Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Иммунологические и иммуногенетические факторы развития хронической обструктивной болезни легких в условиях естественного дефицита цинка

На правах рукописи

Ф?

УХТЕРОВА 00347 1824

НАДЕЖДА ДИМИТРИЕВНА

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РАЗВИТИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ В УСЛОВИЯХ ЕСТЕСТВЕННОГО ДЕФИЦИТА ЦИНКА

14.00.16 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 3 23139

Саранск- 2009

003471824

Работа выполнена на кафедре внутренних болезней стоматологического и педиатрического факультетов Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И.Н.Ульянова»

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Карзакова Луиза Михайловна

Официальные оппоненты: профессор кафедры госпитальной хирургии

ГОУВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарева», доктор медицинских наук, профессор Бякин Сергей Петрович

профессор кафедры факультетской терапии ФГОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н.Ульянова», доктор медицинских наук, доцент Остроносова Нина Севастьяновна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»

Защита диссертации состоится «¿5» июня 2009 г. в « »часов на заседании диссертационного совета Д 212.117.08 при ГОУВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарева» (430000, г. Саранск, ул. Большевистская, 68).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарева» (430000, г. Саранск, ул. Большевистская, 68).

Автореферат разослан « 151

» ^Му 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

Д.Г.Голубев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) представляет собой одну из важнейших медицинских и социально-экономических проблем в связи с широкой распространенностью, прогрессирующим течением, сокращением продолжительности жизни больных (Чучалин А.Г. и соавт., 2004). Исследования, проведенные под эгидой ВОЗ и Всемирного Банка, установили средние цифры распространенности ХОБЛ в мире среди мужчин и женщин во всех возрастных группах, составляющие у мужчин 9,3, у женщин 7,3 на 1000 населения (World Health Report, 2000). Ключевым звеном патогенеза этого заболевания является воспалительный процесс, поддерживаемый активностью накопившихся в респираторном тракте нейтрофилов, макрофагов и включающий аутоиммунный компонент за счет цитотоксического действия С08+-Т-лимфоцитов в отношении собственных клеток респираторной системы, модифицированных под влиянием внешних воздушных ирритантов (Yoshida Т., Tuder R.M., 2007). В связи с разночтениями в определении, диагностике и лечении ХОБЛ во всем мире эксперты ВОЗ разработали документ под названием GOLD (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung disease), включающий рекомендации (стандарты) к диагностике и лечению этого заболевания. Этиология ХОБЛ напрямую связана с факторами риска, вызывающими заболевание. Факторами риска ХОБЛ в соответствии с GOLD (2006) названы вдыхание вредоносных частиц - табачного дыма и производственной пыли, дефекты питания, низкий социально-экономический статус, острые респираторные инфекции и др. Действие указанных факторов реализуется преимущественно через иммунологические механизмы (Yoshida Т., Tuder R.M., 2007). Приведенные в литературе данные по изучению характера иммунологических изменений при ХОБЛ на системном уровне неоднозначны и противоречивы. Существует большая вариабельность и в клинических проявлениях ХОБЛ, что, возможно, определяется разнородностью иммунологических изменений на системном уровне и зависит от факторов риска, участвующих в развитии заболевания в конкретном случае. В этой связи заслуживает внимания высокая распространенность и неблагоприятное течение ХОБЛ (гнойный характер воспаления, склонность к формированию бронхоэктазов, частые обострения, резистентность к проводимой терапии) у жителей так называемого Прикубнино-цивильского субрегиона Чувашской Республики (4P), отличающегося низким содержанием цинка в объектах окружающей среды (уровень подвижного цинка в почве менее 0,1 мг/кг) и в водно-пищевом рационе населения - 9,1±0,9 мг/сут (Сусликов В.Л., 2001) при рекомендованной ВОЗ норме - 15 мг/сут. Ранее проведенные исследования показали, что около 70 % жителей этой территории испытывает субклинический дефицит цинка, вызывающий нарушения в клеточном звене иммунного ответа и повышенную восприимчивость к респираторным инфекциям (Карзакова Л.М., 2005). Проживание в условиях геохимически обусловленного дефицита цинка можно рассматривать как фактор риска развития инфекционно-воспалительных заболеваний органов дыхания (Геранюшкина Е.И., 2005; Карзакова Л.М., 2005; Еленкина Ж.В., 2006). Известно, что действие факторов риска реализуется в развитии ХОБЛ лишь при наличии определенной генетической предрасположенности (Дидковский H.A.,

Жарова М.А., 2005; Jóos L. et al., 2002). Влияние естественного дефицита цинка на иммунную систему также находится под генетическим контролем, в частности - аллелей системы HLA (от Human Leucocyte Antigens) (Карзакова JI.M., 2005).

В связи с вышеизложенным можно предположить, что проживание в условиях геохимически обусловленного дефицита цинка откладывает определенный отпечаток на иммунопатогенез и клиническое проявление ХОБЛ, что, возможно, контролируется HLA-системой. Многочисленные данные об обнаружении у больных ХОБЛ всякого рода изменений количественно-функциональных характеристик дендритных клеток (Sabroe I. et al., 2007; Robbins C.S. et al., 2008; Tsoumakidou M. et al., 2008), являющихся, как известно, «профессиональными» антигенпредставляющими клетками и регуляторами иммунологического гомеостаза в организме, подчеркивают необходимость исследований связи ХОБЛ с аллелями системы HLA, обеспечивающей процессинг и презентацию антигенных пептидов (Janeway С.А., 1997; Krensky A.M., 1997).

Цель настоящего исследования - изучить иммуногенетическую структуру и состояние иммунной системы у больных ХОБЛ, проживающих в регионе естественного дефицита цинка.

Задачи исследования:

1. Изучить показатели врожденного и приобретенного иммунитета у больных ХОБЛ цинкдефицитного субрегиона (Прикубнино-цивильский субрегион) и субрегиона с нормальным содержанием цинка (Присурский субрегион).

2. Исследовать содержание цинка и его конкурента за белково-связывающие сайты - меди в периферической крови у больных ХОБЛ указанных субрегионов.

3. Провести исследование особенностей распределения HLA-аллелей классов I и II, а также их связи с ХОБЛ и иммунологическими параметрами у больных, проживающих в условиях естественного дефицита цинка.

4. Оценить влияние сульфата цинка на функциональное состояние иммунокомпетентных клеток больных ХОБЛ in vitro.

5. Провести анализ изменений клинико-иммунологических параметров у больных ХОБЛ под влиянием комплексного лечения, включающего сульфат цинка.

Научная новизна. Впервые проведено изучение связи между показателями иммунной системы, содержанием цинка и его конкурента за белковосвязывающие сайты - меди в периферической крови у больных ХОБЛ, проживающих на территориях с различным уровнем обеспеченности цинком. Показана специфичность патогенетических механизмов возникновения ХОБЛ в условиях дефицита цинка, когда на первый план выступают снижение Т-клеточной функции иммунной системы, фагоцитарной активности нейтрофилов, ускорение активационно-индуцированного апоптоза лимфоцитов, дисбаланс гомеостаза цинка и меди.

Дана характеристика иммуногенетического профиля больных ХОБЛ, проживающих в регионе естественного дефицита цинка, при этом показано, что реализация влияния внешних факторов на иммунную систему находится под

контролем генов системы HLA. Идентифицированы маркеры

предрасположенности к ХОБЛ в условиях дефицита цинка- аллели DRB1*11(05) и DQB1*0301 и маркеры резистентности — аллели DRB1*01, DQA1*010I и DQB 1*0501. Выявлена связь HLA-маркеров предрасположенности к ХОБЛ — DRB1*11 и DQB 1*0301 - с рядом патогенетически важных параметров иммунного статуса (сниженное содержание циркулирующих в крови CD3+-, CD4+-, CD8+- субпопуляций лимфоцитов, снижение ФГА-индуцированной лимфопролиферативной активности).

Установлено иммуномодулиругощее действие цинксодержащего препарата (сульфат цинка) in vitro в ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов и при клиническом применении у больных ХОБЛ (увеличение числа Т-лимфоцитов, преимущественно за счет Т-хелперной субпопуляции, повышение иммунорегуляторного индекса и ФГА-стимулированной лимфопролиферации, снижение уровня IgA).

Практическая значимость. Установление у больных ХОБЛ связи нарушений иммунного ответа с недостатком цинка в периферической крови создали предпосылки для разработки методов направленной иммунокоррекции. Выявление иммуномодулирующего действия сульфата цинка на пролиферативную активность Т-лимфоцитов in vitro и положительной клинико-иммунологической динамики у больных ХОБЛ при включении в лечебный комплекс перорального введения этого препарата открывает перспективы для использования цинксодержащих соединений при лечении больных ХОБЛ с нарушением Т-клеточных функций и дефицитом цинка.

