Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Иммунологические аспекты антифосфолипидного синдрома

С4-ЗУРлГ

На правах рукописи

НОВИКОВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ АНТИФОСФОЛИПИДНОГО

СИНДРОМА

14.00.46 — Клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ ' диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2003

Работа выполнена в лаборотории клинической иммунологии НИИ кардиологии им. А.Л, Мясникоаа Российского Кардиологического Научно-производственного комплекса МЗ РФ.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

професор, член-корр. РАМН Насонов Евгений Львович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор

Кандидат биологических наук, доцент

Резников Юрий Петрович

Гривенников Игорь Анатольевич

Ведущая организация: Институт иммунологии МЗ РФ (Москва)

Защит» диссертации состоится « » г. в на заседании диссертационного

совета КР,208.071.32. в Российской Медицинской Академии Последипломного Образования, не адресу:! 23995, г. Москва, ул. Баррикадная, 2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке РМАПО (г.Москва ул. Беломорская, 19)

Автореферат разослан «17» ноября 2003г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор биологических наук,

профессор Яровая Г, А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время клиническая медицина обогатилась большой группой новых лабораторных методов, позволяющих более полно оценить характер патологических изменений иммунной системы при аутоимуиных ревматических заболеваниях, К наиболее информативным иммунологическим маркерам относятся: органокеспецифкческне аутоантитела, белки острой фазы воспаления, маркеры активации клеточного иммунитета и дисфункции эндотелия (Huges G.R.V., 1983; Matsuura Е. И соавт,, 1990; Gearing AJ. и соавт., 1993; Gabay С., Kushnewr I., 1999).

В последние годы особое внимание уделяется исследованию антител к фосфо лил идам (аФЛ)-большой группы органонеспецифическнх аутоантител, реагирующих с антигенными детермнн антами фосфолипидов и/или фосфолип и довязывающих белков (Насонов Е.Л. и соавт., 1996). Гиперпродукция аФЛ ассоциируется с развитием антнфосфолипидного синдрома (АФЛ), характеризующегося двумя основными клиническими проявлениями: рецидивирующие венозные или артериальные тромбозы и акушерская патология в виде привычного невынашивания беременности и внутриутробной гибели плода. (Wendell A. Wilson и соавт, 1999). Лабораторными критериями АФС являются IgG и IgM антитела к карднолипину (aKJI), выявляемые иммуноферменткым методом (ИФМ) и волчаночный антикоагулянт (ВА), определяемый с помощью фосфолип идзависнмых коагулогнческнх тестов (Насонов Е.Л. и соавт., 1999). При АФС аКЛ наиболее эффективно связываются с кардиолипином (КЛ) в присутствии белка плазмы ßy-гликопротенна I (р^-ГШ). Фактически аКЛ реагируют с антигенными детерминантами не кардиолипина, а конформационнымн эпитопамн рг-ГПЦ экспедирующимися в процессе взаимодействия ßj-ГТП и КЛ Мишенью аФЛ аутоиму иного происхождения в настоящее время считают либо ргГШ, либо его комплекс с анионным» фосфолнпидами (Roubey R., 1996), Обнаружение антигенных эннтопов ßj-ГЩ распознаваемых аутоиммунными аФЛ с использованием соответствующих синтетических пептидов имеет важное значение для уточнения молекулярных механизмов патогенеза АФС. Поскольку в фетальной сыворотке использующейся для определения аКЛ, содержится ßz-ГТП, полагают, что с помошью стандартного ИФМ можно выявить как aßj-ГШ, так и антитела, реагирующие собственно с КЛ. Более специфичный метод определения арз-ГТЦ, основан на использовании "иммобилизнрованиого" на твердой фазе ßrlTTI в ИФМ (Tmcani А., н соавт. 1996; Amengual О.,

с

; ■ ■ О" < 4

1996), По данным литературы аКЛ обладают более высокой "чувствительностью", а ар^-ГТИ — "специфичностью^ Amengual О., и со авт. 1996; Tsutsumi А.. и соавт. 1996; Detkova D. И соавт., 1999) в отношении диагноза АФС, однако результаты исследований противоречивы, что связано с отсутствием стандартизованного на международном уровне метода определения aßi-ГШ. Существенное значение в иммунопатогенезе АФС придают цитокин-индуцированной гиперэкспрессии клеточных молекул адгезии (КМА) (Osborn L, и соавт,, 1989), Установлено, что аФЛ облапают способностью индуцировать экспрессию некоторых форм КМА, в том числе lä-сепектана, Р-селектина, межклеточной молекулы адгезии (ICAM-1) и сосудистой клеточной молекулы адгезии 1 (VCAM-1) ка поверхности эндотелиальных клеток (Simantov R. и соавт,, 1995). Прогресс в изучении КМА при заболеваниях человека во мвогом связан с открытием методов определения растворимых иэоформ КМА (рКМА) и разработке методов их определения в биологических жидкостях. Установлена связь между синтезом рКМА и выраженностью экспрессии КМА на клеточных мембранах (Leeuwenbeg J. и соавт,, 1996). Повышение концентрации рКМА в сыворотке крови наблюдается при многих воспалительных, аутоиммунных, инфекционных, опухолевых заболевания, атеросклеротическом поражении сосудов и при системных васкулитах (Koch А.Е и соавт,, 1991; Pigott R. и соавт., 1992; Gearing A.J.H. и соавт,, 1993; Sfikakis P.P. и соавт., 1994; Price D.T. и соавт., 1999), Однако данные касающиеся клинического значения рКМА при АФС весьма немногочисленны (Kaplanski G. и соавт., 2000),

С-реактивный белок (СРБ) -классический острофазовый белок, синтезирующийся а ответ на воспаление и тканевое повреждение (Насонов ЕЛ. и соавт., 2002). Показано, что у больных системной красной волчанкой (СКВ) повышение СРБ, ассоциируется с развитием тромботических осложнений и обнаружением аКЛ (Клюквина Н.Г. и соавт., 1999). По данным литературы, увеличение концентрации СРБ является предиктором тромботических осложнений у больных ИБС (Насонов ЕЛ. и соавт,, 2002). р2-ГП1- зависимое связывание аФЛ с эндотелиальнымн клетками, не только вызывает активацию эндотелия, проявляющуюся гиперэкспрессией КМА, но и индуцирует продукцию "провоспалительныч" цитокинов ИЛ-б и ИЛ-t (Del Papa и соавт., 1997). В свою очередь эти цитокины являются основными медиаторами, индуцирующими синтез СРБ. Имеются сведения о том .что СРБ может вызывать активацию ЭК "in vitro" ( Paseen V, и соавт., 2000). Все это может свидетельствовать о патогенетической связи между аФЛ-зависимой активацией сосудистого эндотелия, субкдинически текущем воспалением сосуда стой стенки и развитием тромботических осложнений у больных АФС.

Изучение аФЛ, маркеров активации эидотелиальных клеток и острофазового ответа иммунной системы больных АФС в комплексе с клиническими данными может иметь важное значение как с теоретических позиций е плане уточнения патогенетических механизмов АФС, так и с клинической точки зрения, для определения степени активности патологического процесса» диагностики, оценки результатов лечения и прогноза заболевания.

