Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Иммунологические аспекты вирусного канцерогенеза

на правах ГУк'0Г-ис:1

ЕГХОВ Валентин , Сергеевич

УДК 616-006.5:576.6со.6

^^уколспнзже " аспесш вкусного канцерогенеза

14.00.14 - Онкология -

автореферат

'диссертации на соискание ученой степени до:гтора медицинских наук

1!осква

13о7

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного знамени научно-исследовательском-онкологическом институте им. П.А.Герцена 1.13 РС2СР

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор А.и.Агеенко

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, ' профессор З.Г.Кадагидэе; доктор медицинских наук, профессор Г.А.Франк; доктор_ медицинских наук, В.Б.Окулов

Зедуц;.-; оп;1-?-;;:.^.. Институт проблем онкологии им.Р.Е.Кавецкого

АН УССР

Защита состоится" . "_ 193с-г.

на заседании специализированного совета ¿^034.17.01) в Московском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте им. П.А.Герцена ¡.В РСФСР (г.Москва, 2-й Боткинский проезд,д.3

С Диссертацией мокио ознакомиться в библиотеке Московского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского онкологического института им. П.А.Герцена

Автореферат разослан " "_ 198(,г.

Ученый секретарь специализированного совета, профессор К.А.Максимов •

<

Актуальность проблемы. Решить проблему природы взаимоотношений иммунитет/опухолеобразование, по суш, означает определить

эти фс&омвш кал биологические категории. Имеется единственный

*

логический путь определения различных феноменов биологических слХ стем как биологических категорий - это анализ их эволвдионного участия в совершенствовании способа генерации биологического разнообразия. До тех пор, пока феномен не определен как биологичес^ кая категория, его грашин расплывчаты и соотношения с другими феномена!® биологических систем неопределенны.

Проблему взаимоотношений иммунитет/ опухолеобразование обычно трактуют, используя терминологически сугенннй смысл "тглуни-тет" как защиты. Такой подход нашел наиболее полное выражение в концепции йш-пе^ (1970г.) о роли иммунного надзора в опухолэо<£ разованки. По-видимому, как исторически раннему пстходу Д^/гт^ соответствует точка зренп, согласно которой взаимоотношения иммунитет/опухоль имевт однозначный, однонаправленный характер заД щиты, •^ациты" от чего, собственно? По мысли пшадунитет возник в эволюции как способ "защите/* от опухоли, поскольку опухолеобразование приводит к снижению генерации Дологического разнообразия. Следует подчеркнуть, что, таким образом, главным в концепции /7<уг./? е £ язляется анализ взаимодействия иммунитет/ опухоль по отношению к основному содержании биологической эволек ции - совершенствованию способа генерации биологического разкооб^ разия.1 Говоря более точным языком, по мысли Дсп^ с ^, конкурируют не иммунитет и опухолеобразование, а два способа генерации -разнообразия, поскольку, очевидно, и та и другая системы наделе-^ ны способностью генерировать разнообразие биологических признаков. Нам думается, что сведение взаимоотношений опухоль/иммунитет к "защите" кроится в ошибке отождествления способа генерации

разнообразия с срейоменологией самого разнообразия* Совершенно очевидно, что способ генерации разнообразия может быть единым,а самое разнообразие на фенотипическом уровне может иметь различные селективные потенции (вступать в конкуренцию), частным выражением которой может служить противоопухолевый надзор. Следовательно, и в том случае, если феноменологически иммунитет осуществляет функцию надзора овухолеобразования, &то не означает само по себе, что иммунитет в оккогенез используют различные спо собы генерации разнообразия, т.е. имеют различную регуляторнув основу по этому признаку.

Элесте с тем, сомнению подвергаются и тезис (вытекающий и) концепции /З^лсуУо том, что иммунитет возник в эволюции как система, функционирующая по принципу систем с отрицательные обратными связями. Каи, скоро, надзорная функция ищунитета, возможно, есть лишь частная форма иммунитета, правомерно поставить под сомнение утверждение о том, что дискриминация "свое/чужое" - основная функция ишунитета. Если принять это предположение, логично заключить, что система иммунологического распознавания эволюционировала не по пути совершенствования дискриминации "свое/чужое", а по способу выделения и закрепления в эволюции "своего". Шмуналогическое распознавание реализовало свой потенциальный полиморфизм за счет механизмов самораспознавания, т.е. с включением механизмов положительной обратной связи. Несмотря на то, что к настоящему'времени накоплены многочисленные данные, свидетельствующие о тда, что иммуногенез включает распознавание "своего" (это нашдо выражение в сетевой концепции Уе-^л е (1971), в гипотезе "двойного распознавания" (51|" 7-<?г Т. ¡ЗУ У ) и т.д. Сами по себе эти факты не мыут служить доказательством того, что система иммунологического распознавания возникла в эволюции

как система с положительными обратшкн связями. Приведенные вышз общие соображения и имеющиеся экспериментальные свадеши о той, что иммунитет функционирует о обязательны включением' в процесс распознавания "свое" делают это предположение лишь веска вероятным. Эта неопределенность монет бить в значительной степени .. снижена лшнь в там случае, если удастся установить, что иммунологические моханизмы самораспознавашя включены в процесс генерация разнообразия. Анализ взаимоотношений имг.;унптет/опуходь могет оказаться плодотворным в решении этой проблемы, поскольку сущзствует возмолность» что основные изменения параметров цщу-нзтета при онкогенезе имеют тот ке механизм, который обеспечивает генерацию признаков в самой опухолевой системе.

В контексте сказанного о возможности возникновения в эволюции иммунологического распознавания как системы с полони-тельныии обратными связями нельзя умолчать о многочисленных септах, указывающих на структурно-функциональную гомологии приемо-воспринимашцих молекул систеш иммунологического распознавания . и .убедительные доказательства существования семейства лшуногло-булиновых тет^^еи""¿очто указывает на предсущаствова-ние единого предкового гена. Итак, существует возможность, что-иммунитет и опухолеобразоваше по основному признаку - способу генерации биологического разнообразия - имеют вдшшй механизм, что этот механизм функционирует как система с положительными обратными связями. йлесте с тем, монно заключить, что доказательство подобного механизма в опухоли, делает весьма вероятным утверждение о включении этого ке механизма в процесс расширения диапазона шглунологического распознавания.

Очевидно, что, если в опухолях функционирует механизм генерации разнообразия признаков как система с положительными обратными связями, то в этот процесс долины быть включены эволвдионно консервативные, обязательные для опухоли и стабильные в олухолевой прогрессии признаки опухолевой систем. Всем этим требованиям отвечают эмбриональные опухолевоассоциированные поверхностные антигены (Эренпрейс, 1979 г., 1984 г.).

Таким образом, актуальность теш обусловлена, во-первых, имеющейся неопределенностью по вопросу природы взаимоотношений иммуш-тет/опухоль, и, во-вторых, возможностью принципиально по-новому объяснить характер взаимоотношений этих биологических феноменов.

Цель работы: Изучить роль функции иммунитета в процессе опу-холевообразования.

Задача работы. В работе реыали задачу проверки, имеются ли общие звенья изменений иммунного статуса животных при онкогенезе с теми процессами, которые имеют место в самой опухолевой системе, • обеспечивая генерацию разнообразия ее признаков.

В соответствии с общим замыслом, работа подразделялась на ряд этапов, в которых решали следующие конкретные задачи:

I) изучение антигенной структуры опухолей модельной для налей работы системы--сарком, индуцированных обезьяньим аденовирусом Аг, под углом возмокного наличия в них эмбриоспецифических антигенов;

' 2) иммуногенность эмбриоспецифических опухолевоассоциированных антигенов в аутосист-еме, а такке феноменология и механизмы аутоим-мунитета при онкогенезе^Ат,;

3) изучение механизмов иммуностагфляции роста опухоли (роль лимфоцитов, коммитироЕанных к эмбриональным антигенам в этом ■процессе);

4) изучение возможности функционирования в опухолях различной "этиологии" и гистогенеза аутостимула пролиферации вследствие иммунологического распознавания своих собственных эмбриональных поверхностных антигенов.

Научная новизна работы. Впервые показано, что в опухолях различной "этиологии" и гистогенеза функционирует механизм иммунологического распознавания своих собственных эмбриональных поверхностных антигенов; вследствие этого распознавания происходит стимуляция синтеза ДНК в опухолевых клетках.

В генетически селекционированной по чувствительности к онко-генезу системе в ранние сроки онкогенеза появляются клоны лимфоцитов, коимитированные к ранним эмбриональным антигенам; эти лимфоциты сн ¿/^¿'усиливают рост опухоли. Таким образом, изменения иммунитета при онкогенезе в селекционированной по признаку чувствительности к нему системе по своей феноменологии и биологическому значению совпадают с теми процессами, которые имеют место в самой опухолевой системе и обеспечивают генерацию разнообразия признаков в опухолях. Научная ценность работы заключается в том, что в ней сформулированы совершенно новые принципы функционирования опухрле-вой системы; работа содержит сведения о том, что генерация иммунологического разнообразия осуществляется на основе систем с полоки-тельнкми обратными связями.

Практическая ценность работы определяется тем, что на основе полученных в ней результатов возможна разработка принципиально новых методов диагностики и лечения рака.

Целесообразны следующие разработки:

I) поскольку в опухолях постоянно экспрессированы рецепторы к сеоим собственным эмбриональным поверхностным антигенам, использовать клетки эмбриона, несущие на СЕоей поверхности стадиоспецифичес-

кие антигены и меченные^-излучателем, для визуализации опухолевого роста (этот же прием можно использовать в лечебных целях);

2) использовать белок р53, меченный У-излучателем, для визуализации опухолевого роста сь

3) поскольку клетки опухоли содержат рецептор иммунологического распознавания своих собственных эмбриональных антигенов, имеющий идиотипическую детерминанту, антиидиотипические антизмбриональ-)ше антитела можно использовать как для обнаружения находящихся в циркуляции рецег.лэров иммунологического распознавания эмбриональных антигенов, так и для визуализации опухолевого роста ¿¡4 1/С14' ;

4) можно ожидать, что чувствительность этих методов значительно превышает таковую для ныне существующих методов клинической диагностики опухолей, следовательно, они могут быть использованы в целях ранней диагностики первичной опухоли и метастазов.

Основные положения, выдвигаемые для защиты:

I. Взаимоотношения биологических категорий имыунитет/опухоле-образование не ограничивается альтернативой - защита или стимуляция ' 2. Опухолевообразование и иммунный статус при онкогенезе имеют ряд общих проявлений: обязательным компонентом изменений иммунного статуса при онкогенезе является игщукция клонов лимфоцитов, комми-тцрованных к эмбриональным опухолевоассоциированным антигена!.! и спо собных усиливать рост опухоли; с другой стороны, опухоль представля ет собой самоподдерживающуюся систему иммунологического распознавания своих собственных эмбриоспецифических поверхностных антигенов. Это указывает на возможность единого механизма изменений иммунного статуса при онкогенезе и признаков опухолеобразования.

