Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Гуморальные факторы Т-клеток и их роль в регуляции поствакцинального иммунитета

2 ь 0 ? 9 Ц

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ им. Г. И. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

ЩУР И НА Галина Викторовна

ГУМОРАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ Т-КЛЕТОК

И ИХ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА

14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского Министерства здравоохранения РСФСР

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских паук М. С. Бляхер

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Л. А. Захарова доктор биологических наук А. В. Санин

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт иммунологии Министерства здравоохранения СССР

Защита состоится « I^ » 1991 г. в « */ & » часов

на заседании специализированного совета К С84.18.02 Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского МЗ РСФСР по адресу: 125212 Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан « ' Л" »

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

О. В. Котельникова

Ш >'.;2¡¡/l i. i ... l:csäi

чТДЭЛ

1сссртацин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ альность проблемы.В результате многочисленных исследова-

ний, проведенных в последнее десятилетие л области иммунологии, сформировалось четкое' представление о существовании и постоянном, функционировании ряда ауторегуляторных систем, поддерживающих физиологическое состояние имиунной системы. Одни из них способствуют формированию иммунного ответа. Другие составные компоненты системы ауторегуляции иммунного ответа ответственны за его ограничение, за своевременное прекращение разынокения клона лимфоцитов и затухание иммунных реакций. Их основу составляй клетки и антитела, осуществляющие идиотип - антиидиотипическую ревуляцию иммунного ответа (Нраскина H.A. и соавт.,1983; Нестеренко В.Г. 1984; Jerne îî.K., 1S84) и система клеток-супрессоров ( Gerson R/К., "Kondo Ж., 1S7S., Demiesngiemaa s.С., 1984)

При детальном исследовании клеточных механизмов иммунного ответа было показано, что формирование иммунологических реакций практически на все виды антигенов обязательно сопровождается активацией и включением в слохную систему межклеточных взаимодействий клеток-супрессоров, В частности т-супрессоров ( Benacerreif Б,,1980; Golib B.S., 1983).

Появление Т-супрессоров характерно и для формирования противо-инфекционного иммунитета как после введения вакцин: Ви-антигена s.typhi, ыенингококковых полисахаридных вакцин (краскина H.A. и соавт.,1983), пневмококковой полис axa ридной вакцины ( Kuimi т., Feutti Koahela, 1988/ и т.п., гак и в ходе течения инфекционного процесса - при заражении животных различными вирусами - Денге, гриппозным коревым, клещевого энцефалита (Хозинский В.В. и соавт., .1965; Casali I. et al., 1984; Chaturvedi U.C. et al., 1988).

Функционирование Т-супрессоров опосредуется через вырабатываемые ими антигенспецифические и антигеннеспецифические медиаторы. Антигенспецифические супрессорные факторы, изученные достаточно хорошо, не только регулируют развитие иммунных реакций на микробные антигены и вакцины, но и обеспечивают регуляцию каскада клеточных взаимодействий, приводящих к образованию эффекторов супрессии ( Jinenez-Finkel Beatriz Е., Murphy Juneann W., 1958; llurphy J.W., Cor Eebecca Д., 1988).

Молекулярные основы действия антигеннеспецифических супрес-сорных факторов, освобождаемых Т-супрессорами в процессе формиро-

-Z-

ванкя протквоинфекционного посгвакцинального иммунитета во многом неясны.

Ракез было показано, что поверхностная мембранная структура Т-супрессоров мышей, выделенная в очищенном состоянии, способна функционально замечать дефицит Т-супрессоров (Бляхер М.С.,1987; Бляхер М.С., .Щуряяа Г.В., 1987). Пока отсутствуют данные об участии этой структуры в физиологическом функционировании Т-супрессоров, е частности, в гуморальной регуляции ими иммунного ответа, в осуществлении выделяемыми ими факторами негативного контроля ш-ыуноре активности.

Тот факт, что поверхностные структуры лимфоцитов (ПСЛ) мышей -МТСА и MTIA (специфический антигенный маркер зрелых Т-лимфоцитов мышей) способны замещать функционально субпопуляции лимфоцитов,на которых они находятся (Бляхер К.С., 1987; Бляхер М.С., ¡Турина Г.Б., 1987), интересен с точки зрения создания имкунокорригирующих препаратов, направленных на восстановление нарушенной иммунореактивнос:

В связи с этим представляется целесообразным получить и изучить функциональные возможности препаратов аналогичных поверхностных структур Т-лимфоцитов человека - антигена СД^ (специфический антигенный маркер Т.-хеллеров) и антигена СДд (специфический антигенный маркер Т-супрессоров человека) с целью возможного использования этих структур для проведения иммунотерапии при различных им-мунодефкцитных состояниях.

Цель и задачи исследования

Изучение роли поверхностных структур Т-супрессоров мышей в гуморальной регуляции поствакцинального иммунитета, а также функцис нальных возможностей СД^ и СД8 структур Т-хелперов и Т-супрессоров человека.