Цель работы

Изучить диагностическое и патогенетическое значение аФЛ при АФС; характер взаимосвязи между гиперпродукцией аФЛ и хлинико-лаборзториымн особенностями АФС.

Задачи работы

1. Разработать ИФМ определения IgG af^-illl.

2. Изучить кофакторную активность пептидных фрагментов рг-ПП у больных АФС.

3. Исследовать "чувствительно«," и "специфичность" определения аКЛ и IgG арг-ПП при АФС.

4. Исследовать уровень маркеров активации эндотелия рКМА (рР-селектин, рЕ-селектин и pVCAM-1) в сыворотке больных АФС

5. Изучить концентрацию С-ре активного белка при АФС,

Научная новизна

Впервые проведено комплексное изучение иммунологических нарушений при АФС. Показано, что IgG арг-1 ILL являются высокочувствительным и специфичным лабораторным маркером для диагностики АФС и его основных проявлений, в том числе тромботнческнх осложнений. Выяснено наличие кофакторнон активности у рептиднъЕх фрагментов ¡};-ГШ: Р7, PS, Р9, Р5. Исследование молекулярных механизмов взаимодействия аФЛ с ФЛ, позволило уточнить патогенетическое значение аФЛ в развитии артериальных и венозных тромбозов у больных АФС, Показано, что гиперпродукция аФЛ ассоциируется с повышением уровня рКМА и СРБ. Выявлена прямая корреляция между уровнем рЕ-Селектина, pVCAM-1 и концентрацией СРБ при АФС.

Практическая значимость

Полученные данные имеют важное значение для уточнения иммунологических критериев диагностики АФС, а так же для изучения роли иммунологических нарушений в патогенезе тромботических осложнений при АФС.

Публикация

По теме публикации опубликовано 7 печатник работ.

Объем н структура ди«ертацяв Основной текст изложен на стрзнице машинописного текста. Диссертация состоит нэ введения, 3 глав, обсуждения, выводов. Библиографический указатель включает 170 источников, из них 11 отечественных и 159 иностранных. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами, 35 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы исследования

Общая клиническая характеристика больных ПАФС, СКВ с АФС и СКВ Всего обследовано J15 больных АФС и СКВ. У 19 больных (5 мужчин и 14 женщин в возрасте от 14 до 33 лет, средний возраст Зб,9±10Д года.) с отсутствием клинических и лабораторных признаков СКВ был днагносцирован ПАФС. У 23 больных (10 мужчин и 13 женщин в возрасте от 19 до 58 лет, средний возраст 35,3±11,6 года) отмечался вторичный АФС, ассоциирующийся с СКВ (СКВ с АФС). Группу сравнения составили 72 больных СКВ (13 мужчин и 60 женщин в возрасте от 18 до 48 лет, средний возраст 29,0±9,0 года.) без клинических и лабораторных признаков АФС. Диагноз АФС основывался на критериях (Wilson W.A. и coaвт., 1999), СКВ основывался на критериях Американской Ревматологической Ассоциации (Tan Е,М, и соавт., 1982). Для количественной оценки активности СКВ был использован индекс S LED Al Частота клинических признаков АФС представлена в табл. 1.

Таблица I.

Частота основных клинических признаков АФС у 42 больных

Клинические приэики КйлИЧКГВО % 01 об лею

больны! нлжветш

Артериальные троибозы 14 * 33.3

Венозные тромбозы 11 26,2

Артериальные + венозные тромбозы 13 31,0

Все го тромбозов зе 905

Привычное невынашивание а/24 333

беременности

Трс мбоцитопення в 19.0

Сетчатое ливедо 13 42.6

Язвы голеней 9 21.4

Гемолитическая анемия 2 «а

Поражение клапанов сердца 6 12.0

Церебральные нарушения 19 45.2

(ишвмиивский инсульт, нарушение

мозгового

кровообращения, преходя щио

нарушения мозгового

кровообращения)

Концентрацию IgG и IgM aKJI в сыворотке крови измеряли ИФМ и выражали в международных стандартны* единицах GPL и MPL. Верхние границы нормы составили соответственно 23,0 GPL (M+Sa)n 26,0 MPL (М+5ст) (Александрова E.H. и соавт., 1986), Согласно международным рекомендациям были выделены следующие уровни позитивности IgG и IgM аКЛ: низко позитивный (23,0-30.0 GPL и 23,0-35,0 MPL), умеренно позитивный (30.0-60,0 GPL и 35,0-45,0 MPL) и высоко позитивный (более 60,0 GPL и более 45,0 MPL). Содержание IgG арг-ГШ в сыворотке крови выражали в международных стандартных единицах SGU. Верхняя граница нормы составила 9,3 SGU (М+Зст) (Lewis S,, и соавт,, 1998). При этом были выделены следующие уровни позитивности IgG aß2-l iu: низко позитивный (9,3-23,0 SGU), умеренно позитивный (23,0-60,0 SGU) и высоко позитивный (более 60,0 SGU),

В контрольную группу вошли 330 здоровых доноров, соответствовавших по полу и возрасту обследованным больным. Исследуемые сыворотки хранили при температуре -70°С, При статистической обработке результатов использовались* тесты Крускалл-Уоллеса, Манн-Уитни, Стьюдента, также использовалась компьютерная программа "Slatistica'99"(StatSofi,Inc.) Чувствительность и специфичность аФЛ рассчитывали согласно рекомендациям VamvakasE СЕ,С.(1998):

чувствительность - а

а+с

специфичность^ d

d+в

где а — количество больных, истинно положительных no IgG аКЛ/ IgG ар2 -ГШ с достоверным диагнозом АФС/тромбозамн; в - количество больных, ложно положительных по IgG аКЛ/ IgG ар2-ГП1 без АФС/тромбоэов; с - количество больных, ложно отрицательных по IgG аКЛ/ IgG арг-ГШ с достоверным диагнозом АФС/громбозамм; d количество больных, истинно отрицательных по IgG аКЛ/ IgG арг-ПН без АФС/тромбозов.

¡Ь-ГГП выделяли аффинной хроматографией из сыворотки крови здоровых доноров.

Пулированную сыворотку фракционировали сначала на колонке "Ш TRAP PROTEIN А

SEPHAROSE" (Pharmacia), уравновешенной фосфатно-солевым буфером (ФСБ), pH 7,4.

Проходящий раствор собирали и наносили на колонку "HI TRAP HEPARIN A SEPHAROSE"

(Pharmacia), Элюцию фракций содержащих рЬ-ГШ, осуществляли 0,35 М раствором NaCl в

ФСБ. Собранные при 2S0 нм фракции объединяли, ди авизировали против ФСБ в течение ночи

7

при +4С и хранили при -40С не более 30 дней. Концентрацию белка определяли спектро фотометрически при 2S0 и 260 нм, IgG больных <п=3) и доноров (п=2) изолировали из сыворотки или плазмы модифицированным методом аффинной хроматографии на колонке "Ш TRAP PROTEIN A SEPHAROSE" (Pharmacia). Сыворотку разводили в 2 раза ФСБ, рН 7.4 и наносили на коленку, Элкщию фракций, содержащих IgG, проводили 0,2 М глициновым буфером, рН 2,8. Полученный препарат IgG обрабатывали далее в соответствии с процедурой, приведенной выше при выделении ргГШ.

