Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Анализ иммунных реакций на вирус гриппа у мышей с врожденной гриппозной инфекцией

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХТЙУК РОССИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ штл ПОЧЕТНОГО^ АКАДЕМИКА Н.Ф.ГАМАЛЕИ | / // /] //у

На пр.ЯваУ рукописи

Кобвц Наталья Викторовна

АНАЛИЗ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ НА ВИРУС ГРИППА У МЫШЕЙ С ВРОЖДЕННОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ. (14.00.36 - Аллергология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии и микробиологии имени пометного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук И.Ю.Черняховская.

Официальные оппоненты: д.б.н. А.В.Пронин

д.б.н. А.СЛпт

Ведущая организация: Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН

Защита состоится • ^ 1995 года в. часов на заседании диссертационного Совета К 001.07.01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН

Автореферат разослан ^ • _1995 года

Ученый секретарь

диссертационного Совета

доктор медицинских наук Е.И.Коптелова

Актуальность проблемы

В точение последних 75 лет иммунология, генетика и биология вируса фиппа интенсивно изучается. (Sissons, 1993). Несмотря на это, вирус фиппа до сих пор может представлять весьма серьезную опасность для человека. Как известно, меняются не только антигенные характеристики вируса, что делает невозможным создание эффективной вакцины, существенные изменения претерпевает и клиническая картина гриппозной инфекции, что создает значительные проблемы для практической медицины (Burt el at. 1989).

Тяжелое течение гриппозной инфекции особенно характерно для детей, пожилых людей (Tamuraet а!. 1993), и лиц с иммунодефицитами различной природы (Peggy et al, 1988). Развитие иммунного ответа на вирус гриппа у указанных групп людей существенно отличается от иммунного ответа на вирус гриппа взрослого полностью иммунокомпетентного организма (Allan et al, 1990). У людей с иммунодефицитами могут развиваться различные иммунопатологические реакции, способствующие поддержанию вирусной персистенции. Изучение механизмов иммунопатологических реакций необходимо для разработки методов иммунокоррекции тяжелых форм гриппозной инфекции.

В этой связи представляется весьма перспективным изучение иммунопатологии, индуцированной вирусом гриппа на модели врожденной гриппозной инфекции (ВГИ), разработанной в НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (Зуев, 1978; Зуев, 1988 ). Ранее проведенные иммунологические исследования были направлены на изучение неслецифических иммунных реакций у мышей с ВГИ (Пронин и соавт.,1984; 1989 ). Предметом исследований в настоящей работе стало изучение специфических иммунологических нарушений, протекающих на фоне врожденной гриппозной инфекции.

Целью нашего исследования было изучить особенности специфических иммунологических реакций на вирус гриппа при врожденной гриппозной

о

инфекции, а также вероятность возникновения иммунологической толерантности к возбудителю при ВГИ.

Задачи исследования:

. 1. Изучить особенности количественного и субполуляционного состава лимфоидных клеток тимуса и селезенки мышей с ВГИ.

2. Оценить уровень специфической иммунореактивности у мышей с ВГИ In

situ.

3. В реакциях адоптивного переноса определить наличие вирусспеци-фичоских иммунокомпетентных клеток у мышей с ВГИ.

4. Изучить особенности неспецифической иммунореактивности мышей с ВГИ in vitro.

б. Определить наличие пимфоидной лерсистенции вируса при врожденной гриппозной инфекции.

6. Изучить особенности взаимодействия клеток лимфоидных органов мышей с ВГИ и лимфоидных органов сингенных роципизнтов о условиях локального переноса тимоцитов и слленоцитов мышой с ВГИ интактмым сингенным реципиентам.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Впервые показана экспрессия антигенов вируса гриппа клетками лимфоидных органов мышай с ВГИ.

Впервые на клеточном уровне проанализирован характер специфической ареактивности при врожденной гриппозной инфекции. У мышей с ВГИ выявлена специфическая ареактивность in situ, выражающаяся в снижении количества вирусслецифических антителообргзующих клеток в ответ на иммунизацию вирусом гриппа, а также в подавлении реакции ГЗТ на вирус гриппа. В тоже время в реакциях адоптивного переноса было показано, что вирусспецифические иммунокомпетентные клетки у мышей с ВГИ сохранены. Следовательно, у мышой с ВГИ нет "истинной" толерантности, связанной с делецией специфических иммунокомпетентных клеток. Показано, что дефект специфической иммунореактивности у мышей с ВГИ можот быть связан с наличием вирусслецифических супрессорных клеток.

Установлено, что у мышей с ВГИ снижено количество CD4* Т клеток и увеличено количество r5- Т клеток в селезенке. Выявлено также появление двойных негативных Т клеток (С04 CD8 ) в селезенке.

Впервые показано, что у мышей с ВГИ сохранялся нормальный уровень бласттрансформации на аллогенные клетки в смешанной культуре лимфоцитов, наблюдался высокий уровень спонтанной пролиферации in vitro, что свидетельсвует об относительной сохранности неслецифических иммунных реакций у мышей с ВГИ при выраженных нарушениях специфической иммунореактивности.

Впервые показано, что локапьное введение слленоцитов и тимоцитоп мышей с ВГИ интактным сингенным реципиентам приводит к увеличению регионарного лимфатического узла. Реакция зависела от уровня экспрессии вирусных антигенов на клетках донора, Показана корреляцй^ иежду увеличением веса регионарного лимфатического узла сингенного донора и увеличением количества у5 и CD4* Т клеток в регионарном лимфатическом узле реципиента.

Исследование особенностей специфической и неспецифической иммунореактивности мышей с ВГИ важно в связи с имеющимися случаями выявления лимфоидной персистенции вируса гриппа у детей, чьи матери перенесли грипп во время беременности (Зуев, 1990 ). Вирусная персистенция часто сопровождалась выраженными нарушениями иммунореактивности у потомства, а также медленно прогрессирующей патопогией центральной нервной системы (Зуев, 1990).

В проведенной работе изучена роль лимфоидной персистенции вируса гриппа в развитии иммунных нарушений при вертикальной передаче вируса.

Практическую ценность могут представлять ряд методических подходов, примененных в данной работе: решить вопрос о наличии специфической толерантности к возбудителю можно только в результате тщательного изучения сохранности и количества специфических иммунокомлетентных клеток у экспериментальных животных. В работе для этого были использованы реакции адоптивного переноса, а также предобработка экспериментальных животных

низкими долами циклофосфамида. Сохранность неспецифического иммунного ответа у мышей с ВГИ была выявлена в смешанной культуре лимфоцитов с использованием аллогенной стимуляции. Важным является также изучение уЬ Т-клеток в иммунном ответе на вирус гриппа в условиях вертикальной передачи вируса.

Материалы диссертации вошли в монографию Л.Н.Фонталина 'Молекулярно-клеточные механизмы иммунологической толерантности", опубликованную в 1994 ("Наука", Москва). ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. У мышей с ВГИ наблюдается снижение специфической иммунореактивности 1п аНи.

2. У мышей с ВГИ сохранен репертуар вирусслецифических иммунокомпетентных клеток.

3. Наблюдаемая вирусслецифическая среактшзность 1л еКи частично связана с наличием специфических супроссорных клеток.

4. Между клетками лимфоидных органов мышей с ВГИ и клетками лимоидных органов сингенных мышей существуют антигенные различия, способные вызвать увеличение регионарного лимфатического узла у сингенного реципиента при переносе ему спленоцитов и тимоцитов мышей с ВГИ. Частично эта реакция связана с присутствием антигенов вируса гриппа на клетках лимфоидных органов мышей с ВГИ.

5. Уменьшение клеточности лимфоидных органов, изменения субпопуляционного состава Т клеток селезенки, а также выявленные нарушения специфической и неспецифической иммунореактивности у мышей с ВГИ может быть связано с длительным инфицированием лимфоидных органов и реакцией на зараженные клетки сохранившихся иммунокомпетентных лимфоцитов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации были представлены на:

- на Всесоюзном Конгрессе общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов памяти И.И.Мечникова (Алма-Ата, 1969);

- на конференции лаборатории клинической иммунологии Всероссийского Центра Акушерства, Гинекологии и Леринатологии (РАМН, Москва, 1991)

- на Международном Симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата. 1992);

- на Второй Международной Школе имени Джона Хамфри по иммунологии инфекционных заболеваний (Пущино, 1994).

По теме диссертации опубликованы 3 печатных работы.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертационная работа изложена «а 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована в таблицами и 14 графиками. Библиографический указатель включает 150 наи«/энований отечественных и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Животные.

В работе использовали самок и самцов мышей инбредных линий C57BL/6j Sto (Н-2") и СВА /Са Lac Sto (Н-2*), полученных из питомника "Столбовая", РАМН. Беременных самок линии C57BL/0 заражали по методике Мирчинк Е.П. (3,5 lg ЭИДм). От этих мышей получали потомство, которое в 10-15 % случаев имело признаки оставания в росте и развитии, и у них было обнаружено пожизненное вирусоносительство. Такие мыши с врожденной гриппозной инфекцией (ВГИ) отбирались для исследований на основании клинических признаков в возрасте 1-го месяца.

В качестве контрольных использовались интактные мыши C57BL/6 , мыши из одного помета с мышами с ВГИ. но не имевшие признаков врожденной гриппозной инфекцией, условно Называемые сибсами, а также мыши C57BL/6, перенесшие за 2 месяца до начала исследований интраназальное заражение вирусом фиппа.

о

Вирус.

jj работе использовали вирус гриппа,штамм АЛЛ/SN (H1N1). любозно предоставленный д-ром Мирчинк Е.П. (лаборатория микробиологии латентных инфекций, И-то эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи). Вирус пассировали на 9-дневных куриных эмбрионах о точении 48 часов, осоотляли, ультрацентрифугировали и проводили через сахарозный градиент по обычной методике (Вирусология, Методы. Под ред.Мойхи. 1688)

3. Анти сыворотки и моноклональные антитела

Для определения экспрессии антигенов вируса фиппа на платках лимфоидных органов мышей с ВГИ использовали поликлональную кроличью сити сыворотку против гомологичного штамма вируса (AAVSN), любозно предоставленную для работы д-ром Кзпалинсхой Т.В., (лаборатория микробиологии латентных инфекций, И-та эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи). Сыворотка была получена путем иымунизаций кролика вирусом фиппа,обработанной раствором мочевины для выявления внутренних антигемоз вируса фиппа. Сыворотку предварительно профеаали при 5б°С в течение 30 мин,

В работе также использовалась поликлональная сыворотка против иммуноглобулинов мыши, любозно предоставленная для работы проф. Сидоровой Е.В. (Ин-т вирусных препаратов. РАМН).

Моноклональные анти-Thy-l ,2 антитела были получены из гибридомы (клон F7D5), которую культивируют в Институте молекулярной генетики ЧАН в Праге.

Моноклональные антитела против маркеров Т-клеток (CD4; CD8) и у6\ aß Т-клеточных рецепторов, меченые фикоэритрином и флуоросцеиниэоцианатом (ФИТЦ) были получены в Центре по изучению естественной резистентности в Монреале (Канада) и любезно предоставлены для работы д-ром Алтом (Ин-т туберкулеза, РАМН).

4. Клеточные суспензии

I

Для постановки иммунологических реакций у животных забирали тимус, селезенку или лимфатические узлы.Органы измельчали ножницами и гомогенизировали в стеклянных гомогенизаторах Гомогенат фильтровали через

нейлоновые фильтры и в случае последущего культивирования In vttro трижды промывали а среда ценрифугирования, состоящей из среды 199 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки производства НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН России, антибиотиками и HEPES. Суспензий центрифугировали при 4°С, 1000 об/мин на центрифуге К23 (Янецки.ГДР) о течение 10 минут. В случае работы с клеточными суспензиями in vivo при постановке реакций Ерне, ГЗТ, РТПХ и так далее исспользовапи сроду без сыворотки, а в случае постановки реакции Ерно-без антибиотиков.

Количество клоток подсчитывали в камере Горяева, разводя суспензию о 100 раз 3 % уксусной кислотой. Жизнеспособностъклеток определяли в смешанных ox tempore в соотношении 1:1 растворах 0,1 % трипанового синего на дистилированной воде и 0,1% эозина на двухкратном физиологическом раствор®.

5. Исследование функциональной активности лимфоидных клеток in vivo. 5.1.Выявление пирус-специфичесхих антителообразутоших клеток (АОЮ Для выявления клоток, продуцирующих антитела к вирусу гриппа, использовали модификацию метода Ерне, разработанную Е.В.Сидоровой и соавт.(198б) Мышей.иммунизировапи 10 мкг очищенного вируса гриппа на мышь. Количество АОК определяли на 4-день после иммунизации,используя в качестве тест-антигена эритроциты барана (ЭБ).коныогированные с очищенным вирусом гриппа. Коньюгацию проводили следующим образом: 0,1 мл осадка отмытых 0.15М раствором NaCI (о.с.ч.) ЭБ смешивали с 0,1 мл вируса гриппа и добавляли 0.6 мл 0,01% раствора CrCljX HjQ, приготовленный непосредственно перед опытом из 0,1% раствора и доведенного 1N NaOH до рН 5,2. Смеси оставляли на ночь при 4СС, затем ЭБ отмывали от несвязавшегося вируса (не менее 3 раз), в опытах использовали 5% суспензию ЭБ. Реакцию проводили на пластиковых чашках Петри диаметром 40 мм (Ленинградский завод медицинских полимеров). В качестве подложки использовали по 1 мл 0,45% агарозы (Sigma). Верхний слой агарозы, нанесенный на подложку включал 50 мкл сенсибилизированных ЭБ, 100 мкл суспензии спленоцитов в концентрации 3x10* /мл и 0.2мл 0,45% агарозы. Число АОК рассчитывали на 10® клеток. Результаты

представлены в виде средней геометрической и доверительных интервалов при р* 0,05.

8.2.АД9ГТШИЫЙ ГГСР<ЖМ РАШИИ EPH? К fWPYCY ГРИППЯ Сингенным реципиентам,облученным 5 Гр, вводили по ЗОхЮ'сплоноцитоо с/в. Одновременно с суспензией спленоцитов в/в вводили по 10 мкг очищенного вируса гриппа. Реакцию тестировали через 4 дня в реакции Ерне, как описано оыша.

S.3. Реакция ГЗТ к вирусу гриппа Для определения ГЗТ к вирусу гриппа использовали схему иммунизации, предложенную Ada & Leung (1001), Мышам сводили подкожно 104 ГАЕ вируса гриппа. Через 6 дней проводили тсст-ммъекцию 10* ГАЕ вируса гриппа подкожно в правую заднюю лапу. Роакцию ГЗТ оценивали по разнице ото коз опытной и контрольной лап. За единицу реакции принимали разницу о 0,1ьш. О опытах была также включено группа мышей,которым делали только тест-тгьокцим антигена без предварительной сенсибилизации.

5.4. л<?ттжнй ng,ранте реакции ГЗТ к ßngygy гриппа

Реакция локального переноса ГЗТ выполнялось аналогично реакции локального переноса ГЗТ,описанного Лядовой и соаот.(1085)С этой целью 10* ГАЕ вируса гриппа и через 4 часа клетки лифатических узлоо сенсибилизированных доноров вводили интактным сингенным реципиентам подкожно о правую заднюю лапу. Реакцию регистрировали через 24 часа по разнице отеков опытной и контрольной лап. В некоторых опытах 10* пимфоидных клоток, тестируемых на супрессорную активность добавлялись к суспензии эффекторов ГЗТ в реакции адоптивного переноса ГЗТ (Лядова и соавт., 1988).

S.5. Индукция гиперплазии регионарного лимфатического узла сингенного реципиента после введения ему клеток лимфоидных органов мышой с ВГИ

Эта реакцию ставили аналогично реакции локальной РТПХ для аллогенной системы, описанной Опплтовой и Демант (1973). Сингенным интактным реципиентам вводили по Ю'сппеноцитов или тимоцитоа мышей с врожденной гриппозной инфекцией. Уровень реакции измерялся по отношению веса

рогиоиарного и контрлэторальксго лимфатических узлоо - поплитэальмый индекс. В качестао контроля использовали мыший, которым оводили сингенныо интактныо сплшюциты.

0. Фэмотипичгскнй анализ популяций лимфоидных клеток мышэй с врожденной гриппозной инфекцией, б.чиитотоксичоский tfct для орродолдния урооня зкспряссии вирусных и лругих внтигоноп нз лимсЬоиг.ных глотках мышей с прожленной вирусной

Цитотоксмчоский тост проводили по методу Горора и ОТормэна ( Gorer and O'Gormon, 1953) с антивирусной сывороткой. онти-Thy МкАТ и комплементом. 6.2. ИммуноФлюорпсчениия На тонша продмэтныз стекла с парафильмом наносили поли-Ь-лизин в количество 100 мкг на мл и инкубировали 30 минут при 37°С.Д1лоз поли-Ьлизин отмывали и добавляли по 0,07 мл тестируемых клаток в концентрации 2хЮ'/мл. IСпатш росупендирозали а забуфаренном физраспзорэ с 0,1 БСА и азидом. Клетки инкубировали о точении минут при 37°С, отмывали ЗФР с БСА и азидом и инхубирозалм с полихлональной антисывороткой против мышиных иммуноглобулинов. Далее наносили моклональныв антитела к различным маркерам Т-клзток, меченые фикоэритрином и ФИТЦ и инкубировали препарат в течение 30 минут на льду. Избыток антител отмывали и просматривали препараты в флюоресцентном микроскопе фирмы Olympus (Ин-тут туберкулеза АМН России) при увеличении х100.

7. Смешанная культура лимфоцитов (СКЛ) Для анализа применяли первичную однонаправленную СКЛ. Клетки селезенки использовали а качестве стимулирующих и отвечающих клеток. Стимулирующие клетки перед постановкой эксперимента облучали с помощью источника ,0Со в дозе 15 Гр. Клетки культивировали в 96-луночных плейтах в стандартных условиях in vitro в течение 120 часов. Интенсивность пролиферации оценивалась по уровню включения 3Н-тимидина. В некоторых опытах в качестве стимулирующих клеток использовали спленоциты с адсорбированным на них вирусом гриппа. Адсорбцию проводили следующим образом. Вирус гриппа добавляли в суспензию

стимулирующих клеток в количестве 1 ГДЕ на клетку. Далее инкубировали стимулирующие клетки с вирусом гриппа в течение 30 минут при 37°С и три раза отмывали клетки от избытка вируса. Стимулирующие клетки облучали, ресупендировали и смешивали с отвечающими клетками.

7. Статистическая обработка результатов.

При обработке экспериментальных данных были использованы показатели, наиболее употребляемые в биологической статистике: сродное геометрическое (при подсчете АОК в селезенке), среднее арифметическое (для прочих реакций), ошибка среднего (Певницкий, 1973). Значимость различий между группами оценивали по критерию Стъюдента (Рокнцкий, 1961). В работе был принят уровень значимосп*0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

I. ЛимФоидная персистения v мышей с врожденной гриппозной инФекци«^

При вирусологическом исследовании мышей с врожденной гриппозной инфекцией была продемонстрирована порей станция вируса в легких, головном мозге, почках и других органах (Зуев, 1988). Как было показано ранее, для персистентных вирусных инфекций очень характерна лерсистонция имонно в лимфоидных тканях (Slssons,1993). Так как при вертикальной перодачо вируса, потомство, зараженных в период беременности мышей, получает вирус через кровь (что является несколько необычным путем заражения для вируса гриппа) была предпринята попытка выявить вирусные антигены о лимфоидных клетках у мышей с врожденной гриппозной инфекцией.

Наличие вирусных антигенов на лимфоидных клетках мышей с врожденной гриппозной инфекцией было исследована в реакции комплемонт-эависимой цитотоксичности.

Для этого спленоциты и тимоциты мышей с врохеденной гриппозной инфекцией обрабатывали поликлональной кроличьей антисывороткой против

антигенов пи руса гриппа и сзожим комплементом морской свинкиДанные этих опытов представлены на рис.1.

Рис.1 Выявление антигенов вируса гриппа на клетках лимфоидных органов мышей с ВП1

А - спленоциты; В - тимоциты. 1 - мыши с ВГИ; 2 - иммунные к вирусу гриппа мыши; 3 - интактные С57В1./В

Как видно на рис.1 цитотоксический индексу мышей с врожденной гриппозной инфекцией был достоверно выше (группы 1А и 1В),чом у иммунных (2А и 2В), и интактных мышей (группы ЗА и В). Однако мыши с врожденной гриппозной инфекцией были весьма неоднородны по экспрессии их лимфоидными клетками вирусных антигенов. Экспрессия вирусных антигенов,выявляемая в реакции комплемент зависимой цитотоксичност наблюдалась примерно у 70% животных.

Эти данные о присутствии вирусных антигонов в лимфоидных клетках мышей с врожденной гриппозноГ^нфекцией были подтверждены данными о присутствии тРНК вируса гриппа в лимфоидных клетках мышей с врожденной

гриппозной инфекцией, обнаруженной тем методом дот-п;бридизЕЦ!1и при помощи виру оных зондов (Капелинская Т.В., устноа сообщание).

il, Ah,ЗЛИ? ЩЦИФИЧСИЗДЙ ИММШР.РЙЦШНРСТИ V MH^-fl Ç ааа>«<д?пирй ,rpnnn9aHg0 инфекцией-Экспрессия антигенов вируса гриппа на клотках тимуса и солазенки мышей с ВГИ в течение первого месяца их жизни давала возмсксностъ прздпопохагтъ формирование специфической иммунологической толсрантмосш к вирусу гриппа у а тих животных. Изучение характерных особенностей специфического иммунного ответа при врожденной гриппозной инфекции очень важно, так как дефект специфического иммунного ответа у таких мышаЛ и возникающий о результате отого дефект регуляции различных иммунных реакций можот со многом определять возникновение иммунопатологических состояний у таких мышзй.

В связи со всем вышесказанным одной из задач нзшай работы было исследование специфической иммунореаетгианостн мышдй с врожденной гриппозной инфекцией.

1. Анализ специфического В клеточного ответе у мышой с ВГИ Ранее было показано, что у мышей с ВГИ не образуются специфические антитела в ответ на повторное заражение вирусом гриппа при наличии сохранного ответа на вирус энцефаломиокардкте ( Мнрчинк и со дат., 1887; Зуев. 1988). Резкое снижение количества специфических антител в сыворотко мышей с ВГИ могло быть связано с периферической нейтрализацией этих антител антигенами вируса гриппа в условиях вирусоносительства. Представлялось важным определить уровень вирус-слецифичесхих антителообразующих клеток в селезенке таких мышей.

Как видно на рис.2 число АОК к вирусу гриппа о группа у мы шзй с врожденной инфекцией (группа С) достоверно снижено по сравнению с мышами, пережившими интраназальное заражение том же штаммом вируса за два месяца до тест-инъокции вирусом гриппа (группа В) и мышами,но имевшими до тост-инъекции контакта с вирусом гриппа (группа А). Однако в группе мышой с ВГИ

наблюдались выраженные индивидуальны') различия в ответе на вирус филпз. Уровень отсзта колебался от почти нулевого (приблизительно у полоаины «vint;! с ВГМ) до хотя и сниженного, но есо-тош достаточно выраженного урогия отсзта..

А

О

С

,__,_, АОК/10* клеток

i i» ici íes*

Рис. 2. Уменьшена® количества АОК к вирусу филла у мышей с ВП1. А - уроззнь АОК к вирусу фиппа у интектных C57BL/0 (п=*17); В • уровень АОК к вирусу фипла у иммунных мышей (п в14); С - уровень АОК к епрусу филпа у мышей с ВГИ (п »12)

Для выяснения вопроса, вызвана ли специфическая В-клоточмвл ареоктивность ыышей с ВГИ дефектной иммунокомпатенцией лимфоцитов или . особыми условиями функционирования этих клеток в организме вирусоносителсй были поставлены эксперименты с адоптивным перенотом спланоцитоз от мышей с ВГИ сублетально (5 Гр) облученным сингенным реципиентам.

Ках видно на рисунка 3, облучение полностью подавляло ответ на антиген вируса фиппа (фуппа А), перенос 30x10* спленоцитов от кнтактных иг.^ раиео иммунизированных мышей дасало по существу одинаковый уровень ответа на сведение 10 мкг антигена вируса гриппа (фуплы В и С), перенос же 30x10*

спленоцитов мышат с ВГИ обеспечивал высокий уровень ответа по вторичному типу (сравнить группу й и группы В, С) Эти результаты дают возможность предположить сохранность иммунокомпетентных клеток у мышей с ВГИ.

Е

А В

АО К/10' клеток

Рис. 3. Перенос АОК к вирусу гриппа спленоцитами мышей с ВГИ. А - ответ на вирус гриппа у реципиентов без переноса 'п = 10); В - перенос спленоцитов ин-тактных С57Виб (п =13); С-перенос еппеноцитов иммунных мышей (п=ИЗ); Р-перонос спленоцитов мышей с ВГИ (п=13)___________

2. Анализ Т-кле^очных реакций на вирус гриппа у мышай с врожденной гриппозной инфекцией. Для изучения Т клеточной иммунореакгивности была использована реакция

ГЗТ

Как видно на рис.4, реакция ГЗТ на вирус гриппа также резко снижена у мышей с ВГИ (группа С) по сравнению с интакгным и иммунным контролем (фуппы А, В).

о о.об ai ais ад o¿s

мм

Piic.4. Подавление реакции ГЗТ на вирус гриппа у мышей с ВГИ. Л-реакция ГЗТ на вирус гриппа у ижактных C57BI/6 (п »15 ); В - реакция ГЗТ на вирус гриппа у иммунных мышей (п ■ 14 ); С - реакция ГЗТ на вирус гриппа у мышай с ВГУ1 (п= 13 ) Темные столбики - уровень отрицательного контроля

Для решения вопроса является ли отсутствие реакции ГЗТ на вирус гриппа у иышей с ВГИ следствием дефекта специфических Т-клоток, была поставлена реакция адоптивного переноса ГЗТ к вирусу гриппа.

Ксх видно на рис.5, спленоцкты мышей с врожденной гриппозной инфