Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуногенетические исследования популяции здоровых людей и больных инфекционно-воспалительными заболеваниями легких, проживающих в регионе естественного дефицита цинка

На правах рукописи

I

< Карзакова Луиза Михайловна

I

II

I

[

' Иммуногеиетические исследования популяции

здоровых людей и больных инфекционно-воспалительными заболеваниями легких, проживающих в регионе естественного дефицита цинка

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» и Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И.Н.Ульянова» Министерства образования и науки РФ.

Научные консультанты:

академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Ковальчук Л.В. доктор медицинских наук, профессор Сапёров В.Н.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор М.А. Стенина доктор биологических наук Л. А,Захарова доктор медицинских тук, профессор В.Ф.Семенков

Ведущая организация:

ГНЦ РФ Институт иммунологии

Защита диссертации состоится «_»_2005 г.

в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05

в ГОУ ВПО РГМУ Минздрава России по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Минздрава России

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доцент

Т.Е.Кузнецова

Актуальность темы

Известно, что эколого-геохимические факторы среды обитания оказывают существенное влияние на функциональное состояние организма и здоровье населения. Одной из первых реагирует на неблагоприятные эколого-геохимические условия иммунная система. В последние десятилетия большое внимание уделялось вопросу, касающемуся отрицательному воздействию избытка отдельных тяжелых металлов на функционирование иммунной системы. Однако мало изучено влияние естественного дефицита микроэлементов, связанного с низким их содержанием в среде обитания, на здоровье человека в целом и на иммунную систему в частности.

К необходимым для поддержания жизнедеятельности человека биоэлементам относится цинк. Он выступает кофактором более чем 300 ферментов и факторов транскрипции генов. Цинк определяет протнвоинфекционную резистентность организма, оказывает регулирующее влияние на функции Т-, B-лимфоцитов и фагоцитов (Briggs W.A et aL, 1982; Dardenne M., 2002; Fraker PJ. et al., 2000; Prasad A.S., 1998). В последние годы получены данные об участии цинка в процессах алопгоза клеток. Он может выступать в роли как индуктора, так и ингибитора алопгоза (Fraker PJ. et al., 2000; Fraker PJ., Lill-Elghanian D.A, 2004). Эффект влияния цинка на функционирование иммунной системы и апопгоз дозозависим.

Дефицит цинка широко распространен в разных регионах мира. В преобладающем большинстве случаев цинкдефицитное состояние вызывается алиментарной причиной, связанной с низкой обеспеченностью пищевого рациона цинком и/или нарушением усвоения этого биоэлеменга. За более чем сорокалетний период, берущий точку отсчета с описания А.Прасадом цинкдефицигного состояния у иранского мальчика (1961г.), исследованы конкретные причинные факторы и механизмы развития цинкдефицитных состояний, их клинические и лабораторные проявления, разработаны методы профилактики и лечения таких состояний. Однако белым пятном в области исследований цинкдефицитных состояний продолжают оставаться вопросы, касающиеся естественного дефицита цинка, связанного с его низким уровнем в биогеохимической цепи «почва - вода - растения». В доступной нам литературе встретилась лишь одна работа, посвященная этой проблеме. Так, в 1982 г. Г.Э.Шинский и соавторы опубликовали данные, демонстрировавшие связь между цинкассоциированными заболеваниями (энгеропатичес-кий акродерматит, гнездное облысение, тяжелая форма юношеских

i'OC. - Ч'г * Г.;-,!\Я

г КА

¿..i.tityfiyi*'

угрей) и уровнем содержания цинка в культурных почвах и растениях Удмуртии (Удмуртия расположена в европейской части России).

Наше внимание привлёк Прикубнино-цивильский субрегион (ПЦС) биосферы Чувашии, отличающийся снижением подвижного цинка в почве (<0Дмг/кг) и, следовательно, в пищевом рационе населения до 9,1+0,9 мг/сут, что составляет 61 % от рекомендованной нормы 15 мг/сут (Сусликов В.Л., Семенов В.Д., 1981). Дети, живущие на этой территории, отстают в физическом развитии от сверстников (Мадянов И.В. и др., 2003). Здесь же регистрируются самые высокие в Чувашии показатели распространенности инфекционных заболеваний в целом и респираторных инфекций в частности (Государственный доклад о состоянии здоровья населения Чувашской Республики в 2002 году). Основываясь на приведённых фактах, можно предположить, что население ПЦС испытывает дефицит цинка, обусловливающий нарушение роста детей и угнетение иммунного ответа со снижением сопротивляемости к инфекциям. Следует отметить, что не все жители ПЦС чувствительны к инфекциям. Часть населения резистентна к недостатку цинка в чреде обитания, что, возможно, обусловлено генетическими факторами.

Иммуно ге нетическис исследования населения регионов с неблагоприятной эколого-географической ситуацией выявили изменение нормального характера распространения НЬА-антигенов и их комбинаций среди постоянно проживающих на этих территориях. Эти данные свидетельствуют об участии генетических факторов в реагировании иммунной системы человека на воздействие экстремальных для него эколого-геохимических факторов и ассоциированности адаптивных реакций организма с генами главного комплекса гистосовместимости.

В связи с вышеизложенным большой теоретический и практический интерес представляет изучение НЬА-профиля и функционирования иммунной системы населения, проживающего в условиях естественного дефицита цинка, связанного с его низким уровнем в среде обитания человека.

В настоящее время медицинское сообщество озабочено значительным ростом заболеваемости болезнями органов дыхания. По данным официальной медицинской статистики, в России болезни органов дыхания по распространенности занимают первое место и входят в состав четырех основных причин преждевременной смерти (в возрасте 15 - 59 лет), занимая третье-четвертое место (Гусейнов Х.Ю., 2000). Обращают внимание высокие уровни распространенности и летальности по инфекционно-воспалительным заболеваниям легких,

в частности хроническому бронхиту, туберкулезу легких, пневмониям в условиях естественного дефицита цинка, неблагоприятное течение указанных заболеваний - преобладание деструктивных форм туберкулеза и большой частоты бронхоэкгатических осложнений при хроническом бронхите, склонность воспалительного процесса к затяжному, малосимптомному течению, малая эффективность традиционной терапии (Акугинова З.Д и др., 1997; Воронова Г.В., 2003; Михайлова И.В., 1988). Несмотря на совершенствование средств этиологической и патогенетической терапии, существенного прорыва в лечении заболеваний этого класса нет. Среди исследователей и врачей, занимающихся этой проблемой, сформировалось представление о необходимости дальнейшего углубленного изучения патогенеза легочных заболеваний, но уже не только и не столько как инфекционного заболевания, но как сложного патологического процесса, в который интегрирована лишь как часть, инфекционная составляющая.

Представляет практический интерес изучение эффективности цинксодержапщх препаратов, в частности сульфата цинка, при лечении хронического бронхита и туберкулеза. Из литературных источников известно о иммуномодулирующем свойстве цинке о держащих соединений и положительном их клиническом эффекте при ряде патологических состояний (Машковский М.Д., 2002; Г)исЬа1еаи I, 1981). Однако целесообразность и эффективность сульфата цинка в качестве средства для лечения хронического бронхита и туберкулеза легких с дефицитом цинка не изучены.

Таким образом, исследований иммуяогенетической структуры и состояния иммунной системы населения, проживающего на цинкдефицитной территории, позволит расширить представления о механизмах реализации геохимически обусловленного дефицита цинка на организменном уровне. Изучение гомеостаза цинка и его конкурента в кишечном всасывании и за белково-связывающие сайты -меди, а также функционирования иммунной системы у больных ПЦС с инфекционно-воспалительными заболеваниями легких может уточнить особенности патогенеза этих заболеваний и лечь в основу разработки патогенетического подхода к лечению больных этого контингента.

Цель исследования

Изучил, иммуногенетическую структуру и состояние иммунной системы популяции, проживающей в регионе естественного дефицита цинка, выявить роль недостаточности цинка в иммунопатогенезе

инфекционно-воспалительных заболеваний легких и обосновать использование цинксодержащих препаратов с иммуномодулирующей целью в комплексном лечении этих патологических состояний.

Задачи исследования:

1. Исследовать иммунный статус у практически здоровых жителей цинкдефицигного субрегиона (ПЦС) и субрегиона с нормальным содержанием цинка (Присурский субрегион).

2. Изучить содержание цинка и меди в периферической крови (ПК) у здоровых жителей указанных субрегионов.

3. Изучить иммуногенетический профиль населения каждого из указанных субрегионов, а также роль генетических факторов в реагировании иммунной системы человека на геохимически обусловленный дефицит цинка.

4. Провести сравнительную оценку иммунного статуса, содержания цинка и меди в ПК у больных хроническим бронхитом и впервые выявленным туберкулезом легких, проживающих в условиях нормальной обеспеченности среды обитания цинком и на территории с естественным дефицитом этого биоэлемента.

5. Изучить влияние сульфата цинка на функциональное состояние иммунокомпетевтных клеток (ИКК) in vitro.

6. Провести анализ изменений клинико-иммуно логических параметров и «цинкового статуса» у больных хроническим бронхитом и туберкулезом легких под влиянием комплексного лечения, включающего сульфата цинка.

7. Установить критерии прогнозирования и контроля лечебного эффекта сульфата цинка по результатам тестов in vitro.

Научная новизна

Впервые изучено влияние естественного дефицита цинка, связанного с недостатком его в среде обитания, на состояние иммунной системы человека Полученные данные свидетельствуют о том, что геохимически обусловленный дефицит цинка у 77,7 % населения вызывает субклинический дефицит цинка, приводящий к существенной недостаточности клеточного звена иммунной системы на фоне ускорения Fas-опосредованного апоптоза и депрессии фагоцитарной активности нейтрофилов. Впервые дана характеристика иммуногенетического профиля популяции, проживающей в регионе естественного дефицита цинка. Специфическими чертами HLA-профшгя, отражающими адаптивные процессы в отношении геохимически обусловленного дефицита цинка, являются высокая представленность в нем HLA-A28, В15, DQA1*0301, DQB 1*0502/4, присутствие аллеля HLA- DQB1*0302 и низкая частота HLA-B17,

НЬА- БИВ 1*13 (06), НЬА- БС>В1*0602-8 маркеров. Впервые установлена специфичность для здоровой популяции цинкдефнцитной территории гаплотипа НЬА-А2-В12, ассоциированного с высокими показателями относительного числа СБ4+-лимфоцигов и иммунорегуляторного индекса. Проведено изучение параллелей между показателями иммунной системы, содержания цинка и его конкурента за белково-связывающие сайты - меди в ПК у больных с инфекционно-воспалительными заболеваниями легких. Полученные данные внесли вклад в понимание патогенеза хронического бронхита и инфиль-тративного туберкулеза легких, была продемонстрирована специфичность патогенетических механизмов возникновения этих заболеваний в условиях естественного дефицита цинка, когда на первый план выступают снижение Т-клеточной функции иммунной системы, фагоцитарной активности нейтрофилов, ускорение активационно-индуцированного апоптоза ИКК, а также нарушения в гомеостазе цинка, проявляющиеся дисбалансом содержания меди и цинка в сыворотке крови. Показана информативность индекса медь/цинк для оценки Т-клеточного звена иммунной системы. Установлено иммунорегулируклцее, иммунокорригирукщее действие цинксодер-жащего препарата (сульфат цинка) и обоснована эффективность его включения в комплексную терапию больных с инфекционно-воспалигельными заболеваниями легких.

Практическая значимость

Выявленное на примере населения ПЦС Чувашской Республики иммунодепрессирующее влияние дефицита цинка, обусловленного снижением его уровня в среде обитания человека, позволяет рекомендовать включение анализа ПК на содержание цинка и его конкурента - меди в комплекс клинико-лабораторных обследований населения с целью получения дополнительной информации о состоянии иммунного статуса обследуемых и формирования групп риска по развитию иммунологической недостаточности, а также ннфекцнонно-воспалитсльных заболеваний легких. Обнаружение в условиях природного дефицита цинка специфического преадалтивного гаплотипа НЬА-А2-В12 позволяет использовать иммуногенетический анализ населения для формирования дифференцированных групп риска по развитию иммунодефицигных состояний (группа повышенного риска, включающая лиц с отсутствием в НЬА генотипе А2-В12, и группа наименьшего риска, состоящая из положительных по А2-В12 индивидов) и использовать в группе повышенного риска препараты цинка с целью профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний легких. Благодаря установлению у больных с бронхо-

легочными заболеваниями (хронический бронхит, впервые выявленный инфильтративный туберкулез легких) связи нарушений иммунного ответа с недостатком цинка и повышением содержания конкурента цинка - меди в ПК созданы предпосылки для разработки, методов направленной иммунокоррекции. Выявление иммуномоду-лирующего действия сульфата цинка на пролиферативную активность Т-лимфоцитов in vitro и положительной клинико-иммунологической динамики у больных хроническим бронхитом и туберкулезом легких при включении в лечебный комплекс перорального введения этого препарата открывает перспективы для использования цинксодержащих соединений при лечении больных с бронхолегочной патологией с нарушением Т-клеточных функций и дефицитом цинка. Полученные данные о зависимости клинико-иммунологического эффекта лечения у конкретных больных от проявляющейся in vitro способности мононуклеаров в ФГА-индуцированной пролиферации в ответ на добавление в культуральную среду сульфата цинка позволяют использовать этот тест для установления показаний к назначению сульфата цинка и определения продолжительности курса лечения этим препаратом.