Пептиды были синтезированы твердофазным методом на автоматическом синтезаторе Applied Biosistems, модель 431 А, с использованием коммерческих Ftnoc-аминоащи полимеров (смола Ванга, степень замещения 0.S - 0.7 ммоль/г). В работе использованы синтезированные антигенные детерминанты Р2-ТП1, отобранные с учетом гидрофильности участков аминокислотной последовательности, подвижности а-углеродного атома аминокислот и встречаемости сочетания аминокислот в известных детерминантах (Кузнецова Т.В, и соавт,, 1999):

Ы0 GIy-Arg-Thr-Cys-Pn>-Lys-Pro-Asp-Asp-Leu(Pl) 1-13 Gly-Axg-Thr-Cys-Pio-Lys-Pro-Asj>Asp-Leu-Pro-Phe-Ser(P2) 96-112 Tyr-Leu-Asn-Gly-Ala-As p-Cys-Ala-Ly s-Cys-Thr-G) u-GI u-Glu-Lys -Trp-Set(P3) 102-138 Pro-lle-De-Cys-Pro-Pro-Pro-Ser-I]e-Pro-Thr-Phe-Ala-Thf-Leu-Arg-Val-Tyr-Lys(P4) 280-289 Phe-Cys-Lys-A$n-Lys-Gtu-Lys-Lys-Cys-Ser(P5) 313-326 Leu-Ala-Phe-Tfp-Ly3-Thr-Asp-Ala-Ser-Asp-VaI-Lys-Pro-Cys(P6), а также вновь синтезированные пептидные фрагменты р?-ГТП: 263-279 Lys-Asn-Giy-Met-Leu-His-G1y'Asp-Lys-Val-Ser-Phe(P7) 249-267 Val -Lys-Lys-Ala-Ihr-Val-Val-Tyt-G) n-Giy-Gl u-Arg-Val-Lys-Il e-Gln-Glu-Lys-Ph e(P8)

200-220 Pro-AJa-Ly s-Pro-Thr-Leu-Tyr-Ty г-Lys-Ai p-Lys-AJa-Thr-Phe-Gly-Cys-Hi s-Asp-Gly-Thr-Sei(P9)

Кофакторную активность очищенной фракции рг-ГТП оценивали модифицированным ИОМ. Кардиолипин в этаноле наносили микроплашку (PVC, Flow Laboratories, Нидерланды) и до полного удаления спирта. Места неспецифического связывания блокировали раствором желатина в ФСБ. Затем в лунки добавляли реакционную смесь, содержащую IgG или пробы сыворотки в разведении 1:100 и 6,6 мкг ргГП1 в буферном растворе. Плашки инкубировали. Затем в лунки добавляли IgG-фракцню козьих моноспецифических антител к IgG человека, меченных пероксидазой хрена ("Sigma", США) н инкубировали. После каэкдой инкубации

плашку промывали ФСБ. Пероксццазную реакцию проводили в растворе, содержащем ортофемнлендиамин (ОФД) и перекись водорода, останавливали ее добавлением 50% серной кислоты и регистрировали оптическое поглощение прн длине волны 492 нм. Процент связывания, обусловленного присутствием кофактора (рг-ПП) вычисляли следующим образом-. % связывания = (1- ОП1 /ОГО) х 100, Где: ОП1 - оптическая плотность при связывании без кофактора, ОП2 - оптическая плотность при связывании в присутствии кофактора.

аРз-ГП! и степень связывания пептидных фрагментов ргГГП определяли ИФМ В лунки лолистироловые микроплат ("Нипс тахиогр") вносили по 0,05 мл выделенного ^О а^г-ГГО или пептидного фрагмента Рг-ГШ в ФСБ в конечной концентрации 40 мкг/мл и инкубировали при +14°С в течении 18 часов. Лунки планшета с иммобнлизированным на твердой фазе ар2~ГП1 или пептидным фрагментом Рг-ГШ промывали Э раза 0,15М фосфатно-со левым буфером (ФСБ) по 0,2 мл. После отмывки избытка АГ в лунки вносили по 0,1 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА.) в ФСБ и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Планшет промывали 3 раза ФСБ с добавлением 10% Т\УЕЕЫ-20 , в лунки вносили по 0,05 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:100 в ФСБ и инкубировали 1 часа при комнатной температуре. Лунки промывали 5 раз ФСБ для удаления не связывающихся АТ. Затем в лунки вносили по 0,05 мл кроличьих АТ, меченных пероксидазой, против (в разведеннн 1:500) человека, распознающих связавшиеся с КЛ специфические АГ, и инкубировали 1,5 часа при комнаткой температуре. Не связавшиеся коньюгаты отмывали ФСБ 5 раз, после чего в лунки йюснли по 0,1 мл субстратного раствора (0,05% ортофен клепан амин (ОФД) и 0,01% перекись водорода в 0,1М цитратн о-фосфатном буфере (ЦФБ)). Планшет выдерживали в неосвещенном месте 15-30 минут. После появления желтой окраски в результате действия пероксидазы на субстрат реакцию останавливали добавлением в лунки по 0,05 мл 50% раствора серной кислоты и немедленно производили измерение оптической плотности (ОП) при длине волны 495 нм. Каждое исследование осуществлялось в дубликатах. При учете результатов реакции из средних арифметических значений ОП позитивного стандарта, отрицательного контроля и тестируемых сывороток вычитали среднее арифметическое значение ОП разводящего раствора (10% раствор ФТС в ФСБ), Полученные показатели ОП исследуемых образцов переводились в единицы концентрат!и БРЬ и МРЬ, пользуясь калибровочной кривой зависимости логарифма ОП стандарта от логарифма концентрации аКЛ, описанной уравнением линейной регрессии; ^е(ОП)=а+Ь'^е(аКЛ), где значение коэффициент "Ь", выражающего наклон кривой линейной регрессии, в пределах чувствительности метода для каждой постановки должно быть не менее

Также при определении IgG aßi-ITII в сыворотке крови, использовалась коммерческая тест система "QUANTA Lite ß2-GPI IgG" фирмы INOVA Diagnostics, Inc.

Определение содержания рР-Сеяектина, рЕ-Седектна и pVCAM-1 в крови человека осуществлялось ИФМ с использованием наборов фирмы "R&D Systems" (Minneapolis USA) согласно инструкции фирмы изготовителя.

Определение концентрации СРБ производилось ИФМ.В лунки полистнрсдовых микроплат вносили по 0,05 мл кроличьих антител к CK человека ( по 0,05 мл кроличьих антител к СРБ человека (DAKO A/S CODE № А073) разведенных в 1.800 в 0,05 M карбонатном буфере (рН=9,б) и инкубировали при 4 "С в течении IS часов. Лунки микроплат с иммобилизированным на твердой фазе антителами к СРБ промывали 3 ршза 0,15 M фосфатио солевым буфером (ФСБ) (рН=7Д) содержащим 0,05% TWEEN-20 (ФСЕ-Т). В луики вносили по 0,05 мл тестируемых сывороток, контрольных сывороток, калибратора и СРБ в разведении t/10000 в ФСБ-Т с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (ФСБ-Т-ФТС).

После инкубации в течении 2 часов при 37 'С лунки микроплат промывали 3 раза ФСБ-Т. Затем в лунки вносили по 0,05 мл. кроличьих антител , меченых пероксидазой против СРБ человека (DAKO CODE Jé PÛ277), в разведении 1/1000 и инкубировали 2 часа при 37 "С, Планшеты отмывали 3 раза ФСБ-Т, после чего в лункц вносили по 0,1 мл. субстратного раствора (0,05% ортофеинлендиамни и 0,01% перекись водорода в 0,15 M ЦФБ, рН=5.0). Микро платы выдерживали в темном месте в течения 20-25 минут, после появления желтой окраски, вызванной действием пероксидазы на субстрат, реакцию останавливали добавлением в луики по

0.05 мл 50% раствора серной кислоты и незамедлительно производили измерения ОП на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Результаты исследована» и hi обсуждение.

1. Определение кофактор ной активности ßi-1'Ш

В таблице 2 представлены результаты исследования связывание IgG, изолированных из сыворотки донора и 3 больных с АФС, с кардиолипином в присутствии fb-ПШ в зависимости от концентрации вносимых IgG и р^-ГГО. Установлено, что связывание препаратов IgG, полученного от больных с АФС, с иммобилизированным на твердной фазе кардиолипином возрастает по мере увеличения концентрации как IgG так и ßi-ГШ и практически не изменяется при исследовании IgG донора.

Таблица 2,

Связывание донора и больных АФС о кардиолипином ИФМ в зависимости от концентрации; (а) (концентрация у донора р2-ППГ132 мкг/мл); (6) РгПН (концентрация АФС-1-300 а)

Концеїггрвния р-2-ГТП, мит/ил Оптнчсскяя плотность при 492 ни

16,5 0.064

ЗЇ 0.123

66 0.184

132 0,714

Добавление Рі-ГТЇЇ не оказывало естественного влияния на связывание с кардиолипиком сывороток доноров и больных СКВ без аКЛ. В то врем* как при изучении больных с аКЛ отмечена существенная гетерогенность влияния РгГГО на связывание фракций с кар дно лип ином. В большинстве проб (2, 3, 4, і) наблюдалось значительное увеличение связывания фракции сывороток в присутствии Рз-ГШ, в пробах I, 6, 7 и 8 связывание фракции с мрднолишном практически ие менялось, а в пробе 9, 10 наблюдалось некоторое его снижение (табл.З).

Таблица 3.

Связывание аКЛ с кардиолипиком в иммуноферментном анализе.

Л» выворотки Нет кофактора Добавят 61Ш1

1 0,133 0,138

2 0,319 0,743

3 0,690 1,069

4 0,997 1,417

5 ОД? 1,391

б 0,877 1,126

7 0,678 0,697

8 0,505 0,342

9 1,899 1,829

10 1.139 0,896

г/мд)

Кояцентрацля Мкг/ил АФС-1 АФС-1 АФС-Э ДвІГОр

0 0 0 0 0

75 0,163 0,ІЇ5 0,37 0,034

НО 0,403 0.792 1,082 0.04

300 о.зи 0,659 1,090 0.03

2. Изучение степени связывания аФЛ с пептидными фрагментами pi-ГШ.

При изучении сывороток доноров (п=5) среднее значение уровня связывания пептидных фрагментов свойственных V домену Рз-ПЛ (ед, ОН) (М ± SD) составили дня: Р5: 0,171 ±0,027, Рб: 0,190±0,026, Р7: 0.223±0,028, PS: 0.211 ±0,019, Р9: 0,223+0,031, PS-Aig: 0.182±0.046 (ед. О .П.). Среднее значение степени связывания пептидных фрагментов при АФС (п=36) составили для: Р5: 0,253±0,121, Р6: 0,371 ±0,209, Р7: 0,396±0,222, Р8 0,366+0,199, Р9: 0,371±0,215, P5-Arg: 0,410±0,197 (ед. О.П.) (р<0.05). При изучении IgG аКЛ позитивных сывороток (>20 GPL) средний уровень связывающей активности AgP5(Acm) (0.444*0.231 ед О.П.) и ßrlTII (0,355±0,231 ед.ОЛ) достоверно превышал соответствующие значения для IgG негативных сывороток (<20GPL)-{0.282±Q.I01 и 0,187±0,451 ед О.П. р<0.05).

Кроме того у IgG- позитивных больных АФС обнаружена более высокая частота выявления связывающей активности пептидных фрагментов ßH HL Было установлено, что в группе больных АФС с высоким значением IgG aKJI (>20 GPL), пептидные фрагменты проявили связывающую активность у большего количества больных (Р5-у 66,0%, Рб - 93,1%, Р7 - 83,0%, Р8 - 93,1%, Р9- 90,0% и AgP5(Acm) - 90,0%), чем в группе низким значением IgGalOI (<20 GPL) (Р5-у 57,1%, Рб - 71,4%, Р7 - 57,1%, Р8 - 71,4%, ?9- 22^% и AgP5(Acm) - 71,4%). В группе больных с диагнозом АФС наибольшей степенью связывания обладают пептидные фрагменты Р7, Р8, Р9, и AgP3(Acm) и она достоверно вьппе, чем у ill (р<0.05). Таким образом, наибольшее значение в процессе взаимодействия рт-ГП! с аФЛ имеют пептидные фрагменты Р7, Р8, Р9 и ArgP5(Acm), что согласуется с данными других исследователей, предполагавших наличие антигенных детерминант в соответствующих участках (32-ГШ (Wang М. и соавт., 1995; Lauer S. и соавт., 1993, Takeya Н. и соавт., 1997).

Место расположения большинства аФЛ связывающих эпитопов р2-ГШ еще не известно, но существующие данные подтверждают и* существование в разных участках молекулы (Giles 1Р н соавт., 2003). В последнее время появились данные о том, что не только V ио к I (амино терминальный) домен молекулы ß2-\ Ш содержит эпитопы ответственные за связь как с аннтелами к самому р2-ГШ, так и с аКЛ (Bouma В. и соавт,, 1999; Redde) S.W. и соавт., 2000; McNeetey P.A. и соавт., 2001). Считают, что в большинстве случаев аФЛ узнают именно 1 домен ¡32-ГП1. Изучение кристаллической структуры (Й-ПП, позволило предположить что положительно заряженний V домена протеина служит для связывания с фосфолипидной мембраной, с 1 доменом связываются аФЛ, а Ü домен содействует связыванию р2-ГТП с фосфолипидной мембраной, возможно из-за высокой аффинности двухвалентного комплекса "IgG- ßI-ГШ (Norden D, и соавт., 1995; Belmont Н.М. и соавт,, 19%)

3. Антитела к фосфол ипидам.

3.1 IgGitlgMaKfl

Уровень IgG аКЛ в сыворотках крови у больных ПАФС (69,9± 116,0 GPL) и СКВ с АФС (60,5±68,9) был достоверно выше, чем у больных СКВ (19,5±27,6; р=-0,0025) и доноров (3.9±0.3 GPL; р=0,0001). Достоверных различий по уровню IgG аКЛ между группами больных ПАФС и вторичным АФС ие выявлено (р>0.05) {рис. 1). Рисунок 1.

Уровень IgG аКЛ у больных ПАФС, СКВ с АФС, СКВ и доноров.

550 500 4» 400 350 300 250 200 (50 100 «I

о -id иоо

Уровень IgM аКЛ в сыворотках крови у больных ПАФС (27,0±17,0 MPL) и при СКВ с АФС (47,4±43,0 MPL) был достоверно выше, чем у доноров (7,5±0,4 MPL);( р=0,0000, р-0,0003) (рнс.2) При венозных тромбозах отмечался более высокий уровень IgG аКЛ (119,4 ±31,4 GPL) чем при артериальных (pf=0,002).

Уровень IgM аКЛ при ПАФС был ниже соответствующего показателя при СКВ с АФС (р=0,0001) и при СКВ (34,0±85,б MPL; р=0,0001), В целом повышенный уровень IgM аКЛ выявлен у 52,6 % больных ПАФС, у 82,6% больных СКВ с АФС к у б,б% больных СКВ,

3.2 IgG ар,-ГШ

Уровень IgGaPi-ПП при ПАФС (74,I±117,4 SGU) н СКВ с АФС (6б,2±88,3 SGU) был достоверно выше, чем при СКВ (14.5±41.9 SGU) (р=°0,0000) и у доноров (5,7*1 Д SGU);

6PL

ПАФС СКВ с АФС СКВ Донсви

Рисунок 2.

Уровеньбольных ПАФС, СКВ с АФС, СКВ и доноров.

pl

JM -----

«Н

о

IN

и1'»

о

8 о. о о

cratAoc

СКВ

Диары

(р=0,0014т р=0,0012) (рис. 3), Достоверных различий по уровню IgO арз-ГП! между группами больных ПАФС и вторичным АФС с СКВ не выявлено.

В целом, повышенный уровень IgG ар2-ПП вьивлен у 57,9 % больных ПАФС, у 61,9% больных СКВ с АФС ну 21,9% больных СКВ,

При венозных тромбозах отмечался более высокий уровень IgG ajVl ill (259,5±I09,5 SGU) по сравнению с данным показателем при артериальных тромбозах (120,8134,2 SGU, р =0,004 ), а также при артериальных и венозных тромбозах (131,4±19,2 SGU р=0,04), Повышение уровня IgG аРз-ПП у 3 из 8 (37,5%) больных с ПНЕ, а также у 5 из 7 (71,4°/») больных с ТЦП. Полученные результаты подтверждают материалы других авторов и данные наших предыдущих исследований о связи между гиперпродукцией аФЛ и развитием АФС (Batka N. и совет., 1995; Martinuzzo М,Е. и соавт., 1995; Guerin X, и соавт,, 1997;РешетнякТ.М. и соавт,, 1998; Carreras L.O, и соавт,, 2000; Кузнецова Т,В. и соавт,, 1998), Уровень IgG аКЛ и JgG аДгПЦ у больных ПАФС и вторичным АФС достоверно выше, чем у больных СКВ без АФС, При этом отмечена достоверна* корреляция между концентрацией IgG ар JT1I и IgG аКЛ(при ПАФС: г=0.85,р<0.05; при СКВ с АФС: г=0.9,р<0.05), что также совпадает сданными других исследователей (Amengual О, и соавт., 1996; DetkovaD. и соавт,, 1999) Результаты данного исследования

Рисунок 3.

Уровень IgG арг-ПП у больных ПАФС, СКВ с АФС, СКВ и доноров.

,„ sou____

«Юр ■ -.-

пис сюсмс сю донора

говорящие о тесной связи между повышением уровня аФЛ и развитием тромбогических осложнений в рамках АФС хорошо соответствуют материалам других автор» (Matsuura Е, н соавт., 1992; Horbach D.A. и соавт., 1996; Harris E.N. н соавт,, 1998; CanerasL.O. и соавт., 2000).

3Л Чувствительность н специфичность методов определения aKJI и IgG api-ГШ.

Данные чувствительности и специфичности аФЛ относительно АФС н тромбозов при использовании верхних границ нормы для IgG аКЛ- 23 GPL; IgM - 26 MPL и для арз-ПТГ 9,4 SGU, представлены в таблице 4 (а,б), Как следует из таблицы при сравнении чувствительности и специфичности определения IgG ар2-ГП1 при использовании собственного метода и коммерческого набора получены сходные результаты. Таблица 2.

а) Чувствительность и специфичность аФЛ относительно АФС %

АФЛ IgG аКЛ IgM аКЛ IgG ар2-ГП1 IgG ар2-ГП14NOVA"

Чувствительность 57,1 69.1 63.0 60.0

Специфичность 73.5 80.8 94.4 83.8

6) Чувствительность ti специфичность аФЛ относительно тромбозов %

АФЛ IgG аКЛ ISM аКЛ lgGap2-mi " IN OVA"

Чувствительность 54.5 58.6 58.1

Специфичность 72,7 77 84.6

Чувствительность IgG аКЛ и IgG аргПП для диагностики АФС была примерно одинаковой -57,1% н 60,0% соответственно, Скодкые результаты получены R. Roubey и соавт., (1996), по данным которых обнаружение IgG аКЛ и IgG арг-ГТП имеют одинаковую чувствительность (57,0%), Однако, другие авторы выявили более высокую чувствительность IgG аКЛ по сравнению с IgG ар ¿ГШ при вторичном АФС связанном с СКВ (AJar con-Segovia D. и соавт., 1997; D. Detkova и соавт,, 1999). По данным Amengua! О, и соавт.,(1996) чувствительность IgG аКЛ в группе больных СКВ с АФС (гг=71) составила 70,4%, a IgG аргГТП только 53,5%. D. Detkova и соавт (1999), обследовав 42 больных ПАФС и СКВ с АФС, обнаружили IgG аКЛ в 95,0%, a IgG аРгГШ в 86,0% случаев. При СКВ IgG аР>-ГШ выявлялись реже, чем IgG аКЛ. Поэтому специфичность IgG а{Ь-Ш1 для АФС (83,8%) была выше, чем IgG аКЛ (73,5%). Сходные результаты, свидетельствующие о более высокой специфичности IgG аргГШ при АФС, по сравнению с IgG аКЛ приводят и другие исследователи (Amengual О. и соавт.,1996; Detkova D. и соавт., 1999; Hunt J, и соавт,, 1994; Roubey R.A.S. и соавт., 1995). По данным D. Detkova и соавт, (1999), которые обследовали 32 больных СКВ без АФС, специфичность IgG afonn составила 91,0%, a IgG аКЛ - 75,0%.

