Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунобиологические свойства нового специфического иммуномодулятора на модели экспериментального туберкулеза

На правах рукописи

РГ5 ОД

- 6 СЕН 1399

ГОРЕЛОВА Либовь Алексеевна

ИКМУНОБИОПОГИЧЕСКИЕ свойства НОВОГО СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИНМШЮН0ДШ1ЯТ0РА НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО Т9БЕРКШ1ЕЗА

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание дченой степени кандидата биологических наук

Яосква - 1999

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза PfiMH

Научный руководитель

Офицальнне оппоненты

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник P.D. Романова доктор биологических наук, профессор Я,И. Краснопрошина доктор биологических наук, профессор В.Н. Федосеева

Ведучее учреждение - Научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Московской Академии наук им. U.M. Сеченова

Зачита состоится " " ............ 1399 г. в часов на

заседании диссертационного совета К.084.18.02 при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10.

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского.

Автореферат разослан " " .......... 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Л.И. Новикова

PS4X -¿33,0

ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТИ

Актуальность проблемы

В настоящее вреня наблюдается утяжеление течения туберкулезного процесса, снижение иммунитета и развитие вторичного иммунодефицита у подавлявшего числа больных (до 75%), а также появление больного количества больных с резистентными микобактерияни к противотуберкулезным препаратам (Хоненко А.Г. и др., 1994, Кузьмина Н.В., 199В).

Для повнвеиия эффективности противотуберкулезного лечения с цельв коррекции вторичного иммунодефицита применятся неспецифические иммуноиодулирувщие средства: синтетические-леванизол. диу-цифон, нуклеинат натрия и др. (А.5. Инсанов, 1384, Т.В.Баранова, 1986), биологические препараты, полученные из тимуса животных -Т-активин, тималин, тимоген и др., а также вещества, выделенные из бактерий-рибомунил, нродигиозан и дрЛВ.Я.Арион, 1984, Хоненко И.С.. 1993).

Под воздействием выне перечисленных препаратов, у больных туберкулезом частично нормализовнвались показатели иммунитета и

г

повивалась эффективность лечения. Однако положительный эффект отмечался не у всех больных, и нередко, такие показатели.как специфическая пролиферативная активность Т-клеток в РБТ в ответ на антигены иикобактерий, не всегда восстанавливалась.

Известно, что больным туберкулезом для стимуляции специфических реакций клеточного иммунитета, являющегося основным звеном противотуберкулезной защиты, в качестве иммуномодулирунщих средств применянт туберкулин, реже - вакцину БЦЯ (В.А. Крылов, 1995).

Для получения хорошего эффекта данная патогенетическая терапия обычно применяется на ранних этапах лечения, но индивидуаль-нын схемам с учетом туберкулиновой чувствительности организма больного. При тяжелых формах туберкулеза применение туберкулине и БЦ1 - терапии ограничено.

Эчитывая, что часть туберкулезных антигенов при самостоятельном введении является слабыми иммуногенами, было необходимо соединить их с синтетическим адьввантом, который, сам обладая им-муномодулирущим эффектом, усиливал бы имиуногенное действие данных антигенов.

Для этих целей нам представлялось интересным использовать новый синтетический имнуномодулятор-пслиоксидоний, ( разрешенный для применения и хоропо зарекомендовавший себя в клинике (В.Ф.С. 42-2727-96). Било показано, что применение полиоксидония в сочетании с лекарстветшми препаратами нормализовало показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных бронхиальной астмой, хроническим бронхитом, с гнойно-раневыми инфекциями(й.И.Борисова с соавт., 1997; В.Н.Некрасов с соавт., 199?; 1!.А.Козлов с соавт., 1997; Т.И.Гривина с соавт., 1998). При этом повивались сниженные показатели лимфоцитов с маркерами СДЗ, СД4, увеличивалась фагоцитарная активность нейтрофилов.

В настоящем исследовании сделана попытка создать противотуберкулезный препарат, который соединил бы в себе свойства полиок-сидония активно стимулировать неспецифические иммунологические показатели (Т-лимфоциты, их субпопуляции, активность фагоцитоза) и усиливать специфическое имиуногенное действие антигенов, выделенных из туберкулезных микобактерий.

Для этого было необходимо соединить полиоксидоний с антигенами микобактерий вакцинного ятамма БЦ8, отработать безопэснуп для организма дозу, ливеннуш токсико-аллергических свойств, изучить специфические свойства препарата, особенно его специфическое иммуиоиодулирупдее действие, а также экспериментально обосновать возмояность его применения на больных туберкулезом.

Цель исследования

Разработка специфического противотуберкулезного иммуноиоду-лятора, состоящего из антигенного комплекса цитоплазмы микобактерий БЦЗ и неспецифического имиуномодулятора - полиоксидония (П),(препарат ЦП-Б1Ш3. изучение его иммунобиологических свойств.

Задачи исследования

1. Вндслить из микобактерий туберкулеза вакцинного втамна БЦ1 антигенный комплекс цитоплазмы (ИКЦ).

2. Сконструировать специфический противотуберкулезный имму-

I

номодулятор ЦП-БШ из антигенного комплекса цитоплазмы и полиоксидония.

3. Изучить токсичность, реактогенность и специфическую активность препарата Щ1-БЦ8 на здоровнх яивотных.

4. Отработать оптимальную дозу препарата Щ1-БЦ1, не вызывавшую токсико-аллергических реакций у иивотннх.

5. Изучить иммупомодулирушцее и лечебное действие препарата ЦП-БЦ1 на модели экспериментального туберкулеза.

Научная новизна

1. Разработан и сконструирован специфический иммуномодулятор Щ1-БЦЯ, содержащий комплекс туберкулезных антигенов, выделенных из цитоплазмы микобактерий туберкулеза штамма ГзЩ.и синтетического носителя: иммуномодулятора - полиоксидония .

2. Показано отсутствие токсичности и геактогенности препарата ЦН-БЦ8 в оптимальных дозах с помощью современных морфологических и инмунологических методов.

3. Впервые показана возмонность применения данного специфического иммуномолулятора I самостоятельно и в сочетании с противотуберкулезной химиотерапией) при экспериментальном туберкулезе у мыией. Изучены иммуноиодулирующие свойства препарата.

4. Получен патент на изобретение "Имиунокодулируиадее лекарственное средство" N 2112543 от 1С/ июня 1998 г.

Практическая значимость

1. Сконструирован специфический противотуберкулезный иммуио-модулятор - ЦП-БЦШ, способный восстанавливать нарушенные параметры противотуберкулезного иммунитета, ке вызывая при этом токси-ко-аллергических реакций в организме экспериментальных яивотиых.

2. На основании проведенных экспериментов отработаны дозы препарата ЦП-БЦЯ и схемы которые могут быть использованы в после-душней при пведения больным туберкулезом.

I

Внедрение результатов в практику здравоохранения

Разработанной специфический противотуберкулезный иммуномодулятор ЦП-БЦЯ внедрен в ЦНИИТ РАМН (акт внедрения ЦНИИТ РАМН).

С целью получения разревения на клинические испытания имму-номодулятора на ограниченном контингенте больная туберкулезом, осложненным вторичным иммунодефицитом разработаны:

1) Инструкция по приготовлении и контролю препарата ЦП-БЩ.

2) Результаты лабораторно-экспериментального (доклинического) изучения препарата 1Ш-БЦ8 - специфического противотуберкулезного иымуномодулятора.

3) Программа клинических испытаний препарата Щ1-БЦ8 при туберкулезе,

4) Приготовлены 3 серии препарата ЦП-БЦ8.

Положения, выносимые на защиту

1. Сконструирован специфический противотуберкулезный иммуно-модулятор - ЦН-БЩ, состоящий из антигенного комплекса цитоплазма (ЙКЦ), содержащего ОЛ мкг белка, и 1 мг полиоксидония (П).

2. Обосновано, что препарат ЦП-БЦ8 с содержанием 0,1 мкг белка АКЦ является безвредным и не вызывает токсико-аллергических реакций.

3. Показано, что введение специфического иммунонодулятора Ш-0Ц1 в отработанной дозе и схеме 2 раза в недели в течении двух !едель (2x2) повышает фагоцитарную активность макрофагов, ин-шчирует развитие в организме здоровых мнией развитие специфических реакций ГЗТ и аитителообразовання.

4. Использование препарата 1ДО-1Щ1 по отработанной дозе и :хеме как самостоятельно, так и совместно с противотуберкулезной [имиотерапией, оказывает иммуномодулирующее действие и обеспечи-1ает высокий терапевтический эффект.

- 6 -

Апробация диссертации

Материалы диссертации долояенн на конференции "Молекулярные основы патогенеза и диагностики туберкулеза и другой легочной патологии" (Москва, 1995), II Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва 1995), Международной конференции по легочным заболеваниям (Пария, 1977), йеяотделенческой конференции ЦНИИ туберкулеза РАИН (1998).

Диссертация опробярована 14.07.98 г. на научной конференции отдела иммунологии Ц1ШМТ Р1Ш1.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Получен патент на изобретение "Иммуноыодулирукщее лекарственное средство" N 2112543 от 10 ивня 1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалы

В работе использованы микобактерии туберкулеза.