Внедрение результатов исследования в практику

Комплексная терапия с применением сульфата цинка используется для лечения больных хроническим бронхитом в пульмонологическом отделении ГУЗ "Республиканская клиническая больница №1 Минздрава Чувашской Республики". Исследование сыворотки крови на содержание цинка и меди, изучение чувствительности мононуклеаров ПК к сульфату цинка в реакции ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов применяют для комплексной характеристики иммунного статуса и дифференцированного подбора иммуномодуляторов при лечении больных во втором и третьем терапевтических отделениях ГУЗ "Республиканский противотуберкулезный диспансер Минздрава Чувашской Республики".

По результатам исследования получено решение о выдаче патента на изобретение «Способ лечения туберкулеза легких» (приоритет от 02.08.2004), составлены методические рекомендации для врачей общей практики, фтизиатров и клинических иммунологов "Туберкулез легких в условиях естественного дефицита цинка", утвержденные Министерством здравоохранения Чувашской Республики от 15.09. 2004 г.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Методология, организация и итоги массовых иммунологических обследований" (Ангарск, июнь 1987), Всесоюзном

симпозиуме "Микроэлементозы человека" (Москва, ноябрь 1989), Всесоюзной конференции "Экологические аспекты иммунопатологических состояний" (Алма-Ата, сентябрь 1990), Пленуме Всесоюзной проблемной комиссии "Эпидемиология иммунодефицитов и оценка иммунного статуса" (Пермь, июнь 1991), Первом съезде иммунологов и аллергологов Чувашии (Чебоксары, октябрь 1991), VII Российском съезде фтизиатров (Москва, 2003), Первой международной научно-практической конференции "Биоэлементы" (Оренбург, июнь 2004), Межрегиональной конференции, посвященной 70-летию кафедры патологической анатомии и патофизиологии БГМУ "Аюуальные вопросы патологии" (Уфа, октябрь 2004), Второй международной конференции "Патофизиология и современная медицина" (Москва, апрель 2004).

Основные положения, выносимые на защиту

Естественный дефицит цинка, связанный с его низким уровнем в пищевой биогеохимической цепи «почва - вода - растения», у 77,7 % населения вызывает развитие латентного цинкдефицитного состояния, приводящее к недостаточности клеточного звена иммунной системы и снижению фагоцитарной активности нейтрофилов. Реагирование иммунной системы человека на природный дефицит цинка находится под контролем HLA-комплекса. Риск развития иммунопатологии при естественном дефиците цинка повышен у индивидов, не имеющих гаплотип HLA-A2-B12.

Практически здоровые люди, имеющие иммунные нарушения вследствие недостаточного поступления в организм цинка, составляют группу риска по развитию инфекционно-в с спалите льных заболеваний легких. Недостаточность Т-клеточного звена иммунной системы на фоне ускорения активационно-индуцированного алоптоза, снижение фагоцитарной активности нейтрофилов в сочетании с дисбалансом гомеостаза цинка и меди, проявляющимся в повышении соотношения медь/цинк в сыворотке крови, являются специфическим звеном патогенеза инфекционно-воспалительных заболеваний легких в условиях естественного дефицита цинка. Неблагоприятное течение, торпидность к обычно применяемой стандартной терапии хронического бронхита и инфильтративного туберкулеза легких у больных с недостаточностью цинка требуют включения в схему комплексной терапии препаратов цинка, проявивших выраженный иммуномодули-рующий эффект как in vitro, так и при использовании у больных.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, пяти глав, заключения,

выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего источников, приложения. Текст диссертации иллюстрирован таблицами и рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Отбор практически здоровых людей для исследования проводился экспедиционной бригадой среди коренных, родившихся и постоянно проживающих в ПЦС и Присурском субрегионе. Клиническая часть работы выполнена на базе ГУЗ «Республиканская клиническая больница № 1» в пульмонологическом отделении и ГУЗ «Республиканский противотуберкулезный диспансер» Минздрава Чувашской Республики. Лабораторные исследования проведены в лаборатории клинической иммунологии Республиканской клинической больницы №1 и Централизованной лаборатории физико-химических и радиологических исследований ЦГСЭН в Чувашской Республике.

Оценка иммунного статуса, определение концентрации сывороточных цитокинов и исследование содержания цинка, меди в ПК осуществлялись в группах практически здоровых людей (40 человек) и больных с инфекционно-воспалигельными заболеваниями легких (40 - с хроническим бронхитом, 50 - с впервые выявленным туберкулезом легких), проживающих в цинвдефицитном субрегионе - ПЦС. В качестве контроля служили 40 здоровых, 20 больных с хроническим бронхитом и 25 - с впервые выявленным туберкулезом легких, являющихся жителями субрегиона с нормальным содержанием цинка в среде обитания человека (Присурский субрегион).

Типирование генов и антигенов HLA проводили в популяциях цинкдефицитного (113 человек) и контрольного (111 человек) субрегионов. ГЧЗТ на туберкулин исследовали у 17-летних студентов (117 студентов из ПЦС, 113 - из контрольного субрегиона).

Объектом иммунологических исследований служила ПК. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из ПК обследуемых лиц центрифугированием в градиенте плотности фиколл - верографина (р=1,077 г/см3) в течение 45 мин при 400 g.

Идентификация лимфоцитов и их субпопуляций

Для идентификации лимфоцитов и их субпопуляций проводили иммунофенотипированис МНК методом непрямой иммунофлю-оресценции с использованием МКАТ CD3, CD4, CD8, CD16, CD20,

CD25, CD71, HLA-DR, CD95 («Сорбент», Москва) согласно методике производителя МКАТ.

Оценка функциональной активности Т-лимфоцитов Функциональную активность Т-клеточного звена иммунной системы оценивали по способности лимфоцитов к митогениндуци-рованной пролиферации на ФГА «Difco» (США), 5 мкг/мл Уровень пролиферации клеток определяли с помощью радиоактивной метки: за 24 ч до окончания культивирования в культуры МНК вносили тимидин (4 мкКи/мл). Количество включившегося в клетки изотопа измеряли на сцинтилляционном счетчике"Тп-СагЬ" ("Packard", США). Результат выражали в индексах стимуляции.

Изучение влияния сульфата цинка и противотуберкулезных химионрепаратов на пролиферативную активность Т-.тимфоцитов

В качестве модели изучения влияния сульфата цинка и противотуберкулезных препаратов на функцию Т-лимфоцитов in vitro нами использована реакция ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов. Реакцию оценивали по индексу стимуляции и проводили в шести комбинациях:

1) культивирование МНК в отсутствии ФГА (контроль);

2) культивирование МНК в присутствии ФГА (опыт);

3)культивирование МНК в присутствии ФГА и стрептомицина (50 мкг/мл);

4) культивир ование МНК в присутствии ФГА и рифампшшна (10 мкг/мл);

5) культивирование МНК в присутствии ФГА и изониазида (2 мкг/ мл);

6)культивирование МНК в присутствии ФГА и сульфата цинка (50 мкМ в пересчете на элементарный цинк).

Концентрации вносимых в среду культивирования химиопрепаратов соответствовали терапевтическим уровням. Вносимая в среду культивирования МНК концентрация Zn2+подобрана с ориентацией на биотические дозы, близкие к физиологическим концентрациям. В нашем случае использованная концентрация цинка превышала физиологический уровень в сыворотке в 3 - 4 раза Индекс стимуляции (ИС) в реакции лимфопролиферации при использовании препаратов рассчитывали по формуле: ИС = число импульсов в культуре, стимулированной ФГА, в присутствии препарата/ число импульсов в культуре без ФГА

Определение концентрации сывороточных IgM, IgG, IgA

Уровни сывороточных иммуноглобулинов основных классов (IgM, IgG, IgA) определяли методом радиальной иммунодиффузии по Manchini с соавторами (1965) с использованием моноспецифических сывороток и стандартов ФГУТТ НПО «Микроген» МЗ РФ.

Определение концентрации ЦИК в сыворотке

Концентрацию ЦИК в сыворотке крови определяли методом осаждения полиэтиленгликолем ПЭГ-6000 (Гриневич Ю.А., Алферов А.Н., 1981). По разнице оптической плотности сыворотки до и после инкубации ее с ПЭГ высчитывали концентрацию ЦИК в условных единицах.

Оценка фагоцитарной активности

Для изучения процесса поглощения использовали взвесь лейкоцитов, которую инкубировали со стандартными частицами латекса диаметром 1,35 мкм («Иммуноскрин», Москва). Для оценки респираторного взрыва использовали реакцию восстановления нигросинего тетразолия (Виксман М.Е., Маянский А.Н., 1979). Результат реакции выражали процентным содержанием диформазан-положительных (активированных) нейгрофилов.

Оценка содержания цитокинов ИЛ-Iß, ИЛ-4, ИЛ-8, ИФН-у,

ФНО-а в сыворотке крови

Определение концентрации цитокинов проводили методом иммуноферментного анализа в системе бидетерминантного определения антигена с применением пероксцдазы хрена в качестве индикаторного фермента с использованием стандартных наборов («Цитокин», С-Петербург) в соответствии с прилагаемой к набору методике.

Иммуногснетический анализ

Этот этап работы включал обследование практически здоровых людей чувашской национальности, которые удовлетворяли следующим критериям: 1) не состояли между собой в родстве, 2) имели несколько предшествующих поколений, проживавших на определенной территории Чувашии; 3) их предки не имели смешанных браков. Иммуногенетический анализ включал сравнительное изучение частот HLA-ангигенов I класса и генов П класса, НЬА-А,В-гаплотипов. HLA-AB-фенотип устанавливали в стандартном микролимфоцитоток-сическом тесте с помощью набора типирующих анти-НЬА-сывороток АО «Гисанс» Санкт-Пстсрбургского НИИ гематологии и переливания крови. При этом учитывали 8 антигенов HLA-A локуса: AI, А2, A3, А9, А10, All, AI9, А28 и 20 антигенов HLA - В локуса: В5, В7, В8, В12, В13, В14, В15, В16, В17, В18, В21, В22, В27, В35, В40, В41, В42, В47, В53, В70 Типирование генов HLA П класса HLA DRB1,

HLA DQA1, HLA DQB1 проводили методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции, разработанной в ГНЦ "Институт иммунологии" МЗ РФ. Проведено генотипирование по 14 аллелям DRB1, 8 аллелям DQA1 и 13 аллелям DQB1. Полимеразную цепную реакцию осуществляли в ДНК, выделенной из ядерных клеток ПК, по наборам реагентов АО "ДНК-Технолошя" (Москва) согласно инструкций производителя тест-наборов.

Измерение концентрации цинка и меди в ПК

Определение концентрации цинка и меди в крови проводили методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии с использованием пламенного спектрофотометра AAC 115М1 (Украина). Биологический материал (сыворотка крови, взвесь МЕЖ и эритроцитов) вносили прямым аэрозольным методом в пламя ацетилен-воздух. Спектральная ширина щели монохроматора составляла 0,1 нм, резонансная линия -213,9 нм для цинка и 324,8 нм для меди.

Статистический анализ

Полученные данные обрабатывали с использованием прикладного рабочего пакета статанализа « STATISTICA for Windows 6.0» Данные представляли в виде: средняя арифметическая±стандартное отклонение (M+SD), анализировали при помощи теста Стьюдента. При асимметричности распределения совокупности значений показателей в группах вычисляли медиану (Me), а достоверность различий оценивали по непараметрическим критериям Манна-Уитни (pm.w), Вальда-Волфовицы (pw_w) для независимых группировок и Вилкоксона (Pw) для сопряженных групп.

Достоверность связи между двумя рядами наблюдений оценивали на основании вычисления коэффициента корреляции рангов Спирмсна (rs).

Обработку данных иммуногенетического анализа проводили с помощью специального математического аппарата (Зарецкая Ю.М., 1983; Зарецкая Ю.М, Абрамов В.Ю., 1986).

Частоту антигена f в популяции рассчитывали как отношение числа индивидов, несущих данный антиген, к общему числу индивидов в выборке по формуле: f = n/N, где п - число лиц с данным антигеном, а N - общее число обследованных. Частоту гена р определяли по формуле: р =1- Vi-f.

Для локусов DRB1, HLA DQA1, HLA DQB1 частоту аллелей вычисляли по формуле: f=n/2N, где п - частота встречаемости аллеля.

Величину неравновесного сцепления (гаметной ассоциации) рассчитывали по формуле: D = Vd/n - Vb + d /п х с+ d/n;

где п = а+Ъ+с+с1; а,Ъ,с,с1 - значения в таблице 2x2; а - присутствуют оба гена, Ъ и с - присутствует один ген, <1 - отсутствуют оба гена.

Частоту гаплотипа 2 генов \ и ] определяли по формуле: Ь = + рх , где p1pJ - генные частоты НЬА антигенов.

Достоверность разницы в частоте распространения антигенов в группах обследованных оценивали по критерию %2 и двусторонним точным методом Фишера для четырехпольных таблиц (Платонов А.Е., 2000).

Результаты исследования и их обсуждение

Средние значения параметров не всегда отражают истинную картину иммунологических нарушений, поэтому представлялось интересным провести анализ индивидуальных значений показателей иммунного статуса населения цинкдефицитного субрегиона относительно соответствующих референтных значений, вычисленных по варьированию значений показателей у жителей контрольного субрегиона от нижнего квартиля Р25 (меньше этого значения 25 % переменных выборки) до верхнего квартиля Р75 (больше этого числа 75 % переменных выборки).