3. Способ иммунологического распознавания возник в эволюции как система с положи'., зльныли обратными связями.

Апробация работы. Диссертация апробирована на заседании экспе

рш-снталыюго отдела и Ученого совета Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А.Герцена (1966 г.). Основные положения работы доложены и обсуждены на съездах онкологов, международных и всесоюзных симпозиумах, перечень которых: приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 30£ страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, собственных результатов, их обсуждения, выводов'и списка литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 36 таблицами и 15 рисунками. Библиогра- . фический указатель включает 420 источников отечественной и зарубежной литературы.

Содернанне работы

Матешали и тлетсшн. Основной экспериментальной модельной системой, использованной в работе, служил канцерогенез, индуцированный у мышей линии СБА разъодка питомника АН СССР "Столбовая", обезьяньи:»! аденовирусом ^А7(18). Наряду с мышами линии СБА в работе использовали мышей линии С57В£ (линия контрастная к линии СБА по чувствительности к онкогенезу/*А7); гибриды р, ~(СВА х С57В1- ). Линии АКК, СЗН.

Битого «ЯА7(18) поддерживали серийными mccasai.ni на поно-слое клеток почек зеленой мартышки (ПЗЛ); П3.1 получали из института полимиэлита и вирусных энцефалитов АМН СССР.

Титрование вируса осуществляли ■методом конечного разведения и подсчитывали по Риду и Менгу (1960). В работе использовали вирус в.титре 10"^ - 1СП^ ЦПЭ в 1,0 мц. Для индукции онкогенеза 0,1 ш заголовки вируса вводили новорожденным кивотным линии СВА подкожно. Опухоли возникали у всех выяивших животных. Латентный период опухолеобразований имел сезонные колебания в пределах . 45-60 дней. '

Гистологический тип опухолей, индуцированных. ) у

мышей линии СВА - полшлорфиоклеточные саркомы. В работе использованы опухоли 0-6 пассажей в сингенной системе.

Методы определения эмбриональных антигенов в клетках сатжо-мы,ГА7т ■

Для обнаружения эмбриональных антигенов в клетках саркомы ^ А7 использовано несколько методов. Метод предипитадии в агаре по Уохтерлоци, непрямую жмунофлуоресценцшо по Кунсу и цитотокси-ческий тест по высвобождению

Антисыворотку к эмбриональным антигенам получали иммунизацией кроликов или взрослых мышей линии СБА водно-синевыми экстрактами тканей саркомы Л?Д7 или эмбрионов 10-12 дня внутриутробного развития.Полученную антисыворотку подвергали истощению клетками рааилчных органов мышей линии СБА.

Щгтотоксическую активность клеток селезенки от мышей линии СБА, иммунизированных клетками эмбриона или клетками саркомы J~A7, испытывали на клетках гомологичной опухоли и клетках сингенных эмбрионов и плодов.

Ддя определения Феноменов аутоиммунитета при онкогенезе f> А7 использовали следующие подходы:

1) изучали способность клеток селезенки, взяшх в разные сроки канцерогенеза. .Ра7, вызывать реакцию трансплантат против хозяина (РТПХ) при переносе их внутрибршинно новорожденным син-генным реципиентам. Выраженность реакции учитывали на 10 день после переноса клеток по индексу селезенки и тимуса в группах опытных и контрольных животных. В качестве контроля использовали перенос клеток селезенки от интактных животных;

2) аутоишуяитет определялся также то накоплению депо иммуноглобулинов в строме тжуса у мышей инокулированных при рождении вирусом,/"1 А7, а также по наличию в сыворотках этих мышей антител к стромальным клеткам тимуса интактных сингенных животных. В первом случае использован прямой, во втором - непрямой метод Кунса (Cooks', <fS°);

3) С целью определения иммунной реакции на эмбриональные антигены использовали реакцию бдастрансформации в смешанной однонаправленной ьулыуре (лимфоциты селезенки - отвечающие; клетки эмбрионов разных сроков - стимулирующие) по включению Зн -тими-дина ( 1(У. Ao(€ei cr/^/f/u);

ст

4) метод адсорбции меченных С^ клеток селезенки от мышей, находящихся в различных сроках онкогенеза Реакцию бкасттрансформации в смешанной однонаправленной культуре осуще-

С с

ствляли следующим образам: 1x10 отвечающих клеток и 1x10 стимулирующих (облученных 50гр на аппарате Луч I) помещали в 1,0 мя среды а НЛ1 - 1640 содерзащуш /з^/^-у (10 йиЦт), антибиотики) при 37°С и 10% инактивированной прогреванием ;:•.•.'■' эмбриональной сыворотки. Смесь клеток инкубировали в течение 48 часов и затем в пробы добавляли 0,5 тки. ''И -тимидина. Через 24 часа инкубации при 37°С клетки промывали один раз версеном и дваа-ды средой 199 и переносили на мшшшоровые фильтры (величина пор

- 0,45<чш), обрабатывали 5% холодной трихлоруксусной кислотой СТХУ), прогревали при 80°С в течение 15 минут и уровень радиоактивности подсчитывали в /I -счетчике фирмы SJ 2 <>/ /

¿фРГ)

Для получения монослоя клеток использовали первичную культуру фибробластов эмбриона мышей СБА., взвесь которых получали путем обработки измельченной ткани стандартным раствором версена. Клетки культивировали л различной концентрации в смеси сред 199 и лактапьбумина с добавлением эмбриональной сыворотки. В этих опытах клетки селезенки получали путем обработки клеточной взвеси 0,83$ раствором Д'Н4С£ в течение 5 минут для лизиса .

с

эритроцитов; после троекратного отмывания в среде 199, 1x10 клеток селезенки в течение 30 минут при 37°С в 0,5 среды 199, содераащей 120/ЗэВ ^Ст. Клетки, связавтие ^Сг / ~

— на монослое клеток эмбриона культивировали в среде 199+10£ эмбриональной сыворотки при 37°С в течение 2 часов. По окончании срока инкубации подсчитывали радиоактивность адсорбированных и неадсорбированных клеток опытных и контрольных проб.

Для изучения влияния изменений иммунного статуса при онко-генезе рА7 осуществляли перенос лимфоцитов селезенки мышей линии СБА, носителей первичных сарком „Я А7 или лимфоцитов селезенки, взятых на разные сроки латентного периода рК1, с клеткам-ми гомологичной опухоли интактши или сублетально облученным син-генным 14-16-неделышм раципиентам. Клетки опухоли и лаыфовд смешивали в разных пропорциях (1:1,2,10,20) ив объеме 0,1 ют среда 199 вносили подкожно сингенным реципиентам. Контролем служило введение клеток опухоли изолированно или в сяаеси с лимфоцитами селезенки интактных спнгенных яавотных. Эффект переноса оценивали по величине латентного периода и частоте выхода опухолей.

Влияние лимфоцитов, комититюванных к амбшональным антигенам на рост опухоли изучали путем предварительной раздельной адсорбции лимфоцитов на монослое клеток эмбриона и плода

Роль дАМФ в иммуностимуляции роста опухолиА7 изучали посредством определения внутриклеточного у АШ в клетках саркомы (Р А7 в динамике роста опухолей со стимулированным и обычным темпами роста по методу (Т?«"^ & ^ (

Участие различных классов лимЭбопитов в иммуностимуляции ■роста опухоли изучали, используя воздействия гидрокортизоном,. антиТТу 1,2 - антисывороткой, облучением

Для изучения шшунодепрессивного действия вируса ¿Р А7 использовали модель РТПХ, вызванную у Р^СВАхС57В ¿-), переносом лимфоцитов селезенки мышей родительских линий, обработанных за 6 дней до переноса с у с у о вирусом /Р А? интактных мышей линии СВА и С57ВА, 6х106 лимфоцитов селезенки опытных и контрольных мышей (интактных) внутривенно вводили взрослым Б^(СВАхС57В/.). Выраженность РТПХ оценивали через 10 дней по индексу селезенки:

Вес селезенки т тппп вес тела х 1иш

Методы и подходы, использованные ддр доказательства функшо-нигования в опухолях автостимула пролис&еращш посредством распознавания своих собственных поверхностных эмбриональных антигенов.

В этом разделе работы использовали различные шташы опухолевых клеток. Экспериментальные опухоль : саркома./"А7, спонтанная опухоль молочных желез мышей СЗН; саркомы, индуцированные метил-холантреном и диметилбензантраценом (Ш.5-2. НШ-5, Мел-37, 02-5). РШ - рак шейки матки, №ел-17 - меланома, 02-5 - опухоль кадудка; опухоль Зряиха, растущая в асцитной и солидной формах, а также опухоли человека, полученные при хирургическом удалении (рак желудка, рак пищевода, рак шейки матки).

Способность клеток опухолей реагировать в ответ на контакт с клетками эмбриона изучали ¡/Лге[по стимуляции синтеза ДНК) и ¿/I ¡/¿^о (по усилению роста опухоли в тесте 7; 1).

Стимуляцию синтеза ДНК в опухолевых клетках в смешанной однонаправленной культуре с клетками эмбриона и плода оценивали по включению' эБ-тимидина. йша определена динамика синтеза ДНК в этой системе при добавлении 0,5 -/й^'&г 7й-тшидина в разные сроки кокультивирования смеси клеток опухоли и клеток эмбриона. Кокуль-тивирование осуществляли в среде КЕМ1 1640 с добавлением ЮеИ/ми , антибиотиков и 2% эмбриональной сыворотке (или

в бессывороточной среде).

Поскольку максимум стимуляции синтеза ДНК в этой системе приходился на I сутки кокультивирования, в дальнейшем в этих опытах использовага 24-часовую инкубацию. В системе 1" ^ ¡Л/1 влияние клеток эмбрионов на рост саркомы/*1 А7 изучали в тесте ¿-^ло у ин-тактных или сублетально облученных сингенных реципиентов. Мышей облучали 4 ГЬ на аппарате "Луч I" и им вводили или смесь клеток

опухоли и эмбриона, или эти клетки в разные участки тела одновременно.