Выявленные HLA-маркеры предрасположенности и резистентности к возникновению заболевания у жителей цинкдефицитной территории могут быть использованы для прогнозирования развития ХОБЛ и ее ранней диагностики.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Специфическим звеном патогенеза ХОБЛ в условиях природного недостатка цинка является дисбаланс гомеостаза цинка и меди, отрицательно влияющий преимущественно на Т- клеточное звено иммунной системы.

2. Наличие у жителей цинкдефицитной территории в генотипе аллелей DRB1* 11(05) и DQB1*0301, ассоциированных с патогенетически значимыми изменениями показателей клеточного механизма адаптивного иммунитета, определяет повышенный риск развития ХОБЛ.

3. Цинксодержащий препарат - сульфат цинка оказывает иммуномодулирующее действие in vitro и при клиническом применении у больных ХОБЛ.

Внедрение результатов исследования в практику. В процессе выполнения работы разработаны и реализованы два рационализаторских предложения (№1157 от 05.03.2009, №1158 от 05.03.2009). Рекомендации, разработанные и предложенные автором, используются для оценки клеточного звена адаптивного иммунного ответа и оптимизации лечения больных ХОБЛ в пульмонологическом отделении МУЗ «Центральная городская больница» Управления здравоохранения и социальной политики администрации г. Чебоксары.

Основные положения диссертации используются в процессе обучения на курсах повышения квалификации терапевтов, врачей общей практики, в учебном

процессе на занятиях по клинической иммунологии, патологической

физиологии и внутренним болезням для студентов медицинского факультета Чувашского государственного университета.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на научно-практической конференции, посвященной 70-летию ГУЗ «Республиканский противотуберкулезный диспансер» Минздравсоцразвития ЧР «Актуальные вопросы фтизиатрии и пульмонологии» (Чебоксары, 2007); научной конференции к 60-летию ГУЗ «Республиканская клиническая больница» Минздравсоцразвития ЧР «Вопросы клинической медицины» (Чебоксары, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции» (Пенза, 2008); Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Екатеринбург, 2008); объединенном заседании кафедр внутренних болезней лечебного факультета, патологической физиологии, внутренних болезней стоматологического и педиатрического факультетов ФГОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н.Ульянова» (Чебоксары, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, 4 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Оформлено два рационализаторских предложения.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 106 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 15 таблицами, 7 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 227 источников (77 отечественных и 150 зарубежных) и приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для достижения поставленной цели было проведено популяционное иммуногенетическое исследование у 113 практически здоровых жителей и 31 больного ХОБЛ (в стадии ремиссии) цинкдефицитной территории чувашской национальности, а также клинико-иммунологическое обследование 60 больных ХОБЛ чувашской национальности в стадии обострения, госпитализированных в пульмонологическое отделение ГУЗ «Республиканская клиническая больница» Минздравсоцразвития ЧР. В соответствии с задачами исследования выделены три группы больных ХОБЛ в стадии обострения:

1А - больные ХОБЛ (п=20), проживающие в цинкдефицитном субрегионе (Прикубнино-цивильском субрегионе), получавшие стандартное лечение: антибиотик амоксициллин, муколитик амброксол, бронхолитик ипратропия бромид, физиотерапевтические процедуры - электрическое поле УВЧ на боковые отделы грудной клетки.

1Б - больные ХОБЛ (п=20) - жители Прикубнино-цивильского субрегиона, в отличие от больных группы 1А, в схему лечения которых дополнительно к базисной стандартной терапии включали цинксодержащий препарат - сульфат цинка в средней суточной дозировке 150-200 мг, разделенной на 3 приема.

ПА - больные ХОБЛ (п=20) - жители контрольного субрегиона, получавшие стандартное лечение, как и больные 1А группы.

Обследование проводили на 2-3-й день пребывания больного в клинике. У больных IA и 1Б групп проводили повторное определение этих показателей, к моменту купирования обострения, как правило, через 12-14 дней на фоне различных методов лечения. Лабораторные исследования проведены в лаборатории клинической иммунологии Республиканской клинической больницы и Централизованной лаборатории физико-химических и радиологических исследований ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Чувашской Республике -Чувашии». Объектом иммунологических исследований служила периферическая кровь. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из крови обследуемых лиц центрифугированием в градиенте плотности фиколл - верографина (р=1,077 г/см3) в течение 45 мин при 400 g.

Идентификацию лимфоцитов и их субпопулящш проводили иммунофенотипированием МНК методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител (МКАТ) CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, CD71, HLA-DR, CD95 («Сорбент», Москва) согласно методике производителя МКАТ.

Функциональную активность Т-лимфоцитов оценивали в митогениндуцированной пролиферации лимфоцитов на фитогемагглютинин (ФГА) «Difco» (США) 5 мкг/мл. Уровень пролиферации клеток определяли с помощью радиоактивной метки: за 24 ч до окончания культивирования в культуры МНК вносили 3Н тимидин (4 мкКи/мл). Количество включившегося в клетки изотопа измеряли на сцинтилляционном счетчике"Тп-СагЬ" ("Packard", США). Результат выражали в индексах стимуляции (ИС).

Изучение влияния сульфата цинка на пролиферативную активность Т-лимфоцитов. В качестве модели изучения влияния сульфата цинка на функцию Т-лимфоцитов in vitro использована реакция ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов. Реакцию оценивали по ИС и проводили в трех комбинациях:

1) культивирование МНК в отсутствии ФГА (контроль);

2) культивирование МНК в присутствии ФГА (опыт);

3) культивирование МНК в присутствии ФГА и сульфата цинка (50 мкМ в пересчете на элементарный цинк).

Вносимая в среду культивирования МНК концентрация Zn2+ подобрана с ориентацией на биотические дозы, превышающие физиологический уровень в сыворотке в 3 - 4 раза. При использовании сульфата цинка ИС в реакции лимфопролиферации рассчитывали по формуле:

^ _ Число импульсов в культуре, стимулированной ФГА. в присутствии сульфата цинка Число импульсов в культуре без ФГА в отсутствии сульфата цинка

Определение концентрации сывороточных IgM, IgG, IgA проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле по Manchini (Manchini G. et al., 1965) с использованием моноспецифических сывороток и стандартов ФГУП НПО «Микроген» МЗ и CP РФ.

Определение концентрации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке осуществляли методом осаждения полиэтиленгликолем ПЭГ-6000 (Гриневич Ю.А., Алферов А.Н., 1981). По разнице оптической плотности

сыворотки до и после инкубации ее с ПЭГ высчитывали концентрацию ЦИК в условных единицах.

Оценка фагоцитарной активности. Для изучения процесса поглощения использовали взвесь лейкоцитов, которую инкубировали со стандартными частицами латекса диаметром 1,35 мкм («Иммуноскрин», Москва).

Определение содержания цитокинов ИЛ-ip, ИЛ-4, ИЛ-8, ИФН-у в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа в системе бидетерминантного определения антигена с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента с использованием стандартных наборов («Цитокин», С-Петербург) в соответствии с прилагаемой к набору методике.

Иммуногснетический анализ. Этот этап работы включал обследование практически здоровых людей и больных ХОБЛ цинкдефицитной территории чувашской национальности, которые удовлетворяли следующим критериям: 1) не состояли между собой в родстве; 2) имели несколько предшествующих поколений, проживавших на определенной территории Чувашии; 3) их предки не имели смешанных браков. Национальную принадлежность определяли путем опроса. Иммуногенетический анализ включал сравнительное изучение частот HLA-антигенов класса I и генов класса II. HLA-типирование по классу I проводили в стандартном микролимфоцитотоксическом тесте (Зарецкая Ю.М., 1983) с помощью набора HLA- типирующих сывороток ЗАО «Межрегиональный центр иммуногенетики и гистотипирующих реагентов «Гисанс» (С.-Петербург). При этом учитывались 8 антигенов HLA-A локуса: AI, А2, A3, А9, А10, All, А19, А28 и 20 антигенов HLA-B локуса: В5, В7, В8, В12, В13, В14, В15, В16, В17, В18, В21, В22, В27, В35, В40, В41, В42, В47, В53, В70. HLA-генотипирование аллелей класса II проводили методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции, разработанной в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России МЗ РФ» (Трофимов Д.Ю., 1996), сертифицированной МЗ и CP РФ. В качестве материала для HLA-генотипирования использовали образцы периферической крови, взятые непосредственно перед исследованием или хранившиеся при температуре -30°С. Проведено типирование по 14 аллелям DRB1,8 аллелям DQA1 и 11 аллелям DQBl-локусов.

Определение концентрации цинка и меди в периферической крови проводили методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии с использованием пламенного спектрофотометра AAC 115М1 (Украина). Биологический материал (сыворотка крови, взвесь клеток) вносили прямым аэрозольным методом в пламя ацетилен-воздух (щель горелки - 0,4 мм, высота пламени - 10 мм). Спектральная ширина щели монохроматора составляла 0,1 нм, резонансная линия - 213,9 нм для цинка и 324,8 нм для меди.

