Автореферат и диссертация по медицине (14.00.26) на тему:Иммунологические методы в диагностике и оценке течения туберкулезной инфекции

На правах рукописи

Салина Татьяна Юрьевна

оозое1367

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ И ОЦЕНКЕ ТЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

14.00.26 - фтизиатрия

14.00.36- аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 2006

003061967

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет» и в НИИ фтизиопульмонологии ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Михаил Александрович Владимирский

Доктор медицинских наук, профессор Татьяна Ивановна Морозова Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Сергей Евгеньевич Борисов Доктор медицинских наук, профессор Владимир Анатольевич Стаханов Доктор медицинских наук, профессор Александр Александрович Ярилин

Ведущее учрезвдение

Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН

Защита диссертации состоится 25 апреля 2007г. в

часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.06. в НИИ фтизиопульмонологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: 127994, г. Москва, ул. Достоевского д.4

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский пр-т, д.49)

Автореферат разослан «

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

Марина Петровна Грачева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Туберкулез известен с глубокой древности. Однако, несмотря на повсеместно проводимую работу по борьбе с этим заболеванием и совершенствование методов его диагностики и лечения, эпидемическая ситуация по туберкулезу остается весьма напряженной [М.И. Перельман 2001; М.В. Шилова, 2005]. В последние годы отмечается рост числа тяжелых и остро прогрессирующих форм туберкулеза, характеризующихся низкой эффективностью проводимого лечения [А.К. Стрелис и др., 1999; Л.И. Юкелис и др., 2002; В.Ю. Мишин и др., 2005]. Нередко у таких больных отмечается резко выраженный интоксикационный синдром, осложнение туберкулезного процесса присоединением вторичной инфекции, лекарственной устойчивостью мико-бактерий, иммунодепрессией. Уже становится очевидным, что ориентация только на антибактериальную терапию у этих пациентов является ошибочной [А.Г. Хоменко, 1997]. Внедрение стандартных режимов, рекомендованных ВОЗ, и новых технологий химиотерапии отечественных разработок не обеспечили существенного повышения эффективности лечения [H.A. Жук, 2003] Если у большинства таких пациентов и удается добиться уменьшения выраженности клинических проявлений заболевания, то инволюция развившихся локальных изменений в легких происходит очень медленно [А.Г. Хоменко, 1997]. По-видимому, основного упора на подавление микробного фактора в развитии туберкулезного процесса явно недостаточно, так как элиминация любого инфекционного агента является результатом синергичного взаимодействия между защитными силами макроорганизма и антимикробными агентами [R. Crevel et al., 2002; M.G. Bonecini-Almeida et al., 2004].

Дальнейшее совершенствование патогенетических методов лечения таких больных - реальная возможность снижения смертности от туберкулеза. Однако для разработки методов патогенетической терапии туберкулеза необходимо детальное изучение механизмов, определяющих неблагоприятное те-

3

чение туберкулезного процесса и тех его звеньев, коррекция которых может потребоваться в процессе антибактериального лечения.

Поэтому первая часть диссертационного исследования посвящена изучению иммунологических механизмов патогенеза туберкулеза, определяющих тяжелое и неблагоприятное течение патологического процесса на основе применения различных иммунологических методов, позволяющих оценить как активационные, так и эффекторные функции противоинфекционной защиты.

Второй, не менее важной, проблемой фтизиатрии является диагностика и верификация диагноза туберкулеза у больных без выделения микобакте-рий. Абациллярный туберкулез, который в настоящее время признан во всем мире, часто труден для диагностики и дифференциальной диагностики его с другими легочными заболеваниями, особенно онкологической природы [А.Г. Хоменко, 1997].

До настоящего времени, несмотря на внедрение таких современных технологий как компьютерная и магнитно-резонансная томография, и целый ряд инструментальных и инвазивных методов, диагноз туберкулеза и рака легких, нередко, ставится методом проб и ошибок. По-прежнему, высок процент (34-40%) ошибочной диагностики туберкулеза [А.Г. Хоменко, 1998; Л.И. Юкелис и др., 2002; В.Ю. Мишин и др., 2004]. Кроме того, существует определенная категория больных, у которых морфологическая верификация диагноза невозможна из-за возраста, тяжелых сопутствующих заболеваний и отказа пациентов от применения инвазивных методов обследования. Разработка и внедрение в практику относительно простых, преимущественно нелучевых методов диагностики туберкулеза и его дифференциальной диагностики с другой легочной патологией - реальные пути снижения смертности от этих заболеваний.

В связи с этим вторая часть диссертационного исследования посвящена изучению диагностической информативности прямых (молекулярно-генетических) и непрямых (серологических) методов диагностики туберкуле-

за и его дифференциальной диагностике с другими легочными заболеваниями. Вышеизложенное определило цель и задачи нашей работы.

Цель исследования

Повышение эффективности диагностики и поиск новых критериев оценки течения туберкулезного процесса на основе применения иммунологических и молекулярно-генетических методов исследования.

Задачи работы

1. Изучить информативность определения экспрессии активационных маркеров на лимфоцитах больных туберкулезом в качестве иммунологического критерия, определяющего неблагоприятное течение туберкулеза.

2. Установить особенности продукции интерферона-у и фактора некроза опухоли-а в разных биологических материалах (сыворотка крови, супернатанты краткосрочных культур мононуклеарных клеток, культуры цельной периферической крови) в зависимости от характера течения туберкулезного процесса и их корреляционные связи с клиническими и некоторыми иммунологическими параметрами туберкулеза.

3. Оценить диагностическую эффективность серологических методов выявления антимикобактериальных антител, определения уровня ИФН-у в сыворотке крови в дифференциальной диагностике туберкулеза легких.

4. Определить диагностические возможности ПЦР в реальном времени в диагностике абациллярного и олигобациллярного туберкулеза и его дифференциальной диагностике с другими легочными заболеваниями.

Научная новизна

Выявлены ранее неизвестные иммунологические критерии неблагоприятного течения туберкулезного процесса, характеризующиеся досто-

верным увеличением в периферической крови клеток, экспрессирующих на своей поверхности активационные маркеры CD25, HLA-DR и Fas (CD95), спонтанной гиперпродукцией ФНО-а и истощением функциональных резервов иммунокомпетентных клеток в виде угнетения индуцированной продукции ИФН-у в ответ на специфические антигены BCG, H37R.v и ESAT-6.

Установлены особенности продукции ФНО-а и ИФН-у в разных биологических субстратах (сыворотка крови, супернатанты краткосрочных культур периферических мононуклеарных клеток и цельной крови) и их взаимосвязи с клиническими проявлениями туберкулеза.

Показано нормализующее влияние лекарственного препарата анафе-рон на уровень спонтанной продукции ИФН-у у больных туберкулезом в супернатантах культур цельной крови in vitro.

Впервые установлены новые диагностические критерии, позволяющие повысить эффективность дифференциальной диагностики туберкулеза и других заболеваний легких, заключающиеся в повышении чувствительности серологических методов выявления антител к М. tuberculosis при комбинированном использовании 2-х антигенов (H37Rv и ESAT-6), а также в определении высокого (свыше 130 пг/мл) уровня ИФН-у в сыворотке крови.

Показана высокая (86,2%) диагностическая эффективность новой молекулярно-генетической технологии ПЦР в режиме реального времени в диагностике абациллярного и олигобациллярного туберкулеза и дифференциальной диагностике туберкулеза и других заболеваний легких.

Практическая значимость

Разработана модель оценки течения туберкулезного процесса и подбора иммунотропной терапии, на основе комбинированного определения количественных (CD 25, HLA-DR, CD 95) и функциональных параметров противоинфекционной защиты (индуцированной специфическими антиге-

нами продукции ИФН-у и ФНО-а) и постановки пробы с лекарственными препаратами in vitro.

Показана возможность повышении эффективности диагностики туберкулеза с помощью комбинированного использования в иммунофер-ментном анализе 2-х антигенов (H37R.v и ESAT-6), применения новой мо-лекулярно-генетической технологии ПЦР в режиме реального времени для оптимизации микробиологической диагностики абациллярного и олигоба-циллярного туберкулеза и его дифференциальной диагностики с другими заболеваниями легких.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Тяжелое, прогрессирующее течение туберкулезного процесса, обусловливающее неблагоприятный исход заболевания, характеризуется усилением активационных механизмов клеточно-медиаторного иммунитета, приводящих к запуску апоптогенных механизмов и возникновению Т - клеточной лимфопении.

2. Функциональные проявления деятельности иммунокомпетентных клеток, оцениваемые по уровню спонтанной и индуцированной антигенами микобактерий и рекомбинантным антигеном ESAT-6 продукции фактора некроза опухоли-a и интерферона-у в периферической крови, отражают характер течения туберкулезного процесса.

3. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени и серологические методы (ИФА и ИХА), направленные на выявление ан-тимикобактериальных антител могут служить существенным дополнением в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза и других заболеваний легких, особенно онкологической природы. Апробация работы

Материалы диссертации доложены на: 7 Интернациональном конгрессе по инфекционным заболеваниям (Hong Kong, 1996); Интернациональном симпозиуме «Геронтологические аспекты пептидной регуляции функций организма» (Санкт-Петербург, 1996); на 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,

15 Национальных конгрессах по болезням органов дыхания; на 3, 4, 7 съездах фтизиатров (1997; 1999;2003); на 3-м конгрессе Европейского интернационального союза борьбы с туберкулезом и другими легочными заболеваниями (Москва, 2004), 3-й Интернациональной хирургической телеконференции «Новые технологии в медицине» (Санкт-Петербург, 2006).

Официальная апробация работы проведена на совместном заседании кафедр фтизиатрии ФПК и ППС, фтизиопульмонологии, лабораторной диагностики, анатомии человека Саратовского государственного медицинского университета 5 октября 2006г и заседании Ученого Совета НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова 13 декабря 2006 г.

Внедрение в практику:

Материалы работы внедрены в практику Саратовского областного противотуберкулезного диспансера, используются в лекционном курсе на циклах повышения квалификации врачей фтизиатров на кафедре фтизиатрии ФПК и ППС, при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами 5 и 6 курсов лечебного и педиатрического факультетов кафедры фтизиопульмонологии СГМУ, включены в учебно-методические пособия и рекомендации. Получено 4 удостоверения на рационализаторские предложения, подана заявка на изобретение № 2005106829. Опубликовано информационное письмо для органов практического здравоохранения, утвержденное МЗ и социальной поддержки Саратовской области.

Публикации

Материалы диссертации отражены в 52 печатных работах, из них 9 в центральных журналах, 5 в материалах Международных конгрессов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя (181 наименование отечественных и 194 трудов зарубежных авторов). Работа изложена на 279 страницах машинописного текста (основной текст - 238 страниц), иллюстрирована 45 таблицами, 25 рисунками и 3 клиническими примерами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Общая характеристика обследованных больных и методов исследования

Основу диссертационной работы составили результаты обследования 429 пациентов, находившихся на стационарном лечении или амбулаторном консультативном приеме в Саратовском областном противотуберкулезном диспансере в 1998-2006 гг.

Из них больных активным туберкулезом было 286, пациентов с онкологическими заболеваниями легких - 103, с другой легочной патологией - 40 человек. В качестве контрольной группы обследовано 115 здоровых лиц. Характеристика больных по полу и возрасту представлена в таблице 1.

Характеристика больных по полу и возрасту

Группы обследованных Число об- Пол Возраст (годы)

следованных Муж. Жен. до 20 2140 4160 Старше 60 лет

1. Активный ту- абс. 286 62 224 42 121 88 35

беркулез легких % 66,7 14,5 52,2 9,8 28,2 20,5 8,2

2.0нкологические абс. 103 66 37 0 12 48 43

заболевания лег- % 24 15,4 8,6 0 2,8 11,2 10,0

ких

3.Другие легоч- абс. 40 17 23 3 12 15 10

ные заболевания % 9,3 3,9 5,4 0,7 2,8 3,5 2,3

Всего: абс. 429 145 284 45 145 151 88

% 100 33,8 66,2 10,5 33,8 35,2 20,5

Согласно поставленным задачам, при решении каждой из них из этих больных формировались самостоятельные группы с различной численностью наблюдений. Некоторые пациенты параллельно участвовали в нескольких фрагментах исследования.

В структуре клинических форм больных активным туберкулезом преобладали пациенты с впервые выявленным инфильтративным туберкулезом легких - 179 (62,6%). Из них с распадом было 150 (52,5%), с бактериовыделе-нием - 133 (46,5%) пациента. Среди больных с нетуберкулезной патологией превалировали больные с онкологическими заболеваниями легких - 103 (72%) человека.

В соответствии с поставленными задачами работа проводилась по двум направлениям. В первой части диссертационного исследования осуществлялось поэтапное наблюдение за особенностями и характером течения патологического процесса у 157 больных преимущественно впервые выявленным активным туберкулезом легких. Пациенты были распределены на 2 группы. Группу 1 (п=75) составили лица с ограниченным (в пределах 1-2 х сегментов) туберкулезным процессом, без выраженных симптомов интоксикации. В группу 2 были включены 82 пациента с тяжелым, прогрессирующим и осложненным течением туберкулеза с выраженным интоксикационным и брон-холегочным синдромом. Всем больным проведен общепринятый во фтизио-пульмонологической практике комплекс клинико-лабораторных, рентгенологических, микробиологических, биохимических и в ряде случаев инструментальных методов исследования. Особое внимание уделялось иммунологическим методам обследования пациентов.