Для достижения этой цели предполагалось решение следующих задач:

1. Получить антигеннеспецифический фактор Т-супрессоров мышей (растворимый супрессор иммунного ответа - РСИО) и исследовать его биологическую активность.

2. Выяснить, какую роль играет специфический антигенный маркер Т-супрессоров мышей - МТСА - в функционировании антигеннеспе-цифического фактора Т-супрессоров.

5. Выявить роль специфического антигенного маркера Т-сулрес-

copos мышей (МТСА) в физиологической регуляции поствакцинального иммунитета.

4. Получить, изучить свойства и функциональные возмогности специфических антигенов Т-супресооров и Т-хелперов человека -СДе и СД^.

Научная новизна работа. Впервые исследована роль МТСА (специфического англгенного маркера Т-супрессоров ыьшей) в функционировании антигеннеслецифического фактора Т-супрз-ссоров мышей - РСИО, который бш получен при культивировании клегон селезенки мышей в присутствии Коняанавалина А (Кон А).

Показано, что РСШ при введении его in vivo угнетает способность мышей формировать иммунный ответ на тимус завис иные и ти-муснезависимые антигены - эритроциты барана и Ви-&нтиген s.typhi.

Впервые установлено, что эта способность РСИО обеспечивается наличием в его составе МТСА, т.к. элиминация из РСИО методом шму-носорбции МТСА липает его иммунодепрессивных свойств, а вещество, аффинно связавшееся с антителами против МТСА, находящимися на им-муносорбенте, эффективно подавляет иммунный ответ мышей на оба вида антигенов.

Впервыз проанализированы молекулярные механизмы антигеннеспе-цифической Т-супрессорной регуляции поствакцинального противоменин-гококкового иммунитета у мышей. Выявлено, что после введения менин-гококковой А полисахаридной вакцины мышам в сыворотке крови этих животных появляется МТСА, что по времени совпадает с активацией системы Т-супрессоров и возникновением поствакцинального иммунодефицита. Сыворотки животных, у которых в результате введения А полисахарида менингококков активирована система Т-супрессоров и снижен ответ на эритроциты барана, при.введении их ин-

• такгным животным обнаруживали выраженное антигеннеспецифическое су-прессорное действие , готорое было овязано о наличием в их составе МТСА, т.к. после прохождения этих сывороток через иммуносорбент^из антител к МТСА их иммунодепрессивная активность исчезала, а елюат с данного сорбента (т.е. вещество комплементарно связавшееся с антителами сорбента) обладал выраженным иныунодепрессивным действием.

Получены новые сведения о функциональных возможностях выделенных поверХй^нь^Т^хелпаров и Т-супрессоров человека - СД^ и СД8. Препараты СД^ и СДд были го лучены из лиэата лимфоцитов миндалин человека методом иммуносорбции с применением монокло-

налыаых антител соответствующей специфичности. Показано, что эти антигены серологически и электрофоретически гомогенны и обладают способностью in vitro изменять уровень пролиферативвого ответа лимфоцитов человека на фиогемагглгггинин (фГА). Препарат СД^ in vitro способен стимулировать ответ лимфоцитов человека на ФГА. Эффект СД^ зависит от исходного уровня пролиферации лимфоцитов человека на фГА и исходного иммунного статуса донора. Препарат СДд оказывает некоторое ингибирующее действие на пролиферации лимфоцитов человека индуцированную ФГА.

Практическая значимость работы

Результаты данной работы, характеризующие роль специфического антигена Т-супрессоров в осуществлении ш гуморальной регуляции иммунного ответа in vivo и in vitro, а такяе о функциональной активности СД^ и CJg формирует лре-дпосыдки для создания мшу но-корригирующих препаратов нового типа, которые представляет собой очищенные препараты антигенных маркеров иммунорегулятарных субпопуляций лимфоцитов я способных специфически замещать дефицит соответствующих субпопуляций.

Появление MECA в сыворотке животных в поствакц инадьвом периоде является показателем возникшего иммунодефицита. Дальнейшее исследование вопроса о появлении в сыворотке крови специфических антигенов яммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов,, активированных различными воздействиями, позволит, вероятно, судить о состоянии той или иной субпопуляции лимфоцитов по наличии в сыворотке ее специфической структуры, что значительно упростит оценку иимунореактивности.

Препараты специфических поверхностных структур Т-супрессоров и Т-халивров человека - антигены СД^ и СДе бьши использованы в лаборатории по изучению клеточных и молекулярных основ иммунитета для получения гетерологичных моноспецифаческих сывороток против Т-супрессоров и Т-хелперов человека.

Кроме того, материалы диссертации использованы при составлении ряда документов:

1. Инструкции по получению и контролю сыворотки диагностической против специфического антигена Т-супрессоров мышей жидкой,ут-верЕДанной Ученым советом МНИИЭМ 25 ноября 1987 г. , протокол Й 7.

2. Инструкции по получению, контролю и применению специфических антигенов лимфоцитов человека и ыышж , утвержденной Ученым сс веток КНИНЭИ (протокол № 8 от 24 ноября 1988 г.).

