Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунокоррекция экспериментального туберкулеза у мышей с помощью воздействия на Т-супрессоры

ч 9 О Л 9'®

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ КазССР

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ, МИКРОБИОЛОГИИ И ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

На правах рукописи

БАТРИДИНОВА Зульфия Мударисовна

ИММУНОКОРРЕКЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА У МЫШЕЙ С ПОМОЩЬЮ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА Т-СУПРЕССОРЫ

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

АЛМА-АТА—1991

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте фтизиатрии и пульмонологии МЗ УзССР

Научные руководители:

доктор медицинских наук А. М. Мороз кандидат медицинских наук Р. А. Агзамов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,, профессор И. Г. Цой кандидат медицинских наук Ж. А. Сатыбалдиева

Ведущее учреждение — Институт иммунологии Минздрава СССР

Защита диссертации состоится « » 1991 г.

в часов на заседании специализированного совета

Д 079 05 01 Научно-исследовательского института эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезнен Минздрава

КазССР по адресу: 480002, г. Алма-Ата^ ул. Пастера, 34.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Минздрава КазССР.,

Автореферат разослан «<1-0 » 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, К- м. н.

Н. М. Нуркина

имтгаглц s

— >• - з -

j. л :5Ш

^ тдел 0Б1ЩЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ :сартаций-| - - -'.....

Актуальность проблемы. Точение хронической туберкулезной инфеквди сопровождается выраженными изменениями иммунологичеоко-го статуса организма-хозяина (Авербах U.M. и др., 1985, Biozxi е(с£.,1%ЪЪ). Эти изменения оказывают решающее влияние на исход . заболевания и и во многом определяются регуляцией иммунного ответа, осуществляемой ллг.йсидашн клетками, среда которых существенная роль принадлежит Т-супрессорам.

Данная субпоцуляция иммунокомдетентных клеток ответственна, в частности, за поддержание иммунологического'гомеостаза организма, поскольку ею ретируются фагоцитоз, гранулемообразование,. толерантность, иммунный ответ ( Waujmann S, ,1989), т.е. механизмы естественной и приобретенной резистентности при туберкулезе.

В то же время, активация Т-супрессоров, характерная для прогрессирующего течения туберкулеза приводит к неспособности организма развивать эффективный иммунный ответ против возбудителя {Lagzange. Р., Huiiie-C $,,1988). В связи с этим разработка методов специфического и неспецифического воздействия на эту субпопуляцию клеток с целью их элиминаций или блокирования MOEQx оказаться одним из путей коррекции юлцунологических.нарушений и явиться чрезвычайно перспективным подходом для лечения, ряда хронических инфекционных заболеваний, в горл, чиоле туберкулеза.

Цель работы. Целью настоящего исследования является.анализ цшунокорригирующей и протективной эффективности различных специфических и неспвцифичвских воздействий на Т-дшфоциты-супреосорц

- 4 -

при экспериментальном туберкулезе у мышай.

Задачи работы. Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Оценить выраженность противотуберкулезного иммунитета и степень резистентности к губер<улезной инфекции при воздействии на Т-супрессоры с помощью антисыворотки к их поверхностным маркерам.

2. Установить характер влияния на течение экспериментального туберкулеза и иммунный статус мышей слленэктоши, выполненной в различные сроки после заражения мышей.

3. Рассмотреть особенности изменения тех же параметров П0С7 ле введения зараженным мышам циклофосфамида. . -

Научная новизна. В работе впарвыо разработана система анализа различных воздействий, влияющих на количественное содержание и функциональную активность Т-супрессоров при экспериментальная туберкулезе.

Разработан новый подход к получению и применены антисыворотки против генетического маркера Т-супрессоров. Дано теоретическое обоснование их назначения на различных этапах экспериментального туберкулеза и в определенных дозах.

Обоснованы возможности применения ряда неспецифических воздействий, обладающих преимущественным' эффектом на систем/ Т-супрессоров. Установлены пределы эффективности их использования при туберкулезной инфекции у мышей.

Во всех экспериментах помимо анализа специфического воз>

действия на Т-супрессоры показан характер изменения показателей противотуберкулезного иммунитета </ъсо и 1П 1/1^10 ,что позволяет судить о степени иыдуномодулирующих свойств кагкдого

воздействия....................................

Практическая значимость. Проведенные исследования выявили конкретные практические перспективы использования ряда .специфических и неспбщфпескнх воздействий в качестве ишунокорриги-рующих средств с учетам их преимущественного влияния..на субпо-. пуляциа Т-лшлДоцптов-супрессоров. Зто имеет важиоа наунно-прак-тическое значение, если иметь в виду роль и место супрессорных механизмов в развитии и поддержании туберкулезной инфекции.

До настоящего времени, по существу, не обосновано применение подобных имцуномодулирующих средств в качестве корректоров дцвднодефицитных состояний, развивающиеся на определенных стадиях туберкулезного процесса, в то время как их назначение существенно влияет на шялунннй статус и степень протекции при экспериментальном туберкулезе.

Положения, вшосшые на защиту:

1. Прп экспериментальном туберкулезе у мшей нарастает активность супрессорных клеток, главным образ ал Т-лимфоцитов..

2. С помощь» многократного введения высокоспецифической аллоантпсывороткн против генетического маркера Т-супрессоров (анти-1-1к) удается усилить показатели противотуберкулезного иммунитета и достоверно пролонгировать-низнь мшей1, зараженных вирулентными М.туберкулеза. :

3. Спленэктоыия, выполненная через 14 дней посла.заражения мышей М. туберкуле за, способствует снижению супрессорной актив*-ности Т-лшллоциюв и макрофагов, главны,1 образом, за'счет элиминации значительной части дула этих клеток и достоверно про-лонгарует унзнь экспериментальных животных.

4. Обработка циклофосфамидом мышей, зарансенных туберкуле-

зом, хотя и обладает антисупреосорнш действием, но..в. результате негативного влияния циклофосфамида на процесс гранулемообра-з.ования и регуляцию специфических воспалительных реакций, приводит к ускоренно^ развитию тяжелой формы. экспериментальной туберкулезной инфекции.

Апробация работы. Основные полоаения диссертации доложены на У конференции молодых ученых НИИ фтизиатрии и пульмонологии МЗ УзССР (1989) и на конференции молодых у.ченых и опециалиотов филиала Института иммунологии МЗ СССР (1990).

Диссертация апробирована на Ученей Совете НИИ фтизиатрии и пульмонологии МЗ УзССР 21 июня 1990 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на Г02 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы,' описания материала и методов, использованных в рабо-. те, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 16 отечественных и 129 иностранных работ. Диссертация иллюстрирована 5 рисунками и'10 таблицами.

МАТЕ ШАЛ И МЕТОда ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в-лаборатории иммунологии научно-исследовательского института фтизиатрии и пульмонологии МЗ. УзССР и в лаборатории экспериментальной иммуногенетики на базе питомника линейных мышей Центрального научно-исследовательского института туберкулеза ЫЗ СССР.

2квотные. Исследования выполнены на 750 мышах инбредных линий СЕ\ZSio и С57ВЬ/Шо. Для работы использовали самок в воз-

расте 2-4 месяца. Для. получения аллоантисыворотки против, антигенной детерминанты I-J маркера иимунокомпетентннх клеток суп-рессорюго ряда, синтезируемого только Т-супрессорами, использовали самок мышей инбредных линий BIO.А (3S)jdi и БЮА (5R)/YCil Для получения антисыворотки против маркера Т-клеток Т/г'у - I в качестве реципиентов использовали мышей АКЕ/Ло.

Заражение и вакцинация. Мышей заранали внутривенным введением живой вирулентной культуры WAußeiCufoiii H37BV в дозе 25 мкг в 0,5 мл физиологического раствора в латеральную хвостовую вену.

Дта исследования зависимости индукции супрессоров от дозы введения вакцинного шташа U.ßovis- BCG , мышей вакцинировали живой культурой BCG подкожно в две точки спины в дозах 100, 500 и 2.500 мкг сухого веса бактерии на мышь. Тесты на наличие ишу-носупрэссни ставили через 4-5 недель после вакцинации. Б эксперименте по тестировании вакцинного олфекта заражение проводили через 5 недель после вакцинации BCG.

Антитела. Для получения высокоэффективной антисыворотки

анти I-J нами был использован метод, предложенный А.С.Аптом

и ссавт. (1988). У мышей-доноров 5R предварительно (за Ю дней)

индуцировали активацию Т-супрессоров введением высокой (6x10^)

дозы эритроцитов барана, а затем клетки селезенки таких'доноров

использовали для 5-6-кратной иммунизации реципиентов ЗЕ. с недель-

7

нкми интервалами в дозе 10 клеток на мышь. В связи с тем, что на поверхности клеток лишш-донора могут быть презентированы, во-первых, процессированнке антигенные детерминанты эритроцитов барана, и, во-вторых, индуцированные эритроцитами барана рецепторы (иммуноглобулины на В-клэтках или Г-рецепторы) с идио-

типическими, детерминантами, которых.нет у .интактного реципиента, существует вероятность, что при иммунизации такими.активированными клетками будут синтезироваться не только антитела, к аллелю I- J^ - , но и антитела к упомянутым антигетшл структурам. Дт того, чтобы избегать неизвестного влияния таких гипотетических антител, получаемую антисыворотку абсорбировали клетками селезенки мышей линии-реципиента 35, предварительно получивших точно такое же как доноры, введение эритроцитов барана. Из-за различий по аллели детерминанты 1-7 антитела против I-J* не абсорбировались клетками ЗЕ. и оставались в сыворотке, тогда как все другие виды антител были абсорбированы, поскольку мши ЗЕ. и 5R не отличаются ни по антиген-презентируютим структурам, ни по ре-цепторным генам, ни но генам, контролирующим процессию?.

Аллоантисыворотка апти I-Jk , полученная описанным способом, перед использованием в эксперименте была предварительно исследована на активность, специфичность и титр с помощью цитотоксичес-кого теста in vii\0 . Установлено, что после абсорбции.на активированных спленовдтах ЗЕ. антисыворотка специфически реагировала только с клетками мышей 5R, не давала перекрестных реакций и имела высокий титр (не менее 1:16).

В опытах in vivo антисыворотку анти I-Jk и контрольную антисыворотку aHTH-I-Jb вводили реципиёнтам внутривенно в дозе 20 гжл на глышь в 0,2 мл физиологического раствора в дни О, +2, +4, +6, +10 и +15 по отношению к заражению.

"Антйсыворотку против маркера Т-клеток, антигена Thy -I получачи многократной иммунизацией реципиентов AK£/<j4о смесью

п

тимоцитов и лимфоцитов мышей СВА в дозе 10 клеток на мышь с недельнши интервалами.

......-9 -

Спланэктомвд миней. После ланаротомии по средней линш жи-вотна келудок п петли тонкой кишки отводили к печени, пинцетом фиксировали селезенку, перенимая сосуда ворот органа. Затом отсекали селезенку,смазывая сосудистую культю клеем и послойно заклеивали брюшную полость.