Использовались методы, направленные на определение активационных механизмов Т-клеточного иммунитета и эффекторных функций противоин-фекционной защиты. Проводилось определение экспрессии активационных маркеров (CD 25, HLA-DR) и Fas (CD 95) на лимфоцитах периферической крови, изучалось содержание ИФН-у и ФНО-а в сыворотке крови, спонтанная и индуцированная антигеном M.bovis (BCG) продукция ИФН-у и ФНО-а в супернатантах краткосрочных (24-х часовых) культур периферических мо-нонуклеарных клеток крови, спонтанная и стимулированная антигенами H37Rv и ESAT-6 продукция ИФН-у в супернатантах 48 часовых культур цельной крови и продукция ИЛ-8 в 24-часовых культурах периферической

крови спонтанно и после индукции антигеном H37Rv. Дополнительно у части пациентов определялось относительное и абсолютное содержание клеток с маркерами CD3, CD4, CD 16, а также некоторые показатели специфического гуморального иммунитета (уровень суммарных антител к возбудителю туберкулеза, количественное содержание антител класса Ig G к M.tuberculosis). Использовались методы иммунофенотипирования лимфоцитов на основе мо-ноклональных антител [Д.К. Новиков и др., 2000], методы твердофазного иммуноферментного анализа с применением 2-х моноклональных антител к рекомбинантным ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-8 в авидин-биотиновой системе (тест-системы г. Новосибирск, ЗАО «Вектор-БЕСТ»; г. С. Петербург, фирма «Cyto-cin»), методы гетерогенного иммуноферментного анализа вариант «сэндвич» для определения антител к микобактериям туберкулеза с использованием антигенов H37Rv и ESAT-6 и метод иммунохроматографического экспресс-теста выявления антител к микобактериям туберкулеза на основе антигена (А-60) штамма BCG («ТВ-CHECK», Франция).

Во второй части диссертационного исследования изучалась диагностическая информативность использования некоторых иммунологических и мо-лекулярно-генетических методов в дифференциальной диагностике туберкулеза и других заболеваний легких. Из общего числа обследованных выделено 272 пациента с различной легочной патологией, у которых установление диагноза представляло значительные трудности. Исследования проводились методом слепого отбора пациентов с ретроспективной оценкой результатов по окончательному диагнозу. После проведенного комплексного обследования с применением клинических, микробиологических, цитологических, рентгенотомографических и в ряде случаев гистологических методов исследования диагноз активного туберкулеза легких был установлен у 129 человек, онкологические заболевания легких - у 103, другие легочные заболевания были диагностированы у 40 пациентов. Группу контроля составили 41 человек, практически здоровых лиц. Из них у 164-х больных проводилось изучение диагностической значимости непрямых иммунологических мето-

дов, направленных на подтверждение специфической этиологии патологического процесса.

У 88 больных проводилось сравнительное исследование результатов иммуноферментного анализа определения антител к М. tuberculosis с использованием разных антигенов (H37Rv и ESAT- 6). Антиген H37Rv представляет собой суспензию гамма облученной биомассы вирулентного штамма М. tuberculosis, получен из НИИ фтизиопульмонологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.

ESAT-6 - новый высоко специфический пептид, с молекулярной массой 6 кДа, продуцент метаболической активности микобактерий туберкулеза [R. A. Ravn et al., 1999; L.A.N, van Pinxterin et al., 2000], секретирующийся в раннюю и активную фазу инфекции. Антиген ESAT-6 любезно предоставлен институтом биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.Н. Овчинникова. Изучение секреторных протеинов M.tuberculosis в качестве главных активаторов специфического иммунитета в настоящее время рассматривается как перспективное направление в создании вакцин и диагностических тестов [V. Traikovic et al., 2002].

При использовании антигена ESAT-6 нами проводилась работа по подбору его оптимальной концентрации, отработки скрининга-титра сывороток больных туберкулезом, нетуберкулезными заболеваниями и здоровых, обеспечивающих максимальные уровни чувствительности и специфичности анализа. Определялась диагностическая эффективность комбинированного использования иммуноферментных тест-систем с применением 2-х антигенов.

У 68 больных, выделенных из общего числа диагностических пациентов проводилось сравнительное изучение эффективности применения иммуноферментного анализа с антигеном H37Rv и иммунохроматографического экспресс-теста с антигеном А 60 в дифференциальной диагностике туберкулеза и рака легких.

У 61 пациента изучалась диагностическая информативность определения уровня ИФН-у в сыворотке крови в подтверждении специфической

этиологии заболевания и возможности использования этого показателя как дополнительного критерия в дифференциальной диагностике туберкулеза и рака легкого.

У 108 больных определялась информативность использования прямых методов диагностики туберкулеза, направленных на выявление фрагментов молекулы ДНК возбудителя, с помощью новой молекулярно-генетической технологии полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Real Time) для дифференциальной диагностики туберкулеза и других заболеваний легких. Диагностическая эффективность метода определялась в сравнительном аспекте с традиционными микробиологическими методами и иммуно-ферментным анализом определения антител к М. tuberculosis. Для проведения реакции использовался специальный ДНК - амплификатор с оптическим блоком (¡Cycler iQ, производства Био-Рад Лаборатории, США), позволяющий совместить этапы амплификации и детекции продуктов ПЦР и измеряющий флюоресценцию после каждого цикла амплификации, возрастающую пропорционально увеличению числа ампликонов в реакционной смеси.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием компьютерных программ Microsoft ® Excel для Windows хр ® и Statistica на персональном компьютере. Использовали методики описательной статистики (вычисление среднего арифметического (М), ошибки среднего арифметического (т) и специальные статистические методики (метод корреляции Пирсона и Спирмена [Н.В.Макарова, В.Я. Трофимец, 2003]; критерий соответствия % «хи-квадрат» на основе таблицы взаимной сопряженности «четырехпольной таблицы»). Сравнение двух групп, подчиняющихся нормальному распределению, проводили с помощью t-критерия Стьюдента, а не подчиняющихся нормальному распределению - теста Вилкоксона и точного критерия Фишера. В качестве критического уровня достоверности различий был принят уровень 0,05.

Определение необходимого (оптимального) объема выборки проводили по формуле: n=t2o2 /Д2, где Д-предельная ошибка выборки, о - дисперсия

генеральной совокупности, t - коэффициент доверия, определяемый в зависимости от того, с какой доверительной вероятностью необходимо гарантировать результаты выборочного обследования [Макарова Н.В., Трофимец В.Я., 2003].

Результаты исследований и их обсуждение.

Установлено, что у больных активным туберкулезом легких отмечается достоверное увеличение в периферической крови мононуклеарных клеток, экспрессирующих на своей поверхности активационные маркеры: рецепторы к ИЛ-2 (CD25) и HLA-DR 45,5±2Д% и 45,6±2,6% соответственно против 29,7±3,5% (р<0,001) и 32,5±3,5% (р<0,01) у здоровых. Параллельно с увеличением в крови клеток CD25 и HLA-DR у больных туберкулезом увеличивается и число CD95 клеток, экспрессирующих Fas, который принято рассматривать как индуктор апоптоза [А.Н. Маянский и др., 1997; А. Ю. Барышников,1998]. Уровень Fas(CD95) клеток у больных туберкулезом составил 39,5%±2,2% против 23,0±2,1% у здоровых (р<0,001). Аналогичные изменения в сторону повышения изучаемых показателей у больных туберкулезом были получены и для CD16 клеток и уровня антител к M.tuberculosis. Количество CD16 клеток у пациентов с туберкулезом легких составило 55,5±5,3% против 23,9±4,8% у здоровых (р<0,01), уровень антимикобактериальных антител - Д ОП 0,23±0,04 против 0,058±0,01 соответственно (р<0,05). Результаты представлены в таблице 2.

Получены достоверные различия, характеризующиеся увеличением числа клеток, экспресирующих на своей поверхности активационные маркеры CD 25, HLA-DR и Fas (CD95) у пациентов, у которых кроме активного туберкулезного процесса в легких имелись клинические признаки присоединения неспецифической инфекции, подтвержденные микробиологическими исследованиями (рост грибов рода Candida, кокковая флора, кишечная палочка и др.). Число CD25 клеток в периферической крови пациентов активным туберкулезом и присоединением неспецифической инфекции составило 51,7±3,6% по сравнению с больными без активации неспецифической флоры

Таблица 2

Средние статистические значения некоторых иммунологических показателей больных активным туберкулезом и здоровых доноров (М±т).

Показатели Больные активным туберкулезом (п=40) Здоровые (п=11) Р

Число

ЛИМФОЦИТОВ

% 28,2±1,7 28,1±1,2 >0,05

абс. в 1 мкл. крови 1495,9+84,0 1496,3±106,8 >0,05

CD 3 (Тл)

% 22,9+1,7 55,1+2,2 <0,001

абс. в 1 мкл. крови 367,9±50,4 837,5+50,8 < 0,001

CD25 (рИЛ-2)

% 45,5±2,1 29,7±3,5 <0,001

абс. в 1 мкл. крови 667,7147,3 436,7±65,2 <0,01

HLA-DR

% 45,6+2,6 32,5±3,5 <0,01

абс. в 1 мкл. крови 683,3±60,1 473,4±67,6 <0,05

CD95 (Fas)

% 39,5+2,2 23,0±2,1 < 0,001

абс. в 1 мкл. крови 563,9±40,7 370,5±45,2 <0,01

CD 16 (NK)

% 55,5+5,3 23,9±4,8 <0,01

абс. в 1 мкл. крови 875,8±95,0 408,71113,3 <0,01

Уровень антител к М.

tuberculosis в перифери-

ческой крови (Д ОП.) 0,23±0,04 0,05810,01 <0,05

42,1±3,2% (р<0,05); НЬЛ-БЯ 51,0+4,1% против 37,6+3,8% (р<0,05); СБ95 45,0+3,4% против 36,1 ±3,6% (р<0,05) соответственно. Однако не было установлено достоверных различий между изучаемыми параметрами у пациентов активным туберкулезом, выделяющих лекарственно-чувствительные и лекарственно-устойчивые, полирезистентные микобактерии туберкулеза.

Динамическое наблюдение в процессе антибактериальной терапии показало, что уже через 2 месяца назначения этиотропных препаратов наблюдается тенденция к снижению клеток с маркерами активации СБ 25 и НЬА-

DR и естественных киллеров CD 16. Однако достоверные различия получены только для клеток с маркером HLA-DR 50,9±4,1% исходно и 30,7±3,6% через 2 месяца терапии (р<0,05) и CD 16 клеток 55,5±5,3% и 31,2±4,8% соответственно (р<0,01).

Индивидуальный анализ экспрессии антигенов в зависимости от характера течения патологического процесса показал, что у пациентов тяжелым, прогрессирующим туберкулезом, выраженным интоксикационным синдромом и обильным бактериовыделением (гр. 2) количество клеток, экспресси-рующих рецепторы к ИЛ 2 было значительно выше 51,4±3,5%, чем у пациентов с ограниченным туберкулезом, благоприятным течением заболевания (гр. 1) 42,1±2,2% (р<0,05) и здоровых 29,7±3,5% (р<0,01). Аналогичные изменения получены и в отношении клеток, экспрессирующих антиген HLA-DR в указанных группах 52,3±3,3% и 40,2±3,4% соответственно (р<0,05) и здоровых 32,5±3,5% (р<0,001). Выявленным изменениям сопутствовало увеличение числа клеток, экспрессирующих Fas, так у пациентов группы 2 количество клеток с маркером CD95 было 44,2±3,5% против 35,7±2,3% у пациентов 1-й группы (р<0,05) и здоровых 23,0±2,1 (р<0,05).

Установлена средней степени прямая корреляционная связь между числом клеток, экспрессирующих рецепторы к ИЛ-2 (CD 25) и уровнем CD 95 клеток с коэффициентом корреляции г = 0,65 (р<0,05) и HLA-DR и CD 95 клетками г = 0,679 (р<0,05) у 14 наиболее тяжелых пациентов.

Это наводят на мысль, что повышение активационной способности лимфоцитов периферической крови, выявляемое по экспрессии рецепторов к ИЛ-2 (CD25) и HLA-DR ,по-видимому, является следствием их «преактива-ции» в организме хозяина и зависит от массивности бактериальной популяции, что подтверждается наибольшей выраженностью этих изменений у пациентов с тяжелым течением туберкулезного процесса и обильным бактериовыделением, а также снижением уровня экспрессии активационных маркеров в процессе противотуберкулезной терапии. Присоединение неспецифической инфекции у больных активным туберкулезом является дополни-

тельным фактором активации иммунной системы и ведет к дальнейшему повышению в периферической циркуляции числа клеток с маркерами CD25 и HLA-DR. Чрезмерная экспрессия Fas (CD95), наблюдаемая одновременно с увеличением активационных маркеров (CD 25 и HLA-DR) и наличие между ними корреляционных связей, возможно, является следствием дисбаланса активационных сигналов, обусловливающих включение программы гибели клеток при их активации («активационный апоптоз», «негативная активация»),

В связи с вышеизложенным, мы сочли правомерным провести сопоставление уровня клеток, экспрессирующих антигены CD 25, HLA-DR, CD 95 и степень выраженности продукции специфических антител с исходом туберкулезного процесса в пределах изучаемых нами групп. Ретроспективно, все пациенты были распределены на 3 подгруппы в зависимости от наблюдавшегося исхода. Подгруппу 1 составили лица с благоприятным исходом туберкулезного процесса (п=19), у которых в результате комплексного этио-патогенетического лечения удалось достичь положительной динамики процесса, в виде прекращения бактериовыделения и рубцевания полостей распада. Подгруппу 2 составили больные (п=10) относительно благоприятным исходом, у которых в процессе лечения было достигнуто незначительное рассасывание инфильтрации и наблюдалось формирование фокусов типа туберку-лем. Подгруппу 3 составили 11 пациенток с неблагоприятным исходом, у которых, несмотря на проводимую терапию, отмечалось прогрессирование туберкулезного процесса или трансформация инфильтративного туберкулеза в фиброзно-кавернозный туберкулез. Клинико-лабораторный анализ показателей экспрессии антигенов и уровня антимикобактериальных антител позволил выявить достоверные различия только в отношении числа клеток, экспрессирующих Fas (CD 95). У больных с неблагоприятным исходом туберкулезного процесса отмечался более высокий уровень CD95 клеток 49,1±4,3% по сравнению с пациентами с благоприятным 37,5±2,7% (р<0,05) и относительно благоприятным исходом 36,1±4,6% (р<0,05).