В исследовании О, Amengua) и соавт. (1996), в которое вошли 49 больных СКВ без АФС, специфичность арШ была 96,0%, a IgG аКЛ 75,0%. Согласно результатам R, Roubey и соавт. (1995), обследовавших 157 больных СКВ и другими ревматическими заболеваниями, специфичность IgG аргПП составила 32,0%, a IgG аКЛ • 43,0%, АФС был диагносцирован только у 10% пациентов с изолированным увеличением аКЛ н у <57% - с изолированным увеличением afijni. По данным E.N.Harris и соавт, (1998), у IS4 больных сифилисом и аутоиммунных заболеваний без признаков АФС, специфичность IgG аРгГШ составляет $2,0%. Данные различия при определении чувствительности и специфичности аФЛ относительно АФС могут зависеть от выбранного уровня позитивности IgG аКЛ и IgG ар2ТТП, подбора трупп больных АФС и методических особенностей определения аФЛ.

4, Растворимые клеточные молекулы адгезии

4.1 рЕ-сеяектик.

Уровень рЕ-селектина в сыворотках крови у больных ПАФС (78,3±61,1 нг/мл) и СКВ (70,5±4б,9 нг/мл) был достоверно выше, чем у доноров (38,0tbI3,4 нг/мл);(р=0,0034, р=0,0147) (рис. 4) Достоверных различий по уровню рЕ-селектина между группами бальных ПАФС, вторичным АФС с СКВ и СКВ не выявлено.

В целом повышенный уровень рЕ-селектнна выявлен у S4.6 % больных ПАФС, у 43,0% больных СКВ с АФС и у 73,0% больных СКВ.

Рисунок 4.

Соотношение уровней рБ-Селектина у больных ПАФС, СКВ с АФС, СКВ и доноров. ЗМ

350

;оо

150 II» 50 0

4.2 рР-селекткн

Увеличение концентрации рР-селектяна в сывортках крови больных по сравнению с донорами (120,1 ±53,7 нг/мл) отмечалось у больных СКВ, (262,4± 158,8 нг/мл; р-Ю,0036 ), но не при ПАФС (154,0*137,9 нг/мл) и вторичном АФС с СКВ (171,4*122,1 нг/мл; р=0,0326) (рис.5). В целом, повышенный уровень рР-селектива выявлен у 27,0 % больных ПАФС, у 27,2%

больных СКВ с АФС и у £0,0% больных СКВ. Отмечалось увеличение концентрации рР-

чгмл

№»С Ш с АФС СЮ Диоры

селектина в группе больных ПАФС с ишемическим поражением ЦНС в виде повторных нарушений мозгового кровообращения (р0.02). Рисунок 5,

Соотношение уровне» рР-Селектина у больных ПАФС, СКВ с АФС, СКВ и доноров, ем

EDO 550 МО 4SQ 400

то

2J0 200

1М 5D 0

У бальных СКВ и АФС+СКВ с поражением почек средний уровень рР-селектина был выше, чем у больных без поражения почек {239,7+144,3 нг/мл и 112,31:60,2 нг/мл, р<0,05). Выявлено, что в группе больных с тяжелыми рецидивирующими тромбозами уровень рР-селектина (168.81131,5) был значительно выше, чем в группе с их отсутствие« (77 8+40.9 р-0,05), Процент больных с повышенным уровнем рР-Селектнна в этих группах составил соответственио 27% и 0%

4.3 pVCAM-1

Уровень pVCAM-1 в сыворотках крови у больных ПАФС (1003,5±552,6 нг/мл), при СКВ с АФС (11189,б±б91,0 нг/мл) н при СКВ (1227,2±б80,2 нг/мл) был достоверно выше чем у доноров (594,7±бЭ,4 нг/мл) (рис. 6). Достоверных различий по уровню pVCAM-1 между группами больных ПАФС, вторичным АФС с СКВ и СКВ не выявлено.

нгли

В целом, повышенный уровень рУСАМ-1 выявлен у 52,3 % больных ПАФС, у 93,0% больных СКВ о АФС и у 91,0% больных СКВ, где он коррелировал с индекоом активности 81£ОА1 (г=0.719,р<0.01).

Рисунок 6.

Соотношение уровней рУСАМ-1 у больных ПАФС, СКВ с АФС, СКВ н доноров.

(ЛО.МОО

2600 ------

МО»---------

ИМ ----------

ахи--------------

.5

о о

о

1800 »ею И00 1200

1<*Х) -

800 К»

СКВ с АФС СКВ

Двмь

Таким образом, при ПАФС наиболее часто отмечается повышение уровен* рЕ-селектина и рУСАМ-1, при АФС с СКВ повышается уровень рУСАМ-1 и при СКВ уровень рЕ-селетина, рУСАМ-1 и в меньшей степени рР-Селекгина. Полученные результаты свидетельствуют о том, что увеличение концентрации рКМА является важным серологическим маркером активации ЭК, а также дополнительным лабораторным критерием активности иммунопатологического процесса при АФС. Более того, высокие уровни рКМА наряду с обнаружением аФЛ и/или повышении уровнем СРВ ухудшает прогноз течения заболевания, так как они способствуют инициирующим и решающим механизмам тромбообразования: "роллингу" (перекатывание), сязыванию, прикреплению н трансы играции лейкоцитов к сосудистому эндотелию (Р1егап$еН Я .8, и соавт,, 2001).

Уровень СРБ в сыворотках крови у больных ПАФС (62,1±12б,6 мг/л), СКВ с АФС (67,0*136,3 мг/л) н СКВ (21,3±34,7 мг/л) был выше, чем у доноров (3,0±8,1 мг/л),< р =<1,0000)

5. СРБ

(рис, 7). Достоверных различий по уровню СРВ между группами больных ПЛФС, вторичным АФС с СКВ и СКВ не выявлено.

В целом, повышенный уровень СРВ выявлен у 58,0% больных ПАФС, у 57,0% больных СКВ с АФС и у 54,0% больных СКВ. Развитие тромботических осложнений на фоне гнперпрадукции аФЛ в рамках АФС, сочетающееся с увеличением уровня СРБ, может быть связано с субклинически текущим оосуднстым воспалением (Norden D, и соавт., 1995), и обострением

Рисунок 7.

Соотношение уровней СРБ у больных ПАФС, СКВ с АФС, СКВ и доноров. Ив

ем ssq

5» 45»

»0 эоо 1» 2Ю 150 1Ю 90

а

-$0 -1«

латентной инфекции (Клюквина Н.Г. н соавт., 1997). По нашим данным уровень СРБ достоверно коррелирует с уровнем рЕ^Селектина (г=0,7, р<0.05 при СКВ) и рУСАМ-1 (г=0.705, р<0.05 при ПАФС ). Эти данные позволяют предположить, что при АФС, гиперпродукция СРБ может ассоциироваться с повышенной экспрессией КМА на мембране активированных ЭК.