Соотношение отвечающих (клетки опухоли) и стимулирующих (клетки эмбриона и клетки различных органов взрослого организма) было различным - 1:1,2,3,5; концентрация отвечающих клеток -

с

1x10 в 0,5 мл среды культивирования: доза изотопа в разных опытах колебалась от 0,1 - до 0,5/ткКи в 0,5 мл среды. Радиоактивность проб измеряли методом (А о!г ¿1с //, /У/ь,- ), подробности которого описаны выше (бласттрансформация лимфоцитов). Для контроля специфичности ответа именно клеток опухоли в данной системе, изучали синтез ДНК в клетках печени, почек, лимфоцитах селезенки в смотанной однонаправленной культуре с клетками эмбриона в' бессывороточной среде. В качестве контроля использовали такие смешанную однонаправленную культуру клеток опухолиЛ^А7 и клеток почки, печени, лимфоцитов селезенки, фибробласты поздних сроков беременности (раздельно) в качестве стимулирующих.

Для исключения влияния растворимых факторов, на синтез ДНК опухолевыми клетками использовали ряд приемов: I) клетки эмбрионов, облученные 50Гр инкубировали в течение 24 часов при 37°С, затем в течение 2-3 суток хранили на льду при 4°С и перед внесением в культуру троекратно отмывали в среде 199; 2) стимулирующие клетки облучали 50Гр и затем помещали в мийлипоровые камеры <■" ( диаметр пор - 1,2 тГЛ); 3) изучали уровень синтеза ДНК опухолевыми клетками при переносе разных количеств среды и в разные сроки кокультпвпрования клеток опухоли и клеток эмбриона; 4) раздель-нуюадсорбцию клеток опухоли на монослое клеток эмбриона (10-12 день) и плода (18-20 день); 5) клетки опухоли/3 А7 до внесения в смешанную культуру с клетками эмбриона обрабатывали аггрегированными наг-гревашем гетерологнчными иммуноглобулинами в дозе ЗОДгкг по белку

на 1x10® клеток опухоли в течение I часа при 37°С; 6) обработку клеток опухолей /'А7 и Ш,1 моноклональныг: г антителами к р53 Клетки опухолей и клетки эмбрионов обрабатывали моноклоналышми антителами к р53 из расчета 1-2 мкг в ОДма (по белку) на 1х106 клеток в течение 2-х часов при 37°С.

. - Методы и способы доказательств экспрессии в опухолевых клетках рецепторов иммунологического распознавания своих собственных эмбриональных поверхностных антигенов.

Для определения природа рецепторов опухолевых клеток к собственных эмбриональным антигенам мы использовали метод, основанный на предположении, что этот рецептор содержит идаотппическую детерминанту, воздействуя на которую антиидиотишгческш.и антиэмбриональными антитела;,ж, моано изменить способность клеток опухоли реагировать в смешанной однонаправленной кулыуре с клетками эмбриона. Ввиду особой важности результатов данного раздела работы, следует подробно описать процедуру получения антнкдиотшшческих антиэмбриональных антител. Взрослых самцов мышей линии СВА иммунизировали различнымй количествами клеток эмбриона или плода, облученными 50 Гр(. подколшо. В разные сроки иммунизации (4-10 день) извлекали клетки селезенки полученные в градиенте плотности фиколд-верограг-фина ( 0^=1,077) испытывали в бласттрансформации в смешанной куль-ауре с клетками эмбриона (8,10-12 день и 1&-20 день), часть лимфоцитов адсорбировали с целью обогащения на монослое клеток эмбриона (ранних и поздних) в течение 2-ух часов при 37°С в среде КРМ1 1640 + 2% эмбриональной сыворотки. Адсорбированные клетки снимали лроназой (25мкг/ш1 в течение I часа при 37°С); лимфоциты отмывали в среде 199 и инкубировали в течение 24 часов в среде ШИ 1640 + 10/2 эмбриональной сыворотки при 37°С. Отмытые триады

в среде 199 лимфоциты облучали ЗОГр и вводили внутрибрюшинно по

с

3x10 лимфоцитов в ОД мл среды 199. Контролем служили животные, . которых иммунизировали лимфоцитами от иммунизированных клетками плода (18-20 день) мышей; п нивотные, иммунизированные лимфоцитами интактных сингенных животных. Для устранения из популяции ансиэмб-риональных лимфоцитов, полученные в градиенте плотности фиколл-верографина адсорбировали на монослов клеток эмбриона и неадсор-бированные лимфоциты использовали в смешанной однонаправленной, культуры клеток опухоли с клетками эмбриона.. Эту процедуру осуществляли следующим способом: лимфоциты, тлеющие антиидиотипическую . активность, облучали 50Гр л вносили в смешанную культуру с клетками опухоли J°A7 или ГШ на 2 часа при - 37°С в с.£э;Аз КНЯ 1640 без сыворотки; затетл в систему кокультивирования добавляли клетки эмбриона или плода и 0,5 мщйи ^Н-тпмидина. Смесь инкубировали вс$е®е ККЯ без сыворотки в течение 24 часов при 37°С. Пилимо лимфоцитов с предполагаемой антиидиотяшческой активностью получали такке антицдлотшгаческую антиэпбриокальную сыворотку. С этой целью cai.*-цов мышей линии CEA подкозно иммунизировали облученными 30 Гр клетками сингенных эмбриона ¿?(3.10,12 )и

с

плодов по 3x10 клеток на животное однократно, через 5-7 дней извлекали селезенки, получали лимфоциты в градиенте плотности фи-колаг-верографина и облученными 30 Гр иммунизировали внутрибрюшинно

с

спнгенных самцов по 3x10 на животное; через неделю получали сыворотку, которую адсорбировали взвесзА? клеток нормальных органов мышей CEA; полученную сыворотку испытывали в шмунофлуоресценции с клетками различных опухолей и нормальных органов.

В пользу экспрессии иммунологических механизмов в клетках опухоли монет свидетельствовать их избирательная цитотоксическая активность в отношении определенного типа клеток нормального фено-

типа. Мы оценивали цитотоксическую активность клеток опухоли по 51

высвобождению Сг, где в качестве клетсх-ыишеней использовали клетки сингенных эмбрионов (10-12 день) и клетки плодов (1&-20 день). Эффект учитывали по формуле:

а ~ > х 100; а - высвобождение 51Сг в опыте А - -£?

в - в контроле

/V - уровень радиоактивности поглощенного ^^Сг

Соотношение клеток-мшпеней и клеток-киллеров было различны:.! в этих опытах - 1:20,30,50. Сроки инкубации смеси клеток также были разными - от 4 до 24 часов. Среда культивирования - среда RH.il 1640, содержащая Ю> эмбриональной сыворотки.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием -тоста >гуа , определяя при этом предварительно характер распределения (Рокецкий, 1961).

' Полученные результаты I. Эмбриональные антигены в клетках саркомы мышей СБА, индуцированной обезьяньим аденовирусом ,РА7(18).

В соответствие с общпм замыслом работ обязательным ее этапом является изучение эмбриональных антигенов в клетках основной экспериментальной системы - полиморфноклеточной саркомы, индуцированной вирусом^А7 (18). Баш интерес к этому аспекту канцерогенеза продиктован тем, что именно эмбриональные опуходевоассоциированные ■ антигены - универсальные, эволюционно консервативные п устойчивые в опухолевой прогрессии - признаки опухолей системы (Эренпрейс, 1982, , 1984, Рсу^ет я 1984). Присутствие эмбриоспецифи-

ческих антигенов в клетках саркомы /^А7 изучали в преципитации в

агаре, непрямым методом Кунса и в цитотоксическом тесте по высво-ст

бождению Сг.

Кроличья антисыворотка к водно-солевому экстракту сарком Д"4 А7, истощенная к леками нормального фенотипа и водно-солевым экстрактом тканей интактных мышей, реагировала с экстрактом опухолей и тканей эмбриона мышей линии СБА 10-12 дня развития. Зта же сыворотка вызывала свечение поверхностных мембран клеток саркомы р- А7 и клеток эмбриона в непрямом методе Куиса. Адсорбция этой сыворотки на клетках эмбриона 10-12 дня развития устраняла ее способность реагировать с клетками опухоли; при адсорбции ке на клетках 18-20 дня развития способность распознавать поверхностные детерминанты сохранялась. Результаты этих опытов свидетельствуют о наличии в клетках саркомы^РА7 эмбриоспецкфической детерминанты • (детерминант); эта детерминанта является общей для цитоплазмы и плазматической мембраны клеток саркомы.

Результаты цитотоксического теста, в котором в качестве клеток-киллеров использовали лимфоциты селезенки мышей, иммунизированных клетками сингенной саркомы^а в качестве клеток-мишеней - клетки эмбрионов разных стадий развития и клетки гомологичной сингенной саркомы, подтверждают этот вывод. Следовательно, клетки саркомы РА7 содержат эмбриоспецкфический антиген (ны), распознававшие гетерологичной сывороткой и лимфоцитами в сингенной системе. В этом последнем случае обнаруженные антигены способны вызвать на себя реакцию отторнения.

Полученные нами результаты не дают оснований для суждения о толщественности обнаруженных нами в разных тестах эмбриоспецифи-ческих антигенов саркомы/ЯА7.

Таким образом, по изучаемому в этом разделе признаку опухолей саркома не является исключением.

2. Взаимосвязь между эмбриональными опухолевоассощкрован-Йймк антигенами и рецепторами 1Ъ~фрагыентоэ (рГс )ишуноглобулинов tía плазматической мембране клеток опухоли ¿f'A?.

Возможность функциональной связи между эмбриональными опухо-йевоассоциированныгли (как эволюционно консервативными элементами) и рецепторами Гс~шялуноглобудинов (распознающих констатше такие эволюционно консервативные элементы) делают такую возможность весьма вероятной.

Исследование функциональной связи между рГс и эмбриональными оцухолевоассоциированкыми антигенами в плане нашего изучения возможности общности механизмов генерации разнообразия в опухолях и имцунной системе вполне оправдано. Следует иметь в виду, что константные участки легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов различных видов животных ¡алеет выраженную гомологию по аминокислотным остаткам и между структурами, включенными в формирование системы Т-кле-точного распознавания.

В конечном счете, не исключена возможность, что процесс генерации разнообразия признаков перв:1чно в эволюции обусловлен взаимодействием этих гомологичных структур.

с

рРс-икмуноглобулинов определяли обработкой 1x10 клеток опухоли ,РА7 аггрегированными нагреванием глобулинами при 63°С в течение 15 минут. Иммуноглобулины получали из сыворотки пнтактнцх

о

мышей высаливанием//(^/с, (¿¡л <- ^Сг. ^Ус ) 1x10 кле-

ток опухоли/J°A7 обрабатывали 30 мкг по бе/rey агрогирсвапыми is&-адуноглобулинами в течение 2-х часов при 37°С. Взвесь клеток опухоли, обработанных иммуноглобулинами и необработанных, обрабатывали люменисцирующеи сывороткой против У -глобулинов мыши. Установлено, что клетки изучаемой саркомы содержат рРс-клмуноглобулпнов как в фор.те точечного распределения, так и в форме "шапочек". На

следующем этапе опухоли предварительно обрабатывали кроличьей антиэмбриональной сывороткой или, наоборот, первоначально клетки опухоли обрабатывали гомологичными агрегированными иммуноглобулина™, а затем люминйсцируицей сывороткой, соответственно или против ^ -глобулинов мыши или кролика.