Обработка нишей циклофосфамидом. Циклофосфаыид вводили мышам в дозах 50, 100 и 200 мг/кг веса внутрибрюшшшо за 10 дней до заражения

Реакция ГЗТ (туберкулиновая проба). Зараженным или вакцинированным, мншам на Г6-1В день после введения микобактерий вводился в подушечку право:'! задней лапы альттуберкулик в объеме 40 мкл, разведенный I:ГО физиологическим'раствором. Контролем служила левая задняя лапа, а которую вводился тот г/.в объем чистого физиологического раствора. Через 24 часа с помощью ьншрометра измеряли толщину обеих лап и реакции ГЗТ выражали как разносить мезду толщиной подопытной и контрольной лапы. Донная реакция является стандартны.! методом оценки клеточного лмлунного ответа Ы ^¿ио (Авер бах МЛ.!, и др., 1978). ...*..

Проли^ератив.чне гесты 1л иНго . Наиболее распространенным и удобным методом оценки иммунологической активности Т-лим-фоцитов споНю является аитигенспоцифичесиая и'поликлональная (под действием митогеиов) пролиферация этих клеток в культуре ш 1хНю , оцениваемая по включению в ДНК радиактивной метки, в следующей модификаций.

Лиглйоузлн или селезенки зараженных или вакцинированных мышей продавливали тефлоновш пестиком через сетку из нержавеющей стали. Затем суспензию клеток дважды отмывали в сраде 193, содержащей эмбриональную телячью сыворотку и антибиотики. После этого

осадок клеток ресуспеидировали в полной культурэлшой среде и. доводили до концентрации 2хЮ6 клеток/мл. Суспензии клеток помещали в дунки плоскодонного 96-луночиого планшета в объеме 200 шел (4хЮ5 клеток на лунку). В подопытные лунки добавляли PPD в конечной концентрации 10 мкг/мл или в качестве митогена Кон А .или ФГА в концентрации- 2-3 мкг/мл. Клетки инкубировали в С02-инкуба-торе, добавляя ^-тимидин в последние 6-8 часов инкубации. Затем оценивали включение метки на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Пролиферация, выражалась либо в распадЬх в минуту, либо в виде индекса стимуляции.

Адоптивный перенос. Для доказательства индукции Т-супрессоров у зараженных и вакцинированных мышей использовали перенос клеток селезенки ингактным сингеннш реципиентам. Суспензию клеток селезенки инкубировали на пластиковых чашках Петри при 37°Ь 2 часа для адгезии макрофагов. Неприлвпшие клетки повторно инкубировали на чашках, покрытых кроличьими антителами против tyG мыши,. Неприлипшие клетки (92% Т-клеток при реакции, с -антисывороткой ан-ти-ТКу 1.2) вводили внутривенно интактным реципиентам в дозе. 5х . I07 на мышь за 3 дня до вакцин,ирга. Через 18 дней после.вакцинации ВСО в дозе 500 ыкг/мышь ставились туберкулиновые пробы......

Имм/нофешентное определение антител к антигенам микобакте-рий. За основу был взят стандартный метод определения антител класса Jg & (gne/t/at g,, Petfaan Р. ,1971), при этом лунки по-листеролового 96-луночного планшета сенсибилизировали 100 мкл антигенного препарата JU, bov/'s ВС О с концентрацией 20-40 мкг/мл

*

антигена в течение 18-20 часов при 4°С. Затем после стандартных обработок в лунки вносили по 100 мкл тестируемых сывороток от зараженных мышей в серийных разведениях, начиная с 1:200 и инкуби-

ровали 1,5. часа при 3?°С. Интенсивность реакции учитывали на ри-дера и выражали в единицах оптической плотности. ......

Результаты обрабатывали методом вариационной статистики.

СОДЕШШИЕ РАБОТЫ

Прежде чем оценить эффективность того или иного метода воздействия на Т-супрзссоры, необходимо было продемонстрировать уровень супрессии именного ответа при туберкулезе у мышей.

Для получения прямых доказательств развития супрессорных механизмов в результате заражения мышей туберкулезом и выяснения природы этих клеток были выполнены эксперименты с сингешшл адоптивным переносом спленоцитов от зарженных вирулентными микобак-терияш ишвй вакцшшрованиш геивотнцм. Перенос осуществлялся как необработанной суспензии, так и с предварительной обработкой клеточной суспензии еггтигамцуноглобулшювой сывороткой и антисывороткой против маркера Т-лимпсцитоз. Кроме того, бшш использованы два способа истощения макрофагов в популяции клеток-супреосоров-абсорбцией на пластике и удаление фагоцитов с помощью карбонильного келеза.

Полученные данные позволяли- сделать вывод, что иммуносупрес-скя возникает при любом ответе зараженного животного на. микобакте-рияльные антигены, но прогрессированиэ болезни сопровождается нарастанием активности супрессорных клеток, причем главным образом Т-лим$оцитов-супрэссоров, так как обработка переносимой взвеси антисывороткой против маркера Т-лимфоцитов ТКу-{ полностью отменяла супрессию.

В то же время удаление фагоцитов из переносимой взвеси спленоцитов приводит к некоторому, но далеко не полному повышению про-

... - 12 - . лиферативной активности тестируемых клеток. Это доказывает, что в супрессии специфического противотуберкулезного иммунного ответа макрсфаги-супрессоры играют определенную, но .далеко не главную роль, а подавление 13Т и пролиферативной активности лимфоцитов осуществляется в основном за счет Т-лимфоцитов-супрессоров.. .