У значительной части обследованных нами жителей цинкдефицитного субрегиона регистрируемые параметры выходили за установленную границу нормативного диапазона. В частности, уменьшение абсолютного числа лимфоцитов ниже Ра5 (< 1600х106/л) обнаруживалось у 47,5 % обследованных лиц. В 50 % уменьшалось относительное число лимфоцитарных клеток. Особенно демонстративны были изменения количественно-функциональных показателей Т-клсточного звена иммунной системы. Так, за границей нижнего квартиля количества Т-лимфоцигов референтного диапазона (58,0 - 65,5 %; 940 - 1480 х 10%) оказались 67,5 % относительных и 56 % абсолютных значений этого показателя у жителей цинк-дефицитного субрегиона. Относительное число Т-хелперов у 63,5 % жителей ПЦС было менее 34 % (Р25 контроля). В результате сокращения содержания СЮ4+-клеток у 52,5 % представителей цинкдефицитной группы иммунорегулягорный индекс оказался ниже значения 1,4, соответствующего нижнему квартилю значений контрольного субрегиона. Особенно ярко выражены изменения в уровнях активированных клеток, экспрессирующих СБ25, СБ71, НЬА-ВК: у жителей цинкдефицитной территории уменьшены как относительные, так и абсолютные показатели этих клеток. Ниже Р25 контроля находились 62,5 % относительных н 67 % абсолютных значений числа СБ25+- лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы

к ИЛ-2. В этой же группе процент НЬА-ОЛ+ лимфоцитов, оказавшихся за границей нижнего квартиля контроля, составил для относительных и абсолютных значений соответственно 85 % и 62 %. Увеличение относительного и абсолютного количества СБ95+ лимфоцитов наблюдалось соответственно у 60% и 65 % жителей цинкдефицигаого субрегиона. У 95% обследованных жителей ПЦС значения индекса стимуляции в ФГА-стимулированной лимфопролиферации составляли менее 34, оказавшись вне предела референтных значений контроля, колебавшихся в диапазоне от 34 до 39.

При анализе индивидуальных значений у 65 % жителей ПЦС фагоцитарный индекс оказался ниже референтных значений, определенных в пределах Р25 - Р75 контроля и равнявшихся 59 - 65 %. В 59 % случаев процент НСТ-положигельных клеток оказался за

> пределом нижнего квартиля значений контрольного субрегиона, составившего 10 %.

Показатели гуморального звена иммунной системы не различались в группах при проведении исследований в летний период, в то же время в исследованиях зимнего периода обнаружено достоверное повышение уровня у жителей ПЦС до 13,25±3,48 г/л при 10,08±2,19 г/л - в контрольном субрегионе, р<0,01.

Анализ показателей цитокинового статуса с использованием критериев согласия показал, что распределение частностей совокупности некоторых цигокинов (ИЛ-1Р, ФНО-а) не соответствует нормальному закону. Этим было продиктовано применение непараметрических методов статистической обработки результатов.

Из приведенных в табл. 1 результатов изучения цитокинового статуса в группах видно, что у жителей ПЦС снижен уровень ИФН-у, основного медиатора, продуцируемого клетками ТЫ. Концентрация

> другого медиатора - ФНО-а, связанного с функцией этих же клеток, не была изменена относительно значения контрольной группы. Содержание ИЛ-4 имело тенденцию к повышению в цинвдефицитной

( группе, что на фоне снижения уровня ИФН-у обусловило снижение

индекса ИФН-у / ИЛ-4. Существенно был снижен также уровень ИЛ-8, обеспечивающего, как известно, хемотаксис и активность нейтро-фильных фагоцитов.

Таблица 1

Содержание основных цитокинов в сыворотке крови практически здорового населения цинкдефицитного

Цитокин Группа сравнения Основная группа р

Ш1-1(5, пг/мл 0(0; 41,0) 0(0; 0) N8

ИЛ-4, пг/мл 13,0(10,0; 17,0) 16,0(15,0; 17,0) Ш

ИЛ-8, иг/мл 48,7 (44,0, 54,0) 39,0 (35,8; 46,0) 0,0018

ФНО-а, нг/мл 2,5(2,4,2,8) 2,8 (2,5; 2,9) Ш

ИФН-у, пг/мд 27,0(16,4,42,0) 19,5 (16,4; 23,5) 0,042

ИФН-у/ ИЛ-4 2,26(1,64; 3,23) 1,16(0,95; 1,69) 0,049

Примечание. Данные представлены в виде Ме (Р25; Р75). где Ме -медиана, - значение нижнего квартиля, Р75 -значение верхнего квартиля совокупности выборки.

Дополнительным тестом оценки Т-клеточного звена иммунной системы являются кожные тесты. Мы проводили одну из разновидностей кожного теста - туберкулиновую пробу. В ПЦС наблюдалась тенденция к снижению процентов положительных тестов и годичного виража, в то время как отрицательные пробы фиксировали в 2,7 раза чаще, чем в контроле.

Настоящее исследование свидетельствует о преимущественной гипофункции в системе Т-клеточного иммунного ответа и активации гуморального звена иммунной системы в условиях естественного дефицита цинка. Из общего числа Т-лимфоцитов наиболее чувствительна к недостатку цинка субпопуляция Т-хелперов. Выявленные у лиц с дефицитом цинка изменения в иммунной системе - отражение развития дисбаланса мезвду двумя типами клеток - ТЬ1 и ТЬ2. Результаты исследования цигокинового статуса, обнаружившие у жителей ПЦС снижение в сыворотке уровня ИФН-у, а также снижение ИФН-у/ИЛ-4, подтверждают депрессию Т-клеточного типа иммунного ответа, связанного с функцией ТЫ.

Выявленные у жителей ПЦС иммунологические расстройства мы связываем с геохимическими условиями среды их обитания, обусловливающими нарушение гомеостаза цинка и его конкурента за общие белково-связывающие сайты - меди. Действительно, как показывают наши исследования, у жителей ПЦС снижено содержание цинка в сыворотке до 54,4±16,1 мкг/дл и МНК до 99,9±37,2 мкг/Ю10 кл относительно контрольных показателей (86,6±.25,4 мкг/дл;

137,5±47,2 мкг/1010 кл). Снижение уровня цинка ниже 70 мкг/дл рассматривается как индикатор дефицита этого биоэдемента в организме (Sauberlich Н Е., 2002). В соответствии с этим 31 из 40 (77,7 %) обследованных жителей ПЦС имели цинковую недостаточность. Содержание цинка в сыворотке положительно коррелировало с рядом параметров Т-клеточного звена иммунной системы: с абсолютным числом Т-лимфоцитов (rs = 0,56, р<0,01), индексом стимуляции в ФГА-индуцированной лимфопролиферации (rs = 0,58, р<0,01), уровнем сывороточного ИФН-у (rs = 0.63, р<0,001) и относительным числом CD25+ - клеток, экспрессируюпщх рецепторы к ИЛ-2 (rs = 0,60, р<0,0001). В то же время между уровнем сывороточного цинка и абсолютным числом С095+-клегок выявлялась слабая отрицательная связь (rs = - 0,34, р<0,05).

Существуют разные точки зрения, объясняющие причины цинкзависимой депрессии Т-системы иммунитета, и большинство из них примиряет гипотеза об апоптозопосредованном влиянии дефицита цинка на иммунную систему. В последнее время получено много данных о регулирующем влиянии на численность клеток иммунной системы апоптоза. Л.В.Ковальчук и А.Н.Чередеев (1998) впервые обосновали гипотезу об апоптозопосредованной делеции Т-кггеток как основного механизма развития вторичного Т-клеточного иммунодефицита.

Мы предлагаем следующую схему развития цинкзависимой Т-кдеточной недостаточности: недостаток цинка приводит к снижению продукции ИЛ-2 (о чем косвенно свидетельствует уменьшение числа CD25+-iciero"K) и ИФН-у. Согласно теории предсуществующей программы гибели клеток, клетки погибают, если в микроокружении не имеют факторов выживания. В условиях дефицита цинка создаются условия для гибели молодых лимфоцитов из-за дефицита факторов выживания - ионов цинка, ростовых факторов Т-лимфоцитов - ИЛ-2, ИФН-у. Предшественники B-лимфоцитов менее уязвимы, благодаря сохранению специфичного для них ростового фактора - ИЛ-4. Зрелые клетки, экспрессируя Bcl-протеины, становятся более устойчивыми к апоптотическому действию. Активированные клетки вновь приобретают чувствительность к апопгозу. Активированные под влиянием антигенов и/или митогенов клетки, включившись в клеточный цикл, могут ответить пролиферацией - позитивной активацией. В то же время возможен другой исход активации индукция апоптотической смерти (негативная активация). Присутствие ионов цинка, ИЛ-2 в определенных концентрациях направляет ответ активированных клеток в сторону пролиферации. При снижении

концентрации факторов выживания возникает сдвиг в сторону негативной активации. Действительно, в наших исследованиях у жителей ТТТТС. выявлено повышение экспрессии Раз-рецептора апоптоза на лимфоцитах и снижение более, чем в 2 раза ФГА-индуцированной лимфодролиферации.

ис

1 2

1 - контрольный субрегион; 2 - цинкдсф и цитный субрегион Рис.1. Пролиферативный ответ лимфоцитов на ФГА и ZnI+ у жителей цинкдефицитного и контрольного субрегионов

Примечательно, что добавление в среду культивирования сульфата цинка (50 мкМ Zn2+) приводило к повышению в 1,5 раза пролиферативной активнос-ти у представителей ПЦС (рис. 1).

Таким образом, наши исследования показывают, что у 77,7% населения ПЦС развивается субклинический дефицит цинка, в 50-60 % случаев снижаются показатели клеточного звена иммунной системы и фагоцитарной активности нейгрофилов. Другая часть населения резистентна к действию геохимически обусловленного дефицита цинка.

С целью исследования значения генетических факторов в реагировании иммунной системы на геохимически обусловленный дефицит цинка нами проведено изучение иммуногс нстической структуры населения цинвдефицитного и контрольного субрегионов.

Частоты наиболее распространенных в исследуемой популяции HLA-ангигенов I класса приведены в таблице 2, из которой видно, что у жителей ПЦС чаще встречаются антигены А28 и В15, редко выявляется антиген В17.

Таблица 2

Частота распределения НЬА - антигенов I класса в чувашской популяции среди жителей пшпсдефицитного и контрольного субрегионов

HLA-анги-ген Чувашская популяция в целом (п=224) Жители контрольного субрегиона (п=111) Жители цинкдефицитного субрегиона (п=113)

Частота антигена, % Частота гена Частота антигена, % Частота гена Частота антигена, % Частота гена

А2 35,0 0,1938 40 0,2255 30,1 0,1639

A3 22,7 0,1634 36 0,2000 24,7 0,1323

А9 30,0 0,1006 18 0,0945 20,3 0,1073

А28 17,8 0,0934 12,6 0,0651 23* 0,1225

В5 12,5 0,0065 И,7 0,0614 13 0,0683

В7 18,3 0,0962 19,8 0,1045 16,8 0,0879

В12 15,17 0,0790 10,8 0,0556 19,4 0,1022

В15 15,6 0,0815 10,8 0,0556 20,3* 0,1073

В16 12,05 0,0622 13.5 0,0700 10,6 0,0545

В17 10,71 0,0657 15,3 0,0797 6,2* 0,0315

В35 12,1 0.0622 15,3 0,0797 8,8 0,0450

Примечание. * - рв^И^ОЗ - в сравнении между жителями цннкдефицнтного и контрольного субрегионов.

Изучение частоты распределения генов HLA П класса проводилось на основе типирования HLA-генов DRB1, DQA1 и DQB1. В таблице 3 приведены значения частот некоторых аллелей этих генов, 1 по которым были выявлены различия в изучаемых популяциях. При

титровании гена HLA-DRB1 в исследуемой популяции в целом идентифицированы 12 аллелей У населения ПЦС достоверно реже встречался аллель * 13 (06) и выявлялся отсутствующий в контроле аллель * 14(06) с частотой 0,055. При типировании гена DQA1 были идентифицированы 8 аллелей. У населения ПЦС аллель *0202 отсутствовал вовсе, в то время как *0301 встречался почти в два раза чаще. Из 11 идентифицированных в исследуемой популяции в целом аллелей на территории ПЦС не обнаруживались *0305, *0401, * 0601. В условиях природного дефицита цинка генная частота по аллели *0502 существенно превышала таковую в контроле, а аллель *0602 встречался реже.

Таблица 3

Частота распределения аллелей НЪА - БКВТ, 1)(}А1, 0(}В1 в чувашской популяции среди жителей цинкдефицитного и

Аллель Чувашская популяция в целом (N=76) Жители контрольного субрегиона (N=40) Жители цинкдефицигног о субрегиона (N=36)

n частота аллеля п частота аллеля п частота аллеля

HLA-DRB1*01 25 0,1644 13 0,1625 12 0,1666

HLA-DRB1*04 18 0,1184 6 0,0750 12 0,1666

HLA- DRB1*13(06) 21 0,1381 15 0,1875 6 0,0833*

HLA- DRB1* 14(06) 4 0,0263 0 0 4 0,0555*

HLA- DQA1*0202 2 0,0131 2 0,0250 0 0

HLA- DQA1*0301 27 0,1776 10 0,1250 17 0,2361*

HLA- DQB1*0302 8 0,0526 0 0 8 0,1111*

HLA- DQB1*0305 4 0,0263 4 0,0500 0 0

HLA- DQB1*0401 1 0,0066 1 0,0120 0 0

HLA- DQB1*0402 1 0,0066 0 0 1 0,0138

HLA- DQBl*0502/4 10 0,0658 2 0,0250 8 0,1111*

HLA- DQB1*0601 1 0,0065 1 0,0120 0 0

HLA- DQB1*0602-8 30 0,1973 21 0,2625 9 0,1250*

Широкое распространение у населения цинкдефицитного субрегиона НЬА-А28, НЬА-В15, НЬА-0(ЗА1*0301, HLA-DQB 1*0502/4 и присутствие НЬА- БС^В 1*0302 может свидетельствовать о их селективном преимуществе в процессе адаптации к условиям недостатка цинка в среде обитания. Снижение частот генов НЬА-В17, НЬА- БИВ 1*13(06), НЬА- БС>В 1*0602-8 в популяции, проживающей

на цинкдеф и цитной территории, напротив, свидетельствует о низкой адаптивной способности его носителей к условиям природного дефицита цинка, что привело к элиминации данных генов в процессе эволюции.