3.Инструкции по применению ИФА для выявления активности и специфичности моно- и поликлональных антилимфоцитарных антител, утвержденной Ученым советом МНИИЭМ (протокол Jra от 16 ноября I9d9r.)

Материалы диссертации опубликованы в 9 научных статьях.

Материалы диссертации доложены на: конференциях молодых ученых и специалистов МНИИЭМ км.Г.Н.Габричевского в 1986 и 1938гг; проблемной комиссии по программе "Бакта-риаяьная вакцина", г.Оренбург,1987; конференции молодых ученых Института им.Пастера, г.Ленинград, 1986; на Всесоюзной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической иммунологии" во II МОЛГМИ им.Н.И.Пирогова, 1989; на пленуме проблемной комиссии "Общая и прикладная инфекционная иммунология", "Иммунокоррекция", г.Рига, 1989; на конференциях лаборатории клеточных и молекулярных основ иммунитета МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевекв-го; на 10-м Европейском съезде иммунологов,. Здинб^рг, 1990.

Диссертация апробирована на заседании Секции Ученого совета МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского "Иммунология и медицинская биотехнология 5 января 1991 г., протокол №1.

Работа выполнена согласно основному плану НИР МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского и в рамках Республиканской программы "Бактериальная вакцина".

Работа одобрена и рекомендовала для приоритетного финансирования Экспертным советом по проблеме СПИД при АМН СССР.

Серологичеекая характеристика препаратов поверхностных структур лимфоцитов (ПСЛ) проводилась совместно с сотрудниками лабора-ратории молекулярных и клеточных основ иммунитета. Основная часть работы по получению гуморальных факторов Т-клеток, антигенов СД^, СДд, по оценке их биологической активности, электрофоретическая характеристика ПСЛ проводилась самостоятельно.

Структура и объем диссертации.

Диссертация написана по обычному плану и включает следующие • разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 3 главы,содержащие результаты собственных исследований, общее заключение, выводы, список цитированной литературы (194назв., в том числе 55 на русском языке). Работа изложена на IЦ?> стр., включает IT2, стр,текста,29 рисунков и 5 таблиц.

Основные положения, выносимые на защиту:

I.Одним из действующих начал антигеннеспецифического факто-

pa Т-супреесоров иыаей (РСИО) является специфическая поверхностная структура Т-супрессоров - МТСА.

2. МТСА, находящийся в составе мембраны Т-супрессоров,~не только способен функционально замещать эти клетки, но и с помощью МТСА Т-сулрессоры осуществляют аутоиммунорегуляцшо в физиологических условиях, з частности при формировании иммунного ответа на А полисахарид менингококков.

3. Специфический антигенный маркер Т-супрдссороз человека -препарат СДц способен оказывать угнетающий эффект на стимулированную ФГА пролифератЕвную активность лимфоцитов человека. Специфический антигенный маркер Т-хелпероз человека - препарат СД^ стимулирует пролиферацию-лимфоцитов человека, в ответ на ФГА.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Материалы исследования. Работа проводилась на мышах ( сзах с57в1/б)31ч ) весом 16-18 г, полученных из питомника АМН СССР "Столбовая". Исследование было проведено на 3800 мышах. 2000 животных было использовано для получения раствора лимфоци-тарных антигенов, из которого впоследствии (методом, специфической иммуносорбции) извлекали специфический антигенный маркер Т-супрес-соров мышей - МТСА. Остальных животных иммунизировали бактериальными антигенами (328), либо им вводили гуморальные факторы Т-супрес-соров мышей - РСИО (732) или иммунные к А полисахариду менингокок-вов сыворотки сингенных животных (440) и изучали влияние вышеописанных -препаратов на иммунный ответ на тимус^зависимые и тимус-независимые антигены. 300 из всех используемых мышей составляли контрольнув группу. . '

Для иммунизации животных з работе использовали:

1. Полисахаридную менингококковую вакцину серогруппы А (Ку-вакина Б.И. и др., 1978).

2. Ви-антиген s.typhi (Холчев Н.В. и др., 1965; Аллилуев А.П. и др., 1968).

Для получения и идентификации отдельных компонентов мембраны лимфоцитов в работе использовали моноклональные антилимфоцитарные антитела против Т-сулрессоров человека - анти СД8 серии "ВЬ" (ЩР) против Т-хелпероз человека анти СД^ серии "31" (ГДР) и антк Leu3 Sigme. (США). Также были использованы поликлональные анти-

лимфоцитарные антитела против Т-супрессоров мышей (АсупрГ), полученные в .МНИЙЭН км.Г.Н.Габричевского (Краскива H.A. и др.,' 1978, 1980; Бляхер М.С., 1987). -

Методы исследования.