В результате установлено, что обработка клеток ощхощрк! не блокирует рГс иммуноглобулинов; и обработка клеток опухоли агрегированными иммуноглобулинами не блокирует реакции сыворотки с эмбриональными антигенами. При предварительной обработке клеток опухоли агрегированными иммуноглобулинами зона образования "шапоч- • ки" захватывает зону расположения эмбриоспецифических антигенов. ' 3. Имглунодетгресспвное действие в1щусаРА7 По замыслу работы шеется возможность,что изменения энного статуса при онкогенезе по своему механизму и биологическому смыслу совпадают с теми процессами, которые обеспечивают кардинальные, основополагающие признаки самой опухолевой системы. Очевидно, при этом имеет значение изучение модифицирующего действия самого канцерогенного агента на иммунную систему. При этом особенно ваэ-ко выбрать такую систему, которая бы позволяла связать самое модифицирующее дейстзие этого агента с чувствительностью к онкогенезу или с какими-либо существенными параметрами его. Этш требованиям, по нашему мнению, соответствует модель РТПХ, ихвгашия введением родительских линий от животных, контрастных по чувствительности к онкогенезу линий. В нашем случае это линии СВА (высокочувствительная) и С57В/. (резистентная). РТПХ оценивала по индексу селезенки после введения лимфоцитов родительских линий от ни-воткых, обработанных и необработанных за 6 дней до переноса вну-трибркшншы введений*.! вируса сублетально облученным взрос-

лыгл IV (СВАхС57В/-). Данные этих опытов представлены в таблице I.

Иммунодепресшшное действие вируса ¡Рш

Таблица I

Лимфоциты селезенки ш- Диафоциты ливотных, обра- кпнтпптп, тактных еивотных ботанных вирусом р А7

ДинйяСВА С57вГ СБА С57вГ

3,3±0,1 3,2±0,2 2,75±0,1 3,01±0,052 2,32^0,1

Р1 Р2 Рз Р4 Р5

РгРзг0,05; Т2-Р4у0,1; Р1;2,3,4 - Р5<^0,05

Как видно из таблицы, только обработка мышей линии СБА высокочувствительной к онкогенезу^р А7 приводит к снижению способности лимфоцитов селезенки вызывать РТПХ; лимфоциты С57В1 не снижают этой способности.

4. Аутоиммунитет при аденовирусном канцерогенезе Изучение феноменологии и механизма ау т опт,: луни те та при онко-генезе - следующий необходимый этап нашего изучения, так как мы предполагаем, что способность генерировать значимое для опухолевой прогрессии разнообразие признаков обусловлена механизмом иммунологического распознавания собственных эмбриональных антигенов и что подобные изменения происходят в иммунной системе при онко-генезе (индукция аутоиммунитета к эмбриональным антигенам). С целью изучения аутоиммунитета при онкогене зе,,/^7 мы использовали модель РТПХ, вызываемую переносом лимфоцитов селезенки, взятых от мышей линии СБА, находящихся в различных сроках онкогене за новорожденным сингенным хпвотным Выралсеиюсть РНК оценивали индексом селезенки и тимуса. Результаты этих опытов представлены в таблице 2.

Таблица 2

J атектини потол НосительНормальные 10 день 25 день первпчнол клетки _опухоли селезенки Ы1ВОШе

5,4±0,5 5,64+0,7 7,61±2,1 3,71±0,3 3,65±0,4

Р1 Р2 Рз Р4 Р5

3,88±0,5 4,04+0,7 4,02±0,4 4,83±0,7 6,24±0,88

Р1,2-Р5 °'05' VV0'01'' Р1,2-Р5^0'05

I

о

о ^

§1 ш о «со Ч са ЙЧ

о са и о

Эа S S

Сведения, представленные в таблице 2 указывают на то, что в патентно:.; периоде онкогенсза в селезенках мышей накапливаются ауто-реактдвные клоны лимфоцитов, способные вызвать РТПХ, что демонстрируется увеличением индекса селезенки и одновременным снпзением индекса индуса. Следует скидать, что подобные проявления РТПХ млеют место в аутосистеме. L'a проследила динамику 1шдексов селезенки и тимуса у мышей СМ, инокулированшх при роадешш вирусом ,S a7.

Таблица 3 Индекс селезенки Индекс тимуса

10 день Латентного периода 25 день

интахтные кпвоткые

4,9^0,3 = I2pj 5,02±0,4 = I2pg 3,72±0,4 = 6р3 Р1,2 - Рз С 0.05

5, <¡±0,6 6,24±0,83

РШХ в аутоспстомэ,как следует из данных представленных в таблице, имеет.- : специфику динамики индексов селезеша! и тимуса у ;гшотык, инокуллровашшх при роддении вирусом ¿ра7, по сравнению с интактшп.::: нпвоттг.:::. Пзменешгя индексов селезенки и тимуса напоминает йекоменологгю РТПХ.

Индукцию при онкогенезе кланов лимфоцитов, комитированных к эмбриоспецифическям антигенам, изучали в реакции бласттрансфор-ыации в смешанной культуре лимфоцитов, взятых на 30 день латентного периода канцерогенеза, и флбробпастов эмбриона разных сроков развития. Результаты этих опытов предетавлеш па рисунке I

И С I - опыт

П - контроль

%0

I !

■30

и О

Г1-

дик

Эти результаты свидетельствуют о том, что при онкогенезе rfА7 к 30 дню латентного периода, в селезенках мышей накапливаются клоны лимфоцитов, кооптированные к ранним эмбриональным антигенам.

■ Факт индукция аутоиглмуншх процессов при канцерогенезе зафиксирован так;:се в опытах адсорбции лиг.йоцитов мыпей СЕ1 л C57BZ, взятых в разные сроки после инокуляции вируса новорозденныгл . кивотшм, на монослое клеток эмбриона разных сроков беременности. Kai: и следовало онидать, получешше в этом разделе работы сведения указывают на то, что индукция ауто;кмунных процессов под влиянием вирусаД^А? имеет место лишь в чувствительно:": к онкогенезу данным вирусом системе. Следует отметить, что характерной чертой аутоиммунных процессов, обнаруженных нами различныш тестами и, по-видимому, к разным группам антигено", в там числе, к эмбрио-специфическнм является то, что они возникают в чувствительной к

г

и

онкогенезу системе и, что более существенно, задолго до появления опухоли, т.е. перестройка функции иммунитета в форме аутоиммуните-та обусловлена, прежде всего, действием инициирующего канцероге- - -.■ нез агента.

Аутоиммунитет в описанной форме не является случайным событием для онкогенеза, поскольку:. I) имеет системный характер . (РТПХ); 2) содержит черты самоподдерживающейся системы, обусловленной, разобщением Т и В-систем иммунитета; проявляет себя развитием РТПХ, но и там, , что при онкогенезе ^А7 в ткани' тимуса ;' происходит отложение иммуноглобулинов, начгшающееся в ранние сроки латентного периода и сопровождающее процесс инволюции,тимуса - ,. при канцерогенезе. Депо иммуноглобулинов в ткани, тимуса.при онко-генезеД"'А7 не есть пассивный процесс, связанный, возможно, с первичны?.!' поранением ткани'тицуса, скорее .процесс активный, так как. в сыворотках мышей, кнокулированных при рождений вирусом ¿Рю, ' имеются антигены к стромальным клеткам, тимуса, что продемонстрй- ■■' ровано обработкой срезов тимуса штактных животных сывороткой та- ' ких животных с последующей обработкой люминесцирующей сыворотки против у -глобулинов мышей. ;

4. ''еханпзмн иммуностгелуляцга поста опухоли '

Один из существенных асиектоз гипотезы, лежащей в основе • этой работы, состоит в допущении возможности функционирования иммунитет-опухоль в качестве системы с положительными обратными связями. Поэтому на следующем этапе работы было изучено влпяиие лнмфо^ цитов, полученных от животных, с первичной опухолью на рост синтез ной, гсслологичной саркош в тесте ^¿пп ■.■

Совместный перенос лимфгцптов селезенки носителей первичных опухолей и клеток гомологичной опухоли интактным спнгенным реципи-*

ентом приводит к сокращению.срс:;ов латентного периода опухолеоб-разования. Лимфоциты сннгенных интактных взрослых животных подоб-. ным действием у необлученных реципиентов подобншл действием не обладали. Предварительное сублетальное облучение реципиентов в дозе 4 Ер до введения им сглеси опухолевых клеток и лимфоцитов в селезенки интактных животных обеспечивает условия, при которых происходит усиление роста опухоли.

.С целью верификации иммунологической природы наблюдаемого ■ роста опухоли и, вместе с тем, доя определения антигенов-мишеней этого действия, мы использовали процедуру адсорбции лии^оцитов селезенки интактных взрослых мышей на моносдое клеток эмбриона или клеток плода с последующим переносом неадсорбпрованшх клеток в тесте /и/о^п с клетками опухоли /Г'А7 сублетально облученным син-генным реципиентам. Как свидетельствуют данные таблицы ^ цредвари-тельная адсорбция л^ял^оцитов селезенки- на монослое клеток раннего эмбриона устраняет их способность вызывать усиление роста опухоли, при сохранении таковой после адсорбции на монослое клеток плода 18-20 дня.

Влияние неиммунных лимфоцитов, комитированных к эмбриональным антигенам, на стимуляцию роста опухоли Г1 А7

' Таблица Ц. .