- Человеческого вида вирулентный нтамм H.huaanus H3?Rv.

- Аттенуированннй вакцинный атамм микобактерий М.bovis BCG -Московский субитамм, бил представлен в виде пленки лабораторией БЦ1 1ШИ Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. Культуру БЦй выращивали на синтетической среде Сотон при t-37,5 и собирали в логарифмической фазе роста через 14 суток после посева. Вирулентную культуру микобактерий 113?Rv выращивали на плотной питательной среде Йкольиикова и собирали через 17 суток после посева. Для заражения использовалась доза 2-5x10 клеток на мывь.

- Иммуномодулирунщийй препарат.

Антигенный комплекс цитоплазмы (ЙКЦ) выделяли из разрушенной

культуры И.bovis ВСЕ дифференциальным центрифугированием при 17000 об/мин. Стандартизация АКЦ проводили по содерванив белка в 1 мг сухого веаества цитоплазмы.

Различные дозы АКЦ, стандартизированные по содержании белка, были соединены с нолиоксидонием (1 иг) донорно-акценторнынн связями (Патент "Имиуномодулируицее лекарственное средство" Н 2112543 от 10 ипня 1938 г).

- Использованы экспериментальные яивотние.

Для изучения токсических свойств, реактогенного и инмуномо-цулирунщего действия препарата 1Ш-БЦ1 использовались мнви линии SBA в количестве 400 аивотннх. Для приготовления гипериммушшх штисывороток к цитоплазме БЦ! были использованы кролики породы '«нняилла" в количестве 10 »ивотннх. Иорскне свинки в количестве 13 животных использовались для изучения анафилантоидного действия фепарата, а такае способности вызывать развитие туберкулиновых Фоб а сенсибилизированная и зараяенннх животных.

Методы,

Дезинтеграции микобактерий БЩ проводили механическим растиранием со стеклянным песком в течение часа с цик-ичностьв по 20 минут. Цитоплазму выделяли дифференциальным уль-рацентрифугированием. Определение белка проводили по Бредфорду 13?2), нуклеиновые кислоты по A.C. Спирину (1958), углеводы в еакцни с антроновнм реактивом.

Изучение белковых антигенных препаратов проводили с помоцъю лектрофореза в 10% полианриламидном геле по методу U.Laeili 1970) в присутствии ДДС при силе тока 30 мА. Для определения ио-гкулярнах масс были использованы наборы стандартных белков фирмы laraacea, которые одновременно с исследуемыми образцами подвер-али электрофорезу в 11АПГ с ДДС.

В работе использованы клеточные тесты для изучения гинер-чдвствительности замедленного типа СГЗТ).

В реакции бласттрансформации (РБТ) на туберкулин (РРД) определяли пролиферативнув активность лимфоцитов селезенки у мнвей по методу М.М. Авербаха и др. (1984).

Определение туберкулиновой чувствительности у мыией проводили в подунечках лапок с использованием альттуберкулина (ЙТК) Коха (Харьковский завод бактерийных препаратов), по' методу И.И. Авербаха и др. (19?8).

Фагоцитарную активность макрофагов перитонеального экссудата мышей проводили с использованием лабораторного «тамма Staphylococcus (N 9198) и М.bovis ВС6 в соответствии с "Основными положениями по доклиническому испытании иммунобиологических препаратов" (1989).

Выживаемость мнвей оценивали на экспериментальной модели по средней продолжительности лизни. С помочью патоморфологического анализа исследовали органы (легкие, селезенку, печень, лимфатические узлы), срезы которых окранивали гематоксилин - эозином.

Определение количества колоний образующих единиц (КОЕ) мико-бактерий в легких мняей проводили в стерильных условиях. Из гомо-гената целого органа в физиологическом растворе готовили серию разведений, которые по 0,15 мл вносили в стерильные чаши с плотной питательной средой (Bubos oleic agar, Difco, Detroit, CSA).Через 3 недели подсчитывали КОЕ иикобактерий на целый орган. Заражение «ивотннх вирулентной культурой II3?Rv и высеваемость никобактерий из легких проведены совместно с д.м.н., профессором Морозом Й.М. Патоморфологическое исследование внутренних органов проведено совместно с д.м.н. Земсковой З.С. и Панасек И.А.

Йммуноблотинг или перенос белков, полученных в результате электрофореза, на нитроцеллплозпуп мембрану (1ЩМ) проводили в

дестайнере фирмы Faraacea, при использовании трис-глицин-буфера, рН-8,3 с 20К метанола при 200 вА в течение 3 часов. Затем НЦМ отмывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР). блокировали активные центры 27. яичннм альбумином и обрабатывали специфическими антителами в разведении 1/100, 1/500, 1/1000, 1/10000, с последующей обработкой антителами к иммуноглобулинам специфической сыворотки, меченым псроксидазой. Субстрат для проявления содержал 0,6 мг/мл 4-хлор-иафтонола, предварительно растворенного в 1 мл метанола и 0,017. Ift0i.

Иммуноферментннй анализ (ЙФП) для определения антител к антигенам клеточных компонентов проводили на 9б-ти луночннх полис-тероловых планпетах завода медицинских полимеров г. Ленинград. D качестве антигена использовали соникат H37Rv. Ö качестве вторых антител - кроличьи антитела против иммуноглобулинов мнии. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин. Реакции останавливали 107. II S0 .

Реакции агрегат-гемагглптинпции (РОГА) для определения свободно циркулирующих в сыворотке крови антигенов микобактерий проводили по методу Л.Г, Гориной и др. (1981).

Оструя и хроническуп токсичность, анафилактические и туберкулиновые свойства препарата ЦП-БЦ8 изучали в соответствии с "Основными положениями по доклиническому испытанию новых медицинских иммунобиологических препаратов" (1989). Анафилактические свойства изучались на вакцинированных Н.bovis ВС5 морских свинках и мыиах 15 результате внутривенного введения препарата. Туберкулиновые свойства препарата били изучены на зараженных вирулентной культурой минах при введении препарата ЦП-Ь'ЦЖ в подушечки ланок.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием критерия Стьвдента (Плохинский H.A., 19?0).

- 10 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Специфический противотуберкулезный иммуномодулирувщий препарат

Необходимость разработки специфического противотуберкулезного иммунонодулятора связана с активным ростом заболеваемостью туберкулезом и значительным утяжелением течения туберкулезного процесса, протекающего чаще всего с выраженным иммунодефицитом.

Для создания такого препарата нами был выделен антигенный комплекс цитоплазмы (ЛКЦ) микобактерий БЦЖ. Для зтого отмытые от культуральной среды микобактерии были механически разрушены растиранием со стеклянным песком при Ь 4 С из расчета равных количеств. С помощы) дифференциального ультрацентрифугирования при 17000 об/мин выделяли ЛКЦ, который проверяли на содержание живых и мертвых микобактерий (Дыхно М.М. и др..1961). Осадки, содержание нераэруяенные клетки и клеточные стенки, удаляли. АКЦ содержал - 36Х белка, 34Х углеводов, 10,27. нуклеиновых кислот. Белковый спектр содержал 52 дискретных белка с М.М. от 205000 до 10000 Д. В иммупоблотинге со специфической гиперимнунниА снпороткой против цитоплазмы БЦ1 все белки оказались специфически активными.

Различные количества АКЦ, стандартизированные по содержанию белка, были соединены с полиоксидонисм в количестве I мг (как указано в патенте К 2112543, 10 июня 1998).

Соединение АКЦ и нолиоксидония было проведено в ГНЦ институт Иммунологии ИЗ РФ, в лаборатории искусственных антигенов, проф. А.В. Некрасовым и к.х.н. II.Г. Пучковой.

Полученный препарат был назван нами ЦИ-БЦЯ (рис.1).

- Ii -

И.bovis SHI

\

Разрумение

\

Выделение внутриклеточного антигенного комплекса

1

Соединение с Полиоксндониен

4

Препарат iitl - БЩ

Рис.1 Конструирование шшунемодуляторз ЦН-БЦЯ. Изучение токсичности препарата ЦН-БЦ1

Для изучения токсических свойств препарата ЦП-БЦ1 были использованы здоровые мнии линии СВП. которым вводили препарат, со-деряаций разные дозы АКЦ и 1 мг полиоксидония. Дозы ЙКЦ составляли по белку: 100 мкг, 10 мкг, 5 мкг, 1 мкг. 0,5 мкг и 0,1 мкг белка.

Однократное внутривенное введение препарата ЦП-БЦ1 не вызывало гибели животных или резкого снижения веса ни в одной случае.

Многократное (20 раз) подкожное введение мыкан препарата ЦП-БЦ1 в дозах 100 мкг и 10 мкг приводило к снижении масса животных. Препарат в дозе 1 мкг и ниже (0,5 икг, 0,1 мкг) такого действия не вызывал.

Таким образом препарат ЦП-БЦЙ не обладал острой токсичностью. а прёпарат с содержанием белка 1 мкг, 0,5 мкг и 0,1 мкг при длительном, многократном подкожном введении не вызывал развития хронической токсичности.