Кроме того, иммунологический мониторинг за больными туберкулезом показал, что у пациентов благоприятным течением заболевания в процессе эффективной этиопатогенетической терапии число CD 3 клеток имело тенденцию к увеличению и стойко нормализовалось к 10-12 месяцам лечения (23,9±2,3% исходно, 37,5±3,8% через 2 месяца терапии, р,.2<0,01 и 49,1±6,7%, через 10-12 месяцев, pi.3<0,001). В противоположность этому у пациентов с неблагоприятным, прогрессирующим течением патологического процесса среднее значение CD 3 клеток достоверно повышалось через 2 месяца терапии 36,1±3,8% по сравнению с исходными данными 20,1±3,1% (р<0,01) и затем снижалось через 4-6 месяцев терапии 30,7±5,7% и стойко сохранялось на низком уровне к 10-12 месяцам лечения 29,0±2,9%. Выявленная и длительно сохраняющаяся Т - клеточная лимфопения у пациентов активным, преимущественно тяжелым течением туберкулезного процесса на фоне исходно высокой экспрессии Fas (CD95), вероятно, является следствием повышенной гибели иммунокомпетентных клеток в результате массивной антигенной стимуляции. Увеличение числа CD 16 клеток и повышение уровня антимикобак-териальных антител могут быть результатом активации эффекторных функций, что в условиях подавления Т-клеточного иммунитета направлено на элиминацию возбудителя из организма.

У 32-х пациентов впервые выявленным активным туберкулезом легких изучалась информативность определения уровня ИФН-у в сыворотке крови. ИФН-у был обнаружен у 81,3% больных активным туберкулезом, среднее значение которого составило 152,5±38,1 пг/мл, что было достоверно выше чем у здоровых (п=16) 20,8±8,9 пг/мл (р<0,05). Нашими исследованиями не получено зависимости уровня ИФН-у в сыворотке крови от тяжести течения туберкулезного процесса, выраженности интоксикационного синдрома, наличия или отсутствия бактериовыделения. Среднее значение ИФН-у в сыворотке крови у пациентов 2-й группы (п=17) с тяжелым, прогрессирующим и осложненным туберкулезом составило 168,7±53,1 пг/мл против 134,3±56,1 пг/мл в 1-й группе (пациентов с ограниченным и благоприятно протекающим

туберкулезом, n=15), р>0,05. В обеих группах имелся большой размах индивидуальных значений ИФН-у от 0 до 740 пг/мл в гр. 2 и от 0 до 660 пг/мл в гр.1. Не установлена зависимость уровня ИФН-у в сыворотке крови и от характера и распространенности рентгенологических изменений в легких. Однако у 20 пациентов, имеющих кроме активного туберкулезного процесса в легких сопутствующие хронические неспецифические заболевания легких, почек, желудочно-кишечного тракта или сахарный диабет, осложненный вторичной инфекцией установлено значительное повышение уровня ИФН-у в сыворотке крови 208,9±55,2 пг/мл по сравнению с пациентами (п=12) без сопутствующей инфекционной патологии 31,4±10,1 пг/мл (р<0,05). Изучение корреляционной зависимости уровня ИФН-у в сыворотке крови с гематологическими показателями и некоторьми иммунологическими параметрами выявило достоверные корреляционные связи только между содержанием ИФН-у в сыворотке крови и уровнем суммарных антимикобактериальных антител с коэффициентом корреляции г=+0,57 (р=0,017) и количественным содержанием Ig G к М. tuberculosis г=+0,76 (р=0,007). Полученные данные позволяют предполагать, что уровень ИФН-у в сыворотке крови определяет ин-терфероногенную активность бактериальной микрофлоры и в меньшей степени отражает функциональную активность клеток крови и других систем, вовлеченных в патологический процесс.

У 18 больных активным впервые выявленным туберкулезом легких изучался уровень ФНО-а в сыворотке крови. Установлен повышенный уровень ФНО-а у 66,6% пациентов, среднее значение которого составило 176,2±28,7 пг/мл по сравнению со здоровыми 63,6±7,3 пг/мл (р<0,05). Аналогично исследованиям ИФН-у, ФНО-а в сыворотке крови имел большие индивидуальные колебания от 60 и менее пг/мл до 450 пг/мл. В то время как у здоровых лиц (п=12) уровень ФНО-а в сыворотке крови был низким, у 10 человек он не определялся и в 2-х случаях не превышал 112 пг/мл. Изучение содержания ФНО-а в сыворотке крови во взаимосвязи с клиническими проявлениями туберкулезного процесса показало отсутствие достоверных раз-

линий уровня ФНО-а в зависимости от степени выраженности интоксикационного и бронхолегочных синдромов, массивности бактериовыделения, характера деструктивных изменений в легких, наличия или отсутствия сопутствующей патологии. Установлена достоверная корреляционная зависимость содержания ФНО-а в сыворотке крови только от некоторых конкретных клинических симптомов: выраженности лихорадки (г=+0,56, р=0,036) и характера туберкулиновой чувствительности (проба Манту с 2 ТЕ, размер папулы в мм г=+0,60, р=0,02), что подтверждает его участие в патогенезе туберкулезного воспаления. Анализируя результаты собственных наблюдений, свидетельствующие о значительном размахе индивидуальных значений ФНО-а и ИФН-у в сыворотке крови, литературные данные [P.F. Barnes, В. Wizel, 2000; S. Smith et al., 2002], указывающие на их локальное накопление в очагах туберкулезного воспаления и лишь транзиторное появление в периферической циркуляции, возможное влияние на их уровень в сыворотке и плазме крови большого количества разнообразных плазменных факторов и ингибиторов дальнейшие исследования продукции ФНО-а и ИФН-у проводили с выделением и культивированием мононуклеарных клеток крови.

Проводилось определение спонтанной и индуцированной M.bovis (BCG) продукции ИФН-у и ФНО-а в супернатантах 24-х часовых культур мононуклеарных клеток, выделенных из периферической венозной крови у 31 пациентки с диагнозом активного туберкулеза легких (рис.1). В качестве антигена использовались живые М. bovis (BCG), предварительно культивированные на среде Левенштейна-Иенсена, в рабочей концентрации 50 мкг/мл. Установлен низкий уровень спонтанной продукции ИФН-у у пациентов с тяжелым, прогрессирующим и осложненным течением туберкулезного процесса (гр.2) 23,0±2,1 пг/мл по сравнению с пациентами 1-й группы с ограниченным и благоприятно протекающим туберкулезом 41,2±6,6 пг/мл (pj. 2<0,05) и здоровых 34,0±2,4 пг/мл (р1.3<0,01). Аналогичные изменения в сторону уменьшения продукции ИФН-у у тяжелых больных были получены и при изучении индуцированной M.bovis (BCG) продукции. У 11 (68,8%) паци-

ентов 2-й группы не было зарегистрировано прироста ответной реакции ИФН-у на индукцию антигеном по отношению к уровню спонтанной продукции и среднее значение Д ВСО составило 35,8±21,8 пг/мл против 214,9±81,9 пг/мл в гр.1 (р!.2<0,01) и здоровых 206,0±31,1 пг/мл (р2.3<0,01). Статистически достоверных различий между уровнем ответа периферических мононуклеарных клеток крови на стимуляцию М.Ьоу1з (ВСв) у пациентов 1-й группы и здоровых не получено 214,9±81,9 пг/мл и 206,0±31,1 пг/мл (р>0,05) соответственно. В тоже время при тяжелом прогрессирующем течении туберкулеза (гр.2) выявлена спонтанная гиперпродукция ФНО-а 1583,0±383 пг/мл, более чем в 10 раз превышающая уровень его продукции у больных с ограниченным туберкулезным процессом и благоприятным течением заболевания (гр.1) 117,5±18,3 пг/мл (р<0,001) и здоровых 175,3±60,3 пг/мл (р<0,01). Однако индуцированная М.Ьстэ (ВСв) продукция ФНО-а мононуклеарными клетками крови у пациентов 2-й группы была неоднозначной, так у 9 из 16 (56,3%) пациентов этой группы отмечался низкий уровень продукции ФНО-а (от 0 до 130 пг/мл), но у 7 человек ответная реакция на ВСв оставалась высокой (от 380 до 1500 пг/мл), несмотря на отрицательную динамику патологического процесса. Среднее значение стимулированной продукции ФНО-а (Д ВСО) составило 400,0±123,7 пг/мл в гр.2 против 129,3±94,4 пг/мл в гр.1 (р>0,05) и 327,1±66,7 пг/мл у здоровых (р>0,05). Результаты проведенных исследований представлены на рис.1 Изменение уровня провоспалительных цитокинов (ИФН-у и ФНО-а) происходило на фоне значительного увеличения в периферической крови числа СБ 95 клеток (относящихся к суперсемейству ФНО-а) 48,9±3,3% у пациентов гр.2 против 33,2±2,7% больных 1-й группы (р!.2<0,01) и здоровых 25,1±2,1% (ры<0,001). Дальнейшее наблюдение за характером течения патологического процесса указанных пациентов показало крайне неблагоприятный исход у11 из 16 (68,8%) пациентов 2-й группы с самым низким уровнем спонтанной и индуцированной продукции ИФН-у и высоким уровнем нестимулированной продукции ФНО-а, что проявлялось в постоянном прогрессировании тубер-

кулёза и трансформации его в фиброзно-кавернозный туберкулез - у 9 (56,3%) человек и у 2-х (12,5%) пациентов наступил летальный исход, несмотря на проведение интенсивной этиопатогенетической терапии с учетом лекарственной чувствительности микобактерий.

1500 -л 1400 -1200 -1000 воо 600 400 200 о

ИФН-

ФНО-а

214,3181,9 41,2 ±5,6

129,3 ±94,4

1117, «±18,3 ,1.1

Благоприятно протекающий

туберкупбз (п=16)

1583,01383 ИФН-у

35,8121,8 23,012,1

продукция

НО-в|

Ц д всс -I счим/кч»

124

: * - различия I достоверны

Тяжелый прогрессирующий туберкупбз (пс 16)

Рис. I Продукция ИФН-у и ФНО-а иононуклеарными клетками крови больных туберкулёзом лёгких в зависимости от тяжести течения

туберкулёзного процесса

Дополнительными исследованиями установлено, что индуцированная продукция ИФН-у (Д ВСО) достоверно отличалась у пациентов без бактерио-выделения (п=13) 213,6±89,3 пг/мл по сравнению с бациллярными больными (п=18) 38,3±17,6 пг/мл (р<0,05).

Таким образом, изучение спонтанной и стимулированной продукции цитокинов периферическими мононуклеарными клетками крови является более информативным, чем исследование сыворотки крови, т.к. позволяют оценить тяжесть течения и прогноз туберкулезного процесса. Однако эти иссле-

дования являются достаточно трудоемкими, требующими предварительного выделения иммунокомпетентных клеток на градиенте плотности фиколл-урографин. Кроме того, в литературе имеются публикации (И.Н. Швыдченко и др., 2005) указывающие на возможность дополнительной активации иммунокомпетентных клеток в процессе их выделения, что затрудняет интерпретацию полученных данных.

В связи с этим наши дальнейшие исследования были направлены на изучение диагностической информативности использования in vitro для определения продукции цитокинов вместо периферических мононуклеарных клеток неразделенной цельной гепаринизированной крови. Определялась спонтанная и индуцированная антигенами (H37Rv и ESAT-6) продукция ИФН-у в супернатантах 48 часовых культур цельной крови, в рабочей концентрации 15 мкг/мл и 10 мкг/мл соответственно. Исследования проводились у 36 женщин, выделенных из общего числа обследованных. В качестве контроля использовалась группа (п=15) туберкулинположительных здоровых лиц, женского пола. Установлена более высокая спонтанная продукция ИФН-у в цельной крови у больных активным туберкулезом 80,1±10,2 пг/мл по сравнению со здоровыми 43,1±9,8пг/мл (р<0,05). Аналогичная тенденция в сторону увеличения у больных туберкулезом наблюдалась и для индуцированной антигенами продукции ИФН-у. Среднее значение стимулированной продукции (A H37Rv) составило 98,2±42,7 пг/мл против 15,0±5,8 пг/мл у здоровых, A ESAT-6 80,4±36,4 пг/мл против 15,1±5,3 пг/мл соответственно, однако из-за большого разброса показателей достоверных различий не получено (р>0.05). Детальное изучение продукции ИФН-у в цельной крови во взаимосвязи с клиническими проявлениями туберкулеза показало, что у пациентов группы 2 (п=22) уровень нестимулированной продукции ИФН-у был достоверно выше 93,2±15,1 пг/мл, чем у пациентов 1-й группы (п=14) 52,7±7,5 пг/мл (р<0,05). Также установлено значительное угнетение индуцированной антигенами продукции ИФН-у у тяжелых больных. Среднее значение Д H37Rv у пациентов 2-й группы составило 10,2±3,8 пг/мл против 225,4±Ю2,0

иг/мл в группе 1 (р<0,05), Д ЕБАТ-б 24,8±9,3 пг/мл против 65,0±15,2 пг/мл (р<0,05) соответственно. Полученные данные, указывающие на угнетение индуцированной антигенами продукции ИФН-у у больных тяжелым, прогрессирующим туберкулезом согласуются с результатами наших предыдущих исследований, где определение продукции ИФН-у проводилось в супер-натантах культур периферических мононуклеарных клеток. Вероятно, снижение индуцированной продукции ИФН-у связано с повреждением иммуно-компетентных клеток или нахождением их в состоянии рефрактерности и невозможности отвечать на повторное антигенное стимулирование, или их функциональным истощением у тяжелых больных. Последнее предположение подтверждается активацией при туберкулезе процессов, связанных с апоптозом иммуноцитов, что проявляется увеличением уровня продукции проапоптогенного цитокина ФНО-а и ростом числа лимфоцитов с готовностью к Баз-зависимому апоптозу, также наиболее выраженное у тяжелых больных. При исследовании спонтанной продукции ИФН-у в супернатантах цельной крови получены противоположные результаты по сравнению с изучением продукции в культурах мононуклеарных клеток, указывающие на повышении этой продукции у больных туберкулезом. Результаты аналогичны исследованиям уровня ИФН-у в сыворотке крови.