Основана экспериментальным приемом для получения и идентификации отдельных компонентов мембраны лимфоцитов явился следующий: из гуморального фактора (РСИО, сыворотки кивотных, у которых активированы 1 супрессоры) методом иммуносорбдии извлекали специфический антиген Т-супрессоров - МТСА и проводили сравнительное наблюдение антигеннеспецифической супрессорной активности указан-•выг факторов' до и после проведеаия шмуносорбции.

Аналогичным образом были получены из лизата лимфоцитов человека СД^ и СД8 структуры.

В процессе работы было получено 10 иаиуносорбентов из антител против специфической поверхностной структуры Т супрессоров мыией - ИСАйулрр , 4 инауносорбента из антител против Т-супрессоров человека СЙСантиСд8) и 4 ишуносорбента из антител против Т-хелпе-ров человека (ИСанти1еи3а или ИСан1иСД^).

Получено и проанализировано б серий РСИО (растворимый супрес-сор иммунного ответа) и 440 сывороток, из которых методом специфической шшуносорбции извлечено 30 серий препарата ЙТСА (специфический антигенный маркер Т-супрессоров мышей). Из раотвора лимфо-цитарных антигенов миндалин человека (PJ1A миндалин) на й1^антис;д и ксан:гисд иетодои шиуносорбции получено 9 серий препарата ^ СД^ и II 8серий СД3 соответственно• \

Поверхностные структуры лимфоцитов (ПСЛ) (антигены - МТСА, СД^ и СДд) были охарактеризованы серологически и методом электрофореза в полиакршгамидноы геле (Остерман, 1987).

Оценку биологической активности гуморальных факторов Т-кле-ток и поверхностных структур лимфоцитов проводили по изменение уровня иммунного ответа при введении этих препаратов in vivo. Для этого использованы следующие методы:

1. Выявление антителообразующих клеток, продуцирующих антитела разной специфичности,'методом локального гемолиза в геле

( Jeme N.X., líordin А.А.,1963).

2. Оценка активности Т-супрессоров по их способности влиять на зрелые антителообразующие клетки (Бляхер М.С., 1987).

-о-

функциональвые возможности Иц и СД8 препаратов изучали в опытах in vitro. Изучалось влияние этих структур напролиферативную активность лимфоцитов человека (исследования проведены на клетках 22 доноров), стимулированных фитогеиагглвтинивом (ФГА) /внауои, 1971/.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием методов вариационной статистики Фвпера-Стьвдента (р$0,05) /Снедекор, 1961/.

• РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Настоящая работа состоит из 3-х основных разделов.

Основной.задачей первого раздела исследования было получение, изучение биологической активности антигеннеспецифического фактора Т-супрессоров мышей (так называемого "растворимого супрессора иммунного ответа" -РСИО), а также обоснование и экспериментальное доказательство возможной роли специфической поверхностной структуры Т-супрессоров мышей - МТСА в осуществлении данным фактором сзоих иммунорегулятораых функций.

PCfcO получали при культивировании клеток селезенки мышей в присутствии Конканавалина а. Среда культивирования-reüi-164-о , з которую добавлены необходимые ингредиенты. После культивирования супернатант обрабатывали сефадексом для удаления КонА, отделяли от сефадекса центрифугированием и диализовали против физиологического раствора.

Изучали влияние РСИО на иммунный ответ мышей на эритроциты

барана и Ви-актиген s.-typhi . Получено б серий РСИО, которые

обладали идентичной биологической активностью- - при введении

in vivo РСИО подавлял иммунный ответ мышей на тммус-зависишй-

эритроциты барана и тимус-независимый антиген - Ви-антиген s.-typhi.

Далее проводилась идентификация активного начала РСИО, в частности выяснялся вопрос о наличии поверхностной структуры Т-супрессоров - Í.ÍTCA в составе РСИО и ее роли в осуществлении этим фактором иимуноделрессивных эффектов.

Выделение МТСА из РСИО проводили с помощью иммуносорбевта из антител к Т-супрессорам мышей. РСИО наносили на иммуносорОент; раствор, прошедший через сорбент, назван РСИОфильтрат; вещество, полученное с данного сорбента после элюции,.названо РСИОэлюат. Зля контроля РСИО пропускали через иммуносорбент из антител дру-

roí; специфичности и получали анаюгичные фракции. Бито проведено сравнение способности исходного препарата РСйО ¡i его фракций, очищенных на иммуносорбентах, влиять на иммунный ответ мышей на эритроциты барана (ЭБ) и Ви-антиген s.typhi.Результаты таких экспериментов представлены на рис.1. Исходный препарат РСЮ угнетал иммунный ответ нишей на оба вида антигенов, РСЮ фильтрат терял иммуно-депрессивные свойства, РСйОэлюат, т.е. вещество, комплементарно соединявшееся с антителами против МТСА, фиксированными на иммуно-сорбентз, полностью сохранял способность к подавлению иммунного ответа мышей на ЭБ и Вя-антиген s.typhi. После прохождения РСИО через иммуносорбент из антител другой специфичности его иммунодепрес-сибныз свойства не изменялись; фракция элюат с этого иммуносорбен-та не подавляла иммунный ответ на оба вида антигенов.