Методы статистического анализа. Полученные данные обрабатывали параметрическими и непараметрическими методами статистического анализа на персональном компьютере IBM PC/AT с использованием разработанных для этого класса вычислительных машин пакетов программ в среде Exel 97.0 и STATISTICA for Windows 6.0. Данные представляли в виде: средняя арифметическая+стандартное отклонение (M±SD), анализировали при помощи теста Стьюдента. При асимметричности распределения совокупности значений показателей в группах вычисляли медиану (Me), границы варьирования изучаемой совокупности определяли в пределах от 10 до 90 перцентилей или от

нижнего до верхнего квартилей (Pîj; Р75), а достоверность различий оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни (pm.w) для независимых группировок и Вилкоксона (pw) для сопряженных групп. Достоверность связи между двумя рядами наблюдений оценивали на основании вычисления коэффициента корреляции рангов Спирмена (rs).

Обработку данных иммуногенетического анализа проводили с помощью специальных математических методов (Зарецкая Ю.М., 1983; Зарецкая Ю.М., Абрамов В.Ю., 1986). Частоту антигена f в популяции рассчитывали как отношение числа индивидов, несущих данный антиген, к общему числу индивидов в выборке по формуле: f = n/N, где п - число лиц с данным антигеном, а N - общее число обследованных. Для локусов HLA DRB1, HLA DQA1, HLA DQB1 частоту аллелей вычисляли по формуле: f=n/2N, где п - количество раз встречаемости аллеля. Достоверность разницы в частоте распространения антигенов и генов в группах обследованных оценивали по критерию %2. Когда значения одного из признаков были менее 5, применяли двусторонний точный метод Фишера для четырехпольных таблиц (Браунли К.А., 1977). Статистическую оценку ассоциации HLA антигенов с ХОБЛ проводили по показателю относительного риска - RR (Певницкий Л.А., 1988; Яздовский В.В., 1994). Величину RR вычисляли по формулам В. Woolf и J. Haldane (Певницкий Л.А., 1988; Svejgaard A. et al., 1974). Достоверность ассоциации (р) определяли по критерию %2 для альтернативных признаков с поправкой на непрерывность выборки (Svejgaard A. et al., 1974) и по точному двустороннему тесту Фишера для четырехпольных таблиц. Коррекцию р (рс) проводили путем умножения величины р на число исследованных HLA-аллелей (Певницкий Л.А., 1988).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Состояние основных звеньев иммунной системы у больных ХОБЛ в условиях различной обеспеченности цинком

При анализе показателей иммунного статуса в группах больных цинкдефицитного и контрольного субрегионов 4P мы использовали в качестве референтных величин показатели здоровых популяций указанных субрегионов, полученные в ранее проведенных исследованиях (Ковальчук Л.В. и др. 2004). По сравнению со здоровыми, у больных ХОБЛ контрольного субрегона снижена фагоцитарная активность нейтрофилов на фоне увеличения абсолютного числа нейтрофилов (табл. 1). Со стороны показателей Т-системы отмечено уменьшение абсолютного числа клеток популяции Т-лимфоцитов, ее хелперной субпопуляции (CD4+), снижение иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+), что свидетельствует о депрессии клеточного звена адаптивного иммунитета. При исследовании гуморального звена у больных ХОБЛ была установлена активация этого механизма адаптивного иммунитета: повышение содержания В-лимфоцитов (CD20+) и уровней двух классов иммуноглобулинов - IgM, IgA, что, видимо, является отражением иммунной реакции на внедрение бактериального возбудителя (Лолор-младший Г. и соавт., 2000; Москалец О.В. и соавт., 2002). Помимо количественных изменений клеточного компонента иммунного ответа у пациентов отмечалось угнетение его функциональной активности, проявлявшееся снижением митогенстимулированной пролиферативной активности лимфоцитов

Таблица I

Сравнительная оценка показателей иммунного статуса у больных ХОБЛ, проживающих в условиях различной обеспеченности цинком среды

обитания (М+ББ)

Показатели Контрольный субрегион Цинкдефицитный субрегион Р

Здоровые (п=40) Больные ХОБЛ (п=20) Здоровые (п=40) Больные ХОБЛ (п=40)

Лейкоциты 10б/л 5585±1294 6384±1675 545011673 675412058** NS

Нейтрофилы % 58,5±7,1 61,0±11,0 61,718,9 66,016,9* 0,045

10б/л 323б±967 3880+1194* 332811438 448211518** NS

Лимфоциты % 36,2±7,1 31,0+8,7* 32,919,1 25,716,2*** 0,011

106/л 20111570 2000±829 17521571 17101611 NS

CD3+ % 61,9+6,3 46,4110,1*** 55,417,8 36,6+10,3*** 0,001

106/л 1246±369 9531485** 9521301 616+257*** 0,001

CD4+ % 37,8±б,2 26,715,9*** 32,2 + 5,6 19,916,2*** 0,000

106/л 757±236 546+265** 555+208 334+138*** 0,000

CD8+ % 24,4+3,4 20,8±5,2** 23,2 +3,8 18,716,4*** NS

10б/л 471±170 4181190 4011134 3311171* NS

СИ4+/ СБ8+ 1,5210,3 1,24±0,32** 1,410,24 1,1510,35* NS

сто* % 14,3±4,5 20,5+7,1*** 14,7+4,3 14,915,1 0,001

106/л 292+145 419+225** 260117 243+94 " 0,000

Фагоцитарный индекс % 62,8±6,1 55,9+9,3*** 55,416,4 47,016,3*** 0,000

Фагоцитарное число 4,2±0,7 4,0+0,8 4,2+0,5 3,910,5* NS

IgM г/л 1,2±0,3 1,5+0,7* 1,310,3 1,210,3 NS

IgG г/л 12,0±1,9 12,3±4,6 12,812,9 12,614,3 NS

IgA г/л 1,8±0,5 2,5+1,4** 2,110,9 3,110,7*** 0,044

ЦИК у.ед. 18,1±9,2 21,1+13,4 21,5110,4 23,5123,9 NS

ИС на ФГА 36,1±5,0 26,2 ±14,9* 15,1315,16 14,3 15,7 0,001

Примечания: р - достоверность различия показателей между группами больных ХОБЛ, звездочками отмечены достоверные различия показателей у больных ХОБЛ по сравнению с таковыми у здоровых соответствующего субрегиона (*-р<0,05, **-р<0,01, *** -р<0,001), N5 -различие не достоверно (р>0,05).

на Т- клеточный митоген - ФГА и уменьшением количества СП)25+-лимфоцитов, экспрессирующих рецептор к ИЛ-2 (рис. 1).

□ Здоровые Я Больные ХОБЛ

клетки/мкл

Ряс. 1. Показатели экспрессии активационных маркеров на лимфоцитах у больных ХОБЛ и здоровых жителей контрольного субрегиона

Таким образом, приведенные данные подтверждают описанный рядом авторов факт о преимущественной депрессии Т-клеточного звена иммунной системы и активации ее гуморальной составляющей у больных ХОБЛ (Byron К.А. et al., 1994; Moszczynski Р. et al, 2001; Takabatake N. et al., 2005). Полярность изменения двух рассматриваемых компонентов иммунного ответа является следствием существования взаимоингибирующих отношений между Thl/клеточной и ТЬ2/гуморальной функциями (Хаитов P.M., 2000; Сепиашвили Р.И., 2003). При анализе цитокинового статуса у больных с обострением ХОБЛ нами выявлено повышение концентрации циркулирующих в крови цитокинов - ИЛ-lß, ИЛ-4, ИЛ-8 (рис. 2). Провоспалительные цитокины ИЛ-lß, ИЛ-8 усиливают воспалительные реакции, активируя

пг/мл □ Здоровые В1 Больные ХОБЛ

ИЛ-lß ИЛ-4 ИЛ-8 ИФН-д

*** - рга-„<0,001

Рис. 2. Содержание основных цитокинов в сыворотке крови больных ХОБЛ и здоровых жителей контрольного субрегиона

гранулоцитарные и моноцитарные фагоциты, повышая их адгезивные свойства, выделял кислородные радикалы и протеазы, оказывающие повреждающее действие (Ярилин A.A., 1997; Baggiolini М. et al., 1994; Rosenwasser L.J., 1998). Обнаруженные нами высокие концентрации циркулирующих цитокинов - ИЛ-lß, ИЛ-8 свидетельствуют об активности воспалительного процесса при обострении ХОБЛ и его проявлениях на системном уровне (Fuster А., 2008; Higashimoto Y. et al., 2008). Повышение концентрации другого цитокина - ИЛ-4 можно объяснить его ассоциацией с ТЬ2/гуморальным типом иммунного ответа (Симбирцев A.C., 2004), находящимся при ХОБЛ, как это было отмечено выше, в активированном состоянии.