Опухоль + лимфоциты Контроль интактных мышей в соотношении

оцухоль + лимфоциты, неадсорби-рующиеся на монослое фибробла^

1:10 1:Н0 12-дневных 1а-днезных

1/5 5/5 * 0/4 0/4 5/5

0/6 3/3 0/8 0/7 5/5

1 Р1 Р2 Р4 Р5

РГР2 0,05; РГР3>0,1; РГР4 >0,1; .РГР5 ¿.0,05

Способностью усиливать рост опухоли у сингеншх субдетально облученных животных обладают Т—клетки, радиочувствительные и корт тизонрезистентные, так как обработка лимфоцитов селезенки анти ф -сывороткой, как облучение 2 блокирует их способность

усиливать рост опухоли. Введение гидрокортизона (6 ыг на ЮОгр веса), сохраняет способность клеток селезенки, взятых на 6 день после обработки, усиливать рост опухоли в тесте -

Усиление роста опухоли в .тесте IVс/^п с лимфоцитами селезенки интактных мышей сопровождается усилением активности внутрикле-. точного цА® (рисунок 3) . -

Побышение уро&ня цАМФ 6 клетках

ч»

12

«3 3

X 8-

опухолей с ускоренным ростом

ю

I

■Ь

I

30

И- уроЬень цЙПФ 6 стипдлиробанных опухолях сп-урсЬень цДМФ Ь контрольной группе

Таким образом, данные этого раздела свидетельствуют о том; что система иммунитет/опухоль может функционировать как система с положительными обратными связями, что совпадает с данными р-ге^п 1971, 1972, 1973; 1974,2^£"^'1974,

1976 и.других авторов. Важно отметить два принципиальных обстоятельства полученных результатов: первое - это то, что мишенью иммуностимулирующего действия могут служить эмбриоспецифи-ческие антигены опухолей (что совпадает с данным Рат-^са+и' 1974,

/Зй/У-чл* 1974, Со*;:* 1973, 1984) и, второе - то, что

в селезенках интактных животных содержатся лимфоциты, к оптированные к рацним эмбрюнальным антигенам, активность которых контролируется гомеостатическими механизмами, чувствительны!,ж к радиоактивному облучению (4Гр). При канцерогенезе происходит увеличение клона лимфоцитов, комитированных к ранним эмбриональным антигенам.

4. Механизмы автостлцула пролиферации клеток опухоли_

Итак, сведения, приведенные в предыдущих разделах работы, свидетельствуют о том, что эволюционно консервативные признаки опухолевой системы - эмбраоспецифаческие антигены-могут быть мишенью муностимулирующего действия. В генетически селекционированной системе при онкогенезе создаются условия накопления клонов лимфоцитов, комитированных к ранним эмбриональным антигенам и способных усиливать рост опухоли в тесте . Существенно, что этот про-:

цесс накопления клонов лимфоцитов, кооптированных к эмбриональным антигена!.! имеет место в латентном периоде вирусного канцерогенеза.

Такое предположение представляется оправданным еще и тем,что именно эмбриоспецифические опухолеассоциированные антигены оказываются удивительно устойчивыми как эволюционно, так и б опухолевой прогрессии. Без сол-иенья, эмбриональные поверхностные антигены опухолей являются существенной частью стабилизирующего отбора, идущего б' опухоли. Заманчиво проверить возможность, что стабилизация этих антигенов в опухолевой системе обусловлена самоподдерживающимся, автоколебательным процессом а, если есть конкретное указание на то, что иммуннологическое воздействие на опухоль имеет черты- системы с положительными обратными. связями, то вполне логично рассмотреть возможность экспрессии иммунологических механизмов, комитированных к этим антигенам, в качестве условия их стабилизации в опухолевой

прогрессии как самоподдерживающейся системы. с

Как нам кажется, такое допущение может оказаться продуктивным, в объяснении ряда феноменов опухолеобразования, как-то: стабилизации эмбриоспецифяческих антигенов, меланизма иммортанизации опухолей и, возможно, феноменов инвазивного роста и метастазирования (последние два феномена - за счет расширения диапазона иммунологического распознавания, в ходе опухолевой прогрессии). Разумеется, я отдаю себе отчет в том, что связь между функционированием возможного автостимула пролиферации опухолевых меток по предполагаемому механизму и основных феноменов опухолеобразования - гипотетична; тем не менее, эта гипотеза не имеет фактических запретов, а по логической структуре, объединяя единым механизмом различные стороны опухолеобразования, отвечает требованиям правила Оккама.

Кроме этого, по заделу работы функция иммунологического распознавания в эволюции рассматривается как способ генерации разнообразия признаков и поэтому следует ожидать, что генерация разнообразия признаков в опухолевой системе сопряжена с экспрессией иммунологических механизмов.

для доказательства функционирования в опухолях автостимула пролиферации вследствие и.мунологического распознавания своих поверхностных эмбриональных антигенов мы использовали систему определения стимуляции синтеза аЖ в смешанной однонаправленной культуре клеток опухоли (отвечайте) и клеток эмбриона и плода (стимулирующие)', а также влиянле клеток эмбриона на рост опухоли ^ !/с /~2-0 тесте УЛ пп; для доказательства экспрессии в опухолях иммунологических механизмов распознавания собственных эмбриональных антигенов мы использовали :.сянмуноморфологические и функциональные тесты определения идиотлпических детерминант соответствующих рецепторов опухолевых клеток.

I. Стимуляция синтеза ЛЕС в опухолевых клетках в смешанной однонаправленной культуре с клетками эмбриона и плода

На первом этапе работы мы испытывали способность различных типов меток дефинитивных тканей (почки, печень, легкие, лимфоциты), а также клеток эмбрионов различных сроков внутриутробного развития стимулировать синтез ДИК в сингенных клетках опухоли ¡Рк! в смешанно однонаправленной культуре. Результаты этих опытов представлены на рисунке 5 и таблице

Сведения, представленные на рисунке 3 и таблице означают, что лишь клетки опухоли отвечают стащуляцией синтеза ДНК в смешанной культуре с клетками эмбриона, клетки дефинитивных органов такой способности не имеют.

Влеста с тем установлено, что лишь клетки эмбриона, но не клетки дефинитивных органов (печень, почки, легкие, лимфоциты селезенки) усиливают синтез ДНК в опухолевых клеток в смешанной культуре. Следовательно, налицо специфика взаимодействия по изуч^мому признаку мезду клетками опухоли /рШ и клетками эмбриона.

Поскольку опухоль представляет собой экосистему взаимодействия клеток нормального и опухолевого фенотипа, на данном этапе работы сохраняется неопределенность, какой тип клеток обеспечивает стимуляцию синтеза ДНК в смешанном однонаправленной культуре. Для получения однозначного ответа мы использовали ряд приемов. .Учитывая то . обстоятельство, что из различных типов нормальных клеток опухолевой экосистемы лимфоциты являются наиболее вероятным кандидатом в участника этого процесса, мы сравнили оптимальные условия стимуляции синтеза ДНК в изучаемой системе, с типовыми же для смешанной культуры лимфоцитов с различныг "и антигенами.

Оказалось, что лимфоциты селезенки интактных взрослых животных не реагируют стимуляции синтеза ДНК в смешанной однонаправлен-

, ' Таблица 3

УСИЛЕНИЕ СИНТЕЗА ДНК В КЛЕТКАХ САРКОМЫ в СМЕШАННОЙ КУЛЬТУРЕ С СИШЖШИ

КШЗТКАМИ ЭМБРИОНА РАННИХ СРОКОВ НЕРЕШЕННОСТИ

Смешанная клетками эмбриона до 14 дня беременности культура клеток опухоли с Клетками плода поздних сроков Контроль клеток опухоли р

1380±310,2 п = 3 905±151 п = 3 306±60,2 п = 3 РгР3 г: 0,001 Р2-03 ¿0,05

8Ю±Ю2 п=3 - , 266^30,2 ■ • п=3 Р^ 0,001 .

400±56,5 п = 3 257±38,2 П в 3 , 189±43 . п = 3 РГРд ^0,01 РГРЙ -¿0,05

2200±230 п = 3 И00±1Ж,2 П = 3 1350±160 : п = з РГР3 ^ оГ01 РГР2>0,05

282±48,2 П а 3 ' 243±40,5 ./. п = 3 235±63,2 п = 3 РгРд < 0,05 РГР3 >0,05

221±38,2 п = 3 • - ' 92±И,3 Р< .0,001

198±33,2 П = 3 129^21,2 п = 3 Р<0,05 "

162±33,4 П = 3 53±9,2 п с 3 ■ ■ Р «¿0,05

-184±119,8 п = 3 49,6^5,4 п = 3 Р <С 0,05

2375±186,5 п = 3 Р1 . 1360±320,2 п,= 3 Р2 . 645±60,3 п = V 3 . ' РГРд ^ 0,001 Р1-Рд ^ 0'05

Цифрами обозначено накопление Н3 - тимидина,выраженное в имп/минк

ЗВ

§

Рис 3

г-Н Г-Ьп

3 4

Л

/V

Рг : Яа ' , < ^ ¡•опуыг.ейые метки * клетки энсриона Ю дня беременности

2-спщопеЬыекпетки-кмтм эп&риона &дн» : , - 6'временности

3-опулопеЬыекдеши- лип<роциты селезёнки - , •• С-спуылеЬые клеши - метни почки

ной кулыуре с'клетками эмбриона и плода; но этот факт не исключа-• ет возможности участия в наблюдаемом феномене стимуляции синтеза ДНК лимфоцитов опухолевой экосистемы из-за избирательною накопления определенных их классов в опухоли, Дротнв того, что стимуляция сш1теза".ЩК в изучаемой системе обусловлена стимуляцией сянте-за ДНК в лиьфоцитах-, свидетельствует определенная динамика синтеза ДНК: в изучаемой системе максимум синтеза црцходптся на X сутки, 'ко^льтйвирования (на;этом основании в дальнейшем использовали Х-суточгщ). смешанную культуру); феномен не'требует присутствия сыворотки и обработка взвеси клеток о1!ухата£антисывороткой не устраняет способности клеток опухоли отвечать стшлуляцией синтеза ДНК в' изучаемой ^системе,- Это,.шестр взятое,- указывает, на стимуляцию синтеза ДНК в • данной системе в опухолевых клотках. Палимо этого, адэкватной- для решения вопроса участия лдофоцитов опухолей в /наблюдаемой системе являетсясистема совестного переноса клеток опухоли и клеток эмбриона в тесте уУ^п.» Сведения,.полученные в этих опытах представлены в таблице

Таблица" Ь

ШИШ МЕТОК ЭМБРИОНА НА РОСТ САРКОМЫ Р к! В ТЕСТЕ ШТАКТНЫХ РЩ'ШИЕНТОВ

Величина латентного периода (в днях)

опухоль +

эмбрион дня лилфоциты Контроль -.2x10"

селезенки

15,6±2,38 Ш,6±2,2 19±0,8

Р1 Р2 ' Рз

РГР2^ 0,05 Р2-Р3 7 0,05

РГР3 ^ 0,01

Влияние меток эмбриона на рост опухоли в тесте требу-

ет непосредственного контакта переносимых клеток и не реализуется посредством индукции иммунной реакции к эмбриональным антителам, поскольку показано, что гффокт усиления роста опухоли тлеет место у сублетально облученных реципиентов и только лишь в том случае, когда клетки опухоли и эмбриона переносят в смеси, а не изолированно

Таблчца ?

Нэлкчдна латентного периода (в днях) опухоль+эмбрион опухоль+эмошон опухоль-контроль _(совместно)_(раздельно)_2. 5x10"_

10,4±0,38 20,8±1,41 20,8±2,1

Р1 Р2 Рз

РГР2>3< 0,001; Р2-Р3>0,1

2. Влияние растворимых факторов, продуцируемых клетками эмбрионов на синтез ДНК в изучаемой системе

Поскольку известно, что клетки эмбрионов продуцируют ряд ростовых факторов 1982) сохраняется возможность, что

стимуляция синтеза ДНК в клетках опухоли в нашей модельной системе обусловлена именно ростовыми факторами. На следующем этапе работы

ш проверяла эту возможность. С ©хсй целью изучали уровень синтеза ДНК в клерках опухоли пра переносе среда культивирования от клеток эмбриона разного срока внутриутробного развития; кроме того, использовали систему смешанной культуры - клетки опухоли клетки эмбриона (облученные 50Гр), помещая последние в ьвшшпоро-вую камеру с размером пор 1,2 мкм, т.е. допускаащш выход в кулв-туральную среду ростовых факторов.

. Результаты этих опытов представлены на рисунке

Рисунок 1

Роль контакта клеточных поверхностей опухоль/эмбрион в усилении синтеза ДНК в клетках опухоли в смешанной культуре с клеткали эмбриона

о ь; а>

80С 70С 600 500 400 300 200 100

878

134

104 118 Г31

РГР3 > 0,05 РГР4 >0,05 РГР2 <0,001 Р3-Р2 ¿0,001 Р4~Р2 ^0,001

1 - клетки опухали - контрольная группа

2 - клетки опухоли Г'А-7 + метки эмбриона

3 - клетки опухоли ^А-7 + клетки эмбриона в ьвгллипоровой

камере

4 - клетки опухоли^/А-7 + мшшшоровая камора (технический

контроль)

Как следует из данных рисунка С1 помещение в мшшипоровуй камеру с диаметром пор 1,2 тМ клетки эмбриона не способны вызвать , стимуляцию синтеза ДНК в опухолевых клетках. Перенос среды кокулъ-тивирования, взятой в различные сроки культуры, в культуру изолированных клеток опухоли не вызывает стимуляции синтеза ДНК в них. Таким образом, эти сведения и результаты опытов адсорбции клеток .. опухоли на монослое клеток эмбриона, в которых показано, что клетки опухоли адсорбируются на поверхностной мембране клеток эмбриона, свидетельствуют о том, что описываемый нами феномен требует контакта поверхностей, участвующих в реакции клеток; наблюдаемая стимуляция синтеза ДНК в опухолевых не обусловлена растворимыми ■ ростовыми факторами, возможно, продуцируемыми клетками эмбриона. Такую возможность, кстати сказать, практически мояно исключить, имея в виду то обстоятельство, что клетки эмбриона, использовала после хранения на холоде, при 4°С в течение 2-5 суток, тщательно их отмывая в среде 199. Мсжно рассчитывать, что подобный механизм распознавания эмбриональных антигенов (коль скоро, они эволюциоз-. но консервативны) и, следовательно, мояет быть обнаружен, в индуцированных, спонтанных экспериментальных опухолях и опухолях человека, одним словом, быть универсальной чертой опухолеобразования. Поэтому следующим этапом работы была проверка способности клеток опухолей различной "этиологии" и гистогенеза реагировать усилением синтеза ДНК в ответ на контакт с клетками эмбриона.

Результаты этих опытов представлены в таблице

Данные, сведенные в таблицу 8 демонстрируют, что усиление синтеза ДНК в исследуемой системе в ответ на контакт с клетками . раннего эмбриона имеет место во всех, взятых в опыт, типах опухолей, что является основанием для вывода об универсальном характере

Таблица

Отппггипк Сметанная культура

идул^ц, эмбрион . +сМбрион Контроль Индекс

ХО Дня

14 дня

стимуляции

ГШ 2 Ш 5

ОЕ 5

Рт

1425*41,6 255±16.13 92,5±ЪЬ 2775 Р-рР ¿0,001

Р2-Р ¿0,001

5.3

П0±Ю,£ Гд РГР ¿0,001

586±ЮЗ,5 23^4524 62б±100 380±62,5

Р2-Р ¿0,05

7.8

80±12,<?Г РГР ¿0,001

Р2-Р ¿0,001

ЫЕЛ- 91 734±125 330±12

140±?Г

Рд-Р ¿0,05 Р2-Р ¿0,001

описанного феномена и что (шлея в виду тождественность этого феномена в опухолях мыша и человека) он обуслозсн эволюционно консервативными механизмами. Таким образом, совокупность приведенных данных есть основание для заключения о там, что в опухолях различного гистогенеза функционирует механизм распознавания их собственных эмбриональных поверхностных антигенов с формированием пролифе-ративного стимула.

■ Если совокупность приведенных сведении, по нашему мнению, однозначно позволяет сделать вывод о том, что в опухолях функцио-. нирует распознавание именно эмбриональных антигенов, то ни их природа (£ Д или^Д - детерминанта), ни природа рецепторов их распо-. знавания неизвестна. Разумеется, есть основание уже на данном этапе нашего изучения проводить аналогию мезду механизмами имь^уноло-гического распознавания и изучаемым нами феноменам; но эти подходы в принципе допускают лишь предположения. Поскольку основным по-. стулатом нашего изучения является постулат о возможности опосредуе-

мого иммунологическими механизмам автостимула пролиферации клеток опухоли, необходимо найти систему доказательств экспрессии иммунологических рецепторов, распознающих поверхностные

эмбриональные антигены.

Для доказательства иммунологической природы рецепторов опухолевых клеток, распознающих собственные эмбриональные поверхностные антигены, мы использовали несколько подходов. Ранняя модель,-призванная решать эту задачу, была построена на создании конку-, рентных отношений рецепторов опухолевых клеток и иммунных лимфоцитов за антигены ранних сингенных эмбрионов. Эти опыты проводи-, лись в различных модификациях. В одной серии опытов иммунные лимфоциты получали иммунизацией сингенныма облученными опухолевыми . клеткамиД1 А7 взрослых мышей СВА и испытывали их в смешанной однонаправленной культуре с клетками эмбриона и плода, используя-последние до и после их адсорбции на монослое клеток опухоли^А7. Результаты этих опытов свидетельствуют, во-первых,.о том, что в клетках саркомы ("&А7 содержатся эмбриоспецпфические антигены (что еще раз подтверждает сделанный ранее вывод), а также о том, что рецепторы клеток опухоли успешно конкурируют за антигены ранних эмбрионов с рецептора:® иммунных лимфоцитов.

Следующий подход, долженствующий, по нашему I»нению, дать ответ, имеются ли в опухолевых клетках рецепторы иммунологического., распознавания эмбриоспецифических антигенов, основан на предположении, что эти рецепторы содержат идиотипическую детерминанту. Здесь необходимо подробнее объяснить важнейший элемент нашей работы. Дело в том, что по замыслу работы, нельзя исключить, что эмб-. риоспецифический продукт опухолевых клеток, участвующий в формировании автостимула пролиферации, не является серологически определяемой детерминалтой, а представляет собой инфраструктуру ряда

эмбриоспецифическях детерминант, распределенных в поверхностной мембране опухолевых и эмбриональных клетках. А это означает, что. мы в принципе не располагаем возможностью получения данного антигена в "чистом" виде, и, следовательно, у нас нет возможности выделить рецептор иммунологического распознавания данной специфичности в "чистом" виде. Поэтому в данных условиях единственный способ доказательства определения антииндиотипической активности антисыворотки есть способ ее получения.

Подробно этот способ описан в разделе "Материалы и методы".

Полученную после последовательных иммунизации в сингенной системе сначала облученными клетками эмбрионов и плодов, затем на. следующем этапе, иммунизацией облученными (50Гр) лимфоцитами селезенки, сыворотку подвергали адсорбции на взвеси клеток дефинитивных органов интактних мышей СБА, клетках плода и испытывали в функциональных тестах и в иммунофлуоресценциа.

,. Клетки опухолей /~К1 и РШ-2 обработанные полученной таким образом сывороткой, в непрямом методе Кунса дают четкое кольцевое и цунктивное свечение по периферии (клетки иивые).

При обработке с л ¿Л /•? о клеток опухолей антиидиотппичесними антиэмбриональныш антителами (8 ж 10 день эмбрионов), в клетках опухолей" снинается сш!тез ДНК (использовали прогретую при 56°С сыворотку). Эти результаты представлены на рисунке

1 - уровень синтеза ДНК в клетках опухоли, обработанных сывороткой

против сингенных лимфоцитов интактных мышей.

2 - уровень синтеза ДНК в клетках опухоли,обработанных антиидао-

тлшческой сывороткой против 10-дневных эмбрионов.

о

Следует оплатить, что снижение синтеза ДНК в клетках опухоли особенно значительно в тех случаях, когда обработке антиидио-. . типической антисывороткой подвергаются одновременно и клетки опухоли (отвечающие) и клетки эмбрионов (стимулирующие). Этот факт даст основание предполагать, что, возможно, в клетках эмбрионов, содержится идиотипическая детерминанта рецепторов иммунологического распознавания эмбриоспецифических антигенов; помимо этого, это означает, что система формирования пролиферативного стимула действует в двух направлениях рецептор*—», эмбриоспецифический. антиген. Этот вывод следует также из результатов, приведенных вы- . ше, свидетельствующих о том, что иммунологическое воздействие к • эмбриональным опухолевоассоциированным антигенам стимулирует рост опухоли; с другой стороны, контакт клеток опухоли с клетками эмбриона приводит к сгащуяяции в опухолевых клетках синтеза ДНК• с и 1/1^0 и стимуляции роста опухоли ¿"'1/1/0

Коль скоро, усиление синтеза ДНК в опухолевых клетках обусловлено контактом поверхностей реагирующих клеток, можно ожидать,., что оптимизация условий контакта опухолевых клеток будет сопровождаться усилением синтеза ДНК в изучаемой системе, Использование определенных количественных отношений стимулирующая/отвечающая, клетка, где стимулирующими были клетки той же самой опухоли,' обработанные митомицином С или облученные 50Гр, показало, что в клетках опухоли и ИМ имеется автостимул пролиферации за счет контакта их поверхностей. Результаты этих опытов представлены на рисунке

Рисунок б~

ЗАВИСИМОСТЬ УРОВНЯ СИНТЕЗА ДНК ОЕУХСШЕЕШИ КИЕТКАМИ ОТ УСЛОВИИ КОНТАКТА ПОВЕРХНОСТЕЙ

гЕ

г!

Д!

] I г

•2 ?

- ¡-¿он Т

г. - оп 0 п э - оп *■

Х'ГГ Х - 2 .г' А \--,

Максимальный уровень синтеза ДНК в системе опухоль/одухоль

значительно ниже, чем в системе опухоль/клетка эмбриона. Весьма вероятно, это означает, что наиболее вероятным состоянием системы эмбриоспецифический антител/рецептор его иммунологического распознавания есть их количественное несоответствие (ассиметрия).

Поскольку установлено, что в опухолях функционирует автостимул пролиферации, обусловленный контакт поверхностных мембран клеток, ожидаемо, что обработка антшдиотшшческиш анти эмбриональ- . ными антителами (эмбрионы 8 и 10 дня внутриутробного развития) найдет выражение в изменении уровня синтеза ДНК в клетках опухоли, а также в системе смешанной культуры их с клетками эмбриона. Установлено, что обработка клеток опухоли антшдиотипическиып антиэмбриональными антителами снижает синтез ДНК в клетках опухоли. Эти сведения предоставлены в таблице

Таблица 9

Роль иммунологических механизмов в стимуляции синтеза ДНК в опухолевых клетках

Таблица 9

интактные клеткиКлетки опухоли,обра-клетки опухоли, Контроль +опухоли 1:2 ботанные аит анти 8дн» обработанные тттг>5 _аит анти 10

- Интактные к ки опухоли 1X23 ± 265 Р1 443±170 . Р2 421±Х6,8 рз 180,6±6.78 р4 РГР2,з<0'05 Р2-Р3 > 0,05 РГР4 <0,01 Р2,з-Р4^»05

Клетки оцу холи,обработанные 'ант анти 8 507,6±130,6 Р5 546^166,8 Р6 402±125,1 Р7 183*22,1 Р8 .. Р5"Р6 >0'05 р5,6-р2^0'05 Р5,6,7-Р8<0'05

Клетки опухоли, обработанные ант анти 10 240±П,5 ?9 296,3*525 рю 152±31 рн Ю2,3±2,3 Р12 , р9,10гр1«г4>.05 Р9,10-РП^0'05 РЦ-Р12 < 0,05

Р-Р Р * р-Рд<£ 0,05{ Р^-Р^О.Об Р2-Р6</0.05; рб-рю <0'05 Р3,7-РП^0'05 Р4,8-Р12^0'05 Р4-Р8>0'1

Примечание: Айт анти 8 или 10 - антиидиотипическая сыворотка к 8 или 10-дневными эмбрионам

ис 'ч 1

В последние годы уделено много внимания изучению роли коми-. лекса белков, объединенных общим термином р53. В процессе злокачественной трансформации и прогрессии опухолей (/ Аис,?с 7, ). Особый интерес к этому белку обусловлен его присутствием в различных типах опухолей и доказательствами его вовлечения в процесс ншортализацшг опухолей (/2.^ои'С^Р Очевидно, что описи- . ваемый нами феномен, имеющий черты самоподдерживающейся, автоколебательной системы также, вероятно, включен в процесс иммортаниза-ции опухолевой системы. Кроме того, белок р53 мояет быть отнесен к эмбриоспецифическим антителам, так кач в высоких количествах присутствует в клетках эмбриона (А ¿h-.it,и его экспрессия, возрастает (в сравнении с клетками дефинитивных тканей) при опухолевой трансформации (Д-^еСсик '?>)*)•

Вопрос о роли белка р53 в описанном нами в этой работе автостимула пролиферации клеток опухоли мы изучали с помощью монокло-нальных антител рАВ 421, полученных (Г. На ц/, Ога ,1981,

и любезно предоставленных нам д-ром Чумаковым И. В. (В-т молекулярной биологии АН СССР).

В этих опытах такяе изучали уровень синтеза ДНК в смешенной культуре опухолевых клеток Д"*А7 и РШ с клетками эмбрионов и пло-• дов, отвечающие и стимулирующие клетки обрабатывали рАВ 421 из расчета 0,5-1мкг (по белку) антител на 1x10 клеток. Результаты этих опытов представлены на рисунке

. Рисунок Ь

рьцМ-У

< -

I зьТ

"ЧГТ

ЗмТ

^ А7 Ш №5

Р1>2-Р3<0.05 РгР3<0,05

Р1]2-Р4(5>0,05 Р5-Р4>0'05

Р3-Р415'<0,05 РгР5 < 0,05

1 - контроль

2 - оп.клетки + эмбр.16дн.

3 - оп. клэтки + эмбр.Юдн.

4 - оп.клетки + эмбр.16дн., обработанные МАТ к р53

5 - оп.клетки + эмбр.Юдн., обработанные 1ЛАТ к р53

Сведения представленные на рисунке , свидетельствуют

об участии р53 в формировании автостимула пролиферации посредством иммунологического распознавания эмбриональных поверхностных, антигенов. Как видно на рисунке, обработка о уЯ?о клеток эмбриона антителами рАВ 421 блокирует их способность усиливать синтез ДНК в клетках опухоли. Таким образом, правомерно заключение, что белок р53 участвует в стимуляции синтеза ДНК в опухолевых клеток по описанному нами механизму. Обработка клеток опухоли

и ИМ антителами рАВ 421 не снижала их способности отве-. чать усилением синтеза ДНК в смешанной культуре с клетками, эмб- . рионов. Таким образам, эпитолы белка р53, расположенные на поверх^ ностной мембране клеток опухолей и эмбриона^участвуют в формировании автостимула пролиферации. ' . -Вчесте взятые;представленные в этой работе сведения позволяют сделать вывод, что существенными чертами опухолевой системы . является функционирование самоподдерживающегося процесса иммунологического распознавания своих собственных эмбриональных антигенов. Полученные результаты дают основание для предположения о том, что подобный механизм реализуется при эмбриогенезе. Заманчиво предположить, что прогрессирующий отбор, идущий в опухоли обусловлен . генерацией иммунологического разнообразия. Возможно, что избирательная инвазивная и метастатичеекая активность также обусловлена расширением в опухолях диапазона иммунологического разнообразия.

В первом приближении это мажет найти выражение в цитотоксической. избирательной активности клеток опухоли нг клетки нормального фенотипа.

С этой целью клетки сингенных эмбрионов и плодов мы метили

а в качестве клеток-киллеров использовали клетки опухолей (0 А7 0-Ш пассажей. Установлено, что цитотоксическое действие клеток опухоли (цитотоксический индекс - с, Г2 - с, ) выражено только в отношении клеток плода, но не в отношении клеток эмбриона. Полученные нами результаты совпадают по феноменологии с данными' фукса и соавторов (1982г.).

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что контакт поверхностных мембран опухолевых клеток приводит к стимула-ции синтеза ДНК в них. Стимуляция синтеза ДНК в опухолевых клетках, опосредованная контактом поверхностей реагирующих клеток, обусловлено иммунологическим распознаванием собственных поверхностных эмбриональных антих'енов. Характерным для этого феномена является то, что подобный механизм стагфляции синтеза ДНК функционирует в каждый момент существования опухолевой системы, выражен в разной степени и не коррелирует с исходным уровнем синтеза ДНК. Отсутствие корреляции между исходным уровнем • синтеза ДНК и состоянием "Компетентности" опухолевой системы к стимуляции синтеза ДНК в смешанной однонаправленной культуре с клетками эмбриона и гомологичными клетками опухоли, вероятно, объясняется наличием • разных.программ опухолевой клетки, контролирующих синтез ДНК: например, црограммой прогрессирующего отбора (собственно "опухолевой"), которая функционирует на основе описанного механизма автостимула пролиферации и программы нормального фенотипа, исходной для озлокачествления. Взаимодействие: рецептор иммунологического распознавания <-—» эмбриональный поверхностный анти-

ген как стимулятор синтеза ДНК действует в обеих направлениях. Весьма вероятно, что устойчивость в опухолевой прогрессии механизма автостимула пролиферации указывает на его самоподдерживающийся характер. Более того, процесс, результирующийся стимуляцией синтеза ДНК и устойчивый в опухолевой прогрессии есть основания рассматривать как условие ее реализации в качестве генератора разнообразия признаков.

Таким образом, в нашей работе впервые получены доказательства функционирования в опухолях иммунологического распознавания поверхностных эмбриональных антигенов как системы с положительными обратными связями. Участие эмбриональных стадиоспецифических ■ эволюционно консервативных антигенов в процессах генерации разнообразия признаков по указанному механизму делает оправленным предположение, что подобные процессы имеют место в эмбриогенезе.

Ранее ( р-ьсЬп 1972, Бабаева 1975,86) установлен факт позитивного контроля клетками иммунокомпетентной системы процесса в регенерации. Полученные нами результаты представляют собой основу для рассмотрения способа генерации разнообразия признаков системы иммунитета как субстрата клеточной и органной дифференцировки с определенного момента онтогенеза.

Необходимо учесть, что частные доказательства участия иммунологического распознавания как системы с положительными обратными связями в генерации разнообразия признаков позволяют . сделать лишь вероятностный вывод о том, что система иммунологического распознавания возникла и закрепилась в эволюции как спо-. соб генерации разнообразия. Два обстоятельства, взятые в совокупности, увеличивают правомерность такого вывода: это то, что в процесс вовлечены эволюционно консервативные эмбриоспецифические

антигены (повидимому, дифференцкровочныо) и что изменения в иммунной системе макроорганизма при онкогенезе в основных чертах совпадают с иммунологическими механизмами автостимула пролиферации опухолевых клеток.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что проблема имцунитет/оцухолеобразование по своему содержанию значительно шире рамок отношений "ингибация-стш^уляция". В самой опухоли экспрессированы иммунологические механизмы, которые участвуют не только в процессах иммортализации опухолей, но и в генерации разнообразия признаков опухолевой системы. Очевидно, это обстоятельство следует учитывать при разработке различных способов "иммунотерапии" опухолей. Результаты нашего изучения вносят новый аспект в проблему иммунологических взаимоотношений опухоль/организм, создавая предпосылки их рассмотрения с точки зрения взаимодействия "прогрессирующей" мнкропммунной системы (опухоль) и специфически измененной системы иммунитета организма'

-

выводы

1. В генетически селекционированной Ъо чувствительности .

к онкогенезу системе иммунологические взаимоотношения опухоль/организм представляют собой систему с полояптелышми обратными связями; мишенью иммуностимулирующего действия служат эволюцпонно консервативные, устойчивые в прогрессии признаки оиухоли - поверхностные эмбриональные антигены.

2. В опухолевой системе функционирует автостимул пролиферации на основе иммунологического распознавания своих собственных эмбриональных поверхностных антигенов.

3. Онкогенез и изменения иммунного статуса организма при онкогенезе имеют общую регуляторную основу.

4£Г

Список работ, опубликованных по теш диссертации

1. йщтнологические аспекты и кинетика цитопатологии аденовирусного канцерогенеза. Материалы объединенной научной сессии, посвященной столетию со дня рождения П.А.Герцена. М.,1971,с.14-18. (А.И.Агеенко). . •

2. Нммунодепрессивные состояния и иммуновоздействия на опу--холь в процессе аденовирусного канцерогенеза. Материалы П Всесоюзного съезда онкологов. Таллин, 1972, с.172-173. (А.И.Агеенко).