Данные, представленные в этой глазе, свидетельствуют о наличии в составе активного начала антигеннеспецифичвского супрессорниго фактора - поверхностной мембранной структуры Т-супрессоров мышей -МТСА. Можно предавлаттъ, что о длин из возможных механизмов действия Т-супрессоров является секреция в окружакщую среду в определенных условиях (активация антигеном, ыитогеном и др.) данной поверхностной структуры, свойственной этой субпопуляции лимфоцитов и способной осуществлять супрессорные эффекты.

Исследованию механизма действия Т-супрессоров in vivo посвящены эксперименты, результаты которых представлены в следующей части работы. —

В следующей разделе работы проанализированы шлекулярные механизмы регуляции поствакцинального иммунитета. В связи с этим проведаны исследования по. выявлению МТСА в сыьоротках мышей на определенных сроках иммунного ответа на А полисахарид менингококка и его роли в регуляции ишунореактивности у эгюс животных. Схема опытов представлена на рис.2.

Мышам (СБА х C57BI/6)Fj вводили внутривенно иммуногенную дозу А полисахарида менингококка (0,5 мкг). Иммунизация проводилась в разные дни (по 10 мышей на каждый срок). Затем часть животных (по 5 мышей каждого срока) забивали, извлекали селезенку и брали сыворотку крови. В селезенках мышей определяли уровень антитело-образования на данный бактериальный антиген и активность Т-супрессоров. Сыворотку мышей,иммунизированных А полисахаридом менингококка, использовали для изучения ее иммуномодулирующих свойств, т.е. сыворотку вводили внутривенно (по 0,5 мл) янгактньш синген-

iUU.

эб

a)

AOK

"Vi

б)

II III

I II III Группы животшх

Рисунок 1. Иммунодепрессивная активность РСИО и его фракций,

получению; на ИСАсупрГ-Vl-антиген S. typhi).

(ответ на. „эритроциты барана (а) к

Группы животных (шли, которые за 1 сутки до введения ЭБ еде Vl-антигев S.iypfii получали:): I - препарат РСИО; II - РСИО-фпльтрат ИС АсупрГ; III - РСИО-элкаг ¡1С, _ .

АсупрГ

Контроль - уровень иммунного ответа на эритроциты барана (а) ели Vl-антиген S.typhi (б) у мшей, не получавши препарате

РСИО.

А П/С

^>1

вскрытие

сыворотка

введение кнтакт-нкм кипам и изучение илмукомоду-лкрувдкх свойств

селезенка

АОК,

иммунизация зрцтраш'тами барана

5 дней

о '

о о ❖

АОК,

'ЭБ

Рисунок 2, Изучение механизмов Т-супрессоркогс контроля пост-вакшнального иммунитета (Схема опытов).

А0К,„ - 103

менингококка

Рисунок 3. Иммунный ответ милей, вакцинированных А-полисахаридом менингококка, на эритроциты барана".

Контроль - уровень иммунного ответа мышей, не полу^ав'аих А полисахарид менингококков, на эритрошты барано

гег.нш кивотным и наблюдали за изменением уровня иммунного ответа на ЭБ- Второй части животных, получавших в разные дни А полисахарид менингококка, вводили ЗБ, т.е. била изучена способность мышей, получавших А полисахарид менингококка., отвечать.на посторонний антиген - ЭБ.

Была изучена динамика ишунного ответа мышей на А полисахарид менингококков и показана выраженная активность Т-сулрессоров практически на всех сроках формирования поствакци^ального противоменин-гококкозого иммунитета.

Следующей задачей данного раздела работы было выявление изменения иммунореактивности ныией по отношению к постороннему антигену - ЗБ-в ходе формирования у них поствакцинального противоменин-гококкового иммунитета.

На рис.8' представлены результаты опыта, в котором изучалась способность животных, получавших в разные сроки А полисахарид менингококка отвечать на ЭБ. Обнаружено, что на поздних сроках (9-13 сутки) формирования поствакцинального иммунитета возникает состояние иммунодефицита, которое выранается в значимом угнетении способности еивотных формировать иммунный ответ на посторонний высокои!'.-муногенный антиген - ЭБ.-

Вакная роль клеток-супрессоров~в- регуляции поствакцинального иммунитета не вызывает сомнений.

Современные представления о механизмах действия Т-супрессорсв сзязани с выделением ими растворимых медиаторов иммунного ответа так называемых сулрессорных факторов. Возможно, что антигзннеспеци-фические Т-сулрессоры, активирующиеся после введения вакцинных препаратов', также выделяют в окружающую среду (в,кровоток) антигенне-специфлческай супрессорный фактор и посредством этого фактора осуществляют свою иммунодепрессивную функцию,-

Для выяснения этого вопроса были исследованы имыуномодулнрукь щие свойства сывороток крови мышей! иммунных к А-пслисахариду менингококков. Мышам (СБА-зс С57В1/6) Р} вводили внутривенно 0,5 мл нормальной мышиной сыворотки или по 0,5 мл сыворотки крови кыаей, взятой в определенный срок после иммунизации А-антигенок. На следующий день животные получали по 2»106ЭБ (в/в). Через 5 дней после введения ЭБ в селезенках мышей определяли число клеток, продуцирующих антитела к ЭБ.

Н2 рис.4 приведен припер результатов такого опыта.

т—I—I—I—I—I—I—I—I—1—I—I—I * 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13

Сутки после вьедения Л-п/с менингококка

■ Рисунок 4. Изучение шмуношодулкрушкх свойств сывороток мшпей, ю.иункнх к А-полксахзридУ менкнгококка.

Контроль - уровень иммунного ответа мьией, получавших

сыворотку интактных животных, о———о - уровень ;;ымунного ответа мышеР, получавших сыворотки, и:я.:ункых к А-подисахариду животных.

Показано, что сыворотка, взятые у животных через 9-13 дней после введения 'им А полисахарида менингококка, обладали ангагенне-спбцифнческкми шшунодепрессивнши свойствами. При введении "таких сывороток интактнш сингенным вдвотным происходило значимое подавление иммунного о!вета на ЭБ. Сыворотки, взятые у кивотных в другие сроки формирования поствавдинального иммунитета, имыунодепрессивными свойствами не обладали.

Данные, представленные в этом разделе работы, свидетельствуют о том, что на поздних сроках формирования поствакцинального иммунитета возникает состояние иммунодефицита, которое выражается в значимом угнетении способности животных, получавших А-вакцину формировать иммунный ответ на посторонний в ысо колыму но генный антиген. Сыворотки, взятые у вакцинированных животных в эти сроки, обладают выраженным иммунодепрессивным действием.

Поскольку на гоздних сроках формирования лоствакцинального иммунитета активируются антигеннеспецифические Т-супрессоры, механизм действия которых опосредуется через вырабатываемые ими супрес-сорные факторы, мы предположили, что депрессивный эффект сывороток крови обусловлен наличием в них гуморального фактора, действующем началом юторого является МТСА.

Для идентификации компонента выворотки крови, за счет которого реализуется ее иымуноделрассивная активность, был применен метод иимуносорбции. Сыворотки после диализа наносили на аффинную колонку из антител против МТСА. Далее исследовались исходные сыворотки и их фракции, полученные в результате иммуносорбции, на их способность изменять иммунный ответ мышей на ЭБ. На рис.5 приведены результаты исследования шшунодепрессивных свойств сывороток, взятых у мышей через Ю, II, 13 дней после введения А полисахарида менингококка. Показано-, что эти сыворотки обладали выраженным антигеннеспецифическим иммунодецрессивным действием, подавляя иммунный ответ интагсгных кивотных на ЭБ. Эта супрессорная активность связана с наличием в сыворотках МТСА, так как после контакта с иы-ку но сорбентом из антител прошв МТСА их супрессорная активность исчезает, а элюат о этого иммуносорбента оказывает выраженный иммуно депрессивный эффект. Зхо связано со специфическими свойствами антител, фиксированных на данном иммуносорбенте, так как проведение сывороток через иммуносорбенг из антител против -мышиных глобулинов не изменяло их иммунодепрессивных свойств, а элюат с последнего сорбента не обладал кммунодепрессивными свойствами. Это сви-

е л.

100-

80-

60

40

20-

1 2 3

Н.М.С.

контроль

СЮ

С11

А

с13

Рисунок 5. Роль МТСА в ишунодаду.тсрущих свойствах сывороток мышей, шлунных к А-пом:сахэ~ рвд/ менингококка.

По оси ординат:

АОК^ в селезенка н ь к контролю

Исследованы скворотки мышей к их фракции, полученные ка ^"нсупрГ'

Мышам за 1 сутки до ЭБ введена:

1 - исходная сыворотка, взятая через 10 (с10), И

(с11 ) ели" 13 (с13) суток после введения А-еслксохс-рида менингококка.

2. - фильтрат ИС.

- АсупрТ

3 - элюаг ИС,

АсупрГ

"Контроль - иммунный ответ мышей, не получавших скворото^ т эритроциты барана.

-Io-

детельствует также о том, что имкунодепрессивные свойства сывороток , по-видимому, не связ-аны с антиидиотилическими антителами. Сыворотки иктакгных мышей при введении je in vivo не влияли на уровень иммунного ответа на ЭБ и не содержали в своем составе КГ С А.

Таким образом, выявлено, что после введения меншгококковой А по ли с ах аридной вакцины мшам в сыворотке крови этих еивоткых появляется МТСА, что по времени совпадает с активацией системы Т-супрессоров и возникновением поствакцинального иммунодефицита. Зто позволяет предположить, что МТСА, находящийся в составе мембраны Т-супрессоров, не только способен функционально замещать эти клетки, но и с помощью МТСА Т-супрессоры осуществляют аутоиммунорегуля-цию в физиологических условиях.