Наибольшее значение для анализа генетической структуры популяции имеют устойчивые гаплотипические сочетания, которым свойственно достоверное положительное неравновесное сцепление (Зарецкая Ю.М., Абрамов В.Ю., 1986). К таким HLA-галлогипам в популяции контрольного субрегиона относятся гаплотипы АЗ-В7 (Н = 389, D = 255, рр2 = 0,046), A3-B35 (Н = 372, D = 270, р^р 0,005) и А28-В17 (Н = 293, D = 241, рр2 = 0,005)л. Для населения ПЦС характерны гаплотипы А2-В12 (Н = 478, D = 311, pF2= 0,008) и АЗ-В7 (H = 313, D = 214, Pf2 = 0,027). Общим для популяций обоих субрегионов является АЗ-В7 гаплотип, являющийся одним из иммуногенетических маркеров европеоидной расы. По мнению W. Bodmer и J. Bodmer (1978), проявление неравновесного сцепления в случае стабильного состояния популяции обусловлено действием естественного отбора. Неравновесное сцепление обеспечивает наиболее благоприятное взаимоотношение с окружающей средой. Набор аллельных вариантов HLA-генов, характеризующихся наибольшей частотой в популяции, является отражением процессов адаптации к условиям ее проживания.

Для популяции, проживающей на цинкдефицитной территории, специфичен гаплотип HLA-A2-B12. В то же время у ее представителей отсутствует достоверное неравновесное сцепление для пар аллелей HLA-A3-B35 и А28-В17, характерных для населения контрольного субрегиона. Видимо, А2-В12 является преадаптивным гаплотипом, накапливающимся в популяции, населяющей цинкдефицитный субрегион, тогда как для гаплотипов A3-B35 и А28-В17, по-видимому, не обеспечивающих в условиях природного дефицита цинка необходимого порога компенсаторно-приспособительных реакций, наблюдался процесс элиминации.

Чтобы ответить на вопрос, имеется ли связь изучаемых HLA-маркеров с показателями иммунного статуса, исследуемую популяцию здоровых людей разделили на 2 группы: одна объединила индивидов с наличием соответствующего маркера, другая - без такового (табл. 4).

А Н - частота гаплотипа ( х 10 000), Б - величина неравновесного сцепления ( х 10 000), рК2 _ достоверность по двустороннему точному методу Фишера для четырехпольных таблиц.

Лица, НЬА-профиль которых отличался присутствием га плотила НЬА-А2-В12, имели достоверно более высокие значения относительного числа Т-хелперов и иммунорегуляторного индекса. В группе индивидов, несущих гаплотип НЬА-А3-В7, отмечены достоверно более высокие показатели экспрессии лимфоцитами рецепторов к ТЬ-2 (СБ25) и трансферрину (СБ71). Высокие значения абсолютного числа лимфоцитов и показателей экспрессии рецепторов к трансферрину были ассоциированы с наличием в генотипе обследованных ОС>В1 0602. НЬА-ОЛВ1 13(06)- позитивные лица имели большие цифры процентного содержания эозинофилов.

Таблица 4

Генетические маркеры НЬА и отдельные параметры иммунного статуса здоровых людей (л=69)

Генетический маркер Показатель иммунного статуса Значение показателя в присутствии генетического маркера Значение показателя в отсутствии генетического маркера Р

HLA-A2B12 CD4\ % CD4'/CD8+ 51,0±12,2 2,40±0,64 36,2±6,9 1,56±0,38 0,040 0,037

HLA-A3B7 CD25+, % CD 2 5", абс. CD71+, % CD71+, абс. 11,0±4,3 250±80 12,0±5,4 272±112 5,8±2,4 111±59 5,4±2,8 104±67 0,046 0,003 0,028 0,019

HLA- DQB 1*0602-8 лимфоциты, абс. CD71*, % CD71+, абс. 2204±237 8,6±2,7 188±58 1805±457 5,0±2,7 94±63 0,046 0,005 0,002

HLA-DRB113 эозинофилы % 3,8±0,8 2,3±1,3 0,030

Примечания: абс. - абсолютное значение (х 106 клеток/л);

р - степень достоверности различия значения показателя по критерию Стьюдента.

Таким образом, специфический для здоровой популяции цинкдефицитной территории преадаптивный гаплотип НЬА-А2В12 ассоциирован с высокими показателями относительного числа С04+-лимфоцитов и иммунорегуляторного индекса.

Субклинический дефицит цинка обусловливает снижение инфекционной резистентности и создает фон для развития инфекций респираторного тракта в связи с тем, что органы дыхания в силу анатомо-физиологических особенностей, испытывая постоянную антигенную нагрузку, наиболее чувствительны к иммунным нарушениям. Этим объясняется высокая распространенность инфекционно-воспалительных заболеваний легких на территории цинкдефицитного субрегиона Чувашии

Под нашим наблюдением находились 60 больных хроническим бронхитом (40 - из ПЦС, 20 - из контрольного субрегиона) и 75 -впервые выявленным туберкулезом легких (50 - из ПЦС, 25 - из контрольного субрегиона). В обследуемые группы вошли 54 больных об структивным хроническим бронхитом, 6 - необструктивным хроническим бронхитом. В составе обследованных больных с впервые выявленным туберкулезом легких были 69 больных с инфильтратив-ной формой, 2-е очаговым туберкулезом и 4 - с диссеминированным туберкулезом легких.

Обращали на себя внимание различия в клинических проявлениях заболевания в зависимости от принадлежности больных к тому или иному субрегиону. Так, у больных из контрольного субрегиона обострения хроническим бронхитом протекали более остро, с повышением температуры тела до субфебрильных (в 35 % случаев), в ряде случаев (у 2-х больных из 20 обследованных) - до фебрильных цифр. Обострение хронического бронхита у жителей ПЦС имело вялое течение, редко (лишь у 12,5 % больных) сопровождалось повышением температуры до субфебрильных цифр. У больных этой группы воспаление чаще носило гнойный характер, нередко имелись признаки полостного синдрома, обусловленные развитием такого осложнения, как вторичные бронхоэктазы.

Острое начало заболевания, в половине случаев с повышением температуры тела до фебрильных цифр, заставляло больных туберкулезом легких из контрольного субрегиона активно обращаться за медицинской помощью. В то же время в условиях естественного дефицита цинка туберкулез развивался постепенно, без выраженных симптомов, чаще на фоне субфебрилитета, при этом заболевание часто (в 56 % случаях) впервые выявлялось на профосмотре.

Независимо от геохимических условий иммунный статус больных хроническим бронхитом отличался от такового у здоровых лиц уменьшением числа лимфоцитов (процентного значения), нейгрофилов, депрессией Т-клеточного иммунного ответа (уменьшение числа Т-лимфоцитов, снижение иммунорегуляторного индекса и

ФГА-стимулированной пролиферации лимфоцитов), а также снижением фагоцитарной активности нешрофилов. Как у больных ПЦС, так и в контрольной группе больных выявлялись признаки активации гуморального звена иммунного ответа, о чем свидетельствовало, повышение уровня ^А.

Вместе с тем, у больных хроническим бронхитом, проживающих в субрегионе с недостатком цинка, выявлялись и некоторые «новые» черты иммунопатологии, отсутствовавшие у больных контрольного субрегиона. Во-первых, обострение хронического бронхита в условиях дефицита цинка протекало на фоне нейтрофильного лейкоцитоза, в то время как у больных контрольного субрегиона число лейкоцитов не отличалось от показателя здоровых. Во-вторых, у больных ПЦС наблюдалось сокращение численности клеток, экспрессирующих ранние активационные маркеры - СБ25 и СБ71, в то время как у больных контроля обнаруживалось снижение экспрессии лишь ГЬ-2-рецепторов (С025). В-третьих, в отличие от контрольного субрегиона, обострение хронического бронхита в условиях дефицита цинка сопровояедалось уменьшением числа 'ЫК (С016^-клеток).

На первый взгляд, характер изменений иммунного статуса при туберкулезе легких напоминает черты иммунопатологии хронического бронхита. Так, у больных туберкулезом, проживающих в контрольном субрегионе, снижено содержание клеток Т-популяции и ее иммуноре-гулятортшх субпопуляций в процентных значениях. Так же, как и при хроническом бронхите, присутствуют признаки активации гуморального звена иммунной системы. Однако, помимо указанных сдвигов, в иммунном статусе у больных туберкулезом появились специфические черты - это рост экспрессии акгивационных маркеров на МНК, свидетельствующий о повышении активации (СБ25), пролиферации (С071) и дифференцировки (ЖА-ОЯ) клеток. В отличие от хронического бронхита, при туберкулезе иммунорегулягорный индекс сохранялся на уровне значений здоровых. Приведенные данные говорят об активации функции Т-лимфоцитов, отражающей реакцию иммунной системы на микобактерии туберкулеза (МБТ).

Характер иммунологических расстройств у больных туберкулезом, проживающих в цинкдефицигном субрегионе, в целом повторял основные черты иммунопатогии туберкулеза контрольного субрегиона. При этом у больных цинвдефицитной группы более выражены, чем в группе сравнения, лейкоцитоз и нейгрофилез, а относительное число лимфоцитов, напротив, уменьшено. К дефициту цинка наиболее чувствительна популяция Т-хелперов: их число

значительно уменьшено (22,5±4,0 % - в ПЦС и 31,5±9,5 % - в группе контроля), что отражалось на снижении иммунорегулягорного индекса (СБ4+/СВ8+) до 1,2+0,2 (в контрольной группе больных -1,6±0,6, р<0,001).

Большую информацию о функциональной активности Т-системы дает изучение экспрессии маркеров активации - СБ25, С071, ЖАБР.. У больных цинкдефицигной территории наблюдалось существенное снижение экспрессии всех указанных антигенов, медианы процентного содержания которых представлены в виде столбцов на рис. 2. Кроме того, в этой же группе отмечалось достоверное (рш.и<0,001)

QK он хр о ль кы й субр егион ВЦтгкхдефицнтный субрегион

*

W0L * Н^В

яг ggggj m ir

CD2J* CD71* HLA-DR* CD 95+ рШ11< 0,001

Рис. 2. Уровни активированных клеток у больных инфильтративным туберкулезом легких

уменьшение содержания медиатора Т-клеточного иммунитета - ИФН-у и увеличение показателей СЮ95+-клеток, медианы которых составили 27 % и 589 х10б/л соответственно против 13% и 310х106/л в группе сравнения (р<0,001). Интегральным показателем функциональной активности Т-лимфоцитов служит уровень пролиферации лимфоцитов в ответ на стимуляцию ФГА, который был вдвое ниже у больных ПЦС (индекс стимуляции в РБТЛ составил 9,84±6,87 в ПЦС и 24,67+9,17 в контроле, р<0,01).

В результате корреляционного анализа показателей иммунного статуса и содержания микроэлементов у больных инфекционно-воспалительными заболеваниями легких обнаружилась обратная корреляционная связь значений индекса медь/цинк с процентным числом Т-лимфоцитов (rs = - 0,70) и уровнем ИФН-у (rs = - 0,58). В условиях геохимически обусловленного дефицита цинка происходило

значительное повышение индекса медь/цинк у больных хроническим бронхитом и туберкулезом легких, в то время как в контрольном субрегионе этот индекс практически оставался без изменения. Van Weyeriberg и соавт. (2004) предлагают рассматривать индекс медь/цинк как отражение отношения функции Thl к функции Th2. Авторы расценивают повышение индекса медь/цинк как индикатор ослабления функции Thl.

В здоровой популяции контрольного субрегиона, где обеспечивается нормальное функционирование иммунной системы, 80% частностей индекса медь/цинк, входящих в диапазон от 10 до 90 перцснтилей, колебались в пределах от 0,63 до 1,26. Видимо, превыше- i

ние этого предела следует рассматривать как отражение дисбаланса уровней цинка и меди, отрилдтельно сказывающегося на функционировании иммунной системы - ослаблением Т-клеточной функции. * Обострение хронического бронхита у 28 % жителей контрольного субрегиона сопровождалось повышением рассматриваемого индекса выше 1,26. Что касается ПЦС, то у 88,6 % здоровых жителей и 90,3% больных индекс медь/цинк был повышен относительно референтного предела. Соответственно у большинства из них снижены показатели клеточного типа иммунного ответа, связанного с функцией ТЫ.