На наш взгляд подобный парадокс можно объяснить тем, что ИФН-у попадает в системную циркуляцию путем его диффузии из очагов туберкулезных повреждений [Р.Б. Вагпеэ, В. \Vizel, 2000], где происходит локальное накопление цитокинов и тем, что, возможно, он продуцируется не только лимфоцитами, но и другими форменными элементами крови. В свете современных экспериментальных данных нейтрофильные гранулоциты рассматриваются не только как эффекторные клетки, но и как регуляторные, обладающие цитокинсекреторной функцией [И.Н. Швыдченко и соавт., 2005].

Изучение индуцированной антигенами продукции ИФН-у в супернатантах цельной крови в зависимости от массивности бактериовыделения позволило выявить значительное угнетение стимулированной антигеном Н37Яу

продукции ИФН-у у больных с обильным бактериовыделением 5,0±3,8 пг/мл по сравнению с пациентами со скудным бактериовыделением 48,3±13,7 пг/мл (р<0,05) и больными, в мокроте которых микобактерии туберкулеза не определялись никакими методами 211,1±104,0 (р<0,05). Результаты аналогичны данным, полученным при исследовании продукции ИФН-у периферическими мононуклеарными клетками при стимуляции M.bovis (BCG). Это позволяет предположить, что выраженная антигенная нагрузка, обусловленная массивной бактериальной популяцией в живом организме, возможно, приводит к дефициту иммунокомпетентных клеток в результате их гибели или истощающей дифференцировки, что и проявляется снижением их функциональной активности и невозможностью отвечать на антигены. Получены дополнительные данные, свидетельствующие о повышении спонтанной продукции ИФН-у в цельной крови у пациентов с распространенными, полисегментарными и двусторонними процессами в легких 112,8±16,0 пг/мл против 49,1±7,3 пг/мл (р<0,01) у больных с ограниченными в пределах 1-2х сегментов туберкулезными изменениями в легочной ткани. Индуцированная антигеном H37Rv продукция ИФН-у была достоверно угнетена при наличии у больных туберкулезом деструктивных изменений в легких 26,1 ±7,7 пг/мл против 200,4±105,0 пг/мл (р<0,05) у пациентов с активным туберкулезом без фазы распада, а также при наличии бронхогенного обсеменения 34,5±9,8 пг/мл против 218,8±112,0 пг/мл у пациентов без фазы обсеменения (р<0,05).

Таким образом, у больных активным туберкулезом наблюдается высокий уровень ИФН-у в сыворотке крови, повышенный уровень спонтанной продукции в супернатантах цельной периферической крови и угнетение индуцированной антигенами его продукции как в культурах периферических мононуклеарных клеток, так и в культурах цельной крови. Эти изменения наиболее выражены у больных с тяжелыми, распространенными и осложненными туберкулезными процессами. Как же можно трактовать эти находки? Мы разделяем мнение ученых P.F. Barnes, В. Wizel (2000), которые считают, что высокий сывороточный и плазменный уровень ИФН-у являются ре-

зультатом просачивания цитокинов в системную циркуляцию из очагов туберкулезного воспаления, где происходит их локальное накопление. Высокий уровень провоспалительных цитокинов в очагах повреждений наряду с защитным действием может стать причиной неконтролируемого воспаления и жизнеугрожающих ситуаций. Следовательно, возникающая в местах тканевых повреждений секвестрация клеток, продуцирующих ИФН-у может стать причиной угнетения индуцированной продукции ИФН-у иммунокомпетент-ными клетками. Такое двойное действие ИФН-у требует осторожности в применении иммунокорригирующих препаратов, направленных на регуляцию его продукции.

Нами предпринята попытка изучить влияние препарата анаферон на продукцию ИФН-у иммунокомпетентными клетками больных туберкулезом. Анаферон - лекарственный препарат, содержащий аффинно очищенные антитела к ИФН-у человека в сверхмалых дозах. Экспериментальными работами (О.И. Эпштейн и соавт., 2000; М.А. Мягкова 2001) было показано, что использование потенциированных (сверхразбавленных растворов) антител к эндогенному антигену приводит не к подавлению его активности, а напротив к модификации его свойств.

У 21-й пациентки впервые выявленным инфильтративным туберкулезом легких проводилось определение спонтанной продукции ИФН-у в супер-натантах 48 часовых культур цельной крови до и после инкубации с раствором анаферона 3 мкг/мл in vitro. У 5 пациенток с исходно высокими показателями ИФН-у (от 80 до 180 пг/мл) наблюдалось его снижение (предел колебаний от 40 до 120 пг/мл), у 7 больных с низкой концентрацией ИФН-у (от 0 до 50 пг/мл) установлено его повышение (50-90 пг/мл), у 9 пациенток -уровень ИФН-у остался без изменений. Среднее значение спонтанной продукции ИФН-у составило 71,9±11,2 пг/мл до и 68,8*8,6 пг/мл после инкубации с анафероном (р>0,05), но между исходными значениями ИФН-у и его уровнем после инкубации с анафероном получена высокой степени корреля-

ционная связь г=0,72 (р<0,01). Результаты проведенных исследований представлены на рисунке 2,

140

! , 124,0+16,9

120

100

80

60

40

20

*- различия достоверны

о

Исходно высокий Исходно низкии " Средний уровень уровень ИФН-у уровень ИФН-у ИФН-у

Рис. 2 Уровень ИФН-у в супернатантах культур цельной крови больных активным туберкулезом до и после инкубации с анафероном

В результате проведенных исследований установлено иммуномодулиру тощее действие анаферола на выработку эндогенного ИФН-у, что открывает перспективы клинических исследований использования его в качестве средства целенаправленной иммунокоррекции у больных туберкулёзом.

Дополнительно у 28 женщин впервые выявленным, преимущественно инфильтративным туберкулезом легких определялась спонтанная и индуцированная антигеном Н37Ку продукция ИЛ-8 в супернатантах 24-х часовых культур цельной гепаринизированной крови. Спонтанная продукция ИЛ-8 обнаружена у 19 из 28 (67,9%) больных активным туберкулезом и у 9 т 10 (90%) здоровых. Уровень ИЛ-8 в супернатантах культур периферической крови колебался у больных туберкулезом от 0 до 13 000 ггг/мл и от 0 до 8000 пг/мл у здоровых, среднее значение которого составило

1900,0±544 пг/мл и 2920,0±939 пг/мл соответственно, но из-за большого размаха дисперсий статистически достоверных различий не получено, (р>0,05). Уровень индуцированной антигеном Н37Лу продукции ИЛ-8 был несколько меньше у больных активным туберкулезом 1779,8±567 пг/мл против 2244,6±842 пг/мл у здоровых, но также статистически значимых различий не получено. Не удалось установить достоверных различий спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-8 в надосадочной жидкости культур цельной крови и в зависимости от тяжести течения туберкулезного процесса. Спонтанная продукция ИЛ-8 у пациентов 1-й группы составила 1665,8±659 пг/мл против 2134,2±886 пг/мл в группе 2 (р>0,05), индуцированная А Н3711у - 581,7±309 пг/мл и 2892,3±981 пг/мл соответственно (р>0.05). Однако следует отметить, что у 5 пациентов группы 2 с крайне тяжелым течением туберкулезного процесса, приведшим в дальнейшем к летальному исходу, наблюдалось значительное угнетение индуцированной продукции ИЛ-8, что, вероятно, следует рассматривать как проявление анергии в терминальном периоде туберкулезной инфекции. Изучение спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-8 у пациентов при наличии и отсутствии очагов сопутствующей хронической инфекции показало достоверное увеличение нестимулированной продукции ИЛ-8 у 13 пациенток, имеющих кроме активного туберкулеза легких хронические неспецифические воспалительные заболевания. Уровень спонтанной продукции ИЛ-8 в супернатантах культур цельной крови составил у них 2878,3±829 пг/мл против 385,5±192 пг/мл соответственно (р<0,01). Достоверных различий по уровню индуцированной продукции ИЛ-8 в указанных группах не выявлено. Таким образом, создается впечатление, что продукция ИЛ-8 в большей степени отражает присоединение и активность неспецифической инфекции в организме, чем тяжесть и особенности течения туберкулезного процесса.

Обобщенные результаты исследования иммунологических параметров у всех больных активным туберкулезом в зависимости от особенностей течения туберкулезного процесса представлены в таблице 3.

Таблица 3

Иммунологические параметры у больных прогрессирующими формами

туберкулеза в сравнении с благоприятно протекающим _ туберкулезом __

Параметры Число наблюдений Группа 1 Группа 2 Р

CD 25 (%) 40 42,1±2,2 51,4±3,5 <0,05

HLA-DR (%) 40 40,2±3,4 52,3±3,3 <0,05

CD 95 (%) 40 35,7±2,3 44,2±3,5 <0,05

Уровень цитокинов в

сыворотке крови

ИФН-у (пг/мл) 32 134,3±56,1 168,7±53,1 >0,05

ФНО-а (пг/мл) 18 171,8±34,8 189,0±47,1 >0,05

Продукция цитокинов

периферическими мо-

нонуклеарными клет-

ками крови

Спонтанная продукция 31 41,2±6,6 23,0±2,1 <0,05

ИФН-у (пг/мл)

Продукция ИФН- у, ин-

дуцированная 31 214,9±81,9 35,8±21,8 <0,01

М. bovis (BCG) (пг/мл)

Спонтанная продукция 31 117,5±18,3 1583,0±383 <0,001

ФНО-а

Продукция ФНО-а, ин-

дуцированная M.bovis 31 129,3±94,4 400,0±123,7 >0,05

(BCG) (пг/мл)

Продукция цитокинов в

цельной крови

Спонтанная продукция

ИФН-у (пг/мл) 36 52,7±7,5 93,2±15,1 <0,05

Индуцированная антиге-

ном H37Rv (пг/мл) 36 225,4±102,0 10,2±3,8 <0,05

Индуцированная антиге-

ном ESAT-6 36 65,0±15,2 24,8±9,3 <0,05

Спонтанная продукция

ИЛ-8 в цельной крови 28 1665,8±659 2134,2±886 >0,05

(пг/мл)

Индуцированная антиге-

ном H37Rv (пг/мл) 28 581,7±309 2892,3±981 >0,05

Во 2-й части диссертационного исследования проводился анализ диагностической эффективности серологических и молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза и его дифференциальной диагностики с другой легочной патологией.

Сравнительное изучение информативности иммуноферментного анализа, направленного на выявление антител к возбудителю туберкулеза, с использованием разных антигенов (Н37Яу и ЕБАТ-б) проводилось у 88 больных с трудностями установления диагноза туберкулеза. В результате комплексного клинико-рентгенологического обследования из них диагноз активного туберкулеза установлен у 45 человек, онкологические заболевания легких - у 43 пациентов. Установлено, что при использовании ИФА с применением антигена Н37Иу число положительных результатов в группе больных активным туберкулезом составило 29 из 45 (64,5%) и у 16 пациентов с ограниченными туберкулезными процессами в легких получен ложноотрица-тельный результат. В группе больных с неопластическими процессами в легких число истинно отрицательных результатов получено у 37 из 43 чел. (86,1%). Ложноположительные результаты получены в 6 случаях (у 1-й пациентки с лимфогранулематозом, в 2-х случаях доброкачественных опухолей легких и в 3-х случаях рака легкого). При использовании антигена ЕБАТ-6 специфические антитела были обнаружены у 24 из 45 (53,3%) больных туберкулезом. У 21 пациента получен ложноотрицательный результат, также, преимущественно, при ограниченных процессах в легких (мелкие туберку-лёмы, инфильтративный туберкулез в пределах 1 - 2-х сегментов, экссуда-тивный плеврит, состояние после оперативного лечения). Среди онкологических пациентов истинно отрицательный результат получен в 37 из 43 (86,1%) случаев. У 6 пациентов с диагнозом лимфогранулематоз, гамартохондрома и периферический рак легкого зарегистрированы ложноположительные результаты. Таким образом, диагностическая чувствительность (ДЧ) ИФА тест-системы с применением антигена Н37Яу составила 64,5%, специфичность

(ДС) - 86,1%, диагностическая эффективность (ДЭ) - 75,3%, прогностическая ценность положительного результата (ПЦПР) - 82,9%, прогностическая ценность отрицательного результата (ПЦОР) - 69,8%, в тоже время диагностическая чувствительность ИФа тест-системы с использованием антигена Е8АТ-6 составила 53,3%, специфичность - 86,1%, диагностическая эффективность - 69,7%, прогностическая ценность положительного результата -80%, прогностическая ценность отрицательного результата 63,7% Результаты исследований представлены на рис.3

90 80 70 60 50 4030 20

ю-;

i

oJ

53,3

86,1 B6,1

f / j(

Ж щ 64,5 Ш .Г -■ : 'b» •'

Л1

i «7 чувствительность Xvjw - '

щ ttV? VÍÍ: . bjí FÚ l'll i i 1

' ££ .

ü Я i Mi iíf

-Г" ?У í • •

1¿J Sis? Ш

S4,4 81,4

ESAT-6

специфичность

H37R»

H37Rv+ESAT-6

'-роЗЛЛЧ/й

достиесня

Рис. 3 Сравнительная характеристика ИФА определения антител к М.tuberculosis с использованием антигенов H37Rv и ESAT-6 в группе диагностических больных (п=88)

При обследовании здоровых лиц ложноположительный результат анализа получен в 2-х случаях при использовании антигена H37Rv и в 1-м случае применения ESA7-6, т.е. специфичность тест-систем у здоровых составила 90,9% и 95,4% соответственно.

Таким образом, как следует из рис.3, при равной специфичности ИФА с применением 2-х разных антигенов, чувствительность тест-системы с анти-

геном Н37Яу выше на 11,2%. Применение очищенного антигена ЕБАТ-6 не позволило улучшить диагностические возможности ИФА. Однако одновременное использование 2-х разных антигенов Н37Яу и ЕБАТ-6 позволило достоверно увеличить число положительных результатов среди больных активным туберкулезом до 38 из 45 (84,4%). Нам представляется, что улучшение качества серодиагностики при создании тест-систем может быть достигнуто не путем очистки антигенов, а в результате их комбинированного использования.