. 3. Исследование трансплантационных антигенов саркомы А-12. Труды по клинической и экспериментальной онкологии. М.1972. (А.И.Агеенко).

.4. Иммунодепрессия и канцерогенез. "Опухоль и организм". ' Материалы научной конференции. Киев. 1973» с.33-34. (А.И.Агеенко).

■ , 5. й.щунодепрессия и противоопухолевая, резистентность. Труды I съезда онкологов РСФСР. Уфа, 1973, с.489-492.(А.И.Агеенко).

6. Антигенная трансформация и иадунореактивность при аденовирусном канцерогенезе. Материалы Советско-Болгарского симпозиума по иммунологии опухолей. М.1973, с.3-4. (А.И.Агеенко, И.С.Еашкаев).

7. Иммунодепрессивное действие онкогенных вирусов. Балл. ' эксп.биологии и мед., 1974, й 5, 79-82. (А.И.Агеенко, Г.РЛ.Сухин).

8..Специфические факторы противоопухолевой резистентности в латентном периоде вирусного канцерогенеза. Материалы симпозиума "Факторы антиканцерогенеза". Кие.в, 1974, с.7-8. (А.И.Агеенко).

.' 9. Иммунологические механизмы вирусного онкогенеза. Тезисы докладов симпозиума "Иммунология опухолей". Киев, 1975, с.20-22. (А.И.Агеенко).

10. Аутореактивность спленоцитов мышей чувствительных линий в латентном периоде канцерогенеза, индуцированного вирусом/5''А7.. Вопросы вирусологии, 1976, й 6, 731-734. (А.И.Агеенко).

П. Иммуностимуляция роста сингенной саркомы- первично индуцированной у мышей аденовирусом обезьян^А7(с8). Вопросы онкологии, 1977, & 8, с.57-60. (А.И.Агеенко).

12. Иммунологические аспекты возникновения и прогрессии опухолей. В кн. Ш Всесоюзный съезд онкологов. Ташкент,.1979, с.136-137. (А.И.Агеенко).

13. Роль эмбриональных антигенов при вирусном канцерогенезе. В сборнике "Вопросы оикоиммунологии". М.1978, с 19-34. (А.И.Агеенко, И.С.Башкаев).

14. Рель эмбриональных опухолевоассоциированных антигенов в иммуностимуляции роста опухоли. Экспериментальная онкология. 1979, I, с.35-37. (А.И.Агеенко).

15. Изменение уровня дАМФ в клетках саркомы мышей, индуцированной вирусом^"1 А7, в динамике роста опухоли, ускоренного лимфоцитами от интактных сшгенных мышей. Вопросы онкологии, 1980,

й П, с.71-73. (А.И.Агеенко, Т.И.Кравцова).

16. Еластомогенные и иммунодепрессантные свойства вируса ^С А7. Вопросы онкологии, 1974, II, с.40-43. (А.И.Агеенко).

17. Аутоиммунитет и канцерогенез. В кн.."Иммунология и вирусный канцерогенез". Сборник научных трудов. М.1978, с.16-30. (А.И.Агеенко).

18. Иммунологические аспекты возникновения и прогрессии опухолей. В кн."Иммунологическая реактивность в патологии".Киев--5инница, 1979, с.3-4. (А.И.Агеенко).

19. К вопросу о природе автономности опухолевого рост. В* кн."Актуальные вопросы онкологии". Кемерово,1981, с.165-166. . (А.И.Агеенко).

20. Аденовирусный онкогенез. В кв. "Ш Всесоюзный съезд онко« логов". Ташкент, 1979, с.136-137. (А.И.Агеенко, И.С.Башкаев, Ю.Е.Виторган).

21. Новые подходы к изучению иммунологических отношений опухоли и организма. Цитология, 1982, Л 9, с.1038-1089. (А.И.Агеенко).

4822. Иммунология опухолевого роста. В кн."Актуальные вопросы, иммунодиагностика и нммунорегуляцип". Тезисы докладов научной конференции по проблемам клинической иммунологии. Таллин, 1982, с.110-112. (А.И.Агеенко).

23. Стимуляция роста опухоли неиммунныни сингеннши клетками селезенки. В кн."Актуальные вопросы онкологии. Тезисы докладов 12 Закавказской конференции онкологов. Ереван, 1982. с.446-447. (А.И.Агеенко).

24. Антигзнная трансформация и иммунологические взаимоотношения опухоль/организм. В кн."Иммунология опухолей". Рига. "Зинатне", 1982, с.36-41. (А.И.Агеенко, И.С.Бакаев, И.Я.Коган).

25. Иммуностимуляция опухолевого роста. Тезисы докладов .. Межреспубликанского симпозиума "Неспецифические стп.уляторы против опухолевой защиты. (А.И.Агеенко).

26. Опухоль и гомеостазис. В кн."Теоретическая иммунология -практическому здравоохранению". Тезисы докладов 1У научной конференции по проблеме иммунодиагностики. Таллин, 1978. (А.И.Агеенко).

27. О механизмах изменения массы центральных органов иммунитета при аденовирусном канцерогенезе. 'Ч&ил.экспер.биологии и мед.", 1978, й 9, с.356-358. (А.И.Агеенко, И.К.Свиридова).

28. Онкогены и канцерогенез. Вопросы онкологии, 1982, й 10, с.114-120. (А.И.Агеенко).

29. Исследование функциональной и структурной перестройки, клеток в динамике вирусного канцерогенеза. В кн."йгрускъй канце-. рогенез и его молекулярно-блологпческие аспекты". Труды симпозиума. М.1978. (А.И.Агеенко, Ю.К, Виторган, Т.Н.Кравцова).

30. Стимуляция >ч ^ I/"2. ^ синтеза ДНК клетками мышиной саркомы ^ А7 под влиянием грубых экстрактов тимуса. В кн. "Актуальные вопросы этиологии и патогенеза опухолей. 1.1.1982,с. 16-19. (Л.О.Агад-

31. Противоопухолевый эффект неираминлдазной вакцины оцухо-. левых клеток. Вопр.вирусолопш, 1980, 1я 3, с.292-295. (В.Д.Соловь-93, А.И.Агеенко, Н.Г.Гутман,'С.В.Мойснади).

32. Еммуностлмуляция опухолевого роста оцухоли. В кн.: .. "Новые подходы к вопросам иммунологии рана". Томск, 1984,0.30-46. (А.И.Агеенко).

33. Иммунитет к стадии специфически!.! эмбриональным антигенам. Экспер.онкология, 1985, 2, с.38-39. (А.И.Агеенко,Р.М.Авясов).

34. Механизмы автостимула пролиферации опухолевых клеток'на модели злокачественных новообразований, вызванных обезьяньим аде- . новирусом ¡PА7(С8). В кн.: "Первично-локализованные опухоли кро-- . ветворной ткани прпматов и пути их генерализации, 1986, с.37-39. (А.И.Агеенко, Р.М.Авясов, С.П.Гордиенко).

35. Динамика иммущ-эго ответа к различным группам опухолево-ассоцянрозанных антигенов при аденовирусном канцерогенезе. В кг.:. "Злокачественные лпмфош и ассоциированные с ними лимфотропкые вирусы: - Труды Всесоюзного симпозиума. 1986, с.160-171.

36. йлмуностшудяцг'я опухолевого роста. - Тезисы доклада Межреспубликанского симпозиума: "Неспецкфические стимуляторы противоопухолевого иммунитета. Рига, 1983, с.50-51. (А.И.Агеенко).

37. Значение иммунологического распознавания эмбриональных стадаоспецифических антигенов в процессах возникновения и прогрессии опухолей. - В сборнике научных трудов: "Радионуклидные и ра^ даоиммунологдческке методы в онкологической клинике". Фрунзе, 1984, с.71-73 (А.И.Агеенко, М.Р.Авясов).'

38. Роль эмбриональных поверхностных опухолеассоциирован-кых антигенов в формировании автостшдула пролиферации опухолевых, клеток. - В кн.: "Ноше подходы к вопросам ищунолопш рака". Материалы рабочего совещания, декабрь 1984. Кемерово, 1986, с.56-57

(А.И.Агеенко).

39. Новое в вопросе иммунологических взаимоотношении опухоль/организм (механизма автостимула пролиферации). - В кн.: "1У съезд онкологов СССР"- тезисы доклада, 1986, с.436 (А.И.Агеенко, Р.М.Авясов).

40. Возможности разработки методов иммунодиагностики опухолей. - В кн. "Ш-й Всероссийский съезд онкологов". Тезисы доклада. Ростов-на-Дону, 1986, с.481-482.

41. Возможная роль эмбриональных поверхностных антигенов в формировании автос пнула пролиферации опухолевых клеток. - Экспер онкология, 1986, 2, с.36-40. (А.И.Агеенко, Р.М.Авясов).

42. Клеточный иммунитет к эмбриональным стадиоспецифичес-ким антигенам в динамике аденовирусного канцерогенеза. - В кн.: "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физио логических и патологических состояниях". Челябинск, 1986, с.54-56 (А.И.Агеенко, Р.М.Авясов).

43. Значение иммунологического распознавания эмбриональных антигенов в опухолевой прогрессии. - Тезисы Международного симпозиума. Дагомыс, май 1984, с.25-;29 (А.И.Агеенко,Р.М.Авясов).

44. Механизмы автостимула пролиферации опухолевых клеток. -Тезисы доклада УП съезда онкологов УССР. Киев,1985, с.36-38. (А.И.Агеенко).

45. Иммунологические аспекты опухолеобразования. - Тезисы доклада; в кн.: "Биофизика рака". I Всесоюзное совещание. Черноголовка, 1987,с.5.

Материалы диссертации докладывали и обсуждели на П,Ш и 1У Всесоюзных-съездах онкологов (1972, 1979, 1986, Таллин, Ташкент, Ленинград): на 1,Ш Всероссийских съездах онкологов (1973, Уфа; 1986, Ростов-наг-Дщгг); на УП съезде онкологов УССР (1985г.), на

совещании по международному сотрудничеству со странами СЭВ (1980г.); на Советско-Болгарском симпозиуме по иммунологии опухолей (1973г.); на рабочем совещании онкологов (г.Кемерово, 1981,1986г.); на симпозиуме "ЯЕЛмунологпческая реактивность в патологии (Киев-Виннлца.1979); на Всесоюзном симпозиуме "Злокачественные лпглромы и ассоциированные с ними лимфотрошше вирусы" (Сухуми, 1986.); на межреспубликанском симпозиуме "Неспецифичес-*ие стимуляторы противоопухолевого иммунитета (Рига, 1982г.); ¿а I Всесоюзном рабочем совещании. Вюфпзпка ра:-:а (Черноголовка, [937.).