Итак, суть изменений, происходящих в иммунном статусе больных инфекционно-воспалительными заболеваниями легких, сводится к угнетению функции клеточного звена иммунной системы и фагоцитарной активности нещрофилов. У больных, проживающих в условиях естественного дефицита цинка, усугубляются выявленные иммунные нарушения и, помимо этого, появляются новые черты иммунопатологии - преобладание маркера отрицательной активации (CD95) над позитивными (CD25, CD71, HLA-DR), увеличение числа нейзрофилов, повышение активности гуморального иммунитета, i

имеющие видимо компенсаторный характер в условиях сниженной Т-клеточной функции. Однако они не в состоянии обеспечить полноценный иммунный ответ. Свидетельством тому является неблаго- f

приятное течение хронического бронхита и туберкулеза легких - вялый, затяжной воспалительный процесс, склонность к деструкции, торпидность к лечению. Выявленные особенности в иммунном статусе больных ПЦС мы связываем с дисбалансом гомеостаза меди и цинка. Нарушение клеточной функции, имеющей обратную корреляцию с индексом медь/цинк, можно рассматривать как одно из патогенетических звеньев инфекционно-воспалигельных заболеваний легких в условиях геохимически обусловленного дефицита цинка.

Из литературных источников известно об отрицательном влиянии на иммунную систему людей лечения противотуберкулезными препаратами (стрептомицин, рифампицин). Данные в отношении иммунодепрессивного эффекта изониазида противоречивы (Александрова А.Е., 1987: Шес1ег М.1, 1993). В связи с этим мы провели собственные исследования по влиянию основных аигимикобактери-альных препаратов на пролиферативную активность Т-лимфоцигов, с функцией которых связано формирование протективного иммунитета при туберкулезе. Исследования проводили в двух сериях: первую - на МНК здоровых людей, вторую - на МНК больных с впервые выявленным туберкулезом легких. Медианы индекса стимуляции в реакции митогенстимулированной лимфопролиферации в присутствии противотуберкулезных химиопрепаратов представлены в виде столбиков на рис. 3. из которого видно, что в первой серии исследований наименьшее значение индекса стимуляции получено при добавлении в культуру лимфоцитов рифампицина (р,„<0,01) Влияние стретомицина и изониазида на пролиферативную активность лимфоцитов здоровых было не существенно Результаты второй серии исследований показали, что МНК больных туберкулезом легких были чувствительны ко всем добавляемым в культуральную среду противотуберкулезным препаратам и отвечали на их введение достоверным снижением пролиферативной активности.

10ФГА

2НФГА+*.1уепгоыицин

ЗИФГА+рифнмпкцик

4НФГА+юокиазид

2 3 б

ИС—индекс стимуляции; ** р„<0,01 — достоверность различия (парный тест Вилкоксона) индекса стимуляции по сравнению со значением в культуре без добавления химиопрепарата

Рис. 3. Влияние противотуберкулезных препаратов на ФГА-индуцир ов анную пролиферацию лимфоцитов: а - здоровых людей; б - больных с инфильтративным туберкулезом легких

Таким образом, наши исследования демонстрируют неоднозначное действие противотуберкулезных химиопрепаратов на функциональную активность Т-лимфоцитов здоровых людей и больных туберкулезом. Постоянным был эффект лишь у рифампицина, который в одинаковой степени снижал ФГА-стимулированную пролиферацию и у здоровых, и у больных, в то время как другие лекарственные средства - стрептомицин и изониазид - проявляли отрицательное действие на активность лимфоцитов у больных, но не у здоровых лиц. На сегодня нет ясного, научно обоснованного представления о механизмах угнетающего действия химиопрепаратов на функциональную активность ИКК. Легче всего объяснить действие этих лекарств на клетки иммунной системы их метаболическим эффектом. Вместе с тем нельзя оставить без внимания данные о способности стандартных антимикобакгериальных препаратов вызывать алоптоз ИКК (0д1 Б. е1 а!., 2003). Можно предположить, что химиопрепараты реализуют свое иммунодепрессирующее действие на иммунную систему через ускорение программированной гибели клеток. Вероятно, клетаи больных людей менее устойчивы к апоптогенному действию лекарств из-за исходно повышенной их готовности к программированной гибели. При туберкулезе легких повышенная готовность МНК к апопгозу может быть обусловлена действием МБТ, повышенным уровнем ФНО-а, усилением продукции глюкокортикостероидов и других алоптогенных факторов.

Таким образом, инфекционно-воспалительные заболевания легких в условиях 1фиродного дефицита цинка имеют неблагоприятное течение, ассоциированное с исходным снижением клеточных функций, которое усугубляется алопгозом ИКК и полихимиотерапией. Лечение таких больных лишь антимикробными средствами малоэффективно. Итогом поиска эффективных методов иммунокоррекции инфекционно-воспалигельных заболеваний легких явилась разработка нами нового способа лечения больных этого контингента, что легло в основу оформленного нами патента на изобретение «Способ лечения туберкулеза легких» (приоритет от 02.08.2004). Предложенный нами способ отличается тем, что в схему комплексного лечения дополнительно к стандартной терапии включается сульфат цинка в суточной дозе 2,3 - 3,45 мг/кг двух-трёхкратным приемом внутрь курсом 21-28 дней при туберкулезе легких, в период интенсивной терапии на фоне адаптации к противотуберкулезным препаратам. При хроническом бронхите сульфат цинка следует применять с 3-4-го дня после назначения базисной терапии, курс лечения - 10-21 день

(в среднем две недели) в зависимости от сроков достижения клинической ремиссии.

Выбор дозировки препарата осуществлялся с ориентацией на «биотические» концентрации, близкие к физиологическим потребностям организма в цинке. Основанием для назначения сульфата цинка явилось его модулирующее влияние на ФГА-индуцированную лимфо-пролиферацию больных инфекционно -в оспалительными заболеваниями легких: при добавлении сульфата цинка (50 мкМ Zn2+) в среду культивирования у жителей ПЦС медиана индекса стимуляции достоверно повышалась, в то время как в контрольной группе, напротив, снижалась. Мы проводили предварительную оценку in vitro чувствительности МНК больных к сульфату цинка и назначали препарат лишь тем пациентам, у которых прирост индекса стимуляции в ответ на введение этого соединения в культуру клеток составлял не менее 20 % Больных, МНК которых были инертны к добавлению Zn2+, вели на обычно используемой стандартной терапии.

С целью изучения эффективности применения сульфата цинка в комплексном лечении больных хроническим бронхитом и туберкулезом легких мы провели параллельное обследование двух подгрупп в каждой группе больных. Пациенты одной подгруппы (подгруппа сравнения) получали общепринятую стандартную терапию (при хроническом бронхите - антибиотики, бронхолитики, муколитики, отхаркивающие средства, при туберкулезе легких - противо-микобактериальные препараты - изониазид, рифампицин, этамбутол, пиразинамид). Вторая подгруппа больных кроме стандартного набора препаратов получала сульфат цинка (основная подгруппа). Эффективность препарата оценивали на основании сравнительного анализа динамики клинико-лабораторных показателей до и после проведения курса лечения.

При применении комплексного лечения, включающего сульфат цинка, в 95 % случаев достигнут положительный клинический эффект, причем у 1/3 больных со значительным улучшением. При лечении обычно принятыми средствами улучшение клинического состояния достигнуто лишь у 75 %, в то время как у 25 % клинический эффект отсутствовал. Срок достижения клинической ремиссии на фоне применения сульфата цинка сокращался на 2,5 дня.

Применение сульфата цинка при туберкулезе легких также существенно повышало эффективность лечения. В подгруппе сравнения к концу двухмесячного стационарного лечения абациллирование достигнуто лишь у 63,1±11,0 % больных, закрытие полости произошло лишь у одного больного. Больные предъявляли различные жалобы

(на кашель, потливость, общую слабость) в течение 32,3±6,3 дней. Туберкулезная интоксикация у преобладающего большинства больных исчезла через 4 мес. лечения. Количество койко-дней в интенсивной фазе лечения у больных этой группы составило 103,3±9,3 дней. В основной подгруппе анализируемые показатели интенсивной фазы лечения были намного лучше, что проявлялось в большем проценте закрытия каверн и абациллирования Кроме того, в этой группе на 15 дней раньше прекращались жалобы, на 5,6 дней меньше держалась повышенная температура тела, туберкулезная интоксикация прошла через 3 мес. В результате пребывание больных в стационаре на интенсивной фазе лечения сократилось, по сравнению с группой сравнения, на 28 дней и составило 75,1 ±4,3 койко-дней.

Наблюдение больных в фазе продолжения лечения показало, что в основной подгруппе к концу четвертого месяца амбулаторного лечения процент закрытия полостей достиг уровня 69,5±9,5 %, в то врет как в подгруппе сравнения к этому периоду произошло закрытие полостей лишь у 20,8±8,2% больных. В группе, получавшей сульфат цинка, у одного больного наблюдалось бацшгловыделение к концу шестого месяца лечения, в то же время в группе больных, не получавших сульфат цинка, бацилловыделение к этому сроку сохранялось у 4 пациентов.

К 28 дню лечения туберкулеза легких у больных основной подгруппы обнаружена положительная динамика исходно измененных показателей иммунного статуса. В частности, достоверно уменьшились средние значения содержания лейкоцитов (с 8472±3515 до 6888±1824х10б/л, р<0,05) нейгрофилов (с 5713±2912 до 4109±1486х106/л, р<0,01). Напротив, числа лимфоцитов, Т-лимфоцитов и Т-хелперов достоверно увеличились с 26,7±8Д% до 34,6±6,8 % (р<0,001), с 41,7±7,3 % до 51,6±5,9 % (р<0,001) и с 23,0±4,9 % до 33,7±6Д% (р<0,001) соответственно, приблизившись к соответствующим значениям здоровых людей цинкдефицитного субрегиона. Ликвидировался дисбаланс иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов: иммунорегуляторный индекс вырос с исходного уровня 1,2±0,2 до 1,7±0,5 (р<0,001), несколько превысив значение аналогичного показателя в здоровой популяции контрольного субрегиона (1,58± 0,31). Улучшение количественных параметров Т-системы сопровождалось повышением ФГА-иидуцированной лимпролиферации (с 10,2±5,7 до 23,8±13,1, р<0,05). Фагоцитарный индекс, первоначально равнявшийся 47,2±9,3, также повысился в процессе лечения цинксодержащим препаратом и составил 51,7±9,6 (р<0,001). Исходно повышенная активность гуморального звена иммунной системы

снизилась, о чем свидетельствовало уменьшение концентраций ЦИК (с 23,2±7,9 до 17,4± 8,8 у. ед., р<0,01) и IgG (с 14,6*3,1 до 13.3±3,5 г/л, р<0,05) в сыворотке крови больных.

Другая ситуация наблюдалась в подгруппе сравнения, где преобладающее большинство иммунологических показателей не претерпело существенных изменений в процессе лечения. Не был торпиден к лечению лишь гуморальный тип иммунного ответа: достоверно уменьшилась концентрация IgA, проявлял тенденцию к снижению уровень ЦИК.

Сопоставление показателей экспрессии маркеров активации на МНК больных до и после лечения показало, что в основной подгруппе число клеток, несущих CD25, CD71 и HLA-DR, не изменилось в процессе лечения Однако экспрессия другого активационного маркера - Fas достоверно снизилась- медиана процентного значения CD95+-клеток уменьшилась с 30 до 19 % (pw= 0,00006)

Изменения уровня экспрессии активационных маркеров в подгруппе сравнения носили более выраженный характер. Так, у больных данной подгруппы снижалась в ходе лечения экспрессия маркеров ранней активации - CD25, CD71 на лимфоцитах Вместе с тем у этих больных повышалась экспрессия CD95.

Динамика содержания цитокинов также была благоприятней в группе, получавшей сульфат цинка, что проявлялось в статистически значимом повышении сывороточных уровней ИФН-у и ИЛ-8 У больных группы сравнения содержание ИФН-у. напротив, достоверно снижалось к моменту второго исследования. Параллельно уменьшалась концентрация ИЛ-4.

В процессе лечения хронического бронхита в основной подгруппе, получавшей на фоне базисной терапии сульфат цинка, увеличилось общее число лимфоцитов при относительном уменьшении численности нейгрофилов. Абсолютное число СОЗ+-яимфоцитов возросло на 90%, а их хелперной субпопуляции - в 2,34 раза, причем после лечения значение числа CD4+-k.tctok, соответствующее нижнему квартилю, оказалось на 48% выше исходного значения верхнего квартиля. Наряду с этим повышалось абсолютное значение цитотоксических лимфоцитов, относительное число оставалось на исходном уровне. Преобладание увеличения числа Т-хелперной субпопуляции отразилось на нммунорегуляторном индексе, который увеличился на 34,6% от исходного уровня. Отмечено повышение исходно сниженной экспрессии маркеров позитивной активации клеток: абсолютные значения содержания CD25+-, CD71+- и HLA-DR+-клеток повысились соответственно в 2,3, 1,86 и 1,8 раза от исходных

значений. В то же время экспрессия Fas-рецептора апоптоза в процессе лечения существенно не менялась. Позитивный исход активации иммуноцитов под влиянием сульфата цинка, вероятно, определяется не только его прямым стимулирующим эффектом, но и опосредованным действием через повышение уровней ростовых факторов - ИФН-у и ИЛ-2 (об увеличении последнего свидетельствует нарастание экспрессии ИЛ-2- рецепторов).

Убедительным свидетельством роста позитивного активационного потенциала клеток у больных, получавших сульфат цинка, является повышение ФГА - индуцированной пролиферативной способности лимфоцитов in vitro (медиана индекса стимуляции повысилась с 14,6 до 29,0,^0,01).

Помимо влияния на показатели Т-системы иммунитета, сульфат цинка приводил к изменению и других звеньев иммунной системы больных хроническим бронхитом. На 76% от исходного уровня повышалась абсолютная численность натуральных киллеров. Медиана уровня IgA уменьшилась с исходного уровня 3,2 до 2,2 г/л (pw<0,001). Со стороны фагоцитарного звена иммунитета у больных, получавших сульфат цинка, зафиксировано существенное повышение фагоцитарного индекса, а значение, соответствующее Р25 этого показателя, в динамике лечения даже превысило верхний уровень исходного интервала Р25 - Р75. Помимо этого, достоверно (^<0,05) увеличился уровень ИЛ-8.

В отличие от больных основной подгруппы, у пациентов, получавших традиционное лечение, каких-либо существенных иммунологических сдвигов не наблюдалось. Практически все показатели оставались на исходных уровнях. Увеличились лишь абсолютные числа Т-лим-фоцигов и СБ71+-клеток, а также концентрация сывороточного Ig М

В целом, характер изменений иммунного статуса у больных инфекционно-воспалительными заболеваниями легких под влиянием лечения цинксодержащим препаратом сводился к восстановлению исходно сниженной Т-клеточной функции. Количественный рост популяции Т-лимфоцитов и ее хелперной субпопуляции сочетался повышением митогениндуцированной пролиферации, экспрессии маркеров ранней активации, а также уровней цигокинов ИФН-у, ШТ-2, связанных с функцией Thl. Улучшение Т-клеточно-опосредованного типа иммунного ответа приводило к заметному снижению активности ее гуморальной составляющей (уменьшение концентрации ЦИК, сывороточных иммуноглобулинов).

Установленный клинико-иммунолопгческий эффект применения сульфата цинка мы объясняем восстановлением гомеостаза цинка и меди в организме. В процессе лечения медиана сывороточного цинка

выросла с 52,3 до 70,3 мкг/дл (pw = 0,00006) при туберкулезе легких и с 52,6 до 88,3 мкг/дл (pw<0,001) при хроническом бронхите Хотя изменения содержания меди в сыворотке крови были несущественны, значительно снизились медианы индекса медь/цинк (с исходного 1,89 до 1,17 к концу лечения при туберкулезе легких и с 1,77 до 0,96 при хроническом бронхите), приблизившись к уровню соответствующего показателя у здоровых контрольного субрегиона, составляющему 0,81. В группе же больных, не получавших сульфат цинка, не произошло заметной положительной динамики как иммунологических показателей, так и содержания изучаемых микроэлементов.

Устранение дефицита цинка, вероятно, тормозит апоптоз активированных клеток, свидетельством тому является преобладание в гр5тше больных, леченных препаратом цинка, экспрессии маркеров позитивной активации и повышения митогениндуцированной лимфо-пролиферации на фоне снижения уровня клеток, несущих рецептор апоптоза Fas.

ВЫВОДЫ

1. Наиболее ранними, доклиническими проявлениями естественного дефицита цинка, связанного с его снижением в пищевой биогеохимической цепи «почва - вода - растения», являются иммунологические нарушения. 2 Реакция иммунной системы человека на природный дефицит цинка находится под контролем HLA-комплекса. Специфическими чертами HLA-профиля, отражающими адаптивные процессы в отношении геохимически обусловленного дефицита цинка, являются высокая представленность в нем HLA-A28, В15, DQA1*0301, DQB 1*0502/4, присутствие аллеля HLA- DQB1+0302 и галлотипа с достоверно положительным неравновесным сцеплением - HLA-A2-B12 на фоне низкой частоты HLA-B17, HLA- DRJB1*13(06), HLA- DQBl*0602-8 маркеров.

3. Естественный дефицит цинка, реализующийся в организме в дисбалансе медь/цинк, вызывает уменьшение числа Т-лимфоцитов, преимущественно хелперной субпопуляции, снижение ФГА-ицдуцированной лимфопролиферации и экспрессии маркеров позитивной активации, увеличение количества клеток, несущих антиген CD95, а также снижение фагоцитарной активности нейтрофилов.

4. Негативные по HLA-A2-B12 лица здоровой популяции цинкдефицитной территории имеют повышенный риск развития иммунной недостаточности и инфекционно-воспалительных

заболеваний легких; лица с присутствием галлотипа HLA-A2-B12, ассоциированного с высокими показателями относительного числа СБ4+-лимфоцигов и иммунорегуляторного индекса, имеют наименьший риск развития иммунодефицитных состояний

5. В регионе естественного дефицита цинка инфекционно- . воспалительные заболевания легких характеризуются повышенной распространенностью, летальностью, неблагополучным течением и быстрым прогрессированием.

6. Иммунный статус больных с инфекционно-воспалтельными заболеваниями легких на цинкдефицитной территории отличается более выраженным, по сравнению с показателями больных контрольного субрегиона, Т-клеточным иммунодефицитом и снижением фагоцитарной активности нейтрофилов на фоне преобладания экспрессии на лимфоцитах маркеров отрицательной активации над позитивными и активации гуморального звена иммунной системы. Специфическим звеном патогенеза инфекционно-воспалительных заболеваний легких в условиях природного недостатка цинка является дисбаланс гомеостаза цинка и меди, отрицательно влияющий преимущественно на Т-клеточное звено иммунной системы.

7. Сульфат цинка (в концентрации 50 мкМ в пересчете на элементарный цинк) оказывает иммуномодулирукяций эффект in vitro.

8. Включение сульфата цинка в комплексное лечение больных инфильтратявным туберкулезом легких и хроническим бронхитом приводит к увеличению числа Т-лимфоцитов, повышению их пролиферативной активности, снижению активационного апоптоза, повышению фагоцитарной активности нейтрофилов и сопровождается выраженным клиническим эффектом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В здоровой популяции людей следует выделять группы риска по развитию иммунодефицитного состояния, связанного с низким содержанием цинка в объектах среды обитания.

2. Использовать индекс медь/цинк для оценки Т-клегочных функций иммунной системы Повышение этого показателя выше 1,26 рассматривать как индикатор угнетения Т-клеточного типа иммунного ответа.

3. Использовать иммуногенетические исследования для формирования дифференцированных групп риска развития иммунной недостаточности у жителей цинкдефицитной территории с выделением труппы повышенного риска, включающей

индивидов с отсутствием в HLA-комплексе А2-В12, и группы сниженного риска, состоящей из позитивных по этому гаплотипу индивидов.

4. В группе повышенного риска развития иммунодефицитных состояний следует проводить профилактику инфекционно-воспалительных заболеваний легких с применением сульфата цинка в количествах (1-1,2 мг/кг/сутки), обеспечивающих суточную физиологическую потребность организма в цинке

5 Сульфат цинка целесообразно использовать в комплексной терапии больных с инфекционно-воспалигельными заболеваниями легких с недостаточностью Т-клеточного звена иммунной системы в суточной дозе 2.30-3,45 мг/кг двух-трёхкратным приемом внутрь (курсом 21-28 дней при туберкулезе легких, в период интенсивной терапии на фоне адаптации к противотуберкулезным препаратам; при хроническом бронхите курс лечения сульфатом цинка составляет 10-21 день).

6. Для прогнозирования эффективности применения препарата цинка у конкретных больных использовать тест in vitro - ФГА-стимули-рованную лимфопролиферацию в присутствии сульфата цинка (50 мкМ Zn24) Прирост индекса стимуляции на 20 % и более считать показанием к назначению препарата.

7. Определение индекса медь/цинк по содержанию цинка и меди в сыворотке крови следует использовать для контроля эффективности лечения инфекционно-воспалительных заболеваний легких. Снижение индекса медь/цинк до 1,26 и ниже следует рассматривать как положительный прогностический признак.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Соколова Е.В., Карзакова Л.М. Изучение иммунного статуса у населения, проживающего на территории Чувашской АССР // Методология, организация и итоги массовых иммунол обследований- Тез. докл. Всесоюз. конф,- Москва-Ангарск,1987,-С.69-70.

2 Михайлова И.В., Карзакова Л.М., Сапожников С.П. Клинико-иммунологическая характеристика хронического бронхита в различных биогеохимических субрегионах Чувашской АССР // Эпидемиология и диагностика неспец заболеваний легких: Межвуз. науч. сб. -Изд-во Сарат ун-та, 1988. - С.135-136.

3. Карзакова ЛМ. Иммунный статус населения в субрегионах Чувашской АССР, различающихся по содержанию цинка в окру-

жающей среде// Интерлейкины и другие медиаторы в клинической иммунологии: Респ. сб. науч тр -М., 1989. - С188-194.

4. Петров Р В, Соколова Е.В., Карзакова Л.М., Сусликов В.Л., Сапожников С.П. Оценка иммунного статуса у населения, проживающего в условиях естественного дефицита цинка // Иммунология. - 1989. - №3. - С.72-75.

5. Карзакова Л М., Соколова Е.В. Взаимосвязь между содержанием цинка, показателями иммунного статуса и бронхолегочными заболеваниями // Первый Всесоюзный иммунологический съезд: Тез.докл, т.П. - Сочи, 1989 -С.213.

6. Сусликов В.Л., Карзакова Л.М.. Саперов В.Н К вопросу об изучении цинкдефицитных зон на территории Чувашской АССР // Микроэлементозы человека: Сб. материал. Всесоюз. конф. - М., 1989.-С. 264-265.

7. Акугинова З.Д., Смыслов В.В , Карзакова Л.М. Биогеохимические факторы и неспецифическая реактивность при туберкулезе в Чувашской АССР // Микроэлементозы человека" Сб. материал. Всесоюз. конф. -М., 1989. - С. 16.

8. Карзакова Л.М Характеристика гуморального звена иммунной системы у жителей Чувашской АССР // Научные достижения -в практику здравоохр.: Тез.докл к науч.-практ. конф. -Чебоксары, 1990. - С.25-27.

9. Карзакова Л.М. Применение сульфата цинка при лечении больных хроническим бронхитом // Научные достижения -в практику здравоохр.: Тез.докл. к науч.-практ. конф. -Чебоксары, 1990. - С.294-297.

10. Карзакова Л.М., Саперов В.Н, Соколова Е.В. Естественный дефицит цинка как фактор риска формирования хронического бронхита // Экологические аспекты иммунопатолсост.: Всесоюз. конф. Тез. докл. - М - Алма-Ата, 1990. - С.35.

11. Карзакова Л.М. Пограничный дефицит цинка // Научные достижения - в практику здравоохр.: Тез.докл. к науч.-практ. конф. - Чебоксары, 1991. - С.31.

12. Тенюков В.В., Карзакова Л.М Влияние галотералии на показатели иммунного статуса у больных хроническим бронхитом и бронхиальной астмой // Всесоюз. конгресс по болезням органов дыхания: Сб. резюме. - Челябинск, 1991 - С.31.

13. Карзакова Л.М, Саперов В.Н., Соколова Е.В. Выявление и коррекция нарушений иммунной системы, обусловленных дефицитом цинка // Науч.-практ. аспекты совр. иммунол. и

аллергол.: Тез. докл I съезда иммунологов и аллергологов Чувашии. - Чебоксары, 1991. - С 14.

14 Саперов В.Н., Карзакова Л.М, Соколова Е.В. К вопросу о дифференцированной иммунотерапии хронических неспецифических заболеваний легких // I Всесоюз. конгресс по болезням органов дыхания" Сб. резюме. - Киев, 1990. - С.335.

15. Михайлова ИВ., Саперов В.Н., Мадянов И.В., Карзакова JIM. Влияние биогеохимических факторов на структуру смертности от ХНЗЛ // 4-й Национ Конгресс по болезням органов дыхания: Сб. резюме. - М, 1994. - С. 1140.

16. Мингалимова Р.Г., Васильева Г.Т., Карзакова Л.М., Усманова Э М Экстракорпоральное ультрафиолетовое облучение крови в комплексной терапии больных туберкулезом легких // Проблемы туберкулеза. - 1995. - №3. - С.27-28.

17. Мусалимова Г Г., Петров В.П., Борисова Л.В., Карзакова Л.М., Ванькина Н Н Особенности распределения антигенов гисгосов-местимости I класса в чувашской популяции // Тез. докл. к науч,-практ. конф врачей-интернов «Актуальные проблемы в клинике внутр. болезней» -Чебоксары, 1998. -С.38.

18. Иванов Л.Н., Ванькина H.H., Карзакова Л.М., Александров Л.А., Тутканов Н.В, Борисова Л.В., Мучукова О.М Особенности иммунного статуса у жителей экологически неблагоприятных территорий Чувашской Республики// 2-й Национ. конгресс РААКИ «Совр. пробл. аллергол. и иммунофарм.»: Сб. тр. - М, 1998.-С.232.

19. Иванов Л.Н., Борисова Л.В., Яздовский ВВ., Карзакова Л.М., Распределение HLA-аихигенов I класса в чувашской популяции // 2-й Национ. конгресс РААКИ «Совр. пробл. аллергол. и иммунофарм.»: Сб. тр. - М., 1998. - С.609.

20 Карзакова Л.М., Борисова Л.В., Ванькина H.H., Мучукова О.М, Мусалимова Г.Г. Особенности распределения аллелей системы гистосовместимости первого класса в популяциях верховых и низовых чуваш // Тез. докл. к науч -практ. конф. «Иммунодефицит, состоян. в клинике внутр болезней». -Чебоксары, 1999. - С.37-38.