Данные 3 дозы препарата были использованы для введения здоровым животным но схеме 2 раза в неделя в течение 2-х недель, которую предполагалось применить на модели экспериментального туберкулеза.

Гистологический анализ внутренних органов животных (легкие, селезенка, почки) дистрофических изменений не выявил.Однако, в печени на введение препарата в дозе 1 мкг белка АКЦ в поле зрения встречались единичные участки с белковой дистрофией цитоплазмы клеток. В тоже время, при введении дозы 0,5 мкг белка изменения в печени были минимальными. Они характеризовались незначительным, мутннм набуханием цитоплазмы клеток.

При введении дозы 0,1 мкг белка дистрофических изменений в печени не бнло зарегистрировано.

Таким образом, в результате изучения токсических свойств различных доз препарата ЦП-БЦ1, выбран препарат с содержанием белка ЙКЦ 0,1 мкг.

- 13 -

Изучение реактогениости препарата ЦП-БЦЖ

Проведено изучение анафилактических и туберкулиновых свойств препарата ЦП-ВЦ! у вакцинированных Н.bovis БЦ1 морских свинок, в соответствии с "Основными полояелиями по доклиническому испытании новых медицинских иммунобиологических препаратов" (Москва, 1989). Использовался препарат в дозах с содержанием белка 10 мкг, 5 мкг, 1 мкг, 0,5 мкг и 0,1 мкг.

Анафилактического пока на препарат не было выявлено. Однако, внутривенное введение препарата в дозах 10 мкг и 5 мкг вызывало незначительные анафилактоидныо реакции у морских свинок (чихание, вздыбливание версти и т.д.). которые через 30 минут исчезали. В тоже время, препарат в дозах 1 миг. 0.5 мкг и 0,1 ниг реакций апафилактоидного типа не вызывал.

При изучении туберкулиновой активности препарата Ц11-БП8 на зараженных вирулентной культурой l!37Rv мыиах линии СВА выявлено, что препарат в дозах с содержанием 10 мкг и 5 мкг белка вызывал развитие туберкулиновых реакций, чаще всего одинаковых по интенсивности с реакциями, полученными при введении коммерческого туберкулина (О.ЗО; 0.23). Препарат ЦП-БЩ в дозе 1 мкг белка АКЦ вызывал слабую туберкулиновую реакции, а препарат с содержанием белка 0,5 мкг и 0,1 мкг не индуцировал реакций туберкулинового типа.

Таким образом, изучение токсичности, иммунологической реактогениости препарата 1Ш-БЦЯ позволило выбрать две дозы с содержанием белка ARU 0,5 мкг и 0.1 «кг. Яри введении r организм здоровых животных эти дозы не вызывали развития острой и хронической токсичности, не индуцировали анафилактических и внутриковных ту-беркулиновнх реакций. Изучение натоморфологической картины орга-

нов показало, что доза 8,1 нкг практически не вызывала никаких изменений в тканях и клетках внутренних органов.

Иммуномодулирущие свойства препарата ЦП-БЦ8

Изучение иммуномодулирупщего действия препарата ЦП-БЦ1 проводилось параллельно как на здоровых мынах, так и на зараженных вирулентной культурой микобактерий H37Rv. Препарат использован в дозе 0,1 мкг белка ЙКЦ, которая не вызывала токсико-аллергических реакций по схеме 2 раза в неделю в течение 2-х недель (4 подкожные инъекции).

На здоровых мыиах изучены специфические ответные реакции клеточного и гуморального иммунитета, фагоцитарная активность макрофагов перитонеального экссудата (таблица Hi), а также клеточные трансформации в органах ретикулоэндотелиальной системы.

Выявлена стимуляция гиперчувствительности замедленного типа с помощью реакции на туберкулин в подунечках лапок у мнией. Я животных зарегистрированы выраженные туберкулиновые реакции (0,21мм), которые отсутствовали у инвей, получавиих только АКЦ или полиоксидоний (таблица HI).

Введение препарата ЦП-БЦ1 в дозе 0,1 мкг белка стимулировало ответное антителообразование в организме здоровых иышей, хотя этот показатель был невысоким (0,17) (таблица К 1).

Однократное введение препарата ЦН-БЦЖ в дозе 0,1 мкг белка не индуцировало ответных иммунологических реакций ГЗТ и антитело-образования у здоровых мнвей. Однако,по навин данным, оно вызывало активацию фагоцитоза по сравнении с интактными животными.

Фагоцитарная активность макрофагов перитонеального экссудата, как на Staphylococcus (N3198), так и на H.bovis BCG изучалась в течении 5 суток после однократного введения препарата ЦП-БЦ1.

----»ьл«ч» |фииири!и ц»-ица пи адириоил иишал

при введении по схеме 2x2 (2 раза в недела в течении 2-х недель)

Н/п Препарат Доза Туберкулиновые пробы на РРД (мм) Противотуберкулезные антитела (ИФй) ОП Активность фагоцитоза через 3 суток после однократного введения

ЗЬарШасосиз N9198 М.Ьоу1Э ВСЙ

*ПФ **ЧФК• ПФ ш

1 ЦП-БЦЖ 0,1 *кг АКЦ + 1 мг П 0,21. 0,17 75±0,9 8+0,7 83±0.7 7+0,6

2 ЙКЦ 0,1 мкг 0.16 0.12 68+0,1 5±0.9 70+0,7 4+0.2

3 Полиоксидо-ний 1 мг 0,08 отр. 72+0.7 7+0.1 73+0.8 4+0,1

4 Интактные здоровые мыши отр. отр. 66+0,8 5+0.4 66+0,5 3+0.1,

*ПФ - процент макрофагов, фагоцитирувщих бактерий

**ЧЧ>К - число фагоцитированных бактерий

Выявлена стимуляция фагоцитарной активности макрофагов на данный препарат по сравнении с его составляющими только <1КЦ или только полиоксидонием, которая была наиболее выраженной через 3 суток. При этом, показатели как поглотительной способности макрофагов, так и процент фагоцитирующих клеток были несколько внпе на Н.bovis BEG, чем на Staphylococcus (119190) (таблица N1).

При патоморфологическом изучении органов ретикулоэндотели-альной системы выявлены выраженные тканевые реакции, свидетельствующие об иммупоморфологической перестройке этих органов.

В легких субплеврально, периваскулярно и нерибронхиально формировались лимфоидно-макрофагалмю-гистмоцитарные скопления различной величины. Среди ликфоидннх элементов преобладали лим~ Фобласты со светлой широкой цитоплазмой (молодые формы).

В селезенке имела место выраженная гиперплазия лнмфоидной ткани с расвирспием зародыиевых центров, в которых преобладали молодые форны лимфоцитов. В стенках и просветах синусов также имело место увеличение количества лимфоцитов и лимфобластов.

В лимфатических узлах отмечалось увеличение фолликулов, рас-миреиие паракортикальной зоны. Имело место полнокровие сосудов, инфильтрация стенок лимфоцитами. Наблюдалась лимфоидно-макрофа-гальная инфильтрация ткани. В Фолликулах отмечалось больное количество бластных форм и макрофагов.

R меядольковой соединительной ткани и вокруг центральных вен печени также были обнаруяенн скопления лимфоидно-макрофагальных элементов.

Таким образом, препарат ЦП-БЦХ в дозе 0,1 мкг при введении по схеме (2x2) стимулировал в организме здоровых миней развитие гиперчувствительности замедленного тина на РРД, специфическго ан-тителообразования, фагоцитариуи активность макрофагов перитоне-ального экссудата, а также иммуноморфологические реакции, такие

" как пролиферации и гиперплазии иммунокомпетентных клеток в органах ретикулоэндотелиальной системы.

Изучение иымуноиодулирувщего действия препарата ЦП-БЦ1

на модели экспериментального туберкулеза у ннвей

ймауиогенное действие препарата подтверждено в эксперименте на мниах, зараженных вирулентной культурой микобактерий. Исследовали 7 групп мнпой. зараженных Н.Ьияапиз Н3?{{у в дозе 2-5x10^ Через 2 недели после заражения животных начали лечить.