Аналогичные исследования сравнительной эффективности применения иммуноферментного анализа с антигеном Н37Яу и иммунохроматографиче-ского экспресс-теста с антигеном А 60 в дифференциальной диагностике туберкулеза и рака легких проведены у 68 диагностических пациентов. Из них диагноз активного туберкулеза подтвержден у 26 человек, онкологические заболевания легких - у 27, другая легочная патология - у 15 человек.

Применение иммунохроматографического экспресс-теста (ИХА) позволило обнаружить антимикобактериальные антитела у 16 (61,5%) больных активным туберкулезом. Ложноотрицательный результат получен у 10 (38,5%) пациентов (в 2-х случаях диссеминированного туберкулеза легких, в 1-м случае экссудативного плеврита туберкулезной этиологии и в 7-ми случаях ограниченных форм туберкулеза легких без распада). Среди 27 пациентов с онкологическими заболеваниями в легких истинно отрицательные результаты были зарегистрированы у 26 (96,3%) человек и у 1-го пациента с диагнозом периферический рак легкого получен ложноположительный результат теста. ДЧ ИХА составила 61,5%, ДС при обследовании онкологических пациентов - 96,3%, ДЭ - 78,9%, ПЦПР - 94,2%, ПЦОР - 76,2%. Среди 15 больных с нетуберкулезными заболеваниями легких ложноположительный результат получен в 2-х (13,3%) случаях (у одного больного с врожденным поликистозом легкого и у одного пациента с абсцедирующей пневмонией). Диагностическая специфичность ИХА у пациентов с другой легочной патологией составила 86,7%, у здоровых - 94,4%.

Таким образом, среди всех больных диагностической группы ДС метода равна 92,9%, а ДЭ - 77,2% .При использовании ИФЛ специфические антитела были обнаружены у 17 из 26 (65.4%) больных активным туберкулезом легких. Ложноотринательный результат получен у 9 человек, Ложноположи-тельные результаты были зарегистрирован Й в 3-х (11,1%) случаях среди пациентов с неопластическими процессами в легких, у 2-х (13,3%) пациентов с другой легочной патологией и у 1 из 18 (5,6%) здоровых. ДЧ ИФЛ составила 65,4%, ДС при обследовании онкологических пациентов - 88,8%, при другой легочной патологии - 86,7% и 94,4% у здоровых. ДЭ метода при обследовании онкологических пациентов составила 77,1%, П( IIТР - 85%, ПЦОР -72,7%, при обследовании всей группы диагностических больных ДЧ - 65/|%, ДС - 86,1% , ДЭ -76,7%. П1Ц1Р - 77%, ПЦОР - 80,4%.

И ФА (Н37Ру) ИХА (А-60) ИФА+ИХА <Н37Ру+А-60)

Рис.4 Сравнительная характеристика методов ИФЛ и ИХА с использованием антигенов Н37К\ и А 60 в группе диагностических больных

(п=68)

Таким образом, при приблизительно равной диагностической чувствительности (61,5% ИХА и 65,4% ИФА), иммунохроматографический экспресс-тест обладает большей специфичностью (96,3%), чем метод ИФА (88,8%) при обследовании пациентов с онкологическими заболеваниями легких. Это особенно важно, так как позволяет уменьшить число лиц с ложно-положительными результатами, полученными в ИФА и, следовательно, позволяет сократить труппу лиц, нуждающихся в применении инвазивных методов дообследования.

У 61 пациента изучалась диагностическая информативность определения уровня ИФН-у в сыворотке крови в подтверждении специфической этиологии заболевания и возможности использования этого показателя как дополнительного критерия в дифференциальной диагностике туберкулеза и рака легкого. Установлен более высокий уровень ИФН-у в сыворотке крови 185,9±49,7 пг/мл у больных активным туберкулезом легких (п=22), чем у пациентов с неопластическими заболеваниями легких (п=32) 27,8±6,6 пг/мл (р<0,001) и здоровых (п=12) 13,7±6,3 пг/мл (р<0,05). Выявлен пороговый уровень ИФН-у 130 пг/мл и более.

Сравнительный уровень ИФН-у в сыворотке крови больных активным туберкулезом, онкологическими заболеваниями легких и

ИФН-у 900 _ (пг/мл)

здоровых

800

©

700

О

600

о

500

400

300

©

200

130

100

20

Больные туберкулезом (п=22)

Пациенты с онкологическими заболеваниями (п=32)

Здоровые Прочие (п=12) (п=7)

Рис.5

Частота встречаемости этого уровня у больных туберкулезом составила 8 из 22 (36,4%) пациентов. В тоже время в группе больных с онкологическими заболеваниями легких уровень ИФН-у 130 пг/мл выявлен только в 1-м случае (3,1%), у пациента с гамартохондромой легкого, и ни у одного из здоровых лиц. Однако обращает на себя внимание большой размах индивидуальных значений ИФН-у в обеих группах, от 0 до 740 пг/мл у больных туберкулезом и от 0 до130 пг/мл у пациентов с онкологическими заболеваниями легких и от 0 до 60 пг/мл у здоровых. В группе онкологических больных отмечалось достоверно большее число лиц с неопределяемым уровнем ИФН-у 17 из 32 (53,1%), чем при активном туберкулезе 5 из 22 (22,7%), р=0,0267. Детальный анализ уровня ИФН-у в сыворотке крови в зависимости от клинической формы и рентгенологического теневого синдрома позволил выявить достоверные различия. Так, у пациентов с округлыми тенеобразованиями в легких при наличии фокусов типа туберкулем отмечался более высокий уровень ИФН-у 130,0±56,1 пг/мл против 24,7±8,4 пг/мл у больных периферическим раком легкого (р<0,05) и у пациентов с инфильтративным туберкулезом легких 214,0±75,9 пг/мл против 12,9±8,4 пг/мл при центральном раке легкого (р<0,05). Кроме того, у больных с распространенными, распадающимися и осложненными формами рака легких (Т2.41Ч1 .гМ) Определялся достоверно более низкий уровень ИФН-у 15,4±7,9 пг/мл, чем у своевременно выявленных пациентов с онкопатологией (Т^оМо) 43,3±8,5 пг/мл (р<0,05). Число больных с неопределяемым уровнем ИФН-у также было достоверно меньше при неосложненных формах рака 4 из 15 (26,7%) против 10 из 14 (71,4%), р=0,0232.

Таким образом, количественное определение уровня ИФН-у в сыворотке крови может быть использовано как дополнительный критерий в дифференциальной диагностике туберкулеза и рака легких. Высокий уровень ИФН-у более 130 пг/мл указывает на туберкулезную этиологию процесса, однако низкие значения и отсутствие его в сыворотке крови не исключают специфическую природу заболевания.

У 108 диагностических больных изучалась информативность использования прямых методов диагностики туберкулеза, направленных на выявление фрагментов молекулы ДНК М. tuberculosis с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Real Time), в сравнительном аспекте с традиционными микробиологическими методами и иммуноферментным анализом определения антител к возбудителю туберкулеза. Из них диагноз активного туберкулеза подтвержден у 62 пациентов.

Установлено достоверно большее число положительных результатов обследования у больных активным туберкулезом, полученных методами ПЦР (Real Time) по сравнению с результатами микробиологических исследований (р<0,001). Методом ПЦР при однократном исследовании мокроты ДНК возбудителя туберкулеза обнаружена у 48 из 62 (77,4%) пациентов, методом непрямой бактериоскопии с окраской мазка по Ziehl-Neelsen при многократном исследовании мокроты микобактерии туберкулеза не были выявлены ни у одного больного, методом люминесцентной микроскопии МВТ обнаружены у 5 из 62 (8,1%) пациентов. Методом посева на твердые питательные среды возбудитель туберкулеза обнаружен в 7 (11,3%) случаях, скудный рост. Результаты исследований представлены на рис.6

11,3%

8,1%

77,4%

01 ■ 2

ИЗ

ПЦР люминесцентная

микроскопия культуральный

Рис.6 Доля традиционных микробиологических методов и ПЦР в выявлении возбудителя туберкулеза в трудных случаях диагностики (п=62)

Установлена высокая чувствительность ПЦР (Real Time), как в диагностике диссеминированного (100%) и инфильтративного туберкулеза (73,1%), так и в диагностике туберкулём (78,6%). Возможность обнаружения фрагментов молекулы ДНК М. tuberculosis при туберкулёмах методом ПЦР является наиболее важным, так как традиционно туберкулёмы относят к олиго- и абациллярным формам туберкулеза, при которых МБТ выявляются преимущественно при наличии распада и в основном культуральными методами исследования.

В группе пациентов активным туберкулезом, у которых микобактерии туберкулеза не выявлялись ни одним из традиционных методов микробиологической диагностики, методом ПЦР получено 39 положительных результатов из 52 обследованных, таким образом чувствительность ПЦР (Real Time) у абациллярных пациентов составила 75%.

Выявлена тенденция к повышению чувствительности ПЦР (Real Time) при распространенных, полисегментарных патологических процессах 84,4% против 74,4% при ограниченных (в пределах 1-2-х сегментов) туберкулёзных изменениях в легких, но различия недостоверны (р>0,05). Не установлено достоверных различий в чувствительности ПЦР (Real Time) в зависимости от наличия или отсутствия деструкций в легочной ткани у больных туберкулезом (75%) и (80,9%) соответственно.

Анализ кинетики реакции показал, что пороговый цикл, после которого отмечается подъем флюоресценции от изолинии, у больных туберкулёмами в 78,9% случаев составил 28-30 и практически не отличается от пациентов с инфильтративным туберкулёзом, у которых в 84,2% случаев он составил 2630.

Также установлена высокая эффективность выявления M.tuberculosis методом ПЦР (Real Time) в дифференциальной диагностике туберкулёза и неспецифических заболеваниях легких. Среди 53 пациентов с округлыми образованиями в легких у 22 был получен положительный результат анализа и в дальнейшем у 28 из 53 установлен диагноз туберкулёма легких. Ложнопо-

ложительных результатов исследования не было зарегистрировано ни в одном случае. Чувствительность ПЦР в указанной группе составила 78,6%, специфичность - 100%. В группе дифференциально-диагностических больных, с теневым синдромом в виде участка затемнения (п=47) было обнаружено 23 положительных результата, из 47 у 29 пациентов подтверждена туберкулезная этиология патологического процесса. Ложноположительный результат анализа получен в 2-х случаях: у одного пациента с центральным раком легкого и в одном случае лимфогранулематоза. Чувствительность ПЦР (Real Time) в указанной группе составила 72,4%, специфичность - 95,3%. При обследовании пациентов с диссеминациями неясной этиологии (п=8) активный туберкулез подтвержден у 5-ти человек, ДНК М. tuberculosis обнаружена у всех пяти пациентов. Специфичность анализа среди всех больных с нетуберкулёзными заболеваниями легких составила 95,7%.

Сравнительный анализ эффективности ПЦР (Real Time) и метода им-муноферментного анализа, проведенный у 96 диагностических больных, показал, что ПЦР отличается большей чувствительностью и специфичностью получаемых результатов (рис.7).

% 90 80 70 60 50 40 • 30 -20 -10 '-различия достоверны 76,9 тт* ПРяд1 ¡ЙЙЙЯ * Ш 55 8 пцр нРяд2 ¿g|¡¡¡§ ИЗА ШИ 17'9 l|l| 3,6 ц 6,3 63 тгШ ЬШШ

и Активный Онкологические Другие заболевания туберкулез легких (п=52) заболевания легких (п=28) легких (п=16)

Рис.7. Сравнительная частота выявления положительных результатов ПЦР и ИФА в группе диагностических больных (п=96)

Так, методом ПЦР (Real Time) было обнаружено 40 положительных результатов из 52 (76,9%) больных активным туберкулезом, в то время, как методом ИФА антитела к M.tuberculosis были выявлены только у 29 из 52 (55,8%) пациентов (р<0,05). Из них при туберкулёмах (п=25) методом ПЦР обнаружено - 20 (80%) положительных результатов, методом ИФА - 13 (52%), р<0,05 Это особенно важно, так как при наличии округлых образований в легочной ткани наблюдаются наибольшие трудности в диагностике, а верификация диагноза туберкулеза без применения инвазивных методов обследования практически невозможна.

Не было получено достоверных различий при обследовании пациентов с инфильтративным туберкулезом (п=21), чувствительность ПЦР составила -16 из 21 (76,2%), ИФА - 13 из 21 (61,9%), р>0,05. Ложноположительные результаты ПЦР (Real Time) получены у 1-го из 28 пациентов с онкологическими заболеваниями легких (3,6%) и в 5 случаях (17,9%) методом ИФА (в 3-х случаях - у пациентов с центральным раком легкого и в 2-х случаях - периферического рака легкого). Среди пациентов с неспецифическими заболеваниями легких получен 1 (6,3%) ложноположительный результат методом ПЦР у пациентки с лимфогранулематозом и в 1-м случае (6,3%) методом ИФА у больного с эхинококковой кистой. Совпадение результатов исследования при использовании обоих методов наблюдалось у 31 из 52 (59,6%) больных активным туберкулезом, у 21 из 28 (75%) больных с онкологическими заболеваниями легких и у 15 из 16 (93,8%) больных с неспецифическими заболеваниями легких и всего у 67 из 96 (69,8%) всех диагностических больных. Обращает на себя внимание, высокий процент ложноположитель-ных результатов (17,9%), полученных методом ИФА, у больных с онкологическими заболеваниями легких.

Сравнительная операционная характеристика всех серологических методов и ПЦР (Real Time) представлена в таблице 4.

Таблица 4

Сравнительная операционная характеристика непрямых

(серологических) и прямых (молекулярно-генетических) методов обследования всех больных диагностической группы

Методы исследова- Число ДЧ(%) ДС ДЭ ПЦПР ПЦОР

ния наблюдений (%) (%) (%) (%)

1.