ндп

ВЫВОДЫ:

1. При исследовании механизмов взаимодействия антител к фосфояипидам с фосфолипндами наибольшая связывающая активность выявлена для таких пептидных фрагментов V домена молекулы рг-1111 как: Р7, Р8, Р9 и Аг£Р5(Аст),

2. Средний уровень и 1£М антител к кардиолипииу, а также ¡ей антител к р2-1Ш при АФС достоверно превышал таковой у здоровых доноров. Наибольшее повышение уровня и ^М антител к кардиолипииу совместно с антителами к рз-ГТП было выявлено при венозных тромбозах (р0.05). Выявлена достоверная корреляция между антителами к кардиолипииу н ДО антителами к Рг-ГШ при ПАФС (г =0,85; р<0.0005) и АФС с СКВ (г«0,9; р<0.0005).

3. Чувствительность антител к кардиолипииу н антител к Рг-ПП для диагностики АФС была примерно одинаковой - 57,1% и 60,0% соответственно. Специфичность

. антител к РгГШ при АФС (83,8%) была выше, чем Г^й антител к кардиолипииу (73,5%), При сравнении разработанного ИФМ метода определения 1дО антител к РгГТП с коммерческим, чувствительность и специфичность при АФС была примерно одинаковой (чувствительность 63,0/60.0%; специфичность 94,4/83.8%),

4. Выявлено достоверное повышение уровня рЕ-Селетяна и рУСАМ-! при АФС (р<0.05).

5. При исследовании уровня С-реактивного белка выявлено повышение данного показателя у больных ПАФС и АФС с СКВ и достоверная корреляция с уровнем рУСАМ-1 при ПАФС ((=0,705; р<0,05) и рЕ-Селектана при СКВ (г=0,7; р<0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Методы определения аФЛ могут быть рекомендованы к внедрению в лаборатории специализированного стационара, имеющего ревматологическое отделение для диагностики АФС, Результаты исследования целесообразно использовать для изучения роли иммунологических нарушений в патогенезе тромботических осложнений при АФС. Комплексное исследование аФЛ, рКМА и СРБ у больных АФС в сопоставлении с клиническими признаками может являться важным дополнительным методом диагностики и оценки течения заболевания.

СПИСОК РАБОТ ОПУКЛИКОВ АННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1", Александрова Е.Н, Новиков А А,Решетняк Т.М.,КлюквинаН.П, Решетняк ДВ.,Насонов Е,Л, Антитела к (Й-глико протеину I и антитела к кардиояипнну при аитифосфолнпидиом синдроме: анализ чувствитепности н специфичности, И Клиническая медицина, 2003,9,25-311.

2. Александрова ЕН, Новиков А. А, Решетняк Т.М., Клюквина Н.Г., Решетняк Д.В., Самсонов МЮ, Насонов Е,Л, Растворимые молекулы адгезии лри антнфосфолипидном синдроме связанном с системной красной волчанкой, и первичном антнфосфолипидном СиущрЪмь.НТерапевтичееккй архив, 2002,5,23*27.

3, Novikov A.A., Alexandrova EN., Reshetnyak Т.М, Levels of soluble VCAM-l,P-SeIectm and E-Selectin in patients with primary antiphospholipid syndrome and systemic lupus erythematosus, ¡¡Annals of the rheumatic diseases, 2001,60(1 X 194.

4, Калашникова Л.А., Добрынина Л.А., Кротеикова M.B,, Александрова E.H-, Решетняк Т.М,, Новиков АА. Синдром "Рассеянного склероза" при антнфосфолипидном синдроме./¡Десятая конференция "Нейро-иммунолояія ", С.-Петербург, 2001,124-126,

5, Кузнецова Т В., Тищенко В. А, Кобыгинский АГ., Палькеева М.Е.,

Новиков А А, Решетняк Т.М., Клюквина Н.Г., Насонов Е.Л.Зависимые от В 2-гликопротеи на I антитела к карднолипику при антнфосфолипидном синдромеЛТерапеетический архив. ¡999,12,41-43,

6, Насонов Е.Л., Кобылянский АГ., Кузнецова Т.В., Александрова RH., Палькеева М.Е., Новиков A.A., Тищенко В, А Современные представления о патогенезе антифосфоли пи дного синдром г.// Клиническая медицина, (998,9,19-14,

7, Кузнецова Т.В., Тищенко В. А., Кобылянский АГ., Палькеева М.Е.,

Новиков АА, Решетняк Т.М., Клюквина Н.Г., Насонов Е.Л. Бета2-гликопротеин4 зависимые антитела к кардиолипину при антнфосфолипидном синдроме,,// Клиническая медицина. - 1998 - № 9, - С.9-14.

Принято к исполнению 14/11/2003 Исполнено 14/11/2003

Заказ № 430 Тираж; 100 экз.

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 <095)318-40-68 www, autorefem.ni

Актуальность проблемы

В настоящее время клиническая медицина обогатилась большой группой новых лабораторных методов, позволяющих более полно оценить характер патологических изменений иммунной системы при аутоимунных ревматологических заболеваниях. К наиболее информативным иммунологическим маркерам в ревматологии относятся: органонеспецифические аутоантитела и иммунные комплексы, белки острой фазы воспаления, маркеры активации клеточного иммунитета и дисфункции эндотелия [1,2, 3,4].

В последние годы особое внимание уделяется исследованию антител (АТ) к фосфолипидам (аФЛ) - большой группы органонеспецифических аутоантител, реагирующих с антигенными детерминантами фосфолипидов и/или фосфолипидсвязывающих белков. Гиперпродукция аФЛ ассоциируется с развитием антифосфолипидного синдрома (АФС), характеризующегося тремя клинико-лабороторными признаками: рецидивирующие венозные или артериальные тромбозы, акушерская патология в виде привычного невынашивания беременности и внутриутробной гибели плода, тромбоцитопения [3, 5, 6]. Лабораторными критериями АФС являются и ^М антитела к кардиолипину (аКЛ), выявляемые иммуноферментным методом (ИФМ) и волчаночный антикоагулянт (ВА), определяемый с помощью фосфолипидзависимых коагулогических тестов. При АФС аКЛ наиболее эффективно связываются с кардиолипином (КЛ) в присутствии белка плазмы рг-гликопротеина-1 (Рг-ГП1). Фактически аКЛ реагируют с антигенными детерминантами не кардиолипина, а конформационнами эпитопами Рг-ГШ, экспрессирующимися в процессе взаимодействия Рг-ГП1 и КЛ. Мишенью аФЛ аутоимунного происхождения в настоящее время считают либо белок р2-ГП1, либо его комплекс с анионными фосфолипидами [7]. Обнаружение антигенных эпитопов Рг-ГШ, распознаваемых аутоиммунными аФЛ с использованием соответствующих синтетических пептидов, имеет важное значение для уточнения молекулярных механизмов патогенеза АФС. Поскольку в фетальной сыворотке использующейся для определения аКЛ, содержится Рг-ГШ, полагают, что с помощью стандартного ИФМ можно выявить как аРг-ГШ, так и антитела, реагирующие собственно с КЛ. Более специфичный метод определения аРг-ГШ, основан на использовании "иммобилизированного" на твердой фазе Рг-ГШ в ИФМ [8, 9]. По данным литературы, аКЛ обладают более высокой "чувствительностью", а аРг-ГШ — "специфичностью" [9, 10, 11], однако результаты исследований противоречивы, что связано с отсутствием стандартизованного на международном уровне метода определения аРг-ГШ.