йыии 1 группы получали препарат 1Щ-БЦ8 в дозе 0,1 мкг белка по схеме 2x2, совместно с противотуберкулезными хиииопрепаратами (стрептомицин 125 мг/кг, изониазид 10 мг/кг), которые вводили ежедневно в течении 2-х недель, затем лечение прекращали и няней оставляли на выживаемость;

йнви 2-й группы получали препарат ЦП-БЦЖ в дозе 0,5мкг белка по схеме 2x2,совместно с хиииопрепаратами (стрептомицин 125 мг/кг, изониазид 10 мг/кг), которые вводили ежедневно в течении 2-х недель,затем лечение прекращали и нияей оставляли на выживаемость:

Иыжей 3-й группы лечили ежедневно только химиопрепаратами стрептомицином 125 мг/кг и изонназидом 10 мг/кг:

йыии 4-й группы получали препарат ЦП-ВЦ! в дозе 0,1 мкг белка без химиотерапии;

йнжи 5-й группы получали антигенный комплекс цитоплазма (АКЦ) в дозе 0,1 мкг белка по схеме (2x2);

Мыии 8-ой группа получали полиоксидоний в количестве 1 иг по схеме (2x2);

7-уи группу составляли зараженные мняи без лечения(контроль)

Средняя продоляительность иизни

В результате эксперимента мнии всех групп погибали от генерализованного туберкулеза, но в разные сроки. Наиболее выраженным терапевтическим действием, статистически достоверно пролонгирующим жизнь зараженных мыией, обладал препарат ЦП-БЦ5 в дозе 0.1 мкг белка в сочетании с противотуберкулезной химиотерапией. Средняя продолжительность визни животных этой группа была на 23 дня дольне контрольные заракенннх мыией без лечения, на 3 дня долыяе мыгаей, получавших препарат в дозе 0,5 мкг совместно с химиотерапией, на ?,? дней долыве мышей получавших одну химиотерапия и составляла 6310,7; 6010,5; 55,310,3 и -40,1+0,6 дней соответственно. Продолжительность визни ыыией в грушах, получавших отдельно антигенный комплекс цитоплазма ((1КЦ> и полиоксидоний, была на уровне контролькнх кнаей без лечения - 41,5+1,3: 43+0,3 и 40.1+0,6 дней соответственно, тогда кап при введении одного препарата ЦН-БЦЛ мыши прокили на 8 дней дольне.(Таблица 3).

Внсеваемость

Изучение вксеваемости мнкобактерий из легких подтвердило высокий положительный эффект леченля препаратом ЦП-БЦй в дозе 0,1 мкг совместно с химиотерапией. После проведенного лечения высевп-емость иикобактерий из легких ннией этой группы была нияе (2,0х1(Л клеток, чек у мнвей получавших препарат в дозе 0,5 нкг белка совместно с химиотерапией (1,2x10*) или получавших только химиотерапию С2,5х10Ч ).

Внсеваемость микобактерий из легких зараженных мыией, получавших один препарат (ЦП-БЦ8), отличалась от данного показателя у

инией контрольной группы (1.2x10 ; 2,5x10') соответственно, но была выве, чем п первых трех группах.

Патоморфологнческий анализ органов

Изучение морфологической картина органов больных туберкулезом мышей после проведенного лечения выявило наиболее выраженные процессы заживления в 1 группе, п которой мыши получали препарат Щ1-Б1Щ в дозе 0,1 мкг белка в сочетании с химиотерапией. Туберкулезные очаги в легких в этот период практически отсутствовали. Туберкулезные изменения характеризовались лиш> скоплениями зпите-лиоидннх и макрофагальннх клеток в интерстиции легких. Зарегистрированы параспецифические реакции, выражавииеся в виде очаговой и диффузной инфильтрации Т-лимфоцитов и пролиферации гистиоцитов.

При лечении дозой 0,5 мкг белка совместно с химиотерапией, (2 группа) в легких отмечались мелкие туберкулезные очаги, вокруг которых имелась выраженная продуктивная реакция в виде инфильтратов и отдельных гранулем, а также зарегистрирована обширная лим-Фоидная инфильтрация межальвеолярпнх перегородок. Другие органы были без туберкулезных изменений. Подобная картина наблюдалась при изучении легких мыаей З-ей группа, леченных только химиотерапией.

В легких мнией, получавших только препарат ЦП-бЦ1 в дозе 0,1 мкг белка, зарегистрированы больших размеров туберкулезные очаги, которые встречались чаще и были менее продуктивными. В тоже время зараженные мнии без лечения в этот период имели обиирные туберкулезные поранения. В легких отмечено большое количество крупных туберкулезных очагов с экссцдативнай реакцией и первыми признаками некробиоза. Единичные очаги, а также выраженный отек и полнокровие сосудов наблюдалось в печени и селезенке!

Через 40 дней после заражения, в период гибели и контрольных мыией отмечалась картина тотального туберкулеза (больное количество очагов с казеозным компонентом в легких, селезенке и печени). D это же время в легких мыией 1 группы обнаружена туберкулезные очаги небольяих размеров, вокруг которых еже сохранилась продуктивная реакция.

В этот период в легких мыией, леченных химиопрепаратами. туберкулезные очаги встречались чаще, были больиих размеров. В некоторых очагах уже начал развиваться каэеоэный компонент.

Таким образом, изучение средней продолжительности жизни, вы-севаемости микобактерий из легких и патоморфологической картины внутренних органов выявило наиболее выраженное терапевтическое действие препарата ЦП-БЦ1 в дозе 0,1 мкг белка в сочетании с противотуберкулезной химиотерапией.

Комбинированное лечение стимулировало иммуноморфологические реакции: пролиферацию мммунокомпетентпнх клеток в органах иммуногенеза, инфильтрацив лимфоцитами интерстиция внутренних органов, таких как легкие, печень и другие. Зто создавало условия для преобладания продуктивных реакций в пораженных органах, что, в свои очередь, задерживало размножение вирулентных микобактерий и пролонгировало жизнь мнией.Такая картина полностью отсутствовала в группах, где препарат ЦН-Б1Ш или химиотерапия не применялись.

Динамика показателей ГЗТ па туберкулин in vibro и 1п vivo и специфического антителообразования

U мнией всех исследуемых групп после заражения вирулентной культурой H37Rv через 2 недели, 4 недели (включая 2 недели лечения но схеме 2x2) и С недель (2 недели после прекращения лечения), были изучены показатели специфической пролиферативной ак-

ивности лимфоцитов на РРД, туберкулиновые пробы и специфическое нтителообразованне.

Изучение пролиферативной активности лимфоцитов на РРД выяви-о высокое иммуномодулируюцее действие препарата ЦП-БЦ1.(Табл,2).

Таблица 2.

Пролиферативная активность лимфоцитов селезенки на туберкулин (РРД) в реакции бласттрансформации (РБТ)

Н/п Препарат Доза Кол-во навей Индекс пролиферации в РБТ на РРД после зараиения

2 нед. 4 нед. 6 нед.

1 ЦП-БЦ8 стрептомицин изониазид 0,1 миг 125 мг/кг 10 мг/кг 5 3.4 4,7 3,5

2 стрептомицин изониазид 125 мг/кг 10 иг/кг 5 3.5 4,1 2,3

3 ЦП-БЦ1 0,1 мкг 5 3,4 3,0 1.7

4 пкц 0,1 мкг 5 3.2 2.1 1.1

5 Полиоксидо-ний 1 мг 5 3,3 2.3 1,2

6 Контроль 3 3.1 1.8

Введение препарата вызывало в организме мнаей высоку» стимуляцию бластообразования, выявляемого во все периоды исследования. Но наиболее выраяеннын этот эффект был в 1 группе, где препарат использовался в комбинации с химиотерапией (4,7). Даве через 6 недель после заражения, когда контрольные мняи погибли, индекс пролиферации лимфоцитов селезенки у яивотных 1 группы был на вн-

I

соком уровне (3,5), Б группе мнией, получавиих противотуберкулезные препараты, в этот период он был равен (2,9),

В группах мнией, получавиих АКЦ и полиоксидоний, индекс пролиферации лимфоцитов селезенки мало чем отличался от данных показателей в контрольной группе без лечения (2,1; 2,3 и 1,8 соответственно). В группе где мнни получали просто ЦП-БЦ1 он был выяе (3.0), по сравнению с контролем (1,8).

Динамика показателей туберкулиновых проб в группах приведена па рис. 2.

Наиболее высокими туберкулиновые пробы были такяе у мыаей 1 группы после проведенного лечения препаратом ЦП-БЩ в дозе 0,1 мкг белка совместно с химионрепаратами.

Этот показатель бал равен 0,35 и статистически достоверно отличался от контроля (Р<0,01). Во 2 группе (печение химиопрепаратами) размер туберкулиновнх проб был несколько ниве, хотя и оставался на высоком уровне (0,23) и статистически достоверно превышал контроль (Р<0.05).

Б тоже время в группах мнией, получавших отдельно препарат ЦП-ВЦП. ПКЦ и полиоксидоний показатели туберкулиновых проб были слабо половительняии.

Результаты исследования гииерчувствительног.ти замедленного типа свидетельствуют о высоком ответе Т-звена противотуберкулезного иммунитета на препарат Ц11-БЦ1, что выражалось в высоких индексах пролиферации лимфоцитов селезенки, а такме в индукции вн-

Рис. 2 Динамика туберкулиновых проб у мышей исследуемых групп на модели экспериментального

туберкулеза.

0,40

0,35

1Г 0,30

0,25

3

ю с\ 0,20

а с 0,15

ю >» 0,10

н

0,05

0,00

-о- ЦП-БЦЖ+х/терапия

ч * - а- х/терапия

ч ТЕ —Й— ЦП-БЦЖ

\т ТУ - А- ДКЦ

N 4 хЛ ч и • Ь —О— Пол иоксидоний

- -о- контроль

Кз Сю

О

2

4

6

8

недели после заражения

ращенных туберкулиновых проб. Но наиболее высокими эти показатели были в 1 группе, где препарат в дозе 0,1 ыкг белка использовался совместно с противотуберкулезной химиотерапией.