21. Сусликов В.Л., Карзакова Л.М., Толмачева Н.В К вопросу о риске СПИДа в Чувашии по материалам эколого-биогеохимического районирования // Материалы науч.-практ конф., посвящ. 10-летию ГУЗ «Респ. центр по проф-ке и борьбе со СПИД» МЗ 4P. - Чебоксары; 1999. - С.72-74.

22. Мусалимова Г.Г., Карзакова JI.M, Борисова JI.B. Изучение HLA-профиля в чувашской популяции. Тезисный доклад к VI съезду иммунологов и аллергологов СНГ. Москва, Россия, 2001. // Аллергология и иммунология - 2001.^г.2.-№2.-С. 101.

23. Акугинова З.Д., Карзакова ДМ., Мохирева Л.В., Еленкина Ж.В.,' Никитина М.И. Сравнительная оценка показателей иммунного статуса у больных туберкулезом легких, проживающих в различных биогеохимических условиях // Туберкулез сегодня: Материалы УП Российского съезда фтизиатров. М, 2003.-C.60-61.

24. Карзакова Л.М. Роль апопгоза в угнетении Т-клеточного иммунитета, обусловленного естественным дефицитом цинка // Патофизиология и современная медицина: Мат-лы Второй международной конф. - М.: Изд-во РУДН, 2004. - С.183-184.

25. Карзакова Л.М. Естественный дефицит цинка и иммунологическая реактивность // Патофизиология и современная медицина: Мат-лы Второй международной конф. - М.: Изд-во РУДН, 2004. -С. 180.

26. Карзакова Л.М The role of apoptosis in T cell immunity depression caused by native zinc deficiency // Патофизиология и современная медицина: Мат-лы Второй межчуна-родной конф. - М.: Изд-во РУДН, 2004. - С. 184-185.

27. Карзакова Л.М. Native zinc deficiency and immnnoreactivity // Патофизиология и современная медицина: Мат-лы Второй международной конф. -М: Изд-во РУДН, 2004. - С 181-182.

28. Карзакова Л.М. Механизмы развития цинкзависимой недостаточности Т-клеточного звена иммунитета // Здравоохранение Башкортостана - 2004. - №4. - С.114-116.

29. Сусликов В Л., Акугинова З.Д., Мохирева Л.В., Карзакова Л.М., Еленкина Ж.В. Особенности противотуберкулезного иммунитета в различных биогеохимических условиях // Вестник Оренбургского гос. ун-та - 2004.-№4. - С.84-85.

30. Карзакова Л.М, Борисова Л.В., Мучукова О.М. Особенности иммунного статуса жителей Чувашии как результат влияния эколого-биогеохимических факторов // Russian Journal of Immunology. - 2004. - V.9 Suppl.1. -p.201.

31. Воронова Г.В., Карзакова ЛМ. Некоторые биогеохимические особенности острой пневмонии на территории Чувашской Республики // Материалы I Международной науч.-пракг. конф. «Биоэлементы» 17-19 июня 2004 г. - Оренбург, 2004. - С.67-69.

32. Геранюшкина Е.И., Карзакова Л.М, Саперов В.Н., Сусликов В.Л. Влияние природного дефицита цинка на иммунный статус

здоровых лид и больных хроническим бронхитом //Материалы I Международной науч-практ конф «Биоэлементы» 17-19 июня 2004 г - Оренбург, 2004. - С 69-71.

33 Сусликов В Л., Карзакова Л.М. Native zinc deficiency and immunoreactivity // Macro and Trace Elements Second Volume: Agricultural, Biological, Environmental, Nutritional and Medical Importance of Macro, Trace and Ultra Trace Elements. - 22.Workshop -Friedrich-Schiller-University, Jena, 2004 -P.1663-1668.

34 Карзакова Л M Естественный дефицит цинка и цитокиновый статус // Материалы I Международной науч.-практ конф «Биоэлементы» 17-19 июня 2004 г - Оренбург, 2004 -С.82-84.

35 Геранюшкина ЕИ, Карзакова Л.М. Особенности иммунного статуса практически здорового населения: в условиях естественного дефицита цинка // Столичное здравоохранение 2004-Материалы науч -практ - Чебоксары, 2004 - С. 22-24

36 Карзакова Л M Дефицит цинка, иммунитет и бронхолегочная патология // Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 2004 - 120 с (монография)

37. Ковальчук Л.В , Сусликов В.Л., Карзакова Л.М., Соколова Е В Иммунная реактивность организма в условиях естественного дефицита цинка // Иммунология. - 2004 - №6 - 336-339.

38 Борисова Л.В , Карзакова ИМ., Яздовский В В HLA - профиль чувашской популяции // Столичное здравоохранение 2004' Материалы науч.-практ - Чебоксары, 2004. - С. 15-16.

39. Карзакова Л.М. Иммунный ответ в условиях естественного дефицита цинка // Тезисы П1 Всемирного конгресса по клинической патологии и реабилитации в медицине -Аллергология и иммунология. - 2005. - Т 6. - №2. - С.316.

40. Карзакова Л.М., Еленкина Ж В., Мохирева Л.В. Изучение Т-клеточной функции иммунной системы у больных с впервые выявленным туберкулезом легких // Тезисы ПТ Всемирного конгресса по клинической патологии и реабилитации в медицине. - Аллергология и иммунология - 2005. - Т.6. - №2. - С 231

41 Карзакова Л.М., Геранюшкина Е.И., Саперов В.Н. Особенности иммунных нарушений при хроническом бронхите в условиях естественного дефицита цинк // Физиология и патология иммунной системы. - 2005. -Т.9. - №1. - С.49-53.

42. Карзакова Л.М, Сусликов В.Л, Мохирева ЛВ , Еленкина Ж.В Способ лечения туберкулеза легких (Решение о выдаче патенза на изобретение от 28 01.05, заявка № 20004123711, приоритет от 02 08 2004).

Методические работы

1. Методическое письмо "Коррекция нарушений иммунной системы, обусловленных дефицитом цинка", утв. Мин-вом здравоохр. Чув. АССР. - Чебоксары, 1990 - 12 с. (Составители: Сусликов B.JI., Ковальчук JI.B., Саперов В.Н., Соколова Е.В., Карзакова JIM.,' Михайлова И.В.).

2. Методические рекомендации «Туберкулез легких в условиях естественного дефицита цинка» для врачей общей практики, фтизиатров и клинических иммунологов, утв. Мин-вом здравоохр. Чув. Респ. - Чебоксары, 2004. - 49 с. (составители: Карзакова JIМ., Мохирева JI.B., Еленкина Ж.В.).

«I

Подписано в печать 29.03.05. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Усл. пен л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ

Чувашский государственный университет Типография университета 428015 Чебоксары, Московский проспект, 15

«

о»

РНБ Русский фонд

2005-4 46372

2 7 АПР 2005

1141

Актуальность темы

В последние десятилетия большое внимание уделялось вопросу, касающемуся массовых иммунологических обследований населения России. Определены средние показатели иммунного статуса здоровых жителей различных регионов страны. Обращает на себя внимание факт широкого варьирования региональных норм, что зачастую связано с неоднородностью обследованных контингентов за счёт содержания в своем составе групп риска из числа лиц, подверженных отрицательному воздействию эколого-географических факторов. Описано отрицательное влияние экстремальных климатических условий, а также избытка тяжелых металлов на функционирование иммунной системы [4, 16]. Однако мало внимания уделяется изучению влияния естественного дефицита микроэлементов, связанного с низким содержанием их в почве, воде, растениях, на здоровье человека в целом и на иммунную систему в частности.

Цинк является одним из незаменимых для человека нутриентом. Ещё в 1869 году J. Raulin показано, что добавление малых количеств солей цинка к культуре Aspergillus Niger благотворно влияет на её рост [211]. Это было первое сообщение о биологической роли микроэлемента. С тех пор ведутся активные исследования по изучению значения цинка для растительных и животных организмов. Цинк необходим для осуществления фундаментальных жизненных процессов. Он выступает кофактором более чем 300 ферментов и факторов транскрипции генов. Этот микроэлемент чрезвычайно важен для развития и роста тканей организма. Нервная, репродуктивная и иммунная системы особенно чувствительны к недостатку цинка. В течение последних 20 лет в разных научных центрах мира велись работы по расшифровке механизмов влияния цинка на функционирование иммунной системы. К настоящему времени получены данные, доказывающие участие цинка в клеточно-опосредованном, гуморальном типах иммунного ответа и фагоцитозе.

Эти результаты явились основанием для причисления цинка к иммунонутриентам [95, 119, 144, 205].

Новый толчок в научных исследованиях в этой области связан с успехами в изучении процесса апоптоза — программированной гибели клеток. Цинк, принимая непосредственное участие в запуске апоптоза, в то же время проявляет себя и как ингибитор апоптоза. Эффект влияния цинка на процессы, происходящие в клетке, дозозависим. К настоящему времени известно, что в каждой клетке организма есть «цинковые» каналы, регулирующие концентрацию внутриклеточного цинка, а следовательно - баланс между жизнью и апоптотической смертью клетки [106, 144, 145].

Дефицит цинка широко распространен в разных регионах мира. В преобладающем большинстве случаев цинкдефицитное состояние (ЦДС) вызывается алиментарной причиной, связанной с низкой обеспеченностью пищевого рациона цинком и/или нарушением усвоения этого биоэлемента. За более чем сорокалетний период, берущий точку отсчета с описания А.Прасадом ЦДС у иранского мальчика (1961г.), исследованы конкретные причинные факторы и механизмы развития дефицита цинка, клинические и лабораторные проявления ЦДС, разработаны методы профилактики и лечения таких состояний. Однако белым пятном в области исследований ЦДС продолжают оставаться вопросы, касающиеся естественного дефицита цинка, связанного с его низким уровнем в биогеохимической цепи «почва - вода -растения». В доступной нам литературе встретилась лишь одна работа, посвященная этой проблеме. Так, в 1982 г. Г.Э.Шинский и соавторы опубликовали данные, демонстрировавшие связь между цинкассоциированными заболеваниями (энтеропатический акродерматит, гнездное облысение, тяжелая форма юношеских угрей) и уровнем содержания цинка в культурных почвах и растениях Удмуртии (Удмуртия расположена в европейской части России) [72].

Наше внимание привлёк Прикубнино-цивильский субрегион (ПЦС) биосферы Чувашии, отличающийся снижением подвижного цинка в почве

0,1мг/кг) и, следовательно, в пищевом рационе населения до 9,1 ±0,9 мг/сут, что составляет 61 % от рекомендованной нормы 15 мг/сут [50, 63]. Дети, живущие на этой территории, отстают в физическом развитии от сверстников [44]. Здесь же регистрируются самые высокие в Чувашии показатели распространенности инфекционных заболеваний в целом и респираторных инфекций в частности [6, 15, 17, 47, 48]. Основываясь на приведённых фактах, можно предположить, что население ПЦС испытывает дефицит цинка, обусловливающий нарушение роста детей и угнетение иммунного ответа со снижением сопротивляемости к инфекциям. Следует отметить, что не все жители ПЦС чувствительны к инфекциям. Часть населения резистентна к недостатку цинка в среде обитания, что, возможно, обусловлено генетическими факторами.

Иммуногенетические исследования жителей регионов с неблагоприятной эколого-географической ситуацией выявили изменение нормального характера распространения НЬА-антигенов и их комбинаций среди постоянно проживающего на этих территориях населения. Эти данные свидетельствуют об участии генетических факторов в реагировании иммунной системы человека на воздействие экстремальных для него эколого-геохимических факторов и ассоциированность адаптивных реакций организма с генами главного комплекса гистосовместимости.

В связи с вышеизложенным большой теоретический и практический интерес представляет изучение НЬА-профиля и функционирования иммунной системы населения, проживающего в условиях естественного дефицита цинка, связанного с его низким уровнем в среде обитания человека.

В настоящее время медицинское сообщество озабочено значительным ростом заболеваемости болезнями органов дыхания. По данным официальной медицинской статистики, в России болезни органов дыхания по распространенности занимают первое место и входят в состав четырех основных причин преждевременной смерти (в возрасте 15-59 лет), занимая третье-четвертое место [20]. Обращают внимание высокие уровни распространенности и летальности по инфекционно-воспалительным заболеваниям органов дыхания, в частности хроническому бронхиту, туберкулезу легких, пневмониям в условиях естественного дефицита цинка, а также неблагоприятное течение указанных заболеваний - преобладание деструктивных форм туберкулеза и большой частоты бронхоэктатических осложнений при хроническом бронхите, склонность воспалительного процесса к затяжному, малосимптомному течению, малая эффективность традиционной терапии [7, 15, 47]. Несмотря на совершенствование средств этиологической и патогенетической терапии, существенного прорыва в лечении заболеваний этого класса нет. Среди исследователей и врачей, занимающихся этой проблемой, сформировалось представление о необходимости дальнейшего углубленного изучения патогенеза легочных заболеваний, но уже не только и не столько как инфекционного заболевания, но как сложного патологического процесса, в который интегрирована лишь как часть, инфекционная составляющая.

Представляет практический интерес изучение эффективности цинксодержащих препаратов, в частности сульфата цинка, при лечении хронического бронхита и туберкулеза. Из литературных источников известно о иммуномодулирующем свойстве цинксодержащих соединений и положительном их клиническом эффекте при ряде патологических состояний [23, 46, 107, 127, 159]. Однако целесообразность и эффективность сульфата цинка в качестве средства для лечения хронического бронхита и туберкулеза легких с дефицитом цинка не изучены.