Описанный выше спектр иммунопатологических изменений при ХОБЛ, характерный для жителей контрольного субрегиона 4P, можно считать типичным для варианта заболевания, развивающегося под влиянием наиболее часто встречающегося фактора риска развития этого заболевания - курения, имевшего место у 80 % обследованных больных контрольного субрегиона.

В условиях природного дефицита цинка характер изменений иммунного статуса у больных с обострением ХОБЛ имел ряд отличий от такового у больных контрольной территории. В частности, при ХОБЛ в условиях цинковой недостаточности уменьшалось число клеток не только хелперной субпопуляции (CD4+), но и цитотоксической (CD8+), увеличивалось число лейкоцитов, чего не наблюдалось в контрольной группе больных. Не повышались уровни В-лимфоцитов (CD20+) и IgM (см. табл. I).

Сравнение иммунологических параметров исследуемых групп больных между собой показало, что у больных цинкдефицитного субрегиона снижен фагоцитарный индекс, уменьшено число Т-лимфоцитов, Т-хелперов, В-лимфоцитов, снижена пролиферативная активность Т-лимфоцитов (см. табл. 1). Различными оказались значения концентрации IgA сыворотке крови: у больных из цинкдефицитной территории этот показатель был выше, чем в контроле. Кроме того, уменьшены относительные и абсолютные значения содержания всех субпопуляций МНК, несущих исследуемые активационные маркеры -рецепторы для ИЛ-2 (CD25), трансферрина (CD71), HLA-DR-антигены, за исключением С095+-клеток, относительное число которых, напротив, было увеличено (рис. 3).

□ Контрольный субрегион В Цинкдефицитный субрегион % ^

25 __

20 ' 15

10 '' _

]..■• ' fSM^***

okiJBt

CD 25+ CD 71+ HLA-DR+ CD 95+

** - Pm-w<0,01; *** - pra.w<0,001 Рис.3. Показатели экспрессии активационных маркеров лимфоцитов у больных ХОБЛ

Особенностью цнтокинового статуса больных ХОБЛ цинкдефицитной территории явилось уменьшение медианы концентрации цитокина с регулирующим эффектом - ИФН-у (42 пг/мл), по сравнению со значениями соответствующей популяции здоровых (68 пг/мл, pm_w<0,01) и группы больных контрольного субрегиона (144 пг/мл, pm_w<0,01). Этот цитокин, как известно, продуцируется активированными Thl клетками (CD4+), цитотоксическими Г-лимфоцитами (CD8*) и NK-клетками (CD16+) (Bach Е.А. et al., 1997). Недостаточное повышение его уровня может быть связано с низким уровнем функциональной активности клеточного звена адаптивного иммунного ответа.

Суть иммунопатологических изменений, происходящих при ХОБЛ у больных, проживающих в условиях дефицита цинка, сводится к еще более выраженному, по сравнению с наблюдаемым у здоровых жителей этой территории и больных контрольной территории, угнетению фактора естественной резистентности - фагоцитоза и клеточной/Thl составляющей адаптивного иммунитета. Помимо этого у больных цинкдефицитного субрегиона выявлено. повышение уровня IgA, являющееся, по-видимому, изменением: компенсаторного характера в ответ на депрессию функции Thl и фагоцитоза. Однако этого не достаточно для обеспечения полноценного иммунного ответа. Свидетельством тому служит неблагоприятное клиническое течение ХОБЛ в условиях природного дефицита цинка, что проявляется в затяжном, но малосимптомном течении воспалительного процесса, без характерного для жителей контрольного субрегиона повышения температуры тела до фебрильных или субфебрильных цифр, торпидносги к проводимой терапии. Среди сопутствующих заболеваний у больных цинкдефицитного субрегиона чаще, чем в контроле, встречаются очаги хронической инфекции. Бронхолегочный процесс чаще осложняется вторичными бронхоэктазами и системными (внелегочными) проявлениями заболевания (снижение индекса массы тела, гипотрофия скелетных мышц).

Выявленные у больных Прикубнино-цивильского субрегиона 4P особенности иммунного ответа мы связываем с геохимическими условиями их проживания, обусловливающими нарушение гомеостаза цинка и его конкурента за белково-связывающие сайты - меди.

Содержание цинка и меди в крови у больных ХОБЛ

Проведенные исследования показывают, что у больных цинвдефицитного субрегиона существенно ниже показатели содержания цинка в сыворотке и МНК, в то время как индекс медь/цинк (концентрация меди/концентрация цинка в сыворотке крови) - выше (рис. 4). Ряд авторов считает, что индекс медь/цинк -лучший индикатор гомеостаза данных элементов, чем уровень каждого элемента в отдельности (Pfeiffer С., 1975; Kadrabova J. et al., 1996). Медь является конкурентом цинка за белково-связывающие сайты в кишечнике, хотя в физиологических процессах, происходящих в организме, участвует в паре с цинком, оказывая в одних случаях синергическое, в других антагонистическое действие. Как и цинк, медь важна для функционирования иммунной системы. Однако в отличие от цинка, медь влияет преимущественно на пролиферацию гранулоцитарных фагоцитов и антителопродукцию (Prohaska J. R., Lukasewycz O.A., 1990; Karimbakas J. et al., 1998). Уровни цинка и меди в

большей степени зависят от взаиморегулирующих влияний друг на друга, в которых основная роль принадлежит цинку. Последний необходим для обеспечения адреналовой функции надпочечников, регулирующей синтез транспортного белка меди - церулоплазмина - в печени. При снижении уровня цинка нарушается синтез этого белка, и медь накапливается в несвязанной форме, в которой не может усваиваться для биохимических процессов. Избыток свободной меди откладывается в тканях и органах, оказывая токсическое действие на многие системы организма и усугубляя дефицит цинка (Pfeiffer С., 1975).

Обнаружение у больных ХОБЛ обратной корреляционной связи значения медь/цинк с числом Т-лимфоцитов (rs = - 0,70, prs = 0,01) и уровнем ИФН-у (rs = - 0,58, рге = 0,0001) свидетельствует в пользу того, что выявленное ослабление клеточного иммунного ответа у больных цинкдефицитной территории связано с нарушением баланса рассматриваемых микроэлементов. Показано, что 80 % частностей медь/цинк у здоровых лиц, проживающих в субрегионе с достаточной обеспеченностью цинком, находится в диапазоне от 0,63 до 1,26 (Рю— Р90Х следовательно, их можно принять за референтные значения, в пределах которых обеспечивается нормальное функционирование иммунной системы. Превышение уровня 1,26 следует расценивать как дисбаланс уровней меди и цинка, отрицательно отражающийся на функционировании Т-системы (Карзакова Л.М., 2005). Обострение ХОБЛ у 28 % жителей контрольного субрегиона сопровождается увеличением индекса медь/цинк выше 1,26, что сказывается отрицательно на показателях Т-клеточного звена, средние значения которых умеренно снижены относительно группы здоровых. Что касается больных цинкдефицитного субрегиона, большинство (90,3 %) его представителей имеют значения медь/цинк выше 1,26. Соответственно этому, у большинства из них снижены показатели Т-клеточной функции. Тот факт, что у больных цинкдефицитного субрегиона снижена концентрации цинка в крови при сохранении содержания меди на уровне больных контрольного субрегиона, свидетельствует о том, что колебания индекса медь/цинк в большей степени зависят от уровня цинка.

□ Контрольный субрегион ЕЗ Цинкдефицитный субрегион

1000

Zn сыв. мкг/дл

Zn мон.

Zn эр.