ИФА (H37Rv) 88 64,5 86,1 75,3 82,9 69,8

ИФА (ESAT-6) 88

Одновременное использование 2-х методов ИФА с 88

антигенами (H37Rv) и (ESAT-6) 2.

ИФА (H37Rv) 68

ИХА (А-60) 68 Одновременное использование 2-х методов ИФА 68

(H37Rv) и ИХА (А-60) 3.

ИФА (H37Rv) 96

ГТЦР (Real Time) 96

53.3 86,1 69,7 80,0 63,7 84,5 81,4 82,9 82,6 83,3

65.4 88,1 76,7 77,3 80,4

61.5 92,9 77,2 84,2 79,6

69,2 83,3 76,3 72,0 81,4

55.8 86,4 71,1 82,6 62,3

76.9 95,5 86,2 95,2 77,7

Как следует из таблицы 4, метод ПЦР обладает большей чувствительностью (76,9%) и специфичностью (95,5%), чем метод ИФА (55,8%) и (86,4) % соответственно. Использование новой молекулярно-генетической технологии ПЦР в режиме реального времени позволяет улучшить качество диагностики туберкулеза за счет увеличения прогностической ценности положительного результата до 95,2% против 82,6% в ИФА (р<0,05) и прогностиче-

ской ценности отрицательного результата до 77,7% против 62,3% соответственно (р<0,05).

Таким образом, анализ применения ПЦР в режиме реального времени в клинической практике показал его высокую эффективность как при обследовании и олиго- и абациллярных пациентов (использование этого метода позволило в 7 раз повысить выявление МБТ по сравнению с культуральными методами ив 10 раз по сравнению с люминесцентной микроскопией мазка мокроты), так и при обследовании дифференциально-диагностических больных за счет высокой чувствительности (76,9%) и специфичности анализа (95,5%).

Выводы

1. Течение туберкулезного процесса отличается вариабельностью иммунологических параметров и требует индивидуализации проводимой терапии с учетом особенностей противоинфекционной защиты.

2. Тяжелое, прогрессирующее течение туберкулеза характеризуется достоверным увеличением в периферической крови клеток, несущих на своей поверхности активационные маркеры (CD 25, HLA-DR) и Fas (CD 95), спонтанной гиперпродукцией ФНО-а и угнетением индуцированной продукции ИФН-у в ответ на специфические антигены BCG, H37Rv, ESAT-6.

3. Высокое содержание клеток, экспрессирующих Fas в крови больных активным туберкулезом имеет неблагоприятное прогностическое значение.

4. Особенность продукции ИФН-у и ФНО-а в сыворотке крови заключается в больших индивидуальных колебаниях изучаемых показателей и в отсутствии зависимости этой продукции от характера и тяжести течения туберкулезного процесса.

Более информативным является исследование спонтанной и индуцированной BCG продукции ФНО-а и ИФН-у в культуре периферических моно-нуклеарных клеток, а также определение спонтанной и индуцированной антигенами H37Rv и ESAT-6 продукции ИФН-у в супернатантах 48 часовых

культур цельной периферической крови, так как позволяют оценить тяжесть течения туберкулезного процесса.

5. Улучшение качества серологической диагностики туберкулеза и онкологических заболеваний легких может быть достигнуто в результате комбинированного использования в иммуноферментном анализе 2-х антигенов (H37Rv и ESAT-6) за счет повышения чувствительности метода до 84,4% против 53,3% и 64,5% соответственно при их изолированном применении.

6. Для подтверждения туберкулезной этиологии процесса в трудных случаях дифференциальной диагностики туберкулеза и онкологических заболеваний легких имеет значение обнаружение высокого (более 130 пг/мл) уровня ИФН-у в сыворотке крови.

Низкое содержание ИФН-у и его отсутствие в сыворотке крови не исключают специфическую природу заболевания и могут наблюдаться как у больных туберкулезом, так и онкопатологией.

7. Использование ПЦР (Real Time) позволяет достоверно повысить эффективность диагностики олиго- и абациллярного туберкулеза (в 7 раз по сравнению с методом посева и в 10 раз по сравнению с методом люминесцентной микроскопии) и улучшить качество дифференциальной диагностики туберкулеза и других легочных заболеваний.

Метод ПЦР при обследовании диагностических больных с округлыми образованиями в легких обладает высокой чувствительностью 78,6-80% и специфичностью анализа 100%, что позволяет существенно улучшить дифференциальную диагностику туберкулем и округлых периферических опухолей легких.

Практические рекомендации 1. Для оценки тяжести течения туберкулезного процесса рекомендуется определение в периферической крови больных туберкулезом количества клеток, экспрессирующих на своей поверхности активационные маркеры (CD 25, HLA-DR) и Fas (CD 95), спонтанной продукции ФНО-

а и индуцированной специфическими антигенами продукции ИФН-у периферическими мононуклеарными клетками крови.

2. При назначении патогенетической терапии больным туберкулезом следует учитывать, что при тяжелом, прогрессирующем и осложненном течении туберкулезного процесса исходно наблюдается наиболее выраженное повышение уровня активационных маркеров (CD25, HLA-DR) и Fas (CD 95), гиперпродукция ФНО-а.

На наш взгляд, на ранних этапах лечения у таких пациентов является нецелесообразным назначение иммунотропных препаратов, направленных на повышение активационных механизмов макрофагаль-ного фагоцитоза и Т-клеточного иммунитета.

3. Для оценки функциональной способности иммунокомпетентных клеток у больных туберкулезом рекомендуется проводить определение индуцированной антигеном H37Rv продукции ИФН-у в супернатантах культур цельной периферической крови. Наибольшее угнетение этой продукции наблюдается у пациентов с неблагоприятным течением туберкулезного процесса.

Определение уровня спонтанной продукции ИФН-у до и после инкубации с лекарственным препаратом может быть использовано для индивидуального подбора иммунотропной терапии in vitro.

4. К практическому использованию в качестве средства патогенетической терапии может быть рекомендован лекарственный препарат анаферон, представляющий собой аффинно очищенные антитела к гамма-интерферону в сверхмалых дозах, так как в исследованиях in vitro он обладает регулирующим влиянием на эндогенную продукцию ИФН-у.

5. При проведении дифференциальной диагностики туберкулеза и другой легочной патологии существенным дополнением могут служить методы: ПЦР в реальном времени, ИФА и иммунохроматографический экспресс-тест определения антител к возбудителю туберкулеза.

Наиболее эффективным является использование ПЦР в реальном времени при проведении дифференциальной диагностики округлых образований в легких туберкулезной и онкологической природы.

6. Для улучшения качества диагностики олиго- и абациллярного туберкулеза, наиболее чувствительным и специфичным методом является ПЦР в реальном времени.

Для повышения эффективности серологической диагностики туберкулеза рекомендуется одновременное использование иммунофер-ментных тест-систем с разными антигенами, особенно перспективным является комбинация антигенов H37Rv и ESAT-6.

7. В комплексном обследовании больных с трудностями дифференциальной диагностики туберкулеза и рака легких диагностическое значение имеет обнаружение высокого уровня ИФН-у в сыворотке крови (более 130 пг/мл), указывающее на туберкулезную этиологию процесса. Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Худзик Л.Б., Салина Т.Ю. Иммунная система у больных активным туберкулезом легких и методы ее коррекции // Новое, прогрессивное - в практику здравоохранения- Тез. докл. XXVI науч -практ. конф. врачей Ульяновской обл. - Ульяновск, 1991. - С. 63-64.

2. Ингибиторы протеаз и иммуномодуляторы в клинике туберкулеза. Учебно-метод. рекомендации для студентов IV-VI курсов лечебного и педиатрического факультетов

/СМИ; Сост.: Л.Б. Худзик, Т.И. Морозова, Т.Ю.Салина - Саратов, 1991. - 17с.

3. Владимирский М.А., Салина Т.Ю., Старостенко Е В. Продукция фактора некроза опухолей-a периферическими мононуклеарными клетками крови больных туберкулезом легких // Национальный конгресс по болезням органов дыхания, 3-й: Тез. докл. - Санкт-Петербург, 1992. - Пульмонология №4 (приложение) - №938.

4 Salina T., Vladimirsky M., Starostenko Е. Production of Tumour Necrosis Factor by the Mononuclear Blood Cells of the ТВ Patients and the Drug Management // International Journal of Immunoreabilitation - Sochi, 1994. - №1, supp.l. - P.304.

5. Салина Т.Ю, Владимирский M.А., Старостенко Е В. Зависимость продукции фактора некроза опухолей-a мононуклеарными клетками от характера туберкулезного процесса // Съезд фтизиатров, 2-й: Сб. резюме. - Саратов, 1994. - С. 290.

6. Salina T., Vladimirsky M., Starostenko Е. Production of Tumour Necrosis Factor by the Mononuclear Blood Cells and its Relation to the Disease Process in ТВ Patients // 7 Th International Congress for Infectious Diseases - Hong Kong, 1996. - №10493.

7. Khudsik L В., Salina T Y., Morozova T.I. et al. Many years experience in using thymus peptides in phthisiology //Materials of International Symposium «Gerontological aspects of peptide regulation of organism functions» - Sanct-Peterburg, 1996. - S 178-179

8. Диагностика, лечение и профилактика туберкулеза в войсках: Учебно-методическое пособие /СГМУ; Сост.: JI Б. Худзик, М.Н.Лебедева, ВА.Толканица, Т.И. Морозова, Е.Я. Потапова, Е.Н.Александрова, Е.А.Киршак, Н.Е. Казимирова, Т.Ю.Салина, Л.С.Козленко, Л.Е.Паролина, A.A. Чиванов - Саратов, 1996. - 136 с.

9. Салина Т.Ю., Худзик Л.Б,, Потапова Е.Я. и др. Опыт применения иммунофермент-ного анализа у детей и подростков // Съезд научно-медицинской ассоциации фтизиатров, 3-й. Пробл. туб Приложение: Сб. резюме - Екатеринбург, 1997. - С. 65.

10. Худзик. Л Б., Салина Т.Ю., Морозова Т.И. и др. Многолетний опыт применения пептидов тимуса во фтизиатрии // Новости науки и техники. Реферативный сборник. Серия Медицина. Выпуск Туберкулез №6. - 1997. - С.5

11. Салина Т.Ю., Худзик Л.Б., Арсеньев B.C., Бигильдина H.A. Иммуноферментный анализ в дифференциальной диагностике туберкулеза и неспецифических заболеваний легких // Нац. конгресс по болезням органов дыхания, 7-й: сб. резюме. - Москва, 1997,-С.116.

12. Арсеньев B.C., Салина Т.Ю. Опыт применения иммуноферментного анализа в практическом здравоохранении // Проблемы ускоренной бактериологической диагностики туберкулеза: Материалы науч -практ. конф. - Обнинск, 1997. - С.28.

13. Орлова Н.В., Салина Т.Ю. Клинико-иммунологические параллели в диагностике тяжести течения туберкулезной инфекции // Научная конференция молодых ученых и студентов Саратовского государственного медицинского университета, 58-я: Тез. докл. - Саратов, 1997.-С. 177-178.

14. Худзик Л.Б., Паролина Л.Е., Казимирова Н.Е., Салина Т.Ю. Современные возможности комплексной патогенетической терапии во фтизиопульмонологии // Клиническая фармакология-практическому здравоохранению: Тез. докл. Межвузовской науч -практ. конференции, посвященной 10-летию кафедры клинической фармакологии СГМУ.- Саратов, 1998. - С.74.

15. Современные подходы к лечению в клинике фтизиопульмонологии: Учебно-методические рекомендации /СГМУ; Сост.Л.Б. Худзик, Н.М.Сырьпцева, Т.И.Морозова, Н.Е. Казимирова, Е.А. Киршак, Л.Э. Панкратова, Л.Е. Паролина, Т.Ю Салина,

В Н.Шилов, E.H. Савина, В Б Брук. - Саратов, 1998. - 59 с.

16. Патогенетическая терапия туберкулеза легких на современном этапе: Информационное письмо / СГМУ; Сост. Л.Б. Худзик, Н.М. Сырыгцева, E.H. Савина, Л.Е. Паролина, Т.Ю.Салина, Л.Э.Панкратова - Саратов, 1998 - 12 с.

17. Салина Т.Ю., Штеен H.A., Пошатская Т.А. Состояние реактивности у женщин с прогрессирующими формами туберкулеза // Нац. конгресс по болезням органов дыхания, 8-й: сб. резюме. - Москва, 1998. - С. 400.

18 Худзик Л.Б., Салина Т.Ю., Паролина Л.Е Иммунотерапия туберкулеза органов дыхания // Пробл. туб. - 1998. - №6. - С. 23-26.

19. Лечение остропрогрессирующих форм туберкулеза: Информационное письмо /СГМУ; Сост.: Л.Б. Худзик, Л.Э.Панкратова, Т.Ю. Салина, JI.E. Паролина. - Саратов, 1998. - 17с.

20. Переселенцева Е.С., Салина Т.Ю., Федотов Э.А. Новые технологии в диагностике туберкулеза // Информационный бюллетень Саратовского отделения Ассоциации Медицинской Лабораторной Диагностики - 1998, №4. - С.2.

21. Овечкина Е.А., Овечкин В Б., Салина Т.Ю. Вторичные иммунодефицитные состояния у больных туберкулезом и методы иммунореабилитации // Материалы Юбилейной науч конф, молодых ученых и студентов Саратовского государственного медицинского университета - Саратов, 1999. - 4.2 - С.126-127.

22. Салина Т.Ю., Худзик Л Б., Казимирова Н.Е., Паролина Л.Е. Оценка состояния Т-системы иммунитета при туберкулезе // Нац. конгресс по болезням органов дыхания, 9-й: сб. резюме. - Москва, 1999 - С.346

23. Sahna Т.Y., Khoudsik L.B , Kasimirova N.E. et al. Study of activating markers exspres-sion on lymphosytes in tuberculosis patients //International Journal on Immunorehabilitation -1999, September.

24.Салина Т.Ю. Вторичный иммунодефицит как причина прогрессирования туберкулеза у женщин детородного возраста и методы дифференцированной иммунокоррекции // Съезд научно-медицинской ассоциации фтизиатров, 4-й Congress of research medical association of phthisiologists: тез. докл. - Москва-Иошкар-ола, 1999 - С. 109

25. Салина Т.Ю., Морозова Т.И., Федотов Э.А. и др. Сравнительное изучение эффективности разных методов диагностики туберкулеза // Пробл. туб. - 2000. - С.43-44.

26 .Салина Т.Ю. Иммунопатогенетические механизмы туберкулезной инфекции //Нац. конгресс по болезням органов дыхания, 10-й: сб резюме. - Санкт-Петербург, 2000 - №466 -С. 128.

27. Салина Т.Ю , Худзик Л.Б. Иммунопатогенетические механизмы в течении туберкулезной инфекции // Пробл. туб. - 2001. - №8. - С.32-34.

28. Салина Т Ю , Морозова Т.И., Завалева И.И. Информативность иммунологических методов в дифференциальной диагностике туберкулеза и других легочных заболеваний

// Актуальные вопросы фтизиатрии: Материалы науч.- практ. конф., посвященной 80-летию противотуберкулезной службы Кубани - Краснодар, 2001. - С.70-73.

29. Салина Т.Ю. Сравнительная эффективность серологических методов в дифференциальной диагностике туберкулеза //Нац. конгресс по болезням органов дыхания, 11-й: сб. резюме - М„ 2001. - № XLVII - С.265.

30. Клиника и лечение туберкулеза у взрослых: Учебное пособие / Сост. Л.Б. Худзик, Т.И Морозова, Е.Я. Потапова, E.H. Александрова, И.Л. Волчкова, Л.Э.Панкратова, Т.Ю. Салина, В.А. Толканица, И Н Иноходова - Саратов, Ипполит 2002. - 74 с.

31. Морозова Т.И , Салина Т Ю , Завалева И И. Иммуноферментный и иммунохрома-тографический анализы в дифференциальной диагностике туберкулеза и онкологических заболеваний органов дыхания // Пробл. туб. и болезней легких - 2003, №4. - С. 20-21.

32. Туберкулез легких у детей: клиника и лечение: Учебное пособие / Сост. Л.Б. Худ-зик, Т.И. Морозова, Е Я. Потапова, Е.Н. Александрова, И.Л. Волчкова, Л.Э. Панкратова, Т Ю. Салина, В.А.Толканица, И.Н Иноходова - Саратов, Ипполит, 2002. - 51 с.

33. Салина Т.Ю., Штеен Н.А., Моиссейченко Е.А. Изучение активационных механизмов Т-клеточного иммунитета в зависимости от характера бактериальной микрофлоры больных туберкулезом //Нац. конгресс по болезням органов дыхания, 12-й: Тез. докл. - М., 2002.-С. 308.

34. Салина Т.Ю., Морозова Т.И. Некоторые клинико-иммунологические аспекты туберкулеза легких у женщин //Пробл. туб. и болезней легких - 2003, № 9. - С.21-23.

35. Салина Т.Ю. Прогностическое значение показателей клеточного иммунитета у больных туберкулезом легких // Туберкулез сегодня: Материалы 7-го Российского съезда фтизиатров - М., 2003 - С. 77.

36. Худзик JI Б., Салина Т.Ю., Паролина Л.Е и др Опыт применения биорегуляторов и иммунокорректоров у больных туберкулезом //Туберкулез сегодня: Материалы 7-го Российского съезда фтизиатров - М., 2003. - С.305.

37. Салина Т.Ю Продукция цитокинов (ФНО-а и ИФН-у) мононуклеарными клетками крови больных туберкулезом // Актуальные вопросы мониторинга эпидситуации и деятельности противотуберкулезной службы: Материалы науч.-пракх. конф. Уральского НИИ фтизиопульмонологии - Екатеринбург, 2004. - С.237-239.

38. Салина Т.Ю. Морозова Т.И. Продукция интерферона-у мононуклеарными клетками крови больных при разных типах течения туберкулезного процесса. // Пробл туб. и болезней легких - 2004 - № 10 - С. 19-21.

39 Салина Т.Ю , Морозова Т И. Интерферон-у и Ig G антитела к М. tuberculosis в сыворотке крови больных активным туберкулезом легких // Пробл. туб. и болезней легких -2004 -№11.-С. 43-45.

40. Salina T.Yu., Morozova T.I. Production of an interferon-y by mononuclear blood cells by pulmonary tuberculosis //3-rd Congress of European Region International Union against Tuberculosis and Lung Diseases (IUATLD); Russian Respiratory Society 14-th National Congress on Lung Diseases - 2004, Moscow - P 75 - №276.

41. Salina T.Yu., Morosova T.I. Serum level of a gamma-interferon and Ig G of antibodies to M. tuberculosis patients with a fissile pulmonary tuberculosis //3-rd Congress of European Region International Union against Tuberculosis and Lung Diseases (IUATLD); Russian Respiratory Society 14-th National Congress on Lung Diseases - 2004, Moscow - P.75 . - №277.

42. Салина Т.Ю. Иммунитет и аллергия. // Туберкулез у детей и подростков: Учебное пособие./ Под ред. Л.Б. Худзик, Е.Я. Потаповой, Е.Н. Александровой - М.: ОАО Издательство Медицина, 2004 - Гл 1. - С 26-32.

43 Волчкова И.Л., Салина Т.Ю. Лабораторная диагностика. Современные иммунологические и иммунобиотехнологические методы исследования при туберкулезе. // Туберкулез у детей и подростков. Учебное пособие. / Под ред Л.Б Худзик, Е.Я.Потаповой, Е.Н Александровой - М.: ОАО Издательство Медицина, 2004. - Гл. 2,- С. 74-83.

44. Салина Т.Ю., Владимирский М.А., Морозова Т.И. Содержание интерферона-у в периферической крови больных прогрессирующим туберкулезом легких // Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза / Науч тр. Всерос науч.-практ. конф.

Под ред. Ю.Н Левашева - СПб., 2005. - С. 266-268.

45. Салина Т.Ю , Владимирский М.А., Морозова Т.И. Влияние анаферона на продукцию интерферона-у в цельной крови больных активным туберкулезом легких // Нац. конгресс по болезням органов дыхания, 15-й: Сб. тез. - Москва. - 2005. - Ns 691 - С. 191.

46 Салина Т.Ю., Владимирский М.А., Морозова Т.И. Роль интерферона-у и фактора некроза опухолей-a в иммунопатологии туберкулеза // Саратовский научно-медицинский журнал - 2005. - №4. - С.74-81.

47. Салина Т.Ю., Морозова Т.И., Владимирский М.А., Шишкина Н.В. Использование полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа в дифференциальной диагностике туберкулеза и других легочных заболеваний // Актуальные вопросы эпидемиологии, диагностики и лечения туберкулеза: Сб. науч. тр. - Саратов, 2005. - С.145-149

48. Патогенетическая терапия туберкулеза легких: Учебное пособие /СГМУ; Сост.: Т.И. Морозова, Л.Е. Паролина, Е.Н. Александрова, Т.Ю. Салина, Н.П. Докторова - Саратов, 2005 -66 с.

49. Серологическая диагностика туберкулеза методом иммуноферментного анализа: Информационное письмо/МЗ и СП Саратовской области; Сост.: Т.И. Морозова, Т.Ю. Салина - Саратов, 2006 - 2с.

50. Салина Т.Ю., Владимирский M А., Морозова Т.И. Индуцированная антигенами (H37R.V и ESAT-6) продукция интерферона гамма в цельной крови больных туберкулезом легких // Bulletin of the International Scientific Surgical Association - 2006. - vol.l - №2. - C. 56-57.

51. Салина Т.Ю., Владимирский M.A., Морозова Т.И. Спон--танная и индуцированная антигеном (H37Rv) продукция ИФН-у в цельной крови больных туберкулёзом в зависимости от клинических проявлений туберкулезной инфекции // Нижегородский медицинский журнал - 2006 - №6. - С. 25-29

52. Салина Т.Ю., Морозова Т.И., Штеен Н.А. Роль интерлейкина-8 в иммунопатологии туберкулеза //Проблемы эпидемиологии, диагностики, клиники и лечения туберкулеза: Сб науч. тр., посвященный 45-летию кафедры туберкулеза Саратовского государственного медицинского университета - Саратов, 2006. - С. 184-187.

Заказ №78. Объем 2 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Туберкулез известен е глубокой древности. Несмотря на повсеместно проводимую работу по борьбе с этнм чдболсванием, эпидемическая обета* новка в мире н в России остается весьма напряженной |М.И Перельман 2001; М В Шнлова.2005)

Туберкулез имеет глобальное распространение. В докладах ВОЗ подчеркивается. что в настоящее время около трети населения земного шара инфицированы МусоЬас<спит »иЬегсикчОй По-прежнему ежегодно около 8 миллионов человек заболевают туберкулезом и 1,5-2 миллиона умиряют от этого заболевании [У/НО, 1999; А.Г. Чучапни. 20041. Особенно остро и последние годы стоит проблема тяжелого, прогрессирующего течения туберкулезного процесса, характеризующегося быстрой генерализацией процесса и формированием тотального каэсоэного некроза [Б.С. Кибрик, О Г Челнокова, 2002; Л И. Юкелнс н др., 2002, В Ю Мишин н др., 2005).

Клиническое излечение больных активными формами туберкулеза является главным -звеном в сокращении резервуара туберкулезной инфекции н снижении распространения эпидемии туберкулеза. Однако уже становится очевидным, что ориентация только на антибактериальную терапию является ошибочной [А-Г Хоменко, 1997] Внедрение стандартных режимов, рекомендованных ВОЗ, и новых технологий химиотерапии отечественных разработок не обеспечили значительного повышения эффективности лечения [Н А Жук, 2003]

По-видимому, основного упора на подавление микробного фактора в развитии туберкулезного процесса явно недостаточно, гак как элиминация любого инфекционного возбудителя является результатом еннергнчного взаимодействия между защитными силами макроорганизма и антимикробными агентами, что и определяет течение болезни н его исход [Я.М $П1е1сг е1 а!. 2002, К. Сгеуе! е1 а!., 20021 А^гтнбактсрнапьные препараты становятся мало эффективными улиц с пониженным иммунитетом, особенно в условиях высокой лекарственной устойчивости микроорганизмов [Б В, Пинсгин, 2000]. Особенно трудной задачей остается лечение больных с тяжелыми и остро прогрессирующими формами туберкулеза, у большинства иа которых отмечается резко выраженный интоксикационный синдром, высокая частота первичной и вторичной лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза. присоединение вторичной инфекции, сопутствующая нммунодепрессня ¡В.Ю- Мишн» и др. 2005]. Если у этик пациентов н удается добиться умень-шення выраженности клинических проявлений заболевания, то обратное развитие морфологических изменений в лепенх происходит очень медленно [А Г Хоменко, 1997)

Дальнейшее совершенствование патогенетических методов лечения таких больных ' реальная возможность повышения эффективности терапии н снижения смертности от туберкулеза Однако для разработки методов патогенетической терапии и успешного применения нммунотропных препаратов необходимо детальное научение механизмов, определяющих неблагоприятное течение туберкулезного npouecca и тех звеньев иммуногенеза, коррекция которых может потребоваться в процессе антибактериального лечения Неадекватное и необоснованное применение нммунотропных препаратов может оказать вместо положительного отрицательный эффект (Р.М Хаитов, 1999]

Взаимодействие макроорган ним а и возбудителя при туберкулезе является классическим примером внутриклеточной инфекции [R Grevel et al, 2002, R M. Stneter et а]., 2002] Развитие иммунологической гипсрчувствительности к бактериальным продуктам, возможно, ответственно за тканевые повреждения Такие повреждения, как образование полостей в легких, казс-озный некроз и общий токсикоз, возникающий при туберкулезе у человека, могут быть результатом разрегулирования в системе шгтокшюв

Перспективным на сегодняшний день является изучение закономерностей активации имму некомпетентных клеток и эффекгорнмх механизмов уничтожения внутриклеточных возбудителей. поиск новых медиаторов, обеспечивающих иммунный ответ, сравнительное изучение роли неточных и гуморальных факторов в иртнвоннфекцноннон защите организма, опреде-ляюших характер течения и исход туберкулезного процесса, что позволит выявить новые подходы к предотвращению и терапии этой болезни

Другой, не менее важной, проблемой до настоящего времени остается верификация диагноза туберкулеза у больных без выделения микобакгерий, установление правильного диагноза туберкулеза в сложных дифференциально-диагностических случаях

Актуальность проблемы обусловлена неуклонным ростом онкологической заболеваемости, выявлением высокого процента лиц, имеющих запущенные, а нередко н нскурабсльныс формы процесса [И.Е Бахлаев и др ,1998; И.К. Казак н др., 1998; М И. Перельмаи ,2005] Разнообразие клинических н рентгенологических проявлений туберкулеза, однотипность ряда симптомов заболеваний легких, патоморфоз туберкулеза в последние годы, олигобаинллярноегть, появление атипичных случаев заболеваний легких обусловливают установление неверного первоначального лиш~ноза туберкулеза и рака легких [А С Барчук и Др-. 1997, А Г. Хо«енко,1997|

Частота ошибочной диагностики туберкулеза по-прежнему составляет 34-10% [Л-Г Хомеико, 1998] При тгом имеет место как гипо так и гипердиагностика Ведется поиск различных специальных методов исследования, одними из которых являются иммунологические и молскулярно-генетичсские методы, направленные на улучшение диагностики туберкулеза и его дифференциальной диагностики с другими легочными заболеваниями

Цель исследования

Повышение эффективности диагностики и поиск новых критериев оценки течения туберкулезиото процесса на основе применения иммунологических н молекулярно-генетических методов исследовании

Задачи работы

1. Изучить информативность определения экспрессии актнвацноннмх маркеров на лимфоцитах больных туберкулезом в качестве иммунологического критерия, определяющего неблагоприятное течение туберкулеза.

2. Установить особенности продукции интерферон а-у и фактора некроза опухоли-а в разных биологических материалах {сыворотка крови, су-пернатаиты краткосрочных культур мононуклеарных клеток, культуры цельной периферической крови) в зависимости от характера течения туберкулезного процесса и нх корреляционные связи с клиническими и некоторыми иммунологическими параметрами туберкулеза

3. Оценить диагностическую эффективность серологических методов выявления антнмнкобакгеризльных антител, определения уровни ИФН -у в сыворотке крови в дифференциальной диагностике туберкулеза легких.

4 Определить диагностические возможности ПЦР в реальном времени в диагностике абзшшлярного и однгобзциллярного туберкулеза и его дифференциальной диагностике с другими легочными заболеваниями.

Научная пойн та

I. Выявлены ранее неизвестные иммунологические критерии неблагоприятного течения туберкулезного процесса, характеризующиеся достоверным увеличением в периферической крови клеток, экспрессирующих на своей поверхности активацнонные маркеры СО 25. Н1А-ОЯ и Газ (СЕ>95), спонтанной гиосрпродукцисй ФНО-а и истощением функциональных резервов нммунокомпетенгных клеток в внле угнетения индуцированной продукции ИФН-у в ответ на специфические антигены ВСХ». Ш7Ку и Е5АТ-6.

2- Установлены особенности продукции ФНО-а и ИФН-у в разных биологических субстратах (сыворотка крови, супернатанты краткосрочных культур периферических моноиуклезрных клеток и цельном кроен) и их нмн-мосвязн с клиническими проявлениями туберкулеза.

3. Показано нормализующее влияние лекарственного препарата анаферон, представляющего собой сверхрззбавлснныс раствор« антител к эндогенному гамма-интерферону, на уровень его спонтанной продукции у больных туберкулезом в супсрнатэнтах культур цельной кровн m vitro,

4. Впервые установлены новые диагностические критерии, позволяющие повысить эффективность дифференциальной диагностики туберкулеза и других заболеваний легких, заключающиеся в повышении чувствительности серологических методов выявления антимнкобактери&пьных антител при комбинированном использовании 2-х антигенов (H37Rv и ESAT-6), а также в определении высокого (свыше 130 пг/мл) уровня ИФН-у в сыворотке крови

5. Показана высокая (86,2%) диагностическая эффективность новой молеку-лярио-генетической технологии ПЦР в режиме реального времени в диагностике абаднлляркого и олнгобдииллярного туберкулеза и дифференциальной диагностике туберкулеза и других заболеваний легких.

Практическая ценность работы заключается: в возможности индивидуализации иммунореабилитацнонкых мероприятий у больных туберкулезом на основании разработанной нами иммунологической модели оценки течения туберкулезного процесса и подбора им-мунотропной терапии, путем комбинированного определения количественных (CD 25. HLA-DR» CD 95) и функциональных (индуцированной специфическими антигенами продукции ИФН-у) параметров противоинфекциониой зашиты и постановки пробы с лекаре«ценными препаратами ш vitro; в повышении эффективности диагностики туберкул та, основан кой на комбинированном использовании в серологических методах 2-х антигенов (НЗЖу и Е$АТ~6), применении новой молекулярно-генетнческой технологии ГТЦР и режиме реального времени для оптимизации микробиологической диагностики {»бациллярного и олнг обацилллрного туберкулеза, в возможности улучшения дифференциальной диагностики туберкулеза и других заболеваний легких на основании использования комплекса серологических м ,чолек\ лярно-г енетическн.х методой исследования

Основные наложении, выносимые на шщнп:

1, Тяжелое, прогрессирующее течение туберкулезного процесса, обусловливающее неблагоприятный исход заболевания, характеризуется усилением активацнонных механизмов клеточио-медиагорного иммунитета, приводящих к запуску ашнпогекных механизмов м возникновению Т - клеточной лныфопеинн

2, Функцнонал ьные проявления деятельности иммунокомнетсктных клеток, оцениваемые по уровню спонтанной и индуцированной антигенами мико-бактернй и рекомбннантным антигеном Е5АТ-6 продушин фактора некроза опухоли-о и интерферона-? в периферической крови, отражают характер течения туберкулезного процесса.

3, Лолимсразная цепная реакция в режиме реального времени и серологические методы (ИФА и ИХ А), направленные на выявление антител к возбудителю туберкулеза могут служить существенным дополнением а диагностике н дифференциальной диагностике туберкулеза и других заболеваний легких, особенно онкологической природы.

Апробаций работы

Материалы диссертации доложены на; 7-ом Интернациональном конгрессе по инфекционным заболеваниям (Нопй Коп& 1996). научно-практической конференции «Проблемы ускоренной бактериологической диагностики туберкулеза» (Обнинск, 1996), Интернациональном симпозиуме «Геронтологи чеекме аспекты пептидной регуляции функций организма» (Санкт-Петербург. 1996), 7-ом Национальном конгрессе по болезкям органов дыхания (Москва, 1997); на 3 (ХГ1) съезде фтизиатров (Екатеринбург,1997), 8-ом, 9-ом Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва, 1998, 1999,); Международном конгрессе «Современные истоды диагностик» и лечения аллергии, астмы н иммунодефнцитов» (Тбилиси, 1999), 4-ом съезде научно-медицинской ассоциации фтизиатров (Йошкар-Ола, 1999); 10-ом, 11-ом, 12-ом Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва, 2000, 2001, 2002); 13-ом Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2003), 7-ом Российском съезде врачей фтизиатров (Москва, 2003), 3 конгрессе Европейского интернациональною союза борьбы с туберкулезом н другими легочными заболеваниями (Москва, 2004), 14-ом и 15-ом Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва, 2004, 2005). 3-й Интсриационзлъной хирургической телеконференции «Новые технологии в медицине» (Санкт-Петербург. 2006).

Диссертация прошла официальную апробацию на совместном заседании кафедр фткзиатрнн ФПК и ППС, фтизиопульмонологии, клинической лабораторной диагностики, анатомии человека Саратовского государственного медицинского университета 5 октября 2006г. и заседании Ученого Совета НИИ фпгзнопульмонологни ММ А им. И М Сеченова 13 декабря 200бг

Внглренне

Методики определения С025, НЬА-ОЛ, С095, С016 клеток у больных туберкулезом, определения продукции ИФН-у, ФНО-а, Ш1-8 в супернатантах краткосрочных культур периферических мононуклеарных клеток и цельной крови, полимеразиая цепная реакция в режиме реального времени и серологические методы (ИФА. ИХ А) диагностики туберкулеза внедрены я Саратовском областном противотуберкулезном диспансере, в Саратовском государственном медицинском университете

Результаты диссертационного исследования используются а лекционном курсе на циклах повыигсния квалификации врачей-фшзиатров на кафедре фтизиатрии ФПК и ГТГ1С, при «пении лекций и проведении практических занятий со студентами V и VI курсов лечебного н педиатрических факультетов кафедры фтнзнопульмонологин СГМУ, включены в учебно-методическне рекомендации «Современные подходы к лечению в клинике фтхзиопульмонологии», раздел медикаментозная нммунокоррекцня (Саратов, 1998). учебно-методические пособи* «Диагностика, лечение и профи -лактика туберкулеза а войсках» (Саратов, 1996), «Патогенетическая терапия туберкулеза легких», раздел нммунокорригнрующая терапия при туберкулезе легких (Саратов, 2005). В учебном пособии «Туберкулез у детей к подростков» (Москва. 2004) материалы диссертации включены в раздел «Иммунитет н аллергия при туберкулезе», «Лабораторная диагностика Современные иммунологические и иммунобиотсхначог ичеекис методы исследования при туберкулезе»

Получено 4 удостоверения на рационализаторские предложения, принятые Саратовским государственным медицинским университетом «Способ прогнозирования течения туберкулеза легких» удостоверение М1 2440, 2000г; «(Способ лечения больных туберкулезом легких» удостоверение № 2439, 2000 г, «Способ опенки тяжести течения туберкулезного процесса» удостоверсине № 2582, 2004 г. «Способ определения активности туберкулеза легких» 2610, 2004 г.

Подана заявка на изобретение № 2005106829 «Способ определения скрытой активности туберкулезного процесса» Заявка опублн кована в журнале «Бюллетень изобретений полетыс модели н промышленные образцы» -9/08-2006 г

Опубликовано информационное письмо «Серологическая диагностика туберкулеза методом иммуноферментного анализа», утвержденное МЗ и социальной поддержки Саратовской области №16/565-2006 г

Публикации

По теме диссертации опубликовано 52 работы, из них 9 в центральных журналах, 5 в материалах Международных кошрессов

Объем и структура работы

Диссертация изложена на русском языке на 279 страницах машинописного текста (основной текст - 238 страниц) Состоит из введенияг 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя.

ВЫВОДЫ

1 Течение туберкулезного процесса отличается вариабельностью иммунологических параметров н требует индивидуализации проводимой терапии С учетом особенностей нротивоннфекционнон защиты

2 Тяжелое, прогрессирующее течение туберкулеза характеризуется достоверным увеличением в периферической крови клеток, несущих на своей поверхности активацнонные маркеры (CD 25. HLA-DR) и Fas(CD 95), спонтанной гиперпролукцней ФНО-а н угнетением индуцированной продукции ИФН-у в ответ на спеинфнческне антигены BCG, H37Rv. ESAT-6.

3 Высокое содержание клеток, экспрссснруюшнх Fas в крови больных активным туберкулезом имеет неблагоприятное прогностическое зиаченне

4 Особенность продукции ИФН-у н ФНО-а в сыворотке крови заключается в больших индивидуальных колебаниях изучаемых показателен и в отсутствии зависимости этой продукции от характера н тяжести течения туберкулезного процесса

Более информативным является исследование спонтанной н индуцированной BCG продукции ФНО-а и ИФН-у в культуре периферических моно-нуклеарных клеток, а также определение спонтанной и индуцированной ан-тИ!снами H37Rv н ESAT-6 продукции ИФН-у в супернапнеах 48 часовых культур цельной периферической крови, так как позволяют оценить тяжесть течения туберкулезного процесса

5. Улучшение качества серологической диагностики туберкулеза и онкологических заболеваний легких может быть достигнут в результате комбинированного использования в нммуиоферментном анализе 2-х антигенов (H37Rv н ESAT-6) за счет повышения чувствительности метола до 84,4% против 53,3% и 64,5% соответственно яри их изолированном применении

6. Для подтверждения туберкулезной этиологии процесса в трудных случаях дифференциальной диагностики туберкулеза и онкологических заболевании легких имеет значение обнаружение высокого (более 130 itr/мл) уровня ИФН-у в сыворотке крови

Низкое содержание ИФН-у и ею отсутствие в сыворотке крови не исключают специфическую природу заболевания и могут наблюдаться как у больных туберкулезом, так и онкопатоло) ней

7 Использование ПЦР (Real Time) позволяет достоверно повысить эффективность диагностики олиго- и а бациллярного туберкулеза (в 7 раз но сравнению с метолом посева и в 10 раз по сравнению с методом люминесцентной микроскопии) и улучшить качество дифференциальной диагностики туберкулеза н других легочных заболеваний

Метод ПЦР при обследовании диагностических больных с округлыми образованиями в легких обладает высокой чувствительностью 78,6-80% и специфичностью анализа 100% что позволяет существенно улучшить дифференциальную диагностику туберкулем и округлых периферических опухолей легких

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДЛIШИ

1 Для опенки тяжести течения туберкулезного процесса рекомендуется определение в периферической крови больных туберкулезом количества клеток, эксггрессирующих на своей поверхности акгнваиионные маркеры (CD 25, HLA-DR) и Fas (CD 95). спонтанной продукции ФНО-ч и индуцированной специфическими антигенами продукции ИФН-у периферическими моконуклеарнымн клетками крови.

2 При назначении патогенетической терапии больны и туберкулезом следует учитывать, что при тяжелом, прогрессирующем н осложненном течении туберкулезного процесса исходно наблюдается наиболее выраженное повышение уровня зктивационных маркеров (CD25, HLA-DR) н Fas (CD 95), гнлерпролукцня ФНО-а.

На наш взгляд, на ранних этапах лечения у таких пациентов является нецелесообразным назначение нммуиотропных препаратов, направленных на повышение активаиионных механизмов чакрофагаль-ного фагоцитоза и Т-клеточного иммунитета

3 Для оценки функциональной способности нммунокомпетеитных клеток у больных туберкулезом рекомендуется проводить определение индуцированной amm ином H37Rv продукции ИФН-у а супернататгтах культур цельной периферической крови Наибольшее угнетение этой продукции наблюдаося у пациентов с неблагоприятным течением туберкулезного процесса.

Определение уровня спонтанной продукции ИФН-у до н после инкубации с лекарственным препаратом может быть использовано для индивидуального подбора иммунотроппой терапии in vitro

4 К практическому использованию в качестве средства патогенетической терапии может быть рекомендован лекарственный препарат анаферон, представляющий собой аффинно очищенные антитела к гамма-интерферону в сверхмалых дозах, так как в исследованиях ш vitro он обладает регулирующим влиянием на эндогенную продукцию ИФН-у

5 При проведении дифференциальной диагностики туберкулеза н другой легочной патологии существенным дополнением могут служить методы ПЦР в реальном времени, ИФЛ и иммунохроматографическнй экспресс-тест определения антнтел к возбудителю туберкулеза

Наиболее эффективным является использование ПЦР в реальном времени при проведении дифференциальной диагностики округлых образований в легких туберкулезной и онкологической природы

6 Дня улучшения качества диагностики олнго- и абацнллярного туберкулеза, наиболее чувствительным и специфичным методом является ПЦР в реальном времени

Для повышения эффективности серологической диагностики туберкулеза рекомендуется одновременное использование нммунофер-ментиых тест-систем с разными антигенами, особенно перспективным является комбинация антигенов H37Rv и ESAT-6.

7 В комплексном обследовании бальных с трудностями дифференциальной диагностики туберкулеза и рака легких диагностическое значение имеет обнаружение высокого уровня ИФН-у в сыворО!ке крови (более 130 пг/мл), указывающее на туберкулезную этнологию процесса