Следовательно, препарат Щ1-БЦ1 обладает специфически направленным стимулирующим действием на основные параметры иммунной системы больных туберкулезом иивей и резко повывает эффективность противотуберкулезной химиотерапии.

Изучение динамики противотуберкулезных антител (таблица 3) не выявило четкой разницы результатов в исследуемых группах. Однако, монно отметить, что уровень специфических антител в группах, где вводили препарат ЦП—БЦЯ как самостоятельно, так и в сочетании с противотуберкулезной химиотерапией, во все сроки исследования был несколько выше.

Динамика противотуберкулезных антигенов (таблица 3) во всех исследуемых группах коррелировала с эффективностью лечения зараженных вирулентной культурой вытей.

Таким образом, разработан специфический иммуномодулирующий

I

препарат Щ1-БЦ8, отработана биологически безопасная доза, не вызывающая токсико-аллергическик осложнений в организме мывей, даже при многократном введении, разработана оптимальная схема лечения. Введение препарата по данной схеме вызывает высокий терапевтический эффект при экспериментально« туберкулезе, особенно в сочетании с противотуберкулезной химиотерапией.

Известно, что химиотерапия подавляет рост вирулентных мико-бактерий, а препарат ЦИ-БЦК, как уже ясно, стимулирует активность клеточных реакций, являющихся основой противотуберкулезного иммунитета.

Развивающиеся процессы заживления связаны с иммунологическими реакциями, которые стимулирует данный препарат, что делает

Средняя продолжительность аизни, туберкулезные антитела и антигены в сыворотке крови мыяей

больных туберкулеза» в процессе лечения

Н/п Препарат Доза Количество мыией Средняя, проделайте ль -ность жизни (дни) Антитела после заражения и лечения; ОП Антигены после зарааения и лечения;титри (в РАГА)

Антитела, антигены Вызи- вае- мость 2 нед. 4 нед. 2 нед. 4 нед. б нед.

1. ЦП-БЦ1 стрептомицин изониазид 0 Лмкг 125ык/кг 10мк/кг 5 15 63+0.7 0.17 0,28 1:8 1:4 1:8

2. стрептомицин изониазид 125мк/кг Юмк/кг 5 15 55,3+0,3 0.17 0.20 1:8 1:6 1:8

3. цп-ш 0,i мкг 5 15 48,1+1,3 0,1? 0,24 1:8 1:8 1:32

4. акц Q,1ккг 5 15 41,5+1,3 0.17 0,22 1:8 1:32 1:32

5. Полиоксидоний 1мг 5 15 43.0±0.9 0,17 0,19 1:8 1:8 1:32

6. Контроль 5 15 40,1+0.6 0,17 0,20 1:8 1:32 -

ЦП-БЦ1 перспективный иммуномодулирущиы препаратов при лечении туберкулеза.

Данное исследование является основой экспериментального обоснования использования препарата ЦП-БЦ8 в клинике у больных.

В Н В О Д И

1. Разработан новый противотуберкулезный имауномодулируючий препарат - цитоплазма-полиоксидоний-БЦй (Щ1-БЦ8). состояний из комплекса антигенов цитоплазмы нинобактерий вакцинного итамна БЦ1, содержащего 0,1 нкг белка и 1 мг неснецифического имкуноио-дулятора - полиоксидония, представлявдий собой порокок белого цвета, хороео растворимый в воде, рН=7,0-?,2.

2. Найдена биологически безопасная доза противотуберкулезного иммуномодулятора с содержанием белка антигенного комплекса цитоплазмы - 0,1 нкг. которая в отличии от доз с более высоким содержанием белка,не вызывает развитие токсических реакций в организме мняей.

3. Имнуноиодулирующий препарат цитоплазка-полиоксидоний-БЩ в дозе 0,1 ыкг белка не вызывает местных и общих реакций гиперчувствительности немедленного или. замедленного типа при однократном введении его вакцинированным микобактериями БЦ1 или больным туберкулезом экспериментальным вивотным.

4. Многократное введение имнуиомодулятора здоровым мынам оказывает иммушшодулирувчее действие, вырававдееся в развитии гиперчувствителыюсти замедленного типа, специфического антитело-образования. увеличении фагоцитарной активности макрофагов, а также вызывает пролиферацию и дифферсицировку иммунокомпетентных клеток в органах иммуногенеза.

I

5. На модели экспериментального туберкулеза выявлен высокий

модулирующий эффект противотуберкулезного иимуиоиодулятора в дозе 0,1 мкг белка, направленный на восстановление наруиенных специфических показателей клеточного иммунитета, внракаищийся в статистически достоверном увеличении специфической пролиферативпой активности лимфоцитов в реакции бласттрансформации и туберкулиновнх проб. Увеличение дозы белка (0.5 икг) не привело к повыпению им-муномодулирупщего действия препарата ЦП-БЦ8.

6. Наибольаее имиуномодулирупщее действие препарата в дозе 0,1 мкг белка антигенного комплекса цитоплазмы выявлено при введении его больным туберкулезом инвам по схеме 2 раза в недели в течение 2-х недель на фоне противотуберкулезной терапии по сравнении с другими группами (без химиотерапии и без препарата ЦП-БЦ8), а такяе по сравнении с группами напей,получавяих отдельно антигенный комплекс цитоплазмы или полиоксидоний.

7. Иммуномодулирунщий эффект препарата в дозе 0.1 мкг белка антигенного комплекса цитоплазмы оказывает половительиое действие на туберкулезное воспаление, вараяапщееся в активном рассасывании туберкулезных очагов, уменьнении высеваености вирулентных мико-}актерий из органов, статистически достоверном увеличении средней тродолкительности яизни мнпей и увеличивает эффективность проти-ютуберкулезной химиотерапии.

СПИСОК РАБОТ, 01ШБЯИК0ЙА1ШЙХ ПО ТЕЙЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Иммунобиологические свойства новых специфических иммуно-юдулйторов адьювантного типа при экспериментальном туберкулезе у ыней /Романова Р.Я., Мороз A.M.. Горелова Л.А., Поспелов Я.Е.-ат.докл. II Российского национального конгресса "Человек и ле-арство", Москва. 1995. с.250.

2. Иммуностимулирующее действие специфического иммуномодуля-

-автора при экспериментально* туберкулезе. /Романова P.D., Горелова Л.А,— Российская научно-практическая конференция "Молекулярные основы патогенеза и диагностики туберкулеза и другой легочной патологии." - Москва,1993.

3. Иммуностимулирующее действие цитоплазмы "Ц1ШБТ" на модели экспериментального туберкулеза. /Горелова fl.fi., Романова Р.В.-Иат.конференции "Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммунореабилитации"- Москва, 1995.

4. Изучение иммунобиологических свойств специфических имму-номодуляторов адьввантного действия при экспериментальном туберкулезе. /Горелова Л.П., Зеискова З.С., Панасек И.fi., Мороз A.M.. Романова P.D., Некрасов ft.В., Пучкова Н.Г.- курнал "Проблемы туберкулеза", 1996. -КЗ -с.46-4?.

5. Патент Н2112543 на изобретение "Иммунонодулируюцее лекарственное средство". /Хоменко А.Г., Петров Р.В., Хаитов P.M., Литвинов В.И., Мороз А.И., Романова Р.В.. Горелова Л.А., Некрасов A.B. - Москва, 10 ивня 1998.

6. Hew spécifié antituberculosis isBunasodifier CP-ßCG; oflect in experisentaltuberculosis. /Roaanova R.U., Goreiowa L.fl., Khosenko fl.G., Central Tß Research Inctitute, Hosco«, Russia. -Paris, 193?.

В последние годы в России значительно возросли заболеваемость и смертность от туберкулеза (22). Зто связано с ухудшением экологической и эпидемиологической обстановки, социально-экономических условий, со снижением качества противотуберкулезных мероприятий, в том числе связанных с лечением больных (22, 33). В частности, участились случаи неэффективности химиотерапии туберкулеза, что связано в первуш очередь с полирезистентностью мико-бактерий к назначаемым химиопрепаратам и с возникновением в ряде случаев вторичных иммунодефицитов у больных (50, 84, 88). Для решения этой проблемы необходим поиск новых подходов к повышении эффективности лечения,связанных, в частности, с получением новых специфических препаратов, обладавших способностью модулировать противотуберкулезный иммунитет.

Известно, что в возникновении и течении туберкулеза, большое значение имеет состояние системы иммунитета. Выявлена связь динамики основных иммунологических показателей с клинико-рентгеноло-гической картиной туберкулезного процесса (11, 33, 84, 90). Поэтому идея иммуностимуляции, как способа терапии вторичного иммунодефицита и нормализации измененных иммунологических показателей у больных туберкулезом актуальна и в настоящее время.

При туберкулезе легких многие годы используют специфическую патогенетическую терапию с помощью туберкулина или вакцины БЦ1 (93). Однако индивидуальная туберкулино- и БЦ1-терапия легче переносятся больными на раннем этапе заболевания и показаны не всем больным. При наличии тяжелых форм заболевания применение данного вида лечения противопоказано (44, 93).