Си сыв. мкг/дл

Cu/Zn

** - Рш-^<0,01; *** - рт.„<0,001 Рис. 4. Сравнительная оценка содержания цинка и меди в периферической крови у больных ХОБЛ

Патофизиологическое обоснование иммунотропного действия цинка на

лимфоциты н иммунопатологические процессы у больных ХОБЛ

В связи с тем, что лабораторные критерии цинкдефицитного состояния не установлены, и наиболее достоверным методом диагностики цинкдефицитного состояния считается положительный результат от его введения в организм извне, мы разделили группу больных цинкдефицитной территории на две подгруппы и в комплекс лечебных мероприятий одной из них добавили цинксодержащий препарат - сульфат цинка. Выбор дозировки препарата осуществляли с ориентацией на «биотические» концентрации - близкие к физиологическим потребностям организма в цинке. В результате подобрана оптимальная суточная концентрация препарата - 2,3-3,45 мг/кг, при этом обеспечивается введение 0,500,75 мг/кг элементарного цинка, что в 2-3 раза превышает физиологическую норму суточного потребления цинка, составляющую 15 мг. Препарат назначали в среднем в течение двух недель. В процессе лечения сульфатом цинка достоверно повышались медианы уровня цинка и сыворотке и эритроцитах. Медиана сывороточного уровня цинка повысилась с исходного 52,6 мкг/дл (Р25 =39,5; Р75 =75,0) до 88,3 (69,4; 104,0) мкг/дл после лечения (pw<0,001), приблизившись к значению соответствующего показателя в здоровой популяции контрольного субрегиона, составляющего 91,5 мкг/дл. Напротив, медиана исходно повышенного уровня меди в сыворотке 92,4 (72,4; 107,9) мкг/дл уменьшилась до 76,2 (59,7; 93,7) мкг/дл (pw<0,001), и ее значение сравнялось с медианой здоровых лиц контроля (76,2 мкг/дл). Индекс медь/цинк также существенно снизился на фоне лечения, включающего сульфат цинка. Медиана этого показателя с исходного значения 1,77 снизилась до 0,96 и достигла уровня аналогичного показателя у больных контрольного субрегиона, составляющего 0,95. При этом у 75 % больных отношение медь/цинк оказалось ниже критического уровня - 1,26, превышение которого, как было показано выше, сопряжено со снижением показателей Thl/клеточного иммунного ответа. Повышение содержания цинка в крови под влиянием перорального приема сульфата цинка в биотической дозе является бесспорным доказательством того, что обследованная группа больных до лечения испытывала дефицит этого микроэлемента. Позитивная динамика (рис. 5) первоначально сниженных показателей фагоцитарной активности нейтрофилов, клеточного компонента адаптивного иммунитета (увеличение числа Т-лимфоцитов, преимущественно за счет Т-хелперной субпопуляции, повышение иммунорегуляторного индекса и ФГА-стимулированной лимфопролиферации), а также снижение исходно повышенного уровня IgA под влиянием цинксодержащего препарата подтверждают связь выявленных у больных цинкдефицитного субрегиона ЧР отличий в иммунного ответе с дефицитом цинка.

Исследования in vitro также подтверждают наличие прямой связи между функциональной активностью Т-лимфоцитов и присутствием ионов цинка (рис. 6). Повышение под влиянием сульфата цинка у больных цинкдефицитной территории (с 14,3±5,7 до 21,3±13,2, pw<0,001) и отсутствие изменения в контрольной группе ФГА-стимулированной лимфопролиферации, являющейся

Стандартная терапия + сульфат цинка Стандартная терапия

100

* - pw<0,05 - достоверность различия значения показателя после лечения по сравнению с исходным Рис. 5. Динамика показателей иммунного статуса у больных ХОБЛ на фоне различных методов лечения

аналогом антигенспецифической стимуляции активности лимфоцитов in vivo, свидетельствуют об иммуномодулирующем эффекте соединения цинка.

ис

30

25 20 15 10 5 0

- ***

' ®р Y; .V/

- 1 I •

□ ФГА

2+

Ш ФГА+Zn

! - р„.<0,001

Цинкцефицитный субрегион

Контрольный субрегион

Рис. 6. Влияние ионов цинка на ФГА-стимулированную лимфопролиферацию у больных ХОБЛ

Сравнительный анализ клинических результатов лечения разными методами (1А - стандартное лечение, 1Б - стандартное лечение + сульфат цинка) демонстрирует преимущества второго метода над первым: в 95 % случаев достигнут положительный клинический эффект, причем у 1/3 больных со

значительным улучшением. Клинический эффект выражался в

исчезновении признаков обострения воспалительного процесса - гнойности мокроты, кашля, уменьшении одышки и улучшении функции внешнего дыхания. При лечении обычно принятыми средствами улучшение клинического состояния достигнуто лишь у 75 %, в то время как у 25% клинический эффект отсутствовал.

Итак, результаты исследования как in vivo, так in vitro убедительно доказывают, что особенности иммунного ответа, выявленные у больных, проживающих в условиях геохимически обусловленного снижения цинка, связаны с нарушением гомеостаза микроэлемента цинка в организме. Иммунологические расстройства являются самими ранними, доклиническими признаками дефицита цинка (Kilic I. et al., 1998). Настоящее исследование свидетельствует о преимущественной гипофункции в системе Т-клеточного иммунного ответа в условиях естественного дефицита цинка. Подобный характер изменений в иммунном ответе описан A.Prasad (1998) у добровольцев с экспериментально созданным цинкдефицитным состоянием легкой степени выраженности.

Существуют разные точки зрения, объясняющие причины цинкзависимой депрессии Т-системы иммунитета, и большинство из них примиряет гипотеза об апоптозопосредованном влиянии дефицита цинка на иммунную систему. Л.В.Ковальчук и А.Н.Чередеев (1998) впервые обосновали гипотезу об апоптозопосредованной делеции Т-клеток как основного механизма развития вторичного клеточного иммунодефицита. Так, у обследованных больных цинкдефицитного субрегиона уменьшено количество Т-клеток, при этом нарушен нормальный баланс в экспрессии на лимфоцитах маркеров позитивной (CD25, CD71, HLA-DR) и отрицательной (CD95) активации. Актнвационные маркеры характеризуют связанные с клеточным циклом процессы активации (CD25), пролиферации (CD71), дифференцировки (HLA-DR) и апоптоза клеток (CD95) (Swain S.L., 1995). Активированные клетки могут вступать в клеточный цикл, приводящий к митотическому делению клетки (позитивная активация). Возможен и противоположный исход активации клетки - индукция апоптоза и ее гибель (негативная активация). Мы сопоставили число лимфоцитов, несущих маркеры позитивной активации, с числом клеток, экспрессирующих Fas-рецептор апоптоза, путем определения индекса (CD25++CD71++HLA-DR+) / CD95\ Медиана этого показателя у больных цинкдефицитной территории составила 0,9, что в 1,7 раза ниже соответствующего индекса в группе больных контрольной территории, где он оказался равным 1,57 (pm_w<0,001). Следовательно, у больных ХОБЛ в условиях дефицита цинка происходит сдвиг в соотношении активационных маркеров в сторону уменьшения экспрессии маркеров позитивной активации и наблюдается повышение готовности к Fas-опосредованному апоптозу. Убедительным доказательством уменьшения потенциала позитивной активации МНК рассматриваемой группы больных выступает снижение ФГА -индуцированной пролиферации лимфоцитов, существенно повышающееся при добавлении в среду культивирования сульфата цинка. Известно, что результат исхода активации клетки зависит от присутствия «факторов выживания», роль которых способны выполнять ионы Zn2+ и некоторые цитокины - ИЛ-2, ИФН-у, ИЛ-4 (Nieto М.А. et al., 1989; Migliorati G. et al., 1992). Содержание цинка в сыворотке крови и МНК у больных из цинкдефицитной территории оказалось

сниженным с высокой степенью достоверности. У них же уменьшена экспрессия ИЛ-2-рецепторов (CD25), что косвенно говорит о снижении продукции ИЛ-2. Вполне вероятно, что недостаток "ростовых факторов" - ИЛ-2 и цинка обусловливает ускорение апоптоза активированных Т-лимфоцитов и последующее развитие Т-клсточного иммунодефицита в условиях природного дефицита цинка.

Другим отличительным признаком иммунопатологии при ХОБЛ в условиях недостатка цинка является снижение фагоцитарной активности. Ранее описывались цинкассоциированные изменения хемотаксиса гранулоцитов (Briggs W.A., 1982). Возможно, решающее значение в нарушении фагоцитарной функции имеет обнаруженное у больных цинкдефицитной территории снижение уровня ИЛ-8, продуцируемого активированными макрофагами и обеспечивающего, как известно, хемотаксис нейтрофильных лейкоцитов, усиление адгезивных свойств нейтрофилов и генерацию активных форм кислорода (Hebert С., Baker J.B., 1993; Baggiolini М. et al., 1994; Baggiolini M. et al., 1997).

Ранее проведенные исследования показали, что уменьшение сывороточной концентрации цинка наблюдается и у практически здорового населения, проживающего в условиях естественного дефицита микроэлемента цинка (Ковальчук Л.В. и соавт., 2004). Причем, более чем у 60 % обследованных цинкдефицитной территории обнаружены признаки снижения Т-клеточной функции иммунной системы и фагоцитарной активности нейтрофилов. Субклинический дефицит цинка обусловливает снижение инфекционной резистентности и создает фон для развития инфекций респираторного тракта в связи с тем, что органы дыхания, в силу анатомо-физиологических особенностей испытывая постоянную антигенную нагрузку, наиболее чувствительны к иммунным нарушениям. Этим объясняется повышенная распространенность и неблагоприятное течение хронических бронхолегочных заболеваний, в том числе и ХОБЛ, у жителей цинкдефицитной территории. Однако далеко не все жители цинкдефицитной территории болеют ХОБЛ, что свидетельствует об участии генетических факторов в развитии этого заболевания.

ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИ ХОБЛ У ЛИЦ, ПРОЖИВАЮЩИХ В РЕГИОНЕ ЕСТЕСТВЕННОГО ДЕФИЦИТА ЦИНКА

Наилучшими маркерами для выявления предрасположенности к различным патологическим состояниям, связанным с иммунологическими нарушениями, зарекомендовали себя аллели системы HLA (Алексеев Л.А. и соавт., 1988). Изучение HLA-профиля больных ХОБЛ и здоровой популяции цинкдефицитной территории (табл. 2) выявило у первых повышенную частоту HLA-антигена I класса-В21 (рс= 0,025).

Исследование HLA-специфичностей II класса показало у больных ХОБЛ отсутствие в локусе HLA-DRB1 аллеля *01 (рс= 0,006) и повышенную частоту * 11 (05), рс = 0,018. DQA1*0101 отсутствовал вовсе, в то время как у здоровых встречался с частотой 22,2 % (рс = 0,0003). При анализе распределения аллелей

Таблица 2

Частота распределения НЬА - антигенов класса I (в %) в группе больных ХОБЛ и здоровой популяции цинвдефпцнтного субрегиона

НЬА-антиген Больные ХОБЛ (п=31) Здоровые (п=113) НЬА-антиген Больные ХОБЛ (п=31) Здоровые (п=113)

А1 22.6 30,1 В14 6,4 7,9

А2 29 30,1 В15 12,9 20,3

АЗ 22,6 21,2 В16 19,4 10,6

А9 32,3 24,7 В17 16,1 6,2

А10 22,6 20,3 В18 6,4 5.3

ли 9,7 14,15 В21 22,6* 2,6

А12 0 0,8 В22 6,4 13,2

А19 29,0 17,7 В27 9,7 12,3

А28 6,4 23 В35 16,1 8,8

В5 9,7 13 В 40 6,4 7,9

В7 12,9 16,8 В41 3,2 4.4

В8 12,9 17,6 В 42 0 3,5

В12 9,7 19,4 В48 0 0,8

В13 0 7 В53 6,4 2,6

Примечание. +- рс < 0,05 - достоверность различия по сравнению со здоровой популяцией.

локуса НЬА-В(2В1 у больных установлено повышение частоты аллеля *0301 (рс= 0,042) и отсутствие *0501 (рс = 0,003).

Выявленные НЬА-ассоциации у больных ХОБЛ представлены в табл. 3, из которой видно, что рассматриваемое заболевание имеет достоверно

Таблица 3

НЬА-ассоциации у больных ХОБЛ цинкдефнцитного субрегиона

НЬА-аллель Ш1 Рс

Б1Ш1*01 0,031 0,0062

Ш1В1*11(05) 7,530 0,0181

БдА1*0101 0,020 0,0003

одв1*озо1 5,560 0,0424

БОВ 1*0501 0,027 0,0032

положительные ассоциации с аллелями Б1Ш1*11(05) (Ш1 = 7,5), ВСШ1*0301 (М1 = 5,6) и отрицательные - с ВГФ1*01 (Ш*. = 0,031, 1/Ю1 = 32,3), В(ЗА1*0101 (М1 = 0,020, 1/Ш1 - 49,5), 0(ЗВ 1*0501 (Ш1 = 0,027,1ЖК = 37,03).

Для изучения возможности участия в развитии ХОБЛ НЬА-ассоциированных механизмов генетического контроля иммунного ответа нами проведено исследование связи НЬА-маркеров заболевания с теми

иммунологическими показателями, изменения которых наблюдались у больных цинкдефицитной территории. В результате проведенного исследования обнаружена связь некоторых из них с наличием или отсутствием в генотипе больных НЬА-маркеров заболевания (табл. 4). Так, у больных с НЬА-ОЯВ 1*11

Таблица 4

Связь показателей иммунного статуса с НЬА-маркерами

предрасположенности к ХОБЛ в условиях естественного дефицита цинка

Показатель иммунного статуса Ме(Р25; Р75) показателя иммунного статуса HLA-маркер Аллель + (n) Аллель (n)

Лимфоциты, абс. 1800 (1360; 2390) DQB 1*0301 1600 (1250; 1890) (19)* 2240 (1720; 2630) (12)

CD3+, абс. 637 (490; 890) DRB1*11 530 (430; 690) (17)* 730(610; 930) (14)

CD4+, абс. 350 (260; 430) DRB1*11 290 (230; 350) (17)* 370(300; 450) (14)

CD8+, абс. 330 (240; 410) 330 (240; 450) DRB1*11 DQB1*0301 280 (210; 350) (17)* 280 (200; 340) (19)* 355 (280; 445) (14) 360 (290; 460) (12)

CD25+, абс. 60 (30; 100) DRB 1*11 50 (20; 70) (17)* 80 (60; 110) (14)

Примечания: аллель и аллель " - группы больных с наличием или отсутствием в генотипе данного аллеля; * - рш.„<0,05 - достоверность отличий относительно группы больных, у которых отсутствует данный аллель; абс. - абсолютное число (х109 кл/л).

в генотипе наблюдалось снижение содержания общего числа Т-лимфоцитов и их субпопуляций (CD4+ и CD8+). Кроме того, у больных, имеющих данный аллель, уменьшено число клеток, экспрессирующих рецептор к ИЛ-2 (CD25). Больные с наличием в генотипе HLA-аллели DQB1*0301 имели сниженное содержание общей популяции лимфоцитов, С08+-субпопуляции МНК. Представленные данные свидетельствуют о том, что HLA-маркеры предрасположенности к ХОБЛ одновременно являются маркерами сниженных показателей иммунного статуса, характеризующих преимущественно клеточный механизм адаптивного иммунитета - абсолютного содержания Т-лимфоцитов, субпопуляций Т-лимфоцитов (Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток) и клеток, несущих маркер ранней активации лимфоцитов - рецептор к ИЛ-2. К настоящему времени конкретные механизмы влияния HLA-аллелей на иммунный ответ не выяснены. Ряд авторов полагает, что влияние системы HLA на иммунные реакции опосредовано ее регулирующим влиянием на продукцию цитокинов (Morel Е., Bellon Т., 2008; Wallden J. Et al., 2008).

Обобщая полученные данные, можно предположить следующий механизм развития ХОБЛ в условиях геохимически обусловленного дефицита цинка. Дефицит цинка усугубляет действие других факторов риска развития ХОБЛ (курение, экологически агрессивные факторы внешней среды, респираторные инфекции и др.) на иммунную систему, вызывая нарушение баланса клеточных и гуморальных реакций иммунного ответа, выступающее, по всей видимости, одним из звеньев патогенеза этого заболевания. При этом реализация влияния внешних факторов на иммунную систему находится под контролем генов системы HLA. Лица, имеющие в генотипе аллели DRB 1*11(05) и DQB 1*0301,

маркирующие низкий уровень показателей клеточного механизма иммунореактивноети, более чувствительны к геохимически обусловленному дефициту цинка и имеют повышенный риск заболеть ХОБЛ в условиях естественного дефицита цинка.

ВЫВОДЫ

1. Иммунологические изменения при ХОБЛ сводятся к депрессии фагоцитарной активности нейтрофилов и клеточного звена иммунного ответа на фоне активации его гуморальной составляющей.

2. У больных ХОБЛ в условиях природного дефицита цинка усугубляются выявленные иммунные нарушения и появляются новые признаки иммунопатологии (снижение на лимфоцитах экспрессии позитивных активационных маркеров - рецепторов для ИЛ-2, трансферрина, HLA-DR-антигенов и ускорение активационного апоптоза лимфоцитов).

3. HLA-аллели DRB 1*11(05) и DQB 1*0301, ассоциированные с рядом патогенетически значимых для ХОБЛ особенностей клеточного адаптивного иммунитета, являются маркерами предрасположенности к развитию этого заболевания в условиях геохимически обусловленного дефицита цинка.

4. Цинксодержащий препарат - сульфат цинка - оказывает иммуномодулирующее действие in vitro в ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов и при клиническом применении у больных ХОБЛ.

5. Выявленные HLA-маркеры предрасположенности и резистентности к возникновению заболевания у жителей цинкдефицитной территории могут быть использованы для прогнозирования развития ХОБЛ и ее ранней диагностики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Иммуногенетические исследования следует использовать для формирования групп риска по развитию ХОБЛ среди жителей цинкдсфицитных регионов с выделением группы повышенного риска, включающей индивидов с наличием в генотипе HLA-аллелей DRB1*11(05) и DQB1*0301.

2. Сульфат цинка целесообразно использовать в комплексной терапии больных ХОБЛ с недостаточностью Т-клеточного звена иммунной системы и дефицитом цинка в суточной дозе 2,30-3,45 мг/кг двух-трёхкратным приемом внутрь (курсом 10-21 день).