Как было показано ранее, поверхностные структуры лимфоцитов мышей способны замещать функционально эти сублопуляции лимфоцитов. В связи с этим следующий раздел работы был посвящен изучению функциональных возможностей аналогичных поверхностных структур Т-хелле-ров и Т-супрессоров человека - препаратов СД^ и CJg. В результате работы получены новые сведения о функциональных возможностях препаратов поверхностных структур Т-хелперов и Т-супрессоров человека - СД^ и СД0. Препараты СД^ и СДд были получены из лизата лимфоцитов миндалин человека методом иммуносорбции с применением моноклональ-ных антител соответствующей специфичности.

Характеристику полученного антигенного материала проводили методами электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноферментного анализа (ИФА).

Изучение серологической активности антигенов СД^ и СДц проводили методом ИФА, используя вариант непрямой Elisa , с применением коммерческих моноклональных антител фирмы- "ОРТНО". Антиген СД^ давал значимую реакцию только с ыоноклональными антигелами против Т-хеллеров (ОКТ^ифнтиген СД8 взаимодействовал с юноклональ-ными антителами против'Т-супрессоров человека (OKTg). Было сделано заключение о том, что антигены СД^ и СДд, выделенные методом иммуносорбции на специфических иммуносорбентах, элактрофоретически в серологически гомогенны.

Далее изучалось влияние поверхностных структур Т-супрессоров и Т-хелперов человека на стимулированную фГА пролиферацию лимфоцитов здоровых доноров и больных постинфекционным полиартритом.

При изучении влияния антигена СД^ на пролиферативную активность лимфоцитов, стимулированных ФГА, было установлено, что данный

прапарат вызывает увеличение пролиферативной активности этих лимфоцитов (рис.б), причем стимулирующий эффект препарата СД^ более зыраган в том случае, если СД^ вносят в культуру лимфоцитов больных: постинйекционным полиартритом, у которых наблюдаются сдвиги в численности иммунорегулятсрных субпопуляций. Стимулирующий эффчкт препарата СД^ также зависел от некоторых свойств лимфоцитарной суспензии: lo-первых, от исходного уровня пролиферативной активности лимфоцитов на ФГА (обратно пропорциональная зависимость), ^о-вюрых, от количества Т-супрессоров в периферической нрози доноров (прямо пропорциональная зависимость). Не обнаружено зависимости между количеством Т-хелперов в периферической крови доноров и стимулирующим эффектом СД^ (рис.6).

Препарат СД8'обладал активностью противоположной активности СД^ (рис.7). Антиген СДд, внесенный в культуру лимфоцитов человека, стимулированных ФГА, вызывал угнетенна пролиферативной активности лимфоцитов здоровых доноров-, не изменяя пролиферативной активности лимфоцитов больных постинфенционным полиартритом.

Представленные данные свидетельствуют о том, что специфический антигенный маркер Т-супрессоров человека - препарат СДд способен оказывать угнетающий эффект на стимулированную ФГА пролифе-ративную активность лимфоцитов здоровых доноров.

Препарат СД^ стимулирует пролиферацию лимфоцитов человека, индуцированных ФГА, у доноров с повышенным содержанием Т-супрессоров в периферической крови и у доноров со сниженным исходным уровнем пролиферации лимфоцитов на ФГА.

Полученные данные о функциональной активности антигенов СД^ и СДд важны с точки зрения теоретической иммунологии, так как являются основой для понимания механизмов взаимодействия между лим-.фоидными клетками, а также и для практической медицины - вероятно, они найдут применение в клинике для коррекции иммунной системы при патологии, сопровождающейся дефектами иымунорегуляторных субпопуляций. ""'*

Б настоящее время в трех клиниках США начато испытание нового препарата рекомбинантного растворимого рецептора СД^ Т-клеток хелперов человека, связывающегося с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и нейтрализующего его. Препарат прошел ряд экспериментальных проверок in vitro в научных учреждениях США, Швейцарии И Франции ( Edwards В.В., 1988; Bzzell С., 1968; Lifgon J.D.et al., 1933; Iaizuke-Tii Т. et al., 1988).

В указанных случаях авторы исходили из имеющихся данных о на-

Рисунок 6. Стимуляция лролЕфератшкого ответа лимфоцитов человека ка ФГА препаратам СЛд и зависимость эффекта от свойств суспензии лимфоцитов.

180 -

160

140 -

120

1

4

I

и ш

160

140

120

щ

ш

1 1

ш

исходный

ш

ж

уровень РБ

55 Т-суп- % Т-хел-рессоров пероз

группы РБГЛ

доноров >10000 <10000 >18 <18 >55 <55

. ерш ерш

По оси ординат: уровень пролиферативной активности лимфоцитов ка ФГА в % к контролю.

Контроль - уровень пролиферативной активности лимфоцитов ка ФГА без добавления СД,.

Группы доноров: 1-вое обследованные; П-здоровые доноры; III-больнке лостинфекциоякым полиартритом.