Получив данные о существенной роли Т-лимфоцитов-супрессоров в регуляции противотуберкулезного иммунитета и для проверки гипотезы о необходимости блокады (или элиминации) этой субпопуляции Т-клеток на определенных этапах туберкулезной инфекции, нами были применэны три способа воздействия на эти клетки, используя разные точки приложения:

- против маркеров-предшественников Т-оупрессоров (с помощью анти -1-СГ- сыворотки):

- за счет удаления значительной части уже сформировавшейся эффекторной популяции супрессорных клеток (спленэктсмия мышей в определенные сроки после их заражения туберкулезом);

- цутем имэдунохимического воздействия на всю популяцию-Т-лимфоцитов-супрессоров (обработка животных циклофосфамидом);

Для оценки первого варианта воздействия на Т-супрессоры были получены высокоэффективные антисыворотки против аллелей 1-Т и 1-0". Два вида антисыворотки использовали для проверки аллельной специфичности полученных 1-СГ-сывороток.

Прежде чем назначать антисиворотки сп 1ПС/0 , , необходимо было провести ряд абсорбций, особенно дня того, чтобы исключить наличие в адтисыворотке антшдиогипических антител. Для этого полученные ангиснворотки абсорбировали клетками линии мышей-реципиентов , на которых индуцирован такой же кдаотип как на клетках линии донора, т.е. использовали дая абсорбции клетки линии-реци-

Таблица I

Влияние введения антисывороток анти 1-Т (п. ш<го па ивдунный ответ и вызгиваемость мшен СБА, зараженных туберкулезом

йй •. Введенная пп антисыворотка

Туберкулиновая-проба

(МП)

Пшлкйерация Антитела 113727 Срок выни-

(ин- (показатель вания (дни)

деке ст тагу ля- оптической

ции) плотности

1.

2.

анти 1~7к т т5

анти

3.

I) Р<0,05

Нормальная сыворотка

0,24+0,04 0,17+0,02"

0,16+0,03

I

3,23 1,84

1,58

0,216±0,032 0,195+0,027

0,177^0,025

58,0+.4,2 4Э,4±5,2

43,7±5,8

со

I

- 14 - - - .....-.....

пиеитз, у которых предварительно индуцирована иадуяосупрасоия. ..

эритроцитами барана. В результате, были получены анхи..1-Х - ..тсы-

воротки, в которых были истощены антиидиотишческие.антитела... .

к

Для проверки иммунотерапевтического эффекта анти сыво-

ротки ьш применили шестикратное введение антител.(табл.1). Подобный способ введения обладал выраженным антисупрессорным 'эффектом, особенно специфический в отношении клеточного ответа.на РИ)»-Зто приводило к определенно^ усилению клеточного иммунного ответа м \iivo и т 1г1{ю у зараженных мышей и увеличению срока аиз-ни клвотных, хотя в заключительной фазе болезни происходило полг-ноа подавление ответа на шестикратное введение антител.. Вакно отметить, что при подобной лечении усиления показателей.гуморального" имцунитета не было. Следует подчеркнуть, что в срок.жизни, миней, и показатели клеточного шя^иитета были достоверно вше, чему заракенних необработанных ыиией.

Тот факт, что несмотря на шестикратное введение анти 1-СГ сыворотки в заключительной фазе болезни происходило .паигое.'подавление специфического клеточного иммунного ответа, может быть связано о одной стороны с тем, что наиболее ванную антисупрессорную роль играет воздействие на индукторную популяцию Т-супрессоров или даже их предшественников, а с другой стороны, многократное введение 1-3"- антител приводит к развитию ответа на сама антитела, нейтрализуя их действие. .............

Как бы то ни било, подобный способ иммунотерапии оказался. эффективным и, с нашей точки зрения, весьма перспективным.в. ка- . честве возмоя;ного патогенетического средства лечения туберкулеза.

Также весьма позитивные результаты дали исследования,-.выполненные по анализу выраженности показателей противотуберкулезного

..... ... - 15 - . . ..................

иммунитета и особенностей течения инфекции у. сплэнэктсмирсваиных мышей. Но эффективность этого метода была весьма различной в.зависимости от сроков, когда после "заражения животных 6ыло выполнено удаление селезенки. ...

Если показатели противотуберкулезного иммунитета и выживаемости мышей, сплеиэктоиарованных через три и семь дней посла заражения мало отличаются от штакгаых зарзяэнных животных, ..то. при спленэктомии через 14 дней посла заражения, выявляются достоверные различия. Презде всего это касается показателей клеточного, тщт-тета, которые были значительно выше, чем у интактных зараженных мышей. .....

Достоверно различалась в сравниваемых группах и .выживаемость мышей. Средний период -лизни животных, спленэктонированных через 14 дней после заражения, бил достоверно выше, чем у интактных зараженных животных (56,3+3,4 и 43,8±1,2 дня соответственно).. ... ..

Таким образом, спленэктомия, выполненная через. 14 даей.поо-г ле заражения мышей туберкулезом, т.е. в период существенного-увеличения в организме зараженных туберкулезом животных супрессоршк эффекторных клеток, главным образом Т-лимфоцитов, в значительной 'степени локализующихся'в селезенке, обладает выраженным.положи-. тельным иымуяомодулирующим действием. Другими словами, слтанэкто-мия эффективна тогда, когда необходимо удалить по возможности большую ч_асть эффекторных Т-лимфоцитов-супрессоров, которых не

удалить другим способом. ............-.......

В то же время суммарный эффект лечения зараженных туберкулезом мышей цикяойосфамидом оказался негативным несмотря на. .то,что циклофосфамид облапает антисулресоорным эффектом..' Но наряду, о . отменой супрессии, за счет действия на предшественники Т-оупрес-

. . . - 16 -

соров, вдклофосфашд сокращает срок иизни зараженных животных. Как ыы узе отмечали, причиной этого могут быть побочные эффекты циклофосфамида, приводящие, в честности, к нарушению развития специфических гранулем, с одной стороны, и вовлечению в иьмунный ответ тех клеточных популяций, которые оказывают повраадающее действие на различные ткани оргаиизыа-хозяина.