3. Использовать индекс медь/цинк для контроля эффективности лечения ХОБЛ: снижение отношения медь/цинк до 1,26 и ниже следует рассматривать как положительный прогностический признак.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карзакова Л.М. Особенности адаптивного иммунного ответа у больных хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) /Л.М.Карзакова, Н.Д.Ухтерова, Л.Н.Иванов // Актуальные вопросы фтизиатрии и пульмонологии: Сб. трудов, посвященный 70-летию ГУЗ «Республиканский противотуберкулезный диспансер» Минздравсоцразвития ЧР» .-Чебоксары, 2007. - С.88-90.

2. Карзакова Л.М. Механизмы снижения противоинфекционной резистентности населения в Прикубнино-цивильском субрегионе биосферы Чувашии / Л.М.Карзакова, Л.Н.Иванов, Н.Д.Ухтерова // Вопросы клинической медицины: Сборник научных трудов (к 60-летию ГУЗ «Республиканская

клиническая больница» МЗ и CP ЧР). - Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 2008. — С.74-76.

3. Ухтерова Н.Д. Индекс цинк/медь и Т-хелперные функции при хронической обструктивной болезни легких в различных биогеохимических условиях / Н.Д.Ухтерова // Вопросы клинической медицины: Сборник научных трудов (к 60-летию ГУЗ «Республиканская клиническая больница» МЗ и CP ЧР). -Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 2008. - С. 112-114.

4. Иванов Л.Н. Особенности иммунного статуса, гомеостаза цинка и меди при хронической обструктивной болезни легких в условиях геохимически обусловленного дефицита цинка /Л.Н.Иванов, Н.Д.Ухтерова, Е.И.Геранюшкина //Здравоохранение Чувашии. - 2008. - №2. - С. 39-45.

5. Карзакова Л.М. Роль иммунологических и иммуногенетических факторов в развитии хронической обструктивной болезни легких / Л.М.Карзакова, Л.Н.Иванов, Е.П.Сунгоркина, Л.В.Борисова, Т.М.Сунгоркина, Н.Д.Ухтерова, О.М.Мучукова, В.Н.Саперов //Здравоохранение Чувашии. - 2008. - №2. - С.45-51.

6. Карзакова Л.М. Возможности иммунокоррекции при хронической обструктивной болезни легких / Л.М.Карзакова, Н.Д.Ухтерова, Л.Н.Иванов, Е.П.Сунгоркина, П.И.Павлов, А.В.Орешников // Современные представления об иммунокоррекции. Материалы Всероссийской науч. - практ. конф.: Сб. статей. -Пенза, 2008. - С. 44-47.

7. Павлов П.И. Особенности иммунного статуса у больных ХОБЛ /П.И.Павлов, В.А.Кичигин, Л.М.Карзакова, А.В.Орешников, Н.Д.Ухтерова // Уральский медицинский журнал. Приложение. XV1I1 Национальный Конгресс по болезням органов дыхания: Сб. трудов конгресса. - Екатеринбург, 2008. - С. 484.

8. Карзакова Л.М. Иммунологические и иммуногенетические маркеры хронической обструктивной болезни легких в условиях естественного дефицита цинка / Л.М.Карзакова, Н.Д.Ухтерова, Л.В.Борисова, Л.Н.Иванов // Медицинская Иммунология. - 2008. - №6. - С. 513-518.

9. Ухтерова Н.Д. Иммуногенетические факторы в развитии хронической обструктивной болезни легких в условиях естественного дефицита цинка /Н.Д.Ухтерова 11 Вестник Российского Университета дружбы народов. Серия Медицина. - 2008. - № 7. - С. 634-638.

10.Ухтерова Н.Д. Изучение цитокинового статуса у больных хронической обструктивной болезнью легких /Н.Д.Ухтерова, А.В.Орешников, П.И.Павлов, Л.М.Карзакова // Здравоохранение Чувашии. - 2009. - №1. - С.37-43.

11. Ухтерова Н.Д. Особенности клеточного звена адаптивного иммунного ответа у больных обструктивной болезнью легких в условиях естественного дефицита цинка / Н.Д.Ухтерова // Аллергология и иммунология - 2009. - Т. 10. -№1. - С. 37.

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Карзакова Л.М. Способ лечения хронической обструктивной болезни легких /Л.М.Карзакова, Н.Д.Ухтерова // Удостоверение №1157 от 05.03.2009. Выдано ФГОУ ВПО «ЧТУ им. И.Н.Ульянова» 11.03.2009.

2. Ухтерова Н.Д. Способ определения недостаточности клеточного звена адаптивного иммунного ответа / Н.Д.Ухтерова, Л.М.Карзакова // Удостоверение №1158 от 05.03.2009. Выдано ФГОУ ВПО «ЧГУ им. И.Н.Ульянова» 11.03.2009.

Подписано в печать 14.05.2009. Формат 60x84/16 Печать оперативная. Гарнитура «Times». Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №¿.7 J . Отпечатано в типографии Чувашского госуниверситета. 428015 Чебоксары, Московский пр., 15.

Актуальность темы

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) представляет собой одну из важнейших медицинских и социально-экономических проблем в связи с широкой распространенностью, прогрессирующим течением, сокращением продолжительности жизни больных (Чучалин А.Г. и соавт., 2004). Исследования, проведенные под эгидой ВОЗ и Всемирного Банка, установили средние цифры распространенности ХОБЛ в мире среди мужчин и женщин во всех возрастных .группах, составляющие у мужчин 9,3, у женщин 7,3 на 1000 населения (World Health Report, 2000). Помимо повсеместно наблюдаемого роста распространенности ХОБЛ, в настоящее время еще более высокие цифры представляет показатель смертности от этого заболевания. Эта болезнь занимает 4-5-е место среди причин смерти у людей старше 45 лет. В России показатель смертности для мужчин составил 141,7 на 100 тысяч населения (Чучалин А.Г. и соавт., 2004).

Ключевым звеном патогенеза этого заболевания является воспалительный процесс, поддерживаемый активностью накопившихся в респираторном тракте нейтрофилов, макрофагов и включающий аутоиммунный компонент за счет цитотоксического действия С08+-Т-лимфоцитов в отношении собственных клеток респираторной системы, модифицированных под влиянием внешних воздушных ирритантов (Tudhope S.J. et al., 2007; Yoshida Т., Tuder R.M., 2007). В связи с разночтениями в определении, диагностике и лечении ХОБЛ во всем мире эксперты ВОЗ разработали документ под названием GOLD (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung disease), включающий рекомендации (стандарты) к диагностике и лечению этого заболевания. Этиология ХОБЛ напрямую связана с факторами риска, вызывающими заболевание. Факторами риска ХОБЛ в соответствии с GOLD (2006) названы: вдыхание вредоносных частиц - табачного дыма и производственной пыли, дефекты питания, низкий социально-экономический статус, острые респираторные инфекции и др. Действие указанных факторов реализуется через иммунологические механизмы (Yoshida Т., Tuder R.M., 2007; Mehta Н. et al., 2008; Mortaz E. et al., 2009). Приведенные в литературе данные по изучению характера иммунологических изменений при ХОБЛ на системном уровне неоднозначны и противоречивы. Примечательно, что существует большая вариабельность и в клинических проявлениях ХОБЛ, что, возможно, определяется разнородностью иммунологических изменений на системном уровне и зависит от вида фактора риска, приведшего к развитию заболевания в конкретном случае. В этой связи заслуживает внимания высокая распространенность и неблагоприятное течение ХОБЛ (гнойный характер воспаления, склонность к формированию бронхоэктазов, частые обострения, резистентность к проводимой терапии) у жителей так называемого Прикубнино-цивильского субрегиона Чувашской Республики (ЧР), отличающегося низким содержанием цинка в объектах окружающей среды (уровень подвижного цинка в почве менее 0,1 мг/кг) и в водно-пищевом рационе населения - 9,1±0,9 мг/сут (Сусликов В.Л., 2001) при рекомендованной ВОЗ норме - 15 мг/сут (Нормы физиологических потребностей в пищевых веществах и энергии для различных групп населения СССР, 1992; Committee on Dietary Allowances, Food and Nutrition Board, National Research Council. Recommended dietary allowances, 1980). Ранее проведенные исследования показали, что около 70 % жителей этой территории испытывают субклинический дефицит цинка, вызывающий нарушения в клеточном звене иммунного ответа и повышенную восприимчивость к респираторным инфекциям (Карзакова Л.М., 2005). Проживание в условиях геохимически обусловленного дефицита цинка можно рассматривать как фактор риска развития инфекционно-воспалительных заболеваний органов дыхания (Геранюшкина Е.И., 2005; Карзакова Л.М., 2005; Еленкина Ж.В., 2006). Известно, что действие факторов риска реализуется в развитии ХОБЛ лишь при наличии определенной генетической предрасположенности (Дидковский Н.А.,

Жарова М.А., 2005; Joos L. et al., 2002). Влияние естественного дефицита цинка на иммунную систему также находится под генетическим контролем, в частности - аллелей системы HLA (от Human Leucocyte Antigens) (Карзакова Л.М., 2005). Многочисленные данные об обнаружении у больных ХОБЛ всякого рода изменений количественно-функциональных характеристик дендритных клеток (ДК) (Sabroe I. et al., 2007; Robbins C.S. et al., 2008; Tsoumakidou M. et al., 2008), являющихся, как известно, «профессиональными» антигенпредставляющими клетками и регуляторами иммунологического гомеостаза в организме, подчеркивают необходимость исследований связи ХОБЛ с аллелями системы HLA, обеспечивающей процессинг и презентацию антигенных пептидов (Janeway С.А., 1997; Krensky A.M., 1997).