Таким образом, исследование иммуногенетической структуры и состояния иммунной системы населения, проживающего на цинкдефицитной территории, позволит расширить представления о механизмах реализации геохимически обусловленного дефицита цинка на организменном уровне. Изучение гомеостаза цинка и его конкурента в кишечном всасывании и за белково-связывающие сайты - меди, а также функционирования иммунной системы у больных ПЦС с инфекционно-воспалительными заболеваниями легких может уточнить особенности патогенеза этих заболеваний и лечь в основу разработки патогенетического подхода к лечению больных этого контингента.

Цель настоящего исследования - изучить иммуногенетическую структуру и состояние иммунной системы популяции, проживающей в регионе естественного дефицита цинка, выявить роль недостаточности цинка в иммунопатогенезе инфекционно-воспалительных заболеваний легких и обосновать использование цинксодержащих препаратов с иммуномодулирующей целью в комплексном лечении этих патологических состояний.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать иммунный статус у практически здоровых жителей цинкдефицитного субрегиона (ПЦС) и субрегиона с нормальным содержанием цинка (Присурский субрегион).

2. Изучить содержание цинка и меди в периферической крови (ПК) у здоровых жителей указанных субрегионов.

3. Изучить иммуногенетический профиль населения каждого из указанных субрегионов, а также роль генетических факторов в реагировании иммунной системы человека на геохимически обусловленный дефицит цинка.

4. Провести сравнительную оценку иммунного статуса, содержания цинка и меди в ПК у больных хроническим бронхитом и впервые выявленным туберкулезом легких, проживающих в условиях нормальной обеспеченности среды обитания цинком и на территории с естественным дефицитом этого биоэлемента.

5. Изучить влияние сульфата цинка на функциональное состояние иммунекомпетентных клеток (ИКК) in vitro.

6. Провести анализ изменений клинико-иммунологических параметров и «цинкового статуса» у больных хроническим бронхитом и туберкулезом легких под влиянием комплексного лечения, включающего сульфата цинка.

7. Установить критерии прогнозирования и контроля лечебного эффекта сульфата цинка по результатам тестов in vitro.

Научная новизна

1. Впервые изучено влияние естественного дефицита цинка, связанного с недостатком его в среде обитания, на состояние иммунной системы человека. Полученные данные свидетельствуют о том, что геохимически обусловленный дефицит цинка у 77,7 % населения вызывает субклинический дефицит цинка, приводящий к существенной недостаточности клеточного звена иммунной системы на фоне ускорения Fas-опосредованного апоптоза и депрессии фагоцитарной активности нейтрофилов.

2. Показано участие иммуногенетических факторов в реализации действия геохимически обусловленного дефицита цинка на иммунные функции практически здоровых людей.

3. Впервые дана характеристика иммуногенетического профиля популяции, проживающей в регионе естественного дефицита цинка. Специфическими чертами HLA-профиля, отражающими адаптивные процессы в отношении геохимически обусловленного дефицита цинка, являются высокая представленность в нем HLA-A28, В15, DQA 1*0301, DQB 1*0502/4, присутствие в нем аллеля HLA- DQB 1*0302 и низкая частота HLA-B17, HLA- DRB 1*13(06), HLA- DQB 1*0602-8 маркеров. Впервые установлена специфичность для здоровой популяции цинкдефицитной территории гаплотипа HLA-A2-B12, ассоциированного с высокими показателями относительного числа С04+-лимфоцитов и иммунорегуляторного индекса.

4. Проведено изучение параллелей между показателями иммунной системы, содержания цинка и его конкурента за белково-связывающие сайты - меди в ПК у больных с инфекционно-воспалительными заболеваниями легких. Полученные данные внесли вклад в понимание патогенеза хронического бронхита и инфильтративного туберкулеза легких, была продемонстрирована специфичность патогенетических механизмов возникновения этих заболеваний, когда на первый план выступают снижение Т-клеточной функции иммунной системы, фагоцитарной активности нейтрофилов, ускорение активационно-индуцированного апоптоза ИКК, а также нарушения в гомеостазе цинка, проявляющиеся дисбалансом содержания меди и цинка в сыворотке крови. Показана информативность индекса медь/цинк для оценки Т-клеточного звена иммунной системы.

5. Установлено иммунорегулирующее, иммунокорригирующее действие цинксодержащего препарата (сульфат цинка) и обоснована эффективность его включения в комплексную терапию больных с инфекционно-воспалительными заболеваниями легких.

6. Выявлена высокая информативность теста in vitro - ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов в ответ на добавление сульфата цинка в среду культивирования (50 мкМ Zn2+) для установления показаний к клиническому применению сульфата цинка и определения продолжительности курса лечения этим препаратом у конкретных больных.

Практическая значимость Выявленное на примере населения ПЦС Чувашской Республики иммунодепрессирующее влияние дефицита цинка, обусловленного снижением его уровня в среде обитания человека, позволяет рекомендовать включение анализа ПК на содержание цинка и его конкурента - меди в комплекс клинико-лабораторных обследований населения с целью получения дополнительной информации о состоянии иммунного статуса обследуемых и формирования групп риска по развитию иммунологической недостаточности, а также инфекционно-воспалительных заболеваний легких. Обнаружение в условиях природного дефицита цинка специфического преадаптивного гаплотипа HLA-A2-B12 позволяет использовать иммуногенетический анализ населения для формирования дифференцированных групп риска по развитию иммунодефицитных состояний (группа повышенного риска, включающая лиц с отсутствием в HLA генотипе А2-В12, и группа наименьшего риска, состоящая из положительных по А2-В12 индивидов) и использовать в группе повышенного риска препараты цинка с целью профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний легких. Благодаря установлению у больных с бронхолегочными заболеваниями (хронический бронхит, впервые выявленный инфильтративный туберкулез легких) связи нарушений иммунного ответа с недостатком цинка и повышением содержания конкурента цинка - меди в ПК созданы предпосылки для разработки методов направленной иммунокоррекции. Выявление иммуномодулирующего действия сульфата цинка на пролиферативную активность Т-лимфоцитов in vitro и положительной клиннко-иммунологической динамики у больных хроническим бронхитом и туберкулезом легких при включении в лечебный комплекс перорального введения этого препарата открывает перспективы для использования цинксодержащих соединений при лечении больных с бронхолегочной патологией с нарушением Т-клеточных функций и дефицитом цинка. Полученные данные о зависимости клинико-иммунологического эффекта лечения у конкретных больных от проявляющейся in vitro способности мононуклеаров отвечать приростом ФГА-индуцированной пролиферации в ответ на добавление в культуральную среду сульфата цинка позволяют использовать этот тест для установления показаний к назначению сульфата цинка и определения продолжительности курса лечения этим препаратом.

Внедрение результатов исследования в практику Комплексная терапия с применением сульфата цинка используется для лечения больных хроническим бронхитом в пульмонологическом отделении ГУЗ "Республиканская клиническая больница №1 Минздрава Чувашской Республики". Исследование сыворотки крови на содержание цинка и меди, изучение чувствительности мононуклеаров ПК к сульфату цинка в реакции ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов применяют для комплексной характеристики иммунного статуса и дифференцированного подбора иммуномодуляторов при лечении больных во втором и третьем терапевтических отделениях ГУЗ "Республиканский противотуберкулезный диспансер Минздрава Чувашской Республики".

По результатам исследования получено решение о выдаче патента на изобретение «Способ лечения туберкулеза легких» (приоритет от 02.08.2004), составлены методические рекомендации для врачей общей практики, фтизиатров и клинических иммунологов "Туберкулез легких в условиях естественного дефицита цинка", утвержденные Министерством здравоохранения Чувашской Республики от 15.09. 2004 г.

Апробация работы Основные материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Методология, организация и итоги массовых иммунологических обследований" (Ангарск, июнь 1987), Всесоюзном симпозиуме "Микроэлементозы человека" (Москва, ноябрь 1989), Всесоюзной конференции "Экологические аспекты иммунопатологических состояний" (Алма-Ата, сентябрь 1990), Пленуме Всесоюзной проблемной комиссии "Эпидемиология иммунодефицитов и оценка иммунного статуса" (Пермь, июнь 1991), Первом съезде иммунологов и аллергологов Чувашии (Чебоксары, октябрь 1991), VII Российском съезде фтизиатров (Москва, 2003), Первой международной научно-практической конференции "Биоэлементы" (Оренбург, июнь 2004), Межрегиональной конференции, посвященной 70-летию кафедры патологической анатомии и патофизиологии БГМУ "Актуальные вопросы патологии" (Уфа, октябрь 2004), Второй международной конференции "Патофизиология и современная медицина" (Москва, апрель 2004).

194 ВЫВОДЫ

1. Наиболее ранними, доклиническими проявлениями естественного дефицита цинка, связанного с его снижением в пищевой биогеохимической цепи «почва - вода - растения» являются иммунологические нарушения.

2. Реакция иммунной системы человека на природный дефицит цинка находится под контролем HLA-комплекса. Специфическими чертами HLA-профиля, отражающими адаптивные процессы в отношении геохимически обусловленного дефицита цинка, являются высокая представленность в нем HLA-A28, В15, DQA 1*0301, DQB 1*0502/4, присутствие аллеля HLA- DQB 1*0302 и гаплотипа с достоверно положительным неравновесным сцеплением - HLA-A2-B12 на фоне низкой частоты HLA-B17, HLA- DRB 1*13(06), HLA- DQB 1*0602-8 маркеров.

3. Естественный дефицит цинка, реализующийся в организме в дисбалансе медь/цинк, вызывает уменьшение числа Т-лимфоцитов, преимущественно хелперной субпопуляции, снижение ФГА-индуцированной лимфопролиферации и экспрессии маркеров позитивной активации, увеличение количества клеток, несущих антиген CD95, а также снижение фагоцитарной активности нейтрофилов.

4. Негативные по HLA-A2-B12 лица здоровой популяции цинкдефицитной территории имеют повышенный риск развития иммунной недостаточности и инфекционно-воспалительных заболеваний легких; лица с присутствием гаплотипа HLA-A2-B12, ассоциированного с высокими показателями относительного числа С04+-лимфоцитов и иммунорегуляторного индекса, имеют наименьший риск развития иммунодефицитных состояний.

5. В регионе естественного дефицита цинка инфекционно-воспалительные заболевания легких характеризуются повышенной распространенностью, летальностью, неблагополучным течением и быстрым прогрессированием.

6. Иммунный статус больных с инфекционно-воспалительными заболеваниями легких на цинкдефицитной территории отличается более выраженным, по сравнению с показателями больных контрольного субрегиона, Т-клеточным иммунодефицитом и снижением фагоцитарной активности нейтрофилов на фоне преобладания экспрессии на лимфоцитах маркеров отрицательной активации над позитивными и активации гуморального звена иммунной системы. Специфическим звеном патогенеза инфекционно-воспалительных заболеваний легких в условиях природного недостатка цинка является дисбаланс гомеостаза цинка и меди, отрицательно влияющий преимущественно на Т-клеточное звено иммунной системы.

7. Сульфат цинка (в концентрации 50 мкМ в пересчете на элементарный цинк) оказывает иммуномодулирующий эффект in vitro.

8. Включение сульфата цинка в комплексное лечение больных инфильтративным туберкулезом легких и хроническим бронхитом приводит к увеличению числа Т-лимфоцитов, повышению их пролиферативной активности, снижению активационного апоптоза, повышению фагоцитарной активности нейтрофилов и сопровождается выраженным клиническим эффектом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В здоровой популяции людей следует выделять группы риска по развитию иммунодефицитиого состояния, связанного с низким содержанием цинка в объектах среды обитания.

2. Использовать индекс медь/цинк для оценки Т-клеточных функций иммунной системы. Повышение этого показателя выше 1,26 рассматривать как индикатор угнетения клеточного типа иммунного ответа.

3. Использовать иммуногенетические исследования для формирования дифференцированных групп риска развития иммунной недостаточности у жителей цинкдефицитной территории с выделением группы повышенного риска, включающей индивидов с отсутствием в HLA-комплексе А2-В12, и группы сниженного риска, состоящей из позитивных по этому гаплотипу индивидов.

4. В группе повышенного риска развития иммунодефицитных состояний следует проводить профилактику инфекционно-воспалительных заболеваний легких с применением сульфата цинка в количествах (1-1,2 мг/кг/сутки), обеспечивающих суточную физиологическую потребность организма в цинке.

5. Сульфат цинка целесообразно использовать в комплексной терапии больных с инфекционно-воспалительными заболеваниями легких с недостаточностью Т-клеточного звена иммунной системы в суточной дозе 2,30-3,45 мг/кг двух-трёхкратным приемом внутрь (курсом 21-28 дней при туберкулезе легких, в период интенсивной терапии на фоне адаптации к противотуберкулезным препаратам; при хроническом бронхите курс лечения сульфатом цинка составляет 10-21 день).

6. Для прогнозирования эффективности применения препарата цинка у конкретных больных использовать тест in vitro - ФГА-стимулированную лимфопролиферацию в присутствии сульфата цинка (50 мкМ Zn2+). Прирост индекса стимуляции на 20 % и более считать показанием к назначению препарата.

7. Определение индекса медь/цинк по содержанию цинка и меди в сыворотке крови следует использовать для контроля эффективности лечения инфекционно-воспалительных заболеваний легких. Снижение отношения медь/цинк до 1,26 и ниже следует рассматривать как положительный прогностический признак.