняли средой до 40 мл, суспензию инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре и центрифугировали при 800 об/мин в течение 10 мин. Осадок осторожно ресуспендировали в среде ИРМ! 1640 с 15% телячье?

мбриональной сывороткой и ГАТ ( гипоксантин. аминоптерин, тимидин) до юнцентрации 5х106кл/мл ( без учета потерь при слиянии). За 24 ч до :лияния в 96-луночные плоскодонные панели для клеточных культур засе-*али перитонеальные клетки нормальных мышей BALB/c ("перитонеальная сормушка"). Для получения последних, мышам в/б вводили 0,34 М раствора :ахарозы, брюшко массировали, животных забивали и отбирали раствор с слетками, среди которых не менее 50% составляют макрофаги. После отмы-5ания в среде 199 клетки суспендировали в среде RPMI 1640 с 15% теля-гей эмбриональной сьвороткой + ГАТ и рассевали в лунки (150 мкл, 5000 ел на лунку). Немедленно после завершения слияния в каждую лунку вно-:или около ЗхЮ5 клеток смешанной суспензии. Панели с микрокультура-т инкубировали при 37° С в атмосфере с содержанием 5-7% С02. Клетки досматривали под инвертированным микроскопом ежедневно, начиная с 5-х :уток после слияния. С этого же момента через день в каждой лунке ме-1яли приблизительно половину среды. Культивирование гибридных клеток в тоисуствии ГАТ проводили в течение первых двух недель после слияния, затем еще 4 дня клетки культивировали в присуствии ГТ (без аминоптери-ia) и далее переводили на обычную среду без добавок.

Отбор гибридом, продуцирующих МАТ требуемой специфичности осущест-зляли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В пер-зом случае на твердой фазе адсорбировали ААТ человека, во втором - ААТ павиана гамадрила. Для реакции использовали 96-луночные ИФА панели, в пунки которых вносили ААТ (2 мкг/мл, 100 мкл на лунку), разведенный в 50 мМ карбонатном буфере, pH 9,5. Адсорбцию вели при +4°С в течение 16-18 ч, после чего панели трижды отмывали ЗФР, содержащим 0,05% Твина 20 (ЗФР-Тв). Затем в лунки вносили исследуемые культуральные жидкости в разведении 1:5 (100 мкл на лунку) и инкубировали в течение 1 ч при +37°С. Пластины трижды отмывали ЗФР-Тв и в каждую лунку вносили 100

мкл конъюгата - антисыворотку к иммуноглобулинам мыши, меченную перок-сидазой (1:1000 в ЗФР-Тв с 1% обезжиренного сухого молока). Инкубацию с конъюгатом проводили при +37°С в течение 1 ч. После 5 отмываний ЗФР-Тв в лунки вносили по 100 мкл раствора субстрата - ортофенилдиамина Ш202, рН 6,0). Ракцию останавливали 1 И серной кислотой (25 мкл на лунку). Результаты учитывали на спектрофотометре при длине волны 492 нм. В каждую постановку включали контроли: положительный, отрицательный и контроль конъюгата. Гибридому, продуцирующую МАТ нужной специфичности, клонировали в лунках 96-луночнмх панелей, содержащих "пери-тонеальную кормушку". Плотность рассева при клонировании - 1 клетка на 3 лунки.

Таким образом, ИФА позволил выявить специфичность МАТ к двум антигенам: к очищенным препаратам ААТ человека и павиана гамадрила.

ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА МАКАК

У исследованных макак были обнаружены 32 фенотипа ААТ, контролируемые 18 кодоминантными Р1тас-аллелями (таблица 1). Р1тас-аллели с близко расположенными точками рассматривались как подтипы, подобные М1, М2 и МЗ Р1-системы человека. Этот подход позволял оставаться в рамках классификации ОпюЪо ег а1., т.е., все аллели Р1тас, полученные при ИЭФ, могли быть отнесены к одной из пяти групп - А, В, С, Д и Е.