Существенное значение в иммунопатогенезе АФС придают цитокин-индуцированной гиперэкспрессии клеточных молекул адгезии (КМА) [12]. Установлено, что аФЛ обладают способностью индуцировать экспрессию некоторых форм КМА, в том числе Е-селектина, Р-селектина, межклеточной молекулы адгезии (1САМ-1) и сосудистой клеточной молекулы адгезии 1 (УСАМ-1) на поверхности эндотелиальных клеток (ЭК) [13]. Прогресс в изучении КМА при заболеваниях человека во многом связан с открытием методов определения растворимых изоформ КМА (рКМА) и разроботке методов их определения в биологических жидкостях. Установлена связь между синтезом рКМА и выраженностью экспрессии КМА на клеточных мембранах. Повышение концентрации рКМА в сыворотке крови наблюдается при многих воспалительных, аутоиммунных, инфекционных, опухолевых заболевания, атеросклеротическом поражении сосудов и при системных васкулитах [2, 14, 15, 16, 17]. Однако данные касающиеся клинического значения рКМА при АФС весьма немногочисленны [18].

С-реактивный белок (СРБ) - классический острофазовый белок, синтезирующийся в ответ на воспаление и тканевое повреждение. Показано, что у больных системной красной волчанкой (СКВ) повышение СРБ ассоциируется с развитием тромботических осложнений и обнаружением aKJl [19]. По данным литературы, увеличение концентрации СРБ является предиктором тромботических осложнений у больных ишемической болезнью сердца [20]. Рг-ГШ-зависимое связывание аФЛ с ЭК, не только вызывает активацию эндотелия, проявляющуюся гиперэкспрессией КМА, но и индуцирует продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-1 [21]. В свою очередь эти цитокины являются основными медиаторами, индуцирующими синтез СРБ. Имеются сведения о том, что СРБ может вызывать активацию ЭК "in vitro" [22]. Все это может свидетельствовать о патогенетической связи между аФЛ-зависимой активацией сосудистого эндотелия, субклинически текущем воспалением сосудистой стенки и развитием тромботических осложнений у больных АФС.

Оценка функционирования иммунной системы больных АФС на гуморальном уровне в комплексе с лабораторными и клиническими данными может иметь важное значение как с теоретических позиций в плане уточнения патогенетических механизмов АФС, так и с клинической точки зрения, для уточнения степени активности патологического процесса, диагностики, оценки результатов лечения и прогноза заболевания.

Цель исследования

Изучить диагностическое и патогенетическое значение аФЛ при АФС; характер взаимосвязи между гиперпродукцией аФЛ и клинико-лабораторными особенностями АФС.

Задачи исследования

1. Разработать ИФМ определения аРг-ГШ.

2. Изучить кофакторную активность пептидных фрагментов Рг-ГШ у больных АФС.

3. Исследовать "чувствительнось" и "специфичность" определения аКЛ и ^ арг-ГП1 при АФС.

4. Исследовать уровень маркеров активации эндотелия рКМА (рР-селектин, рЕ-селектин и рУСАМ-1) в сыворотке больных АФС.

5. Изучить концентрацию С-реактивного белка при АФС.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное изучение иммунологических нарушений при АФС. Показано, что аРг-ГШ являются высокочувствительным и специфичным лабораторным маркером для верификации АФС и его основных проявлений, в том числе тромботических осложнений. Выяснено наличие кофакторной активности у пептидных фрагментов р2-ГП1: Р7, Р8, Р9, Р5. Исследование молекулярных механизмов взаимодействия аФЛ с ФЛ, позволило уточнить патогенетическое значение аФЛ в развитии артериальных и венозных тромбозов у больных АФС. Показано, что гиперпродукция аФЛ ассоциируется с повышением уровня рКМА и СРБ. Выявлена прямая корреляция между уровнем рЕ-селектина, рУСАМ-1 и концентрацией СРБ при АФС.

Практическая ценность

Полученные данные имеют важное значение для уточнения иммунологических критериев диагностики АФС, а так же для изучения роли иммунологических нарушений в патогенезе тромботических осложнений при АФС. Разработан ИФМ метод определения ар2-ГП1.

Внедрение в практику

Результаты диссертационной работы Новикова Александра Александровича "Иммунологические аспекты антифосфолипидного синдрома" применяются в работе лаборатории системных ревматических заболеваний с группами гемореологических и метаболичнских нарушений ГУ Института Ревматологии РАМН, что позволяет выявлять больных с первичным и вторичным антифосфолипидным синдромом и давать более точную клинико-лабораторную характеристику течению заболевания.

Публикации

По теме публикации опубликовано 6 печатных работ. Апробация работы

Работа апробирована на межотделенченской конференции НИИ кардиологии им. Мясникова А.Л. РКНПК МЗ РФ 5 июня 2002 г.

Объем и структура диссертации

Основной текст изложен на 144 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, 3 глав, обсуждения, выводов. Библиографический указатель включает 166 источников, из них 12 отечественных и 152 иностранных. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами, 37 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. При исследовании механизмов взаимодействия антител к фосфолипидам с фосфолипидами наибольшая связывающая активность выявлена для таких пептидных фрагментов V домена молекулы рг-ГП1 как: Р7, Р8, Р9 и Аг§Р5(Асш).

2. Средний уровень и ^М антител к кардиолипину, а также антител к р2-ГП1 при АФС достоверно превышал таковой у здоровых доноров. Наибольшее повышение уровня ^О и ^М антител к кардиолипину совместно с антителами к Рг-ГШ было выявлено при венозных тромбозах (р<0.05). Выявлена достоверная корреляция между антителами к кардиолипину и антителами к р2-ГП1 при ПАФС (г =0,85; р<0.0005) и АФС с СКВ (г=0,9; р<0.0005).

3. Чувствительность антител к кардиолипину и антител к р2-ГП1 для диагностики АФС бьша примерно одинаковой - 57,1% и 60,0% соответственно. Специфичность антител к р2ГП1 при АФС (83,8%) бьша выше, чем антител к кардиолипину (73,5%). При сравнении разработанного ИФМ метода определения антител к Р2ГШ с коммерческим, чувствительность и специфичность при АФС бьша примерно одинаковой (чувствительность 63,0/60.0%; специфичность 94,4/83.8%).

4. Выявлено достоверное повышение уровня рЕ-Селетина и рУСАМ-1 при АФС (р<0.05).

5. При исследовании уровня С-реактивного белка выявлено повышение данного показателя у больных ПАФС и АФС с СКВ и достоверная корреляция с уровнем рУСАМ-1 при ПАФС (г=0,705; р<0,05) и рЕ-Селектина при СКВ (г=0,7; р<0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Методы определения аФЛ могут быть рекомендованы к внедрению в лаборатории специализированного стационара, имеющего ревматологическое отделение для диагностики АФС. Результаты исследования целесообразно использовать для изучения роли иммунологических нарушений в патогенезе тромботических осложнений при АФС. Комплексное исследование аФЛ, рКМА и СРБ у больных АФС в сопоставлении с клиническими признаками может являться важным дополнительным методом диагностики и оценки течения заболевания.