В связи с вышесказанным можно полагать, что проживание в условиях геохимически обусловленного дефицита цинка откладывает определенный отпечаток на иммунопатогенез и клиническое проявление ХОБЛ, возможно, контролируемых генетической системой HLA. Система генов HLA зарекомендовала себя в качестве наилучших генетических маркеров для выявления предрасположенности к развитию различных патологических состояний, связанных с иммунологическими нарушениями. В этой связи большой теоретический и практический интерес представляет установление связи HLA-аллелей с патогенетически важными особенностями иммунного статуса больных ХОБЛ.

Цель настоящего исследования - изучить иммуногенетическую структуру и состояние иммунной системы у больных ХОБЛ, проживающих в регионе естественного дефицита цинка.

Задачи исследования:

1. Изучить показатели врожденного и приобретенного иммунитета у больных ХОБЛ цинкдефицитного субрегиона (Прикубнино-цивильский субрегион) и субрегиона с нормальным содержанием цинка (Присурский субрегион).

2. Исследовать содержание цинка и его конкурента за белково-связывающие сайты - меди в периферической крови у больных ХОБЛ указанных субрегионов.

3. Провести исследование особенностей распределения HLA-аллелей классов I и И, а также их связи с ХОБЛ и иммунологическими параметрами у больных, проживающих в условиях естественного дефицита цинка.

4. Оценить влияние сульфата цинка на функциональное состояние иммунекомпетентных клеток (ИКК) больных ХОБЛ in vitro.

5. Провести анализ изменений клинико-иммунологических параметров у больных ХОБЛ под влиянием комплексного лечения, включающего сульфат цинка.

Научная новизна

Впервые проведено изучение связи между показателями иммунной системы, содержанием цинка и его конкурента за белковосвязывающие сайты -меди в периферической крови у больных ХОБЛ, проживающих на территориях с различным уровнем обеспеченности цинком. Показана специфичность патогенетических механизмов возникновения ХОБЛ в условиях дефицита цинка, когда на первый план выступают снижение Т-клеточной функции иммунной системы, фагоцитарной активности нейтрофилов, ускорение активационно-индуцированного апоптоза лимфоцитов, дисбаланс гомеостаза цинка и меди.

Дана характеристика иммуногенетического профиля больных ХОБЛ, проживающих в регионе естественного дефицита цинка, при этом показано, что реализация влияния внешних факторов на иммунную систему находится под контролем генов системы HLA. Идентифицированы маркеры предрасположенности к ХОБЛ в условиях дефицита цинка - аллели

DRB1* 11(05) и DQB1*0301 и маркеры резистентности - аллели DRB1*01, DQA1*0101 и DQB 1*0501. Выявлена связь HLA-маркеров предрасположенности к ХОБЛ - DRB1*11 и DQB 1*0301 - с рядом патогенетически важных параметров иммунного статуса (сниженное содержание циркулирующих в крови CD3+-, CD4+-, CD8+- субпопуляций лимфоцитов, снижение ФГА-индуцированной лимфопролиферативной активности).

Установлено иммуномодулирующее действие цинксодержащего препарата (сульфат цинка) in vitro в ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов и при клиническом применении у больных ХОБЛ (увеличение числа Т-лимфоцитов, преимущественно за счет Т-хелперной субпопуляции, повышение иммунорегуляторного индекса и ФГА-стимулированной лимфопролиферации, снижение уровня IgA).

Практическая значимость

Установление у больных ХОБЛ связи нарушений иммунного ответа с недостатком цинка в периферической крови создали предпосылки для разработки методов направленной иммунокоррекции. Выявление иммуномодулирующего действия сульфата цинка на пролиферативную активность Т-лимфоцитов in vitro и положительной клинико-иммунологической динамики у больных ХОБЛ при включении в лечебный комплекс перорального введения этого препарата открывает перспективы для использования цинксодержащих соединений при лечении больных ХОБЛ с нарушением Т-клеточных функций и дефицитом цинка.

Выявленные HLA-маркеры предрасположенности и резистентности к возникновению заболевания у жителей цинкдефицитной территории могут быть использованы для прогнозирования развития ХОБЛ и ее ранней диагностики.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Специфическим звеном патогенеза ХОБЛ в условиях природного недостатка цинка является дисбаланс гомеостаза цинка и меди, отрицательно влияющий преимущественно на Т-клеточное звено иммунной системы.

2. Наличие у жителей цинкдефицитной территории в генотипе аллелей DRB 1*11 (05) и DQB1 *0301, ассоциированных с патогенетически значимыми изменениями показателей клеточного механизма адаптивного иммунитета, определяет повышенный риск развития ХОБЛ.

3. Цинксодержащий препарат - сульфат цинка оказывает иммуномодулирующее действие in vitro и при клиническом применении у больных ХОБЛ.

Внедрение результатов исследования в практику

В процессе выполнения работы разработаны и реализованы два рационализаторских предложения (№1157 от 11.03.2009, №1158 от 11.03.2009). Рекомендации, разработанные и предложенные автором, используются для оценки клеточного звена адаптивного иммунного ответа, оптимизации лечения больных ХОБЛ в пульмонологическом отделении МУЗ «Центральная городская больница» Управления здравоохранения и социальной политики администрации г. Чебоксары.

Основные положения диссертации используются в процессе обучения на курсах повышения квалификации терапевтов, врачей общей практики, в учебном процессе на занятиях по клинической иммунологии, патологической физиологии и внутренним болезням для студентов медицинского факультета Чувашского государственного университета.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на научно-практической конференции, посвященной 70-летию ГУЗ «Республиканский противотуберкулезный диспансер» Минздравсоцразвития ЧР «Актуальные вопросы фтизиатрии и пульмонологии» (Чебоксары, 2007); научной конференции к 60-летию ГУЗ «Республиканская клиническая больница» Минздравсоцразвития ЧР «Вопросы клинической медицины» (Чебоксары, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции» (Пенза, 2008); Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Екатеринбург, 2008); объединенном заседании кафедр внутренних болезней лечебного факультета, патологической физиологии, внутренних болезней стоматологического и педиатрического факультетов ФГОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н.Ульянова» (Чебоксары, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, 4 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Оформлено два рационализаторских предложения.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 106 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 15 таблицами, 7 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 227 источников (77 отечественных и 150 зарубежных) и приложения.

ВЫВОДЫ

1. Иммунологические изменения при ХОБЛ сводятся к депрессии фагоцитарной активности нейтрофилов и клеточного звена иммунного ответа на фоне активации его гуморальной составляющей.

2. У больных ХОБЛ в условиях природного дефицита цинка усугубляются выявленные иммунные нарушения и появляются новые признаки иммунопатологии (снижение на лимфоцитах экспрессии позитивных активационных маркеров - рецепторов для ИЛ-2, трансферрина, HLA-DR-антигенов и ускорение активационного апоптоза лимфоцитов).

3. HLA-аллели DRB1*11(05) и DQB1*0301, ассоциированные с рядом патогенетически значимых для ХОБЛ особенностей клеточного адаптивного иммунитета, являются маркерами предрасположенности к развитию этого заболевания в условиях геохимически обусловленного дефицита цинка.

4. Цинксодержащий препарат - сульфат цинка - оказывает иммуномодулирующее действие in vitro в ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов и при клиническом применении у больных ХОБЛ.

5. Выявленные HLA-маркеры предрасположенности и резистентности к возникновению заболевания у жителей цинкдефицитной территории могут быть использованы для прогнозирования развития ХОБЛ и ее ранней диагностики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Иммуногенетические исследования следует использовать для формирования групп риска по развитию ХОБЛ среди жителей цинкдефицитных регионов с выделением группы повышенного риска, включающей индивидов с наличием в генотипе НЬА-аллелей ОКВ 1*11 (05) и ОС)В 1*0301.

2. Сульфат цинка целесообразно использовать в комплексной терапии больных ХОБЛ с недостаточностью Т-клеточного звена иммунной системы и дефицитом цинка в суточной дозе 2,30-3,45 мг/кг двух-трёхкратным приемом внутрь (курсом 10-21 день).

3. Использовать индекс медь/цинк для контроля эффективности лечения ХОБЛ: снижение отношения медь/цинк до 1,26 и ниже следует рассматривать как положительный прогностический признак.