В последние два десятилетия при лечении туберкулеза применяются разнообразные природные и синтетические иммуностимуляторы, осуществляющие неспецифическую коррекцию ряда показателей иммунного ответа. В основном это синтетические иммуностимуляторы: диу-цифон, левамизол, нуклеинат натрия и другие (8, 35, 86); вещества выделенные из тимуса: тимолин, Т-активин, тимактин и другие (8, 12, 50, 96); вещества выделенные из бактерий: рибомунил (9, 2?, 84).

Введение выше перечисленных иммуномодуляторов вызывало увеличение количества Т-лимфоцитов, повышение их функциональной активности, нормализацию соотношения Т-хелперов и супрессоров.

Новым направлением является применение для лечения туберкулеза, пока в эксперименте, принципиально новых синтетических стимуляторов иммунного ответа, таких как полиакриловая кислота (ПАК), поливинилпирролидон СЫА-5) и др. (66, 68). К ним относится иммуномодулятор - полиоксидоний (ПО), который усиливая иммунную резистентность организма используется при лечении иммунодефицит-ных состояний, как локальных так и генерализованных у больных целым рядом заболеваний (46, 60, 61).

Полиоксидоний значительно усиливает функциональный потенциал иммунной системы, активирует три важнейшие субпопуляции лимфоцитов, при этом, не нарушает естественных механизмов торможения иммунных реакций (61). Как показали исследования последних лет, синтетические иммуномодуляторы нового типа, (в том числе и полиоксидоний) при соединении их с белками, являющимися слабыми имму-ногенами в комплексы или конъюгаты -усиливали иммуногенность последних в организме животных (66, 68).

В настоящее время разработана принципиальная возможность соединения синтетических иммуномодуляторов нового типа с антигенами туберкулезных микобактерий с целью усиления их иммуногенных свойств. Зто позволило провести сравнительное изучение иммуногенных свойст антигенных препаратов, выделенных из микобактерий туберкулеза вакцинного штамма БЦШ, на модели экспериментального туберкулеза (74) и явилось основой для конструирования соединений полиоксидоний-туберкулезные антигены для специфической иммуномо-дуляции иммунного ответа при туберкулезе.

Идея специфической иммуностимуляции возникла еще в 60-е годы, когда J.Youmans с соавторами С118, 134) показали роль рибосо-мального материала, а Ribi с соавторами (118) значение клеточных стенок в осуществлении защиты против туберкулеза.

Учитывая все эти данные, очевидна актуальность разработки специфических противотуберкулезных стимуляторов и их иммунобиологического изучения, что стало возможным на новой основе, благодаря наличию искусственных синтетических полимеров, моделирующих иммунный ответ.

В последние три года в ЦНИИ туберкулеза РАМН и ГНЦ институте Иммунологии МРФ начаты работы в данном направлении. На основе по-лиоксидония сконструированы и на здоровых и зараженных туберкулезом мышах исследованы токсико-аллергические, иммунобиологические и иммуномодулирунщие свойства иммунных конъюгатов, содержащих туберкулезные антигены, полученные из клеточных стенок.

Настоящая работа посвящена разработке препарата представляющего собой комплекс антигенов цитоплазмы микобактерий туберкулеза BUS с полиоксидонием, изучению его токсико-аллергических свойств, подбору оптимальных доз и иммуномодулирующему действию.

Цель исследования

Разработка специфического противотуберкулезного иммуномоду-лятора, состоящего из антигенного комплекса цитоплазмы микобактерий БЦШ и неспецифического иммуномодулятора - полиоксидония (П), (препарат ЦП—БЦШ)»изучение его иммунобиологических свойств.

Задачи исследования

1. Выделить из микобактерий туберкулеза вакцинного штамма БЦ1 антигенный комплекс цитоплазмы (АКЦ).

2. Сконструировать специфический противотуберкулезный имму-номодулятор ЦП-БЦ1 из антигенного комплекса цитоплазмы и полиок-сидония.

3. Изучить токсичность, иммунологическую реактогенность и специфическую активность препарата ЦП-БЦШ на здоровых животных.

4. Отработать оптимальную дозу препарата ЦП-БЦШ не вызывающую токсико-аллергических реакций у животных.

5. Изучить иммуномодулирующее и лечебное действие препарата ЦП-БЦШ на модели экспериментального туберкулеза.

Научная новизна

1. Разработан и синтезирован специфический иммуномодулятор -ЦП-БЦ1, содержащий комплекс туберкулезных антигенов, выделенных из цитоплазмы микобактерий туберкулеза штамма БЦ1 и синтетического носителя, иммуномодулятора - полиоксидония.

2. Изучены токсические и реактогенные свойства препарата ЦП-БЦМ с помощью современных морфологических и иммунологических методов.

3. Впервые показана возможность применения данного специфического иммуномодулятора (самостоятельно и в сочетании с противотуберкулезной химиотерапией) при экспериментальном туберкулезе у мышей. Изучены иммуномодулирующие свойства препарата.

4. Получен патент на изобретение "Иммуномодулирующее лекарственное средство" N 2112543 от 10 июня 1998 г.

Практическая значимость

1. Сконструирован специфический противотуберкулезный иммуно-модулятор - ЦП-БЦ1 способный восстановить нарушенные параметры противотуберкулезного иммунитета, не вызывая при этом токсико-ал-лергических реакций в организме экспериментальных животных.

2. На основании проведенных экспериментов отработаны дозы препарата ЦП-БЦ1 и схемы его введения больным туберкулезом.

Внедрение результатов в практику здравоохранения

Разработанный специфический противотуберкулезный иммуномоду-лятор ЦП-БЦШ внедрен в ЦНИИТ РАМН (акт внедрения ЦНЙЙТ РАМН).

С целью получения разрешения на клинические испытания имму-номодулятора на ограниченном контингенте больных туберкулезом, осложненным вторичным иммунодефицитом разработаны:

1) Инструкция по приготовлению и контролю препарата ЦП-БЦ1.

2) Результаты лабораторно-экспериментального (доклинического) изучения препарата ЦП-БЦШ - специфического противотуберкулезного иммуномодулятора.

3) Программа клинических испытаний препарата ЦП-БЦ1 при туберкулезе.

4) Приготовлены 3 серии препарата ЦП-БЦШ.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Результаты исследований доложены на конференции "Молекулярные основы патогенеза и диагностики туберкулеза и другой легочной патологии" (Москва, 1995), II Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995), Всемирном Глобальном конгрессе по легочным заболеваниям (Париж, 1997), Межотделенческой

- 10 конференции ЦНИИТ РАМН (Москва, 1998).

Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунологии ЦНИИ туберкулеза РАМН 14 июля 1998 г.

Положения, выносимые на защиту

1. Сконструирован специфический противотуберкулезный иммуно-модулятор - ЦП-БЦ1, состоящий из антигенного комплекса цитоплазмы (АКЦ), содержащего 0,1 мкг белка и 1 мг полиоксйдония (П).

2. Обосновано, что препарат ЦП-БЦ1 с содержанием белка 0,1 мкг белка АКЦ является безвредным и не вызывает токсико-ал-лергических реакций.

3. Показано, что введение специфического иммуномодулятора ЦП-БЩВ в отработанной дозе и схеме (2x2) повышает фагоцитарную активность макрофагов, индуцирует развитие в организме здоровых мышей специфических реакций ГЗТ и антителообразования.

4. Использование препарата ЦП-БЦШ по отработанной дозе и схеме как самостоятельно, так и совместно с противотуберкулезной химиотерапией оказывает иммуномодулирунщее действие и обеспечивает высокий терапевтический эффект.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 112 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, использованных в работе, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 100 отечественных и 32 иностранных работ.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый противотуберкулезный иммуномодулирующий препарат - цитоплазма-полиоксидоний-БЦ1 (ЦП-БЦЮ, состоящий из комплекса антигенов цитоплазмы микобактерий вакцинного штамма БЩИ, содержащего 0,1 мкг белка и 1 мг неспецифического иммуномо-дулятора - полиоксидония, представляющий собой порошок белого цвета, хорошо растворимый в воде, рН=7,0-?,2.

2. Найдена биологически безопасная доза противотуберкулезного иммуномодулятора с содержанием белка антигенного комплекса цитоплазмы - 0,1 мкг, которая в отличии от доз с более высоким содержанием белка,не вызывает развитие токсических реакций в организме мышей.

3. Иммуномодулирующий препарат цитоплазма-полиоксидоний-БШБ в дозе 0,1 мкг белка не вызывает местных и общих реакций гиперчувствительности немедленного или замедленного типа при однократном введении его вакцинированным микобактериями БЦЖ или больным туберкулезом экспериментальным животным.

4. Многократное введение иммуномодулятора здоровым мышам оказывает иммуномодулирующее действие, выражающееся в развитии гиперчувствительности замедленного типа, специфического антитело-образования, увеличении фагоцитарной активности макрофагов, а также вызывает пролиферацию и дифференцировку иммунокомпетентных клеток в органах иммуногенеза.