Соответствие аллельных групп В и С аллелям Р1тасВ и Р1тасС, описанным Отои) е^ а1., могло быть выяснено на основе сравнения частот соответствующих аллелей у различных видов макак. Так, по данным Ото г. о еЬ а1., /1970/, Ыогауа е1 а1., /1977/. Р1тасВ является основной аллелью у м. яванских: Р1п,ас С является второй по частоте аллелью у этого вида, но основной аллелью у м. бурых, м. резусов и м. лапундеров. Аналогичный характер распределения частот аллелей у макак был обнаружен

Табл. 1 Распределение фенотипов альфаИ-анпприпсииа у макак

ллт М. Ланские AJ. яляунЫры «.я. и.п. tetro M.peircH К.Я. Н.П. M.Óypue 1 Л1. П.П. tR. ttnO 1 IlílíL M. 1 ЛГ. аееач 1 лииот M. teptí. M. KUIH.

Ш 111 129 240 1 1

В1А1 1 1 < 1

В1ВЗ 2 1 3 1

В1С1 40 40 80 i

мв 1 1 l

В2С1 1 2 1

В2В5 1 1 i

ВЗС1 1 1 t

В4В6 1 ] !

B4CI 5 5 ¡

В4С2 1 1 1

В4СЭ ; 2 1

В4С5 1 1 ] ■

В6С1 8 8 i

В6С5 1 1 5

В7С1 ; i 1

С> 4 4 £ 67 65 132 225 220 ' 445 1 ?S 36 74 6 11 2 1

С1С2 17 76 43 1

СЮ 1 8 S п 1 1 1

С1С< 1 2

Cí С5 3 4 7 1 1

CIC6 1 1 1 1

С1С7 1 1 1 1 1

C1D1 2 2 1 1

С2 2 2 1 1

С2СЗ 2 2 1 1

сз Э 3 1

oes 1 1 t '

OD! 1 1 f 1

а El 1 I 1 1

С4 1 1 1

DI i 1 8

Всею 16 0 174 334 104 130 234 225 ::o >445 .' за -1 3fi 74 6 13 8 3 1

* - неизвестного происхождения (из природной популяции);

** - известного происхождения, т.е. рожденные в питомнике. .

Табл. 2. Чпстоти Р1[ШС аллслси у м. лоэиских, л), ляпуияерои, ли рсэусоо и м. бурых

M.Rnaucmit М.ядяуидсри M. резуем M. бурые

II.n. 11.11. (1741 ocero (33<í Н.П. i ii.n. lotero (I04> 1(1311 ¡(1341 11.П. П1Е) Н.П. (1201 всего 14431 n.il. (3E1 11.n. ¡361 всего (741

AI 0.0031 0.0015 1 1

- 111 0.B3I3 0.S592 О.Б453 1 1

П2 o.oml í o.oom

из 0.0094 0.W29 0.0060 ! 1

(14 lo imsio.eiu

tlf o.oo-u 1 lo.c::i

DS loP3!5lo.c:i4

CI 0.1531 0.1375 0.1(52 0!C!»l t.7 ! 0.7457 0.TO34 1.0 0MSÍ 1.0 1.0 1.0

C2 1 1 0.0513 10.1152 10.10«

C) 0 052? lo.C73l loMJI

CI | 0.0044 00022

C! o.oi!: 1 о.о:31 o.::» -

сь O.OOJ31 lo.c:2i

C7 ! 0,0022 С 0012

DI o.oo?; о.сзз;!о.п«

D2 0 0031 0 ООП 0 00 Г 5 i

Ш о.со:"' с co2i Ч

Пссго 1.0 10 10 D.í?! l.C i слот 1.0 1.0 1.0 1.0 10 1.0

для аллельных групп В и С. выявляемых при ИЭФ (таблица 2).

Вместе с тем, на основе данных о частоте аллелей невозможно было определить соответствие других аллелей, выявляемых при ИЭФ (PimacAl, Pimacfll, Piraacfl2, PinacEl). своим аналогам в классификации Omoto et al., (PiraacA, Pimacfl. PimacE). Так, было обнаружено, что Pimacfll является основной аллелью у м. магот, но к сожалению, этот вид не был исследован ранее. Кроме м. магот» Pimacfll была выявлена только у таиландских м. лапундеров, что согласуется с данным Omoto et al., (1970) о Pimaci, как редкой аллели, но особенно выраженный у данных тайландских макак. Pimacfl2, обнаруженная у м. яванских, была четко отличима с помощью ИЭФ от Р1гоасД1, несмотря на близость изоэлектрических точек этих аллелей. Аллели PimacAl и PimacEl получили свое название в связи с тем. что они контролируют варианты ААТ, расположенные наиболее близко к аноду и катоду. Мы выявили только двух обезьян, имеющих эти аллели: одну м. яванскую (А1В1) и один м. лапундер (СЗЕ1).

По сравнению с электрофорезом в кислом крахмальном геле, ИЭФ не дает значительного увеличения данных о полиморфизме ААТ у м. бурых, м. резусов, м. яванских. Хотя этот метод позволил идентифицировать новые аллели (PimacB3 у м. яванских, PimacC4 и PimacC7 у м. резусов), они являются довольно редкими у этих видов. Вместе с тем, метод ИЭФ позволил выявить значительный полиморфизм ААТ у м. лапундеров. У этого вида был выявлен 21 фенотипа, контролируемые 11 аллелями Pimac. Некоторые из этих аллелей довольно распространены среди м. лапундеров в природной популяции. Интересно, что PiffiacB2 и PimacD5 выявлялись только у м. лапундеров с Малазии, PinacB4 и PimacB6 с Индонезии, a PirnaсД1 -с Тайланда. Однако для подтверждения такого строгого географической распределения аллелей Pifflac необходимо исследовать большее количестве диких обезьян. Во всяком случае, данные о полиморфизме ААТ у м. лапун-

(еров могли быть очень полезный в генетических исследованиях популя-;ий диких макак, а также при контроле скрещивания обезьян, разводимых > неволе, особенно, в контексте недавно полученных сведений о м. ла-[ундерах, как о многообещающей модели для исследования HIV-1 инфекции.

Данные, полученные с помощью ИЗФ, изменяют существующее представ-1ение об общности аллелей Pinac для различных видов макак. Большинство ишелей Pimac. идентифицированных с помощью ИЗФ являются видоспецифич-)ыми. Из 18 аллелей Pimac только 4 одновременно выявлялись у двух 1ли более видов, за исключением к. магот; PimacC4 - ум. резуса и м. 1ссамского; Р1тасД1 - ум. лапундера и м. магот; PimacC3 - ум. ла-1ундера и м. черного. Следует отметить, что Pimacfll не обнаруживалась Г исследованных м. яванских; вместе с тем, наиболее частые фенотипы у этих обезьян (В1В1) во время беременности могли быть ошибочно приняты за В1Д1. Во избежание неверной оценки, фенотипирование ААТ должно быть товторено после родов.

С эволюционной точки зрения Pimac С1 рода макак можно рассматри-зать как прародительскую аллель ААТ. Данные о Р1тасД1 и PimacC3 как об эбщих аллелях для м. лапундеров, м. магот и и. черного, что согласует-:я с классификацией макак, основанной на морфологических признаках ^Fooden, 1980/ и на полиморфизме белка крови /Melnick & Kidd, 1985/, в соответствии с которой эти три вида макак относятся к группе syle-nus-sylvanus. Возможно, что обе аллели возникли у предка этой группы макак. Аллель PimacC4, которая была обнаружена у м резуса и м. ассамского, относящихся к различным, но близкородственным группам видов макак (группам fascicularis и sínica), возможно имеет еще более ранне происхождение. Однако, большинство аллелей Pimac-системы возникли, по-видимому, после дивергенции вида макак.

Таким образом, впервые с помощью ИЭФ. у исследованных обезьян вы-

явлены 32 фенотипа, контролируемые 18 кодоминантными аллелями. Что касается полиморфизма у них, то получены разнообразные оценки: от низкого мономорфизма ( у м. резусов, м. бурых) до высокого полиморфизма (у м. лапундеров и м. яванских). Большинство из аллелей имели видовую специфичность и только 4 аллелей Рд.лас являлись общими для двух или более видов.

ПОДТВЕРЖДЕНИЕ РЕАЛЬНОСТИ ОБНАРУЖЕННЫХ АЛЛЕЛЕЙ В СЕМЕЙНОМ

АНАЛИЗЕ.

Окончательное подтверждение наблюдаемых аллелей возможно лишь после проведения семейного анализа. Как правило, для исследований доступны сыворотки обезьян, полученные из природных популяций, для которых отсуствуют сведения о родственных связях. До настоящего времени семейный анализ по Pi-локусу не был проведен ни для одного вида обезьян.

После расшифровки фенотипов ААТ с помощью ИЭФ было необходимо подтвердить реальность некоторых постулируемых нами аллелей посредством семейного анализа. При построении последнего были использованы данные зоотехнического архива питомников обезьян ИЭПиТ (г. Сухум). Однако с целью их верификации был применен дополнительный контроль, который включал определение фенотипов трансферрина в сыворотках обезьян-родителей и их потомков. Полиморфизм трансферрина был весьма высок: семь аллелей было выявлено среди обезьян-производителей. После применения данного контроля доступными для семейного по Pi-локусу оказались 35 случаев рождения макак яванских, большинство из которых имело место в трех гаремных группах, сформированных из животных, привезенных из мест естественного обитания. Скрещиваемые обезьяны имели следующие фенотипы ААТ: dBlxfJBl, ОВ1С1, 9CI; OBlClxOBl. OBlCl.CClíCBlClx^Bl,

1В1С1, (рВЗВ1. Проведенный семейный анализ показал, что фенотипы всех утенышей полностью соответствуют ожидаемым на основании законов Меняла.

Аналогичный характер распределения был обнаружен и у м. лапунде-)0в. В целом, были проанализированы 59 случаев рождения в 5 гаремных 'руппах ( у обезьян, включенных в семейный анализ, присуствовали алле-ш Р1тасС1. Р1гоасС2, Р1тасСЗ, Р1гаасС5. Р1пасВ4. Р1шасВ6). Как и в пер-5ом случае, семейный анализ показал, что фенотипы всех детенышей соот-зетствовалн ожидаемым на основании законов Менделя; была подтверждена I кодоминантность аллелей ААТ. Наследование аллелей ААТ у макак лапун-1еров показано на рис.1.

Рис I. Наследование альс|т- 1-аититрипспиа у макак дапундеров.

Таким образом, семейный анализ доказал реальность аллелей, которые были предложены исходя из ИЭФ.

Интересно было сравнить реальные и ожидаемые частоты фенотипов ААТ у м. яванских в соответствии с уравнением Харди-Вайнберга. Последнее было выполнено раздельно для обезьян, полученных из мест естественного обитания (Индонезия), и обезьян, рожденных в питомнике (И). Полученные результаты (таблица 3) свидетельствуют об отсуствии достоверных отличий в распределении реальных и ожидаемых частот фенотипов

ААТ в обеих группах обезьян.

Табл. 3. Сравнение реальных и ожидаемых на основании уравнения Харди-Вайнберга фенотипов ААТ макак яванских, полученных из Индонезии и рожденных в питомнике (П)

Группа Количество! В1 | 1- " "1 ~ 1 В1С | С1 1 1 г " г ■" 1 " " |В1ВЗ|С1ВЗ|ВЗВ1 1 1 1

Из Индонезии 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

реально наблюдаемые 117 185 |25 |5 11 11 10

ожидаемые 116,96 182,04|30,14|2.7711, 6610, ЗОЮ. 008 1 1 1111

П 1 1 1 1 1 1 1 I 1 1 1

реально наблюдаемые 98 174 120 13 11 10 10

ожидаемые 1 97,98 |72,85|22,42| 1,72| 0,8610,13|0,002 . 1., ___X ..!..- . -I-.......

В связи с широким распространением гаремного способа разведения проведение семейного анализа в питомниках обезьян затруднительно. В этих условиях возрастает вероятность ошибки при определении матерей. По этой причине было желательно проконтролировать родословные, полученные при зоотехнических наблюдениях, с помощью сывороточного бежа, генетическая система которого хорошо изучена и достаточна полиморфна. Наиболее подходящим в этом отношении является трансферрин. Действительно, семь аллелей этого бежа среди обезьян, отобранных для семейного анализа, позволили обеспечить достаточно эффективный контроль родословных.

Данные семейного анализа подтверждают реальность некоторых аллелей, причем с этим выводом хорошо согласуется и совпадение частот тео-

>етически рассчитанных и действительно наблюдавшихся фенотипов ААТ у )безьян из мест естественного обитания. Такого совпадения могло не >ыть в группе макак, рожденных в питомниках, из-за использования в них •аремного способа разведения. Однако наличие самцов-производителей с )енотипами как В1, так и В1С1 позволило сохранить частоту аллелей ААТ, ¡лизкую к природным популяциям по крайней мере в поколении П.

МИКРОГЕТЕРОГЕННОСТЬ АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА МАКАК.

Все выявленные варианты ААТ характеризуются выраженной микрогете-югенностью. В их гомозиготных вариантах легко обнаруживались несколь-ю характерных зон: а) анодную, слабо окрашенную, диффузную, б) основ-|ую, содержащую наиболее яркую полосу, в) катодную с двумя четкими ли-[иями различной интенсивности (рис. 2). Принадлежность всех этих зон юдтверждалась методом иммунного блоттинга с помощью антисыворотки [ротив ААТ человека. В гетерозиготных вариантах ААТ все зоны каждого тлеля также были хорошо различимы.

Особого внимания заслуживает тот факт, что в сыворотках крови не-юторых обезьян наблюдались варианты ААТ, у которых локализация всех юн хотя и соответствовала обычным фенотипам, однако интенсивность од-юй из линии катодной зоны была столь высока, что приближалась по это-[у признаку к основной линии (рис. 3). Последнее свойство не отображаю какой-то особый генетический вариант и являлось транзиторным, пос-юльку исследование сывороток тех же обезьян через какой-то временной :нтервал выявило обычные фенотипы ААТ. Одна из установленных причин ■акого усиления катодной зоны несомненно связано с беременностью (все О самок, у которых во время взятия крови была определена беремен-ость, имели варианты ААТ с усиленной катодной зоной). В одном случае налогичная картина наблюдалась в сыворотке больной обезьяны, которая

Рис. 2. Микрогетерогенность альфаЛ-аптитрипсииа макак.

Фенотип 1)1.

Зоны: А - анодная; О - основная; К} - катодная полоса 1 и Кт - катодная полоса 2.

Рис 3. Фенотипы альфа-1-антитрипсина у беременных макак.

1 2 3 4 5 8 7 8 9 1011 12

Обычные фенотипы: В1 - 5,7, 8,9,10; В1С1 - 2,4.6. Варианты с усиленной С1 -1; В1С1 - 3; В1-И,12.

огибла спустя два дня после взятия крови с диагнозом гастроэнтероко-ит.

Таким образом, негенетическая микрогетерогенность может усложнять енотипирование ААТ, поскольку у беременных макак наблюдается резкое величение полосы К!. В таких случаях гомозиготные варианты ААТ (с вумя выраженными полосами - 0 и ^) имитируют гетерозиготные вариан-ы. Ошибочная интерпретация гомозиготных фенотипов ААТ у беременных акак будет приводить к завышению частоты обнаружения гетерозигот, что огло быть причиной отклонения от равновесия Харди-Вайнберга, которое аблюдали Купперс и Ганезан /1977/. Действительно, фенотипы с усилен-ыми катодными зонами в первый момент кажутся особыми генетическими ариантами даже при ИЭФ. Несомненно, что распознование таких фенотипов ще более затруднено при электрофорезе в кислом крахмальном геле, так ак , в отличие от ИЗФ, различающего все зоны каждого аллеля, при даном методе аллели В и С имеют общую зону, в которой катодная полоса дного аллеля полностью совпадает с анодной полосой другого. В резуль-ате физиологическое усиление одной из зон может быть ошибочно принято а действие "соседнего" аллеля. В группах импортируемых обезьян, вы-овленных в местах естественного обитания, практически всегда часть амок беременна. По-видимому, наличие беременных самок, фенотипы кото-ых могли быть ошибочно интерпретированы, и является причиной описан-ых в литературе расхождений частот теоретических и реально наблюдав-ихся фенотипов ААТ у макак яванских. Изменение интенсивности отдель-ых зон ААТ при воспалительных процессах, действии эстрогенов, в том исле при беременности, было известно ранее у человека (Уорд, 1981). олее того, довольно подробно изучена биохимическая основа этих изме-ений (Уаищ11ап е1.а1., 1982). В частности установлено, что микрогете-огенность ААТ человека связана с существованием трех изоформ этого

гликопротеина, отличающихся друг от друга степенью разветвленности боковых углеводных цепей. Возрастание уровня ААТ при воспалении идет з; счет изоформ с трихотомическим ветвлением углеводных групп. Последив' соответствует усилению анодных зон ААТ человека. Поскольку аминокис лотный и углеводный состав ААТ макак и человека сходен (Вегп^ег МаЫиз. 1976) можно предполагать, что причины микрогетерогенности это го белка у макак связаны с особенностями структуры углеводных цепей Однако, в отличие от человека, у макак при беременности возрастает ин тенсивность катодной зоны ААТ.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАПЬНЫХ АНТИТЕЛ В ТИПИРОВАНИИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА ПРИМАТОВ

Данные ИФА показали специфичность полученных МАТ человека и одно го вида обезьян - павиана гамадрила. Однако требовалось подтвердить что эти МАТ реагируют с ААТ и других обезьян. Учитывая многобразие ро дов и видов обезьян, было ясно, что в данном случае не приемлем под ход. основанный на выделении очищенного антигена. Эту задачу, однак можно было сравнительно просто решить, воспользовавшись данными о ге нетичическом полиморфизме ААТ приматов, который выявляется при ИЭ<1 Каждый род (а в ряде случаев и вид) обезьян характеризуется свои собственным вариантом ААТ. Эти варианты включают мажорные и минорнь полосы, расположенные в строго определенных участках ИЭФ геля. Следуе отметить, что принадлежность этих полос к ААТ была неоднакратно подч верждена с помощью иммунологических методов, основанных на использовг нии гипериммунных антисывороток против ААТ человека.

Сведения о полиморфизме ААТ у приматов позволили изучить реактин ность полученных МАТ с ААТ большого числа родов и видов обезьян. Прс цедура исследования включала ИЭФ в ПААГ, белковый перенос и иммунопрс

'с. 4. Иммунологическое типированне генетических вариантов ААТ макак с мощью МАТ.

ВШ1 (макак яванский)

(макак магот) С1 (макак резус) С2 (макак лапундер) В1 (макак яванский

с. 5. Иммунологическая идентификация ААТ различных видов зеленых мартышек ноклональными антителами.

Грнвет Вервет Сабэус

мартышка Мона мартышка Диана мартышка Брасса

9,10,12 1,2,6 3,11 7,8 5 4

явление с помощью МАТ. ИЭФ проводили в ПААГ в градиенте рН 4-5 или 4-6,5 в течение 4 часов (включая 1 час префокусирования) при напряжении 2000 вольт и температуре охлаждения +4°С. Сыворотки человека и обезьян с известными вариантами ААТ наносили на бумажные аппликаторь (1:5 в Н20, 20 мкл), которые помещали на гель на расстоянии 1 см от катода. После окончания ИЭФ методом контактной диффузии осуществлял» перенос белка с ИЭФ геля на нигроцеллюлозную мембрану. Для предотвращения неспецифической адсорбции мембрану выдерживали 1 час при комнатной температуре в растворе 8% сухого обезжиренного молока и после отмывки в ЗФР-Тв инкубировали с исследуемым МАТ (в разведении 1:4 дл: культуральной жидкости и 1:500 для асцита). После 3 отмывок ЗФР-Т1 мембрану инкубировали с антимьшиным пероксидазным конъюгатом ("Дако" в разведении 1:250 в ЗФР + 1% сухое молоко. После тщательной отмывк мембрану помещали в раствор субстрата (диаминобензин/Н202) и инкубиро вали в темноте при +37°С.

Рисунки 4 и 5 иллюстрируют некоторые из полученных результатов На рис. 4 показана реактивность МАТ с 5 известными генетическими вари антами макак (В1Д2, Д1, С1, С2, В1). В данной постановке использовг лись сьворотки 4 видов макак: яванских, лапундеров, резусов и магот Иммуноблоттинг после ИЭФ (рис. 5) показал, что полученные МАТ выявлда все полосы ААТ 7 видов зеленых мартышек. Следует отметить, что все ф< нотипы зеленых мартышек расположены ближе к катоду (ниже на геле), 41 ААТ человека и макак. В других экспериментах аналогичная реактивное МАТ была показана для ААТ еще нескольких видов макак (всего 9 видов 3 видов павианов, шимпанзе и красных обезьян. Эти данные свидетельс вуют о том, что полученные МАТ взаимодействуют с общей антигенной д терминантой ААТ приматов. Это свойство определяет равную эффективное МАТ как в отношении разных родов и видов приматов так и в отношен

зных аллельных вариантов внутри одного рода.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены гибридомы. продуцирующие моноклональные анти-ла против антигенной детерминанты альфа-1-ангирипсина, общей для че-века и обезьян. Определены основные характеристики этих антител.

2. Использование изоэлектрического фокусирования в полиакриламид-1М геле в градиенте рН 4-5 позволило впервые выявить 32 фенотипов, итролируемых 18 кодоминантными аллелями у 9 исследованных видов ма-1К, происходящих как из мест естественного обитания, так и рожденных неволе. Большинство из этих аллелей являлись видоспецифичными, толь) четыре - общими для двух или более видов.

3. Впервые доказана реальность некоторых выявленных аллелей в се-шном анализе, показавшего, что фенотипы всех детенышей соответству-г ожидаемым на основании законов Менделя.

4. Иммунологическая идентификация полос альфа-1-антитрипсина маис показала, что исследуемый белок имеет несколько характерных зон: ) анодную, слабо окрашенную: б) основную, содержащую наиболее яркую элосу; в) катодную с двумя четкими линиями различной интенсивности.

5. Применение моноклональных антител в типировании известных ге-егаческих вариантов показало перекрестную реактивность этих антител с бщей антигенной детерминантой альфа-1-антитрипсина человека, несколь-их видов макак, павиана гамадрила, красных и некоторых других обезь-н. Это может быть обусловлено тем, что полученные моноклональные ан-итела направлены к "древней" консервативной детерминанте альфа-1-ан-итрипсина приматов, сохранившейся в процессе эволюции этого отряда.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

В процессе акклиматизации обезьян рекомендовать определение ААТ, как маркера за состоянием здоровья обезьян, привезенных из мест естественного обитания, поскольку отлов и транспортировка в исследовательские центры сопровождаются стрессом и различными инфекциями.

Для всестороннего изучения полиморфизма ААТ у обезьян рекомендуется в комплексе с ИЭФ использовать иммунологическую идентификации исследуемого белка и по возможности проводить семейный анализ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сарсания Ж.Ш., Папава М.А. Детекция альфа-1-антитрипсина ; больных с легочной патологией. Тезисы докладов Всесоюзной конференци молодых ученых и медиков, Бакуриани, 1987, с.228.

2. Сарсания Ж.Ш. Полиморфизм альфа-1 антитрипсина в населении Аб хазии. Тезисы Республиканской конференции молодых ученых Абхазии, Пи цунда, 1989, с.96.

3. Сарсания Ж.Ш. Уровень белков острой фазы в сыворотке-крови ма как резусов, поступающих из мест естественного обитания. Тезисы 2 Мея дународной конференции по использованию лабораторных животных в меда ко-биологических исследованиях, Москва, 1990, с.115.

4. Самильчук Е.И., Сарсания Ж.Ш. Получение моноклональных антите к общей антигенной детерминанте альфа-1-антитрипсина человека и обез! ян. Тезисы 3 Международной конференции по биотехнологии, Рига, 1991 с. 54.

5. Самильчук Е.И., Сарсания Ж.Ш., Зоделава И.Г., Хаджирисьян M.J1. гамм гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела против етигенной детерминанты альфа-1-антитрипсина приматов. Авторское сви-зтельство Н1756352, Открытия. Изобретения. 1992, N31.

6. Е. Samilchuk, S. Sarsaniya. Genetic polimorphism of alp-i-l-arititrypsin in macaque species. Primates. 1994, N7, p.353-360.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AAT - альфа-1-антитрипсин;

ГАТ - гипоксантин, аминоптерин, тимидин;

ГТ - гипоксантин, тимидин:

ИЭФ - изоэлектрическое фокусирование;

ИФА - иммуноферментный анализ;

И.П. - известного происхождения (из природной популяции);

МАТ - моноклональные антитела;

Н.П. - неизвестного происхождения, т.е. рожденные в питомнике;

ПААГ - полиакриламидный гель.