Рисунок 7. Изменение пролиферативной активности лимфоцитов здоровых доноров и больных постинфекционным полиартритом под

влиянием СД,

в1

здоровые больше доноры посткнфекци-ошшы полиартритом

По оси ординат: уровень пролиферативной активности лимфоцитов ка ФГА в % к контролю.

Контроль - уровень пролиферативной -активности лимфоцитов на ФГА без добавления СДд.

-IS-

личин б составе СД^ структуры.участка, способного связывать вирус СПЩа. Мы предполагаем, что препарат СД^ макет быть использован в комплексе иммунотерапии ВИЧ-инфекции с учетом выявленных в данной работе свойств этой структуры - способности усиливать ответ Т-кле-ток, особенно в условиях нарушения иммунного статуса.

ВЫВОДЫ

1. Специфические антигенные маркеры иммунорзгуляторных субпопуляций лимфоцитов человека и мыши играют существенную роль в регуляции инкунореактивности. С этими структурами связана реализация биологической активности Т-помощников и Т-супрессоров.

2. Специфический антиген Т-супрессоров мышей - МТСА явлпстся одной из активных субстанций антигеннеспецифического фактора Т-супрессоров ыьшей - растворимого сулрессора иммунного ответа (РСГО).

3. В процессе формирования противоменингококкового поствак-ционального иммунитета у мышей, одновременно с активацией Т-супрессоров, в сыворотке крови появляется МТСА, наличие которого определяет антигенкеспецифическое ишуно депрессивное действие этих сывороток: секреция МТСА Т-супрессорами является одним из механизмов антигенне специфического иммунорегуляторного действия Т-супрессоров.

4. Препараты СД^ и СДд - маркеры соответсгвенно Т-хелперов и Т-супрессоров человека, полученные из лизата лимфоцитов миндалин методом иммуносорбции с использованием имчуносорбентов из моно-клональных антител Leu 3» ¡цщ аН1и щ серологически и электро-форетически гомогенны.

5. Препарат СД^ in vitro способен стимулировать ответ лия-фоцитов человека на ФГА; эта способность проявляется особенно ярко при низком исходном уровне пролиферации лимфоцитов на ФГА и высоком содержании Т-суп'рессоров в периферической крови доноров.

Препарат СДд in vitro снижает пролиферативную активность лимфоцитов, стимулированных ФГА.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бляхер И.О., Пурина Г.В., Пстошкна С.П. Имку но стимуляция при иммунсдефицитных состояниях с помощью компонентов мембраны лимфоцитов/УИмцунодефЕцитк и аллергия: Тез. докл. Всесоюзного симпозиума с международным участием. - М.,1956. - C.II9-I20.

2. Регуляторные функции Т-супрессоров в поствакцинальном иммуногенезе /Бляхер М.С., ¡¡¡урина Г.В., Еегер Е.М., Каледина И.В./, Теоретические проблемы эпидемиологии и инфекционной иммунологии

на современном этапе. - Нальчик, 1986. - С.172-173.

3. Бляхер М.С., Шурина Г.В., Каледина К.В. Роль поверхностных структур мембраны Т-супрессоров в регуляции поствакцинального иимунитета//Актуальные вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммунологии; механизмы противоинфекционного иммунитета: Тез.докл. Всесоюзной конф. - Саратов, 1987. - С.31-32.

4. Бляхер И.С., Пурина Г.В. Поверхностная мембранная структура Т-супрессоров мышей (МТСА)- препаративное выделение и биологические функции// .Иммунология, 1987. -№ 5. - С.31-38.

5. Бляхер М.С., Щурина Г.В., Исгощина С.П. Участие специфической мембранной структуры Т-лимфоцитов мышей (ЫТЗД) в иммунном ответе// .Иммунология, 1968. 2. - С.39-42.

6. Бляхер М.С., Щурина Г.В., Вегер K.M. Роль Т-супрессоров и поверхностных структур их мембраны в регуляции поствакцинального иммунитета//Современные аспекты изучения иммунологической безвредности и эффективности вакцин: Сб.трудов МНЙИЭМ им.Г.Н.Габричевского. - М., 1988. - C.I05-II7.

7. Шурина Г.В. , Бляхер М.С., Нсгошина С.П.>Ангигеннеспецифический фактор Т-супрессоров (Молекулярные механизмы регуляции иммунного ответа на антлгены бактериальной и небактериальной природы)//Со временные аспекты изучения иммунологической безвредности и эффективности вакцин: Сб.трудов ЫНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского. -«.,1988.-0.134-142.

8. Каледина И.В., Щурина Г.В., Бляхер М.С. Применение метода иммун о сорбции и иимуноферментного анализа для определения специфичности антилимфоцитарных мсноклональных антител//йнтерлейкины и другие медиаторы в клинической иммунологии: Респуб.сб.научных трудов. - М. ,1969. - С.167-172.

9. Bliacher U.S., Sohurina G.Y., Krashina II.A. Functional potency of surface structures isolated from T-lymphocyte membra-nes//European federation of immunological societies 10-th

meeting.- Edinburg, 1990.- P.22.