5. На модели экспериментального туберкулеза выявлен высокий модулирующий эффект противотуберкулезного иммуномодулятора в дозе 0,1 мкг белка, направленный на восстановление нарушенных специфических показателей клеточного иммунитета, выражающийся в статистически достоверном увеличении специфической пролиферативной ак

- 96 тивности лимфоцитов в реакции бласттрансформации и туберкулиновых проб. Увеличение дозы белка (0,5 мкг) не привело к повышению им-муномодулирунщего действия препарата ЦП-БЦИ.

6. Наибольшее иммуномодулирунщее действие препарата в дозе 0,1 мкг белка антигенного комплекса цитоплазмы выявлено при введении его больным туберкулезом мышам по схеме 2 раза в недели в течение 2-х недель на фоне противотуберкулезной терапии по сравнению с другими группами (без химиотерапии и без препарата ЦП-БЦЖ >, а также по сравнению с группами мышей, получавших отдельно антигенный комплекс цитоплазмы или полиоксидоний.

7. Иммуномодулирунщий эффект препарата в дозе 0,1 мкг белка антигенного комплекса цитоплазмы оказывает положительное действие на туберкулезное воспаление, выражающееся в активном рассасывании туберкулезных очагов, уменьшении высеваемости вирулентных мико-бактерий из органов, статистически достоверном увеличении средней продолжительности жизни мышей и увеличивает эффективность противотуберкулезной химиотерапии.

- 97 -СОКРАЩЕНИЯ

АКЦ - антигенный комплекс цитоплазмы

АОК - антителообразующие клетки

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ГЛА - глютаральдегид

Д - дальтон

ДДС - додецилсульфат

ЕК - естественные киллеры

ИИК - искусственный иммуногенный комплекс

ИЛ - интерлейкины

ИФН - интерферон

- иммуноглобулины

КОЕ - колоний образующие единицы

1!. - молекулярная масса

МАТ - моноклональные антитела

НЦМ - нитроцеллюлозная мембрана

ПАГ - полиакриловый гель

ПАК - полиакриловая кислота

ПВП - поливинилпирролизин

ПФК - процент фагоцитирующих клеток

ПЭ - полиэлектролит

РАГА - реакция аггрегат-гемагглютинации

РБТ - реакция бласттранформации

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

ФГА - фитогемагглютинин

ФЧ - фагоцитарное число

ХБ - хронический бронхит

ЦП-БЦ1 - цитоплазма-полиоксидоний-БЦ!

ЦИТ - цитоплазма

- 98

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время участились случаи неэффективности лечения туберкулеза, что связано с одной стороны, с полирезистентностью больных к химиопрепаратам, с другой с тем, что при туберкулезе часто развивается состояния вторичного иммунитета. Кроме того, в последние годы заболеваемость этой нозологией постоянно увеличивается за счет больных туберкулезом на фоне СПИДА. Поэтому проблема иммунокоррекции при туберкулезе легких является высоко актуальной. Нарядуепротивотуберкулезной химиотерапией идет поиск новых способов и средств повышения эффективности лечения туберкулеза. Исследователями разработана идея иммуностимуляции как способа терапии нарушений иммунной реактивности. Данному вопросу посвящено большое количество работ, проведенных как в эксперименте, так и в клинике (8,10,27,32,84).

В клинике туберкулеза легких в качестве иммуностимулирующих средств в комплексе с химиотерапией широко применяются разнообразные природные и синтетические иммуностимуляторы (продигиозан, рибомунил, левализол, диуцифон, нуклеинат натрия и др.). Однако все они осуществляют в основном неспецифическую коррекцию иммунного ответа. Поэтому важной проблемой повышения эффективности лечения является направленная коррекция иммунного ответа за счет применения специфических иммуномодуляторов.

В связи с вышеизложенным, целью нашего исследования явилась разработка и изучение иммунобиологических свойств: токсичности, реактогенности и иммуномодулирующего действия, иммуномодулятора нового типа - ЦП-БЦ1, представляющего собой соединение антигенного комплекса цитоплазмы микобактерий туберкулеза вакцинного штамма БЦ1 и неспецифического иммуногенного носителя - полиоксидония.

Данный препарат был разработан ЦНИИТ PftMH совместно с ГНЦИЙ РАМН.

Для решения этой проблемы на 1-м этапе исследования было проведено изучение токсичности, иммунологической реактивности и специфической активности препарата ЦП-БЦ1, в экспериментах на здоровых мышах с использованием методов, рекомендованных в "Основных положениях по доклиническому испытании новых медицинских иммунобиологических препаратов" (Москва, 1989г.).

На втором этапе работы было изучено иммуномодулирующее действие препарата ЦП-БЦ! как самостоятельно, так и в сочетании с химиотерапией изучено на моделях экспериментального туберкулеза у мышей.

В качестве критериев иммунокоррегирующего действия препарата Щ1-БЦ1 были использованы иммунологические методы in vivo и in vitro, оценивающие показатели клеточного и гуморального иммунитета, патоморфологические и микробиологические методы, а также данные о выживаемости животных.

Для конструирования иммуномодулирущего препарата был использован антигенный комплекс цитоплазмы и рибосом микобактерий БЦ1. Он обладал большим набором специфических антигенов: 8 - серологически активных антигенов, полученных в реакции преципитации (РП) в геле и 52 специфически активных антигенов выявленных в им-муноблотинге при использовании кроличьей гипериммунной антисыворотки к ЙКЦ микобактерий БЦ1. Данные антигенные компоненты оказались идентичными с таковыми M.bovinus, M.huianus, хотя и отличаются в количественном отношении (74). При самостоятельном введении небольших количеств эти антигены не обладали высокой иммуно-генностьш, т.к. быстро элиминировались из организма. Введение больших концентраций микобактериальных антигенов оказывали в организме животных токсическое действие. Следовательно, был необходим адьювант-носитель, который мог бы обеспечить в организме длительное сохранение и направленное специфическое действие небольших и безопасных доз антигена из туберкулезных микобактерий и, в частности^антигенный комплекс цитоплазмы.

Таким адьювантным носителем был выбран синтетический поли-мер-полиоксидоний, разработанный в ГНЦ Иммунологии, который самостоятельно обладал иммунокорригирующим действием (60, 61). Он использовался в модельных экспериментах в комплексной терапии гнойно-раневых инфекций, а также в эксперименте при лечении обожженных животных (42).

Использование в клинике полиоксидония разрежено Фармакологическим Комитетом (В.Ф.С. 42-27-27-96).

В настоящее время полиоксидоний используется в клинике как иммуномодулятор при различных формах хронических неспецифических заболеваний легких, при комплексном лечении хронического рецидивирующего фурункулеза, гнойно-раневых инфекций и др (46,60,61).

Соединение антигенного комплекса цитоплазмы БЦ1 в дозах 100 мкг, 10 мкг, 5 мкг, 1 мкг, 0,5 мкг, 0,1 мкг с полиоксидонием в количестве 1 мг на мыяь было проведено в ГНЦИ Иммунологии.

На I этапе нашего исследования было необходимо изучить токсические свойства различных доз данного препарата и выбрать токсически безопасную дозу. Использовали препарат ЦП-БЦ1 с содержанием АКЦ в дозах 100 мкг, 10 мкг, 5 мкг, 1 мкг, 0,5 мкг и 0,1 мкг белка и Полиоксидоний 1 мг.

Все они при однократном внутривенном введении не вызывали острой токсичности у мышей. Лишь доза с содержанием белка 100 мкг через 4 суток приводила к небольшой задержке веса, которая к концу наблюдения не регистрировалась.

При изучении хронической токсичности использовали дозы с содержанием белка 10 мкг, 5 мкг, 1 мкг, 0,5 мкг и 0,1 мкг. Многократное (20 раз) подкожное введение мышам препарата ЦП-БЦ1 в дозе

10 мкг белка приводило к снижению массы животных. Препарат в дозах 1 мкг белка и ниже (0,5 мкг, 0,1 мкг) такого действия у животных не вызывал.

Таким образом, на эти дозы препарата ЦП-БЦ1 не было призна- . ков хронической токсичности.

Изучение патоморфологических изменений в органах также было проведено с использованием выше перечисленных доз. Гистологический анализ не выявил выраженных дистрофических изменений в легких, почках, селезенке и лимфатических узлах. Однако в печени они имели место и носили дозозависимый характер. При введении дозы 0,5 мкг выявлялись единичные участки с белковой дистрофией цитоплазмы клеток, умеренной вакуолизацией цитоплазмы гепатоцитов и небольшим периваскулярным отеком. В тоже время препарат ЦП-БЦ1 в дозе 0,1 мкг белка токсических изменений в печени не вызывал.

Таким образом, изучение острой и хронической токсичности, а также патоморфологических изменений внутренних органов животных, позволило отобрать дозу препарата ЦП-БЩ с содержанием белка 0,1 мкг, которая была токсически безопасной.