Крше того, наряду с незначительным усилением клеточного ишунного ответа отмечено достоверное возрастание уровня специфических противотуберкулезных антител, что является неблагоприятным прогностическим признаком при туберкулезе. Возможно, его связано с разной чувствительностью Т-супрессоров, регулирующих IST и ан-тиголообразование к циклофюедемиду. .

■'Следовательно, мояно предположить, что введение циклсфосфа-ьшда нарушает регуляцию воспалительного процесса в инфицированных органах, что приводит в результате элиминации Т-сулрессорсш к гиперпродукции антител и подавлении клеточных иммунологических реакций. . .. -----

Таким образом, цшиюфосфамид, хотя и обладает анхнсупроссор-иш действием, не монет использоваться в качестве ишуномодулято-ра при туберкулезе. . . ....

Мы сравнили три метода достаточно избирательного действия на Т-лиглроциты-супрессоры, принципиально отличающиеся как.по.. своему характеру, так и точкам приложения по отношению к различным субпопуляциям Т-супрессоров, Так, антисыворотка цротив.ыар-керов Т-супрессоров действует, главным образом, на шдуктЬрдуа фазу образования этих клеток, циклофосфаыид - на клеткиизредаест-венники Т-супрессоров, а спленэктомия зараженных туберкулезом мшей уделяет э$фекторную популяции Т-супрессоров. Эффект при

этом весьма различен. В то время как акта I-J-сыворотка и. сплен-эктомия суммарно обладают лаложителыпм эффектом, обработка, животных циклофосфамидом оказывэет отрицательное действие я этот, метод не моает быть рекомендован для дальнейшего анализа .и. возможного практического применения, В то жэ время веоьма перспективным представляется комбинированное применение спленэктдаии и антисыворотки против маркеров Т-супрессоров, что требует дальнейших экспериментальных исследования.

выводи

1. При туберкулезной инфекции у мишей происходит активация супрессорных пммунокомпетентных клеток. В их число входят макро-, фаги и Т-супрессорц, причем последние, по крайней мере в селезенке зараженных животных, играют ведущую роль в подавлении иммунного ответа. ........

2. Существенную роль в общем супрессорном эффекте туберкулезной инфекции играют Т-супрессоры-индукторы с фенотипом CDiCD 8" l-jt Эти клетки подавляют не только пролиферэтивньй .ответ в реакциях in viho f цо и гкперчувствительность замедленного типа

Ln vitro . . ,. .- .

3. Полученные ковш методом аллоантиенворотки. к рецелторной детерминанте супрессорных клеток I-J являются высокоактивными Я специфическими. Их воздействие на популяцию Т-супросс.оров-ин-дукторов приводит к отмене ингибирующего действия последних в гест ах in irilio. ...........

4. Аллоангисыворотка анти - I-J"1 - при ее введении зара.-. женным'яивотнш обладает выраженным иммуноторапевтическим действием в отношении туберкулезной инфекции. Этот эффект, вероятно, связан со стимуляцией клеточных иммунологических механизмов при

отсутствия синтеза антител к антигенам микобактериЙ. .......

5. Спленэктомия у зараженных туберкулезом мышей оказывает . благоприятное влияние на течение экспериментального туберкулеза. Наиболее выражен этот аффект при слленгктдаии через 2 .недели после заражения, что связано с удалением значительной, части локализованной в селезенке эффекторной популяции Т-оупрессоров и судрео-сорных макрофагов. ....

6. Лнтисупрессорное действие циклофоофвыида касается не . только пролиферативного ответа wv v'äkо, но и синтеза антител к мшсобакгериям н воспалительных процессов в органах. Вместе о тем, он не действует нп супрессию гиперчувствительности замедленного типа. Суммарный эффект циклофосфашда весьма неблагоприятен для течения туберкулезной инфекции у ышой.

СШСОК РАБОТ, ОПУБГСЖОВАШШХ ПО ТЕМЕ

. ДТССЕРТАЦДО . .

1. Батрпдановз З.М., Внхидова Г.А., Апт A.C., Мороз А.Ы. Влияние неспецифичесхоЛ ишунонодуляции на течение экспериментального туберкулеза. В сб.докладов рвсп.научн.конф.:Иыцунодефи-циты и HU система", Ташкент, 1989, с.96-97.

2. Батркдинова 3.!.!., Агламов P.A. Влияние специфической и неспецифическоЯ иммунотерапии на течение экспериментального туберкулеза. Тезисы докл. 1-го Всесоюзного иш.съезда, 1989, T.I., 0.199.. •:.'.. .•. .

3. Батридинова 3.Ü.' Течение экспериментального, туберкуле за при воздействии на субпопуляцню Т-супрессоров. Б сб.трудов 5т-оЯ конференции молодых ученых НИИ фтизиатрии и пульмонологии им. Ш. А .Алимова, Ташкент, 1Ш9, с. 17-16.

■ 4. БатрвдиновоЗ.М..Бахидова Г.А., Мороз A.M., Апт A.C. Новые антисыворотки к антигенной детерминанте I-J, их специфичность и влияние на течение туберкулезной инфекции у мышей.

Ж.микробиол.,, зпидемиод.ии-лунобпол., 1990, Л 5, о.. ...

5. Бятридинова З.Ы., Вахидовп Г.А-, Агзамов P.A. Модудяг-ция протавотубернулезиюго иммунитета при. воздействии на Т-оуп-рессорн. Мед.».Узбекистана, 1990, "> 7, с.51-52.

Актуальность проблемы. Течение хронической туберкулезной инфекции сопровождается выраженными изменениями иммунологического статуса организма-хозяина (Авербах М.М. и др., 1985, Biozzi G.et. al., 1985). Эти изменения оказывают решающее влияние на исход заболевания и во многом определяются регуляцией иммунного ответа, осуществляемой лимфоидными клетками, среди которых существенная роль принадлежит Т-супрессорам.

Данная субпопуляция иммунокомпетентных клеток ответственна, в частности, за поддержание иммунологического гомеостаза организма, поскольку ею регулируются фагоцитоз, гранулёмообра-зование, толерантность, иммунный ответ (Kaufmann S., 1989), т.е. механизмы естественной и приобретенной резистентности при туберкулезе.

В то же время, активация Т-супрессоров, характерная для прогрессирующего течения туберкулеза, приводит к неспособности организма развивать эффективный иммунный ответ против возбудителя (Lagrange P., Hurtrel В., 1988). В связи с этим разработка методов специфического и неспецифического воздействия на эту субпопуляцию клеток с целью их элиминации или блокирования может оказаться одним из путей коррекции иммунологических нарушений и явиться чрезвычайно перспективным подходом для лечения ряда хронических инфекционных заболеваний, в том числе туберкулеза.

Цель работы. Целью настоящего исследования является анализ иммунокорригирующей и протективной эффективности различных специфических и неспецифических воздействий на Т-лимфоциты-супрессоры при экспериментальном туберкулезе у мышей.

Задачи работы. Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Оценить выраженность противотуберкулезного иммунитета и степень резистентности к туберкулезной инфекции при воздействии на Т-супрессоры с помощью антисыворотки к их поверхностным маркерам.

2. Установить характер влияния на течение экспериментального туберкулеза и иммунный статус мышей спленэктомии, выполненной в различные сроки после заражения мышей.

3. Рассмотреть особенности изменения тех же параметров после введения зараженным мышам циклофосфамида.

Научная новизна. В работе впервые разработана система анализа различных воздействий, влияющих на количественное содержание и функциональную активность Т-супрессоров при экспериментальном туберкулезе.

Разработан новый подход к получению и применены антисыворотки против генетического маркера Т-супрессоров. Дано теоретическое обоснование их назначения на различных этапах экспериментального туберкулеза и в определенных дозах.

Обоснованы возможности применения неспецифических воздействий, обладающих преимущественным эффектом на систему Т-супрессоров. Установлены пределы эффективности их использования при туберкулезной инфекции у мышей.

Во всех экспериментах помимо анализа специфического воздействия на Т-супрессоры показан характер изменения показателей противотуберкулезного иммунитета in vivo и in vitro, что позволяет судить о степени иммуномодулирующих свойств каждого воздействия.

Практическая значимость. Проведенные исследования выявили конкретные практические перспективы использования ряда специфических и неспецифических воздействий в качестве иммуно-корригирующих средств с учетом их преимущественного влияния на субпопуляцию Т-лимфоцитов-супрессоров. Это имеет важное научно-практическое значение, если иметь в виду роль и место супрессорных механизмов в развитии и поддержании туберкулезной инфекции.

До настоящего времени, по существу, не обосновано применение подобных иммуномодулирующих средств в качестве корректоров иммуннодефицитных состояний, развивающихся на определенных стадиях туберкулезного процесса, в то время как их назначение существенно влияет на иммунный статус и степень протекции при экспериментальном туберкулезе.

Положения, выносимые на защиту.

1. При экспериментальном туберкулезе у мышей нарастает активность супрессорных клеток, главным образом, Т-лимфоцитов.

2. С помощью многократного введения высокоспецифической алло-антисыворотки против генетического маркера Т-супрессоров (анти -1 - Jk) удается усилить показатели противотуберкулезного иммунитета и достоверно пролонгировать жизнь мышей, зараженных вирулентными М. туберкулеза.

3. Спленэктомия, выполненная через 14 дней после заражения мышей М. туберкулеза, способствует снижению супрессорной активности Т-лимфоцитов и макрофагов, главным образом, за счет элиминации значительной части пула этих клеток и достоверно пролонгирует жизнь экспериментальных животных.,

4. Обработка циклофосфамидом мышей, зараженных туберкулезом, хотя и обладает антисупрессорным действием, но в результате негативного влияния циклофосфамида на процесс гранулёмообра7 зования и регуляцию специфических воспалительных реакций, приводит к ускоренному развитию тяжелой формы экспериментальной туберкулезной инфекции.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на V Конференции молодых ученых НИИ фтизиатрии и пульмонологии МЗ Уз ССР (1989) и на Конференции молодых ученых и специалистов филиала Института иммунологии МЗ СССР (1990).

Диссертация апробирована на Ученом Совете НИИ фтизиатрии и пульмонологии МЗ УзССР 21 июня 1990 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 102 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, использованных в работе, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 16 отечественных и 129 иностранных работ. Диссертация иллюстрирована 5 рисунками и 10 таблицами.

ВЫВОДЫ: При туберкулезной инфекции у мышей происходит активация суп-рессорных иммунокомпетентных клеток. В их число входят макрофаги и Т-супрессоры, причем последние, по крайней мере в селезенке зараженных животных, играют ведущую роль в подавлении иммунного ответа.

2. Существенную роль в общем супрессорном эффекте туберкулезной инфекции играют Т-супрессоры - индукторы с фенотипом CD4+CD8" I - J+. Эти клетки подавляют не только пролиферативный ответ в реакциях in vitro, но и гиперчувствительность замедленного типа in vivo.

3. Полученные "новым методом аллоантисыворотки к рецепторной детерминанте супрессорных клеток I - J являются высокоактивными и специфическими. Их воздействие на популяцию Т-супрессоров - индукторов приводит к отмене ингибирующего действия последних в тестах in vitro. j

4. Аллоантисыворотка анти - I - Jk - при ее введении зараженным животным обладает выраженным иммунотерапевтическим действием в отношении туберкулезной инфекции. Этот эффект, вероятно, связан со стимуляцией клеточных иммунологических механизмов при отсутствии синтеза антител к антигенам микобактерий.

5. Спленэктомия у зараженных туберкулезом мышей оказывает благоприятное влияние на течение экспериментального туберкулеза. Наиболее выражен этот эффект при спленэктомии через 2 недели после заражения, что связано с удалением значительной части локализо

83 ванной в селезенке эффекторной популяции Т-супрессоров и супрессорных макрофагов.

6. Антисупрессорное действие циклофосфамида касается не только пролиферативного ответа in vitro, но и синтеза антител к микобактериям и воспалительных процессов в органах. Вместе с тем, он не действует на супрессию гиперчувствительности замедленного типа. Суммарный эффект циклофосфамида весьма неблагоприятен для течения туберкулезной инфекции у мышей.

84

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Супрессорные механизмы играют важную роль в регуляции противоинфекционного иммунитета при заражении самыми разнообразными патогенами, но, пожалуй, в наибольшей степени при инфекциях с внутриклеточной локализацией возбудителя. В большинстве работ,как правило, установлен сам факт супрессии иммунного ответа при отдельных инфекциях, в меньшем количестве исследований изучены механизмы супрессии и участвующие в ней субпопуляции лимфоидных клеток и почти нет данных о возможности регуляции течения инфекционного процесса путем селективного влияния на клетки-супре-ссоры.

При экспериментальном туберкулезе выполнены лишь единичные исследования, посвященные данному аспекту регуляции противоинфекционного иммунитета и то, главным образом, касающиеся иммуногенетических вариантов воздействия с помощью специфических антисывороток против маркеров Т-лимфоцитов-супрессоров (Апт А.С. и др., 1984; Авербах М.М. и др., 1985).

Но и этот раздел выполнен в основном для анализа механизмов индукции специфического иммунного ответа при заражении туберкулезом, а не для испытания возможностей применения антисывороток в качестве иммуномодулирующих средств. Еще меньше данных о влиянии на течение экспериментального туберкулеза других способов преимущественной элиминации Т-лимфоцитов-супрессоров, в частности с помощью спленэктомии, выполненной после заражения мышей или обработки мышей циклофосфамидом.

Поэтому целью нашего исследования был сравнительный анализ эффективности различных воздействий на Т-лимфоциты-супрессоры при экспериментальном туберкулезе у мышей.

Были изучены 3 способа воздействия на Т-супрессоры:

- с помощью курса лечения специфической аллоантисывороткой к поверхностным маркерам Т-лимфоцитов-супрессоров;

- путем спленэктомии экспериментальных животных в разные сроки после их заражения туберкулезом;

- в результате обработки зараженных животных циклофосфамидом, иммуно-депрессантом преимущественно действующим на клетки-супр-ессоры.

Для решения этих задач исследования были выполнены на мышах различных линий, главным образом CBA/Sto, зараженных вирулентными М. туберкулеза H37Rv или вакцинированных с помощью BCG. В качестве критериев эффективности предложенных методов воздействия на Т-супрессоры использованы иммунологические тесты in vivo и in vitro, оценивающие показатели клеточного и гуморального иммунитета и характер выживаемости животных.

Но прежде чем оценить эффективность того или иного метода воздействия на Т-супрессоры, необходимо было продемонстрировать уровень супрессии иммунного ответа при туберкулезе у мышей.

Для получения прямых доказательств развития супрессорных механизмов в результате заражения мышей туберкулезом и выяснения природы этих клеток были выполнены эксперименты с сингенным адоптивным переносом спленоцитов от заражженных вирулентными микобактериями мышей вакцинированным животным. Перенос осуществлялся как необработанной суспензией, так и с предварительной обработкой клеточной суспензии антииммуноглобулиновой сывороткой и антисывороткой против маркера Т-лимфоцитов. Кроме того, были использованы 2 способа истощения макрофагов в популяции клеток-суп-рессоров - абсорбцией на пластике и удаление фагоцитов с помощью карбонильного железа.

Полученные данные позволили сделать вывод, что иммуносупрессия возникает при любом ответе зараженного животного на микобактериаль-ные антигены, но прогрессирование болезни сопровождается нарастанием активности супрессорных клеток, причем главным образом Т-лимфоцитов-супрессоров, так как обработка переносимой взвеси антисывороткой против маркера Т-лимфоцитов Thy 1 полностью отменяла супрессию.

В то же время удаление фагоцитов из переносимой взвеси спле-ноцитов приводит к некоторому, но далеко не полному повышению пролиферативной активности тестируемых клеток. Это доказывает, что в супрессии специфического противотуберкулезного иммунного ответа макрофаги-супрессоры играют определенную, но далеко не главную роль, а подавление ГЗТ и пролиферативной активности лимфоцитов осуществляется в основном за счет Т-лимфоцитов-супрессоров.

Получив данные о существенной роли Т-лимфоцитов-супрессоров в регуляции противотуберкулезного иммунитета и для проверки гипотезы о необходимости блокады (или элиминации) этой субпопуляции Т-клеток на определенных этапах туберкулезной инфекции, нами были применены три способа воздействия на эти клетки, используя разные точки приложения:

- против маркеров-предшественников Т-супрессоров (с помощью анти -I-J- сыворотки);

- за счет удаления значительной части уже сформировавшейся эффек-торной популяции супрессорных клеток (спленэктомия мышей в определенные сроки после их заражения туберкулезом);

- путем иммунохимического воздействия на всю популяцию Т-лимфоцитов-супрессоров (обработка животных циклофосфамидом);

Для оценки первого варианта воздействия на Т-супрессоры были получены высокоэффективные антисыворотки против аллелей I - J и

I - Js. Два вида антисыворотки использовали для проверки аллельной специфичности полученных I - J - сывороток.

Прежде чем назначать антисыворотки in vivo, необходимо было провести ряд абсорбции, особенно для того, чтобы исключить наличие в антисыворотке антиидиотипических антител. Для этого полученные антисыворотки абсорбировали клетками линии мышей-реципиентов, на которых индуцирован такой же идиотип как на клетках линии-донора, т.е. использовали для абсорбции клетки линии-реципиента, у которых предварительно индуцирована иммуносупрессия эритроцитами барана. В результате были получены анти - I - J - сыворотки, в которых были истощены антиидиотипические антитела. к

•Для проверки иммунотерапевтического эффекта анти - I - J - сыворотки мы применили шестикратное введение антител по сравнению с двукратным, использованным ранее (Апт А.С. и др., 19846). Подобный способ введения обладал более выраженным антисупрессорным эффектом, особенно специфическим в отношении клеточного ответа на PPD. Это приводило к определенному усилению клеточного иммунного ответа in vivo и in vitro у зараженных мышей и некоторому увеличению срока жизни животных, хотя в заключительной фазе болезни происходило полное подавление ответа на шестикратном и двукратном введении антител. Важно отметить, что при подобном лечении усиления показателей гуморального иммунитета не было. Следует подчеркнуть, что в обоих случаях и срок жизни мышей, и показатели клеточного иммунитета были достоверно выше, чем у зараженных необработанных мышей.

Как мы уже отмечали, не существенные различия шести- и двукратного введения анти -1 - Jk -сыворотки могут быть связаны, с одной стороны, с тем, что наиболее важную антисупрессорную роль играет воздействие на индукторную популяцию Т- супрессоров или даже их предшественников, а с другой стороны, многократное введение анти - I - J антител приводит к развитию ответа на сами антитела, нейтрализуя их действие.

Как бы то ни было, подобный способ иммунотерапии оказался эффективным и, с нашей точки зрения, весьма перспективным в качестве возможного патогенетического средства лечения туберкулеза.

Также весьма позитивные результаты дали исследования, выполненные по анализу выраженности показателей противотуберкулезного иммунитета и особенностей течения инфекции у спленэктомированных мышей. Но эффективность этого метода была весьма различной в зависимости от сроков, когда после заражения животных было выполнено удаление селезенки.

Если показатели противотуберкулезного иммунитета и выживаемости мышей, спленэктомированных через три и семь дней после заражения мало отличаются от интактных зараженных животных, то при спленэк-томии через 14 дней после заражения выявляются достоверные различия. Прежде всего это касается показателей клеточного иммунитета, которые были значительно выше, чем у интактных зараженных мышей.

Достоверно различалась в сравниваемых группах и выживаемость мышей. Средний период жизни животных, спленэктомированных через 14 дней после заражения, был достоверно выше, чем у интактных зараженных животных (56,3± 3,4 и 43,8± 1,2 дня соответственно).

Таким образом, спленэктомия, выполненная через 14 дней после заражения мышей туберкулезом, т.е. в период существенного увеличения в организме зараженных туберкулезом животных супрессор-ных эффекторных клеток, главным образом Т-лимфоцитов, в значительной степени локализующихся в селезенке, обладает выраженным положительным иммуномодулирующим действием. Другими словами, спленэктомия эффективна тогда, когда необходимо удалить по возможности большую часть эффекторных Т-лимфоцитов-супрессоров, которых не удалить другим способом.

В то же время суммарный эффект лечения зараженных туберкулезом мышей циклофосфамидом оказался негативным несмотря на то, что циклофосфамид обладает антисупрессорным эффектом. Но наряду с отменой супресии, за счет действия на предшественники Т-супрессоров, циклофосфамид сокращает срок жизни зараженных животных. Как мы уже отмечали, причиной этого могут быть побочные эффекты цикло-фосфамида, приводящие, в частности, к нарушению развития специфических гранулем, с одной стороны, и вовлечению в иммунный ответ тех клеточных популяций, которые оказывают повреждающее действие на различные ткани организма-хозяина.

Кроме того, наряду с незначительным усилением клеточного иммунного ответа отмечено достоверное возрастание уровня специфических противотуберкулезных антител, что является неблагоприятным прогностическим признаком при туберкулезе. Возможно, это связано с разной чувствительностью Т-супрессоров, регулирующих ГЗТ и антителообразование к циклофосфамиду.

Следовательно, можно предположить, что введение циклофосфамида нарушает регуляцию воспалительного процесса в инфицированных органах, что приводит в результате элиминации Т-супрессоров к гиперпродукции антител и подавлению клеточных иммунологических реакций.

Таким образом, циклофосфамид, хотя и обладает антисупрессорным действием, не может использоваться в качестве иммуномодулятора при туберкулезе.

Мы сравнили три метода достаточно избирательного действия на Т-лимфоциты - супрессоры, принципиально отличающиеся как по своему характеру, так и точкам приложения по отношению к различным субпопуляциям Т-супрессоров. Так, антисыворотка против маркеров Т-супрес

81 соров действует, главным образом, на индукторную фазу образования этих клеток, циклофосфамид - на клетки-предшественники Т-супрессо-ров, а спленэктомия зараженных туберкулезом мышей удаляет эффек-торную популяцию Т- супрессоров. Эффект при этом весьма различен. В то время каканти -1 - J - сыворотка и спленэктомия суммарно обладают положительным эффектом, обработка животных циклофосфамидом оказывает отрицательное действие и этот метод не может быть рекомендован для дальнейшего анализа и возможного практического применения. В то же время весьма перспективным представляется комбинированное применение спленэктомии и антисыворотки против маркеров Т- супрессоров, что требует дальнейших экспериментальных исследований.