На следующем этапе данной работы было проведено изучение иммунологической реактогенности препарата ЦП-БЦ1 исследованием при введении вакцинированным М.bovis 5ЦЖ морским свинкам и мышам линии СВА препарата ЦП-БЦ1 в дозах 10 мкг, 5 мкг, 1 мкг, 0,5 мкг и 0,1 мкг белка.Анафилактического шока на препарат не получено. Дозы с содержанием белка 10 мкг и 5 мкг в организме животных вызывали незначительные анафилактоидные реакции, которые через 30 минут исчезали. Тогда как дозы препарата ЦП-БЦЖ 1 мкг, 0,5 мкг и 0,1 мкг реакций анафилактоидного типа не вызывали.

Для изучения аллергических реакций замедленного типа у сенсибилизированных мышей и морских свинок с помощью внутрикожных туберкулиновых проб были использованы дозы препарата 10 мкг,5 мкг, 1 мкг, 0,5 мкг и 0,1 мкг. Дозы препарата ЦП-БЦЖ 10 мкг и 5 мкг белка в организме животных вызывали развитие туберкулиновой реакции, адекватной с реакцией, полученной при введении коммерческого туберкулина.

Дозы препарата с содержанием белка 0,5 мкг и 0,1 мкг не индуцировали реакции туберкулинового типа.

Таким образом, изучение фармакологических свойств исследуемого препарата ЦП-БЦ1, позволило отобрать две дозы с содержанием белка 0,5 мкг и 0,1 мкг, которые в организме здоровых животных не вызывали острой и хронической токсичности и не индуцировали анафилактических и кожных туберкулиновых реакций.

При изучении патоморфологической картины, доза с содержанием белка 0,1 мкг не вызывала патоморфологических изменений внутренних органов животных.

Следующим этапом данного исследования явилось изучение имму-номодулирующих свойств препарата ЦП-БЦЖ и его составляющих антигенного комплекса цитоплазмы (АКЦ) и полиоксидония в эксперименте на здоровых и зараженных М.Ьшапиз Н371Ш микобактериями туберкулеза мышах линии СБА. Было изучено иммуногенное действие препарата ЦП-БЦЖ в дозе 0,1 мкг белка на здоровых мышах и в дозах 0,5 мкг и 0,1 мкг белка на модели экспериментального туберкулеза по 4 раза в каждом исследовании.

При изучении клеточного иммунитета выявлена стимуляция реакций гиперчувствительности замедленного типа в подушечках лапок мышей на туберкулин. Четырехразовое введение препарата ЦП-БЦЖ в дозе 0,1 мкг белка используемое при лечении больных туберкулезом мышей стимулировало развитие ГЗТ, выражавшееся в появлении туберкулиновых кожных реакций (0,21), которые отсутствовали при введении АКЦ и Полиоксидония.

Введение препарата ЦП-БЦ1 в дозе 0,1 мкг белка стимулировало антителообразование в организме здоровых мышей, при этом туберкулезные антигены у мышей не выявлялись. Наши данные подтверждаются исследованиями, в которых введение внутриклеточных микобактери-альных антигенов в виде вакцинных препаратов соединенных с полиакриловой кислотой, вызывало у мышей стимуляцию гранулематозных реакций в органах РЭС, развитие ГЗТ и антителообразования (74).

Введение препарата ЦП-БЦ1 вызывало значительную стимуляцию фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов перитонеаль-ного экссудата.

Наиболее выраженным иммуногенное действие препарата ЦП-БЦ1 в дозе 0,1 мкг белка, выявлено при изучении иммуноморфологической перестройки внутренних органов здоровых мышей. В органах здоровых мышей наблюдались выраженные иммуногенные тканевые реакции. В легких и селезенке было отмечено формирование лимфоидно-макрофа-гально-гистиоцитарных скоплений различной величины, в которых преобладали молодые формы лимфоцитов- лимфобласты. В стенках и просветах синусов также было отмечено большое количество лимфоцитов и лимфобластов. Аналогичные реакции имели место в лимфатических узлах.

Наиболее выраженное иммуногенное действие препарата было выявлено в печени, где также имела место гиперплазия лимфоидной ткани, скопления лимфоидно-макрофагальных клеток.

Иммуногенное действие препарата подтверждено в следующем эксперименте на мышах зараженных вирулентной культурой микобакте-рий.

Исследовались 7 групп мышей зараженных М.Ьишапиз Н371*у в до$ зе 2-5x10. Через 2 недели после заражения мышей начали лечить.

1 группа - препарат ЦП-БЦ1 в дозе 0,1 мкг совместно с хими-опрепаратами;

2 группа - препарат ЦП-БЦ1 в дозе 0,5 мкг совместно с хими-опрепаратами;

3 группа - лечение химиопрепаратами;

4 группа - препарат ЦП-БЦ1 в дозе 0,1 мкг;

5 группа - антигенный комплекс цитоплазмы (АКЦ);

6 группа - полиоксидоний;

7 группа - контроль, зараженные мыши без лечения.

Наиболее выраженным, пролонгирующим жизнь эффектом, обладал препарат ЦП-БЦЖ в дозе 0,1 мкг белка, применяемый по схеме (4 раза) совместно с противотуберкулезной химиотерапией (1 группа). Средний период жизни животных данной группы, был достоверно выше всех других и, особенно, контрольной группы зараженных мышей, без лечения. В среднем эти животные прожили на 23 дня дольше по сравнению с контролем (63±0,7 и 40,1±0,6) соответственно.

Изучение высеваемости микобактерий из легких также выявило высокий положительный эффект лечения мышей препаратом ЦП-БЦ1 в дозе 0,1 мкг белка совместно с противотуберкулезной химиотерапией. Высеваемость микобактерий из легких у мышей этой группы после проведенного лечения была значительно ниже (2,0х1(? ), чем у мышей получавших только химиотерапию (2,5x10*).

Лечение зараженных мышей одним препаратом ЦП-БЦЖ в аналогичной дозе имело определенный терапевтический эффект, однако он был менее выражен, но отличался от такового показателя у зараженных

5й мышей без лечения (1,2x10 и 2,5x10) соответственно.

Патоморфологический анализ органов зараженных Н371Ш мышей проведен в группах животных, которые получали две дозы препарата ЦП-БЦЖ 0,5 мкг и 0,1 мкг белка как самостоятельно, так и в сочетании с химиотерапией, в сравнении с мышами леченными просто химиотерапией, АКЦ и Полиоксидонием. Исследование выявило наиболее выраженные процессы заживления в группе с использованием препарата Щ1-БЦ1 в дозе 0,1 мкг белка совместно с химиотерапией, по сравнению с остальными группами. Туберкулезные очаги в легких мышей этой группы были небольших размеров, вокруг них имелась обширная продуктивная реакция в виде инфильтратов и отдельных гранулем, а также выявлялась обширная лимфоидная инфильтрация межальвеолярных перегородок. При лечении дозой 0,5 мкг белка туберкулезные очаги были больших размеров.

При самостоятельном введении препарата ЦП-БЦЖ в дозах 0,5 и 0,1 мкг туберкулезные очаги в легких были больших размеров, встречались чаще в поле зрения и были менее продуктивными.

Таким образом, препарат ЦП-БЦ1 в дозе 0,1 мкг белка совместно с противотуберкулезной химиотерапией, по микробиологическим, патоморфологическим данным и показателем средней продолжительности жизни оказал наиболее выраженный положительный терапевтический эффект на течение туберкулезной инфекции при экспериментальном туберкулезе у мышей.

Коррекция иммунологических параметров у больных туберкулезом мышей изучалась с помощью гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)' пролиферативная активность лимфоцитов (РБТ на туберкулин), туберкулинивые пробы и антителообразования.

Изучение пролиферативной активности лимфоцитов селезенки в РБТ на РРД у зараженных Н371Ш мышей, проведенное в различные периоды после заражения и лечения препаратом ЦП-БЦЖ в дозе 0,1 мкг белка самостоятельно, в сочетании с противотуберкулезной химиотерапией, а также просто химиотерапией показало, что введение препарата вызывало в организме мышей высокую стимуляцию бластообра-зования, выявленного во все периоды исследования. Зтот эффект был наиболее выраженным в группе, где препарат ЦП-БЦЖ использовался в комбинации с химиотерапией (4,7). Даже через б недель после заражения, когда контрольные животные погибли, индекс пролиферации лимфоцитов селезенки был на высоком уровне (3,5). У мышей, получавших противотуберкулезную химиотерапию индекс пролиферации лимфоцитов равнялся соответственно (2,9).

Анализ имеющихся работ показал, что введение неспецифических иммуномодуляторов, таких как рибомунил, левамизол, нуклеинат натрия и др., повышает функциональную активность лимфоцитов (8,9,35, 27). Однако в нашей работе выявлена более высокая стимуляция бластообразования.

В группах мышей, получавших самостоятельно ЙКЦ и Полиоксидо-ний индекс пролиферации мало чем отличался от контрольной группы без лечения, тогда как у мышей получавших просто ЦП-БЦ1 он был несколько выше, по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, полученные данные позволили сделать вывод, что введение препарата ЦП-БЦШ в различных вариантах обладает иммуностимулирующим эффектом, что выражалось в высоких индексах пролиферации лимфоцитов селезенки. Но наиболее высоким этот показатель был в группе, где препарат использовался в дозе 0,1 мкг белка совместно с противотуберкулезной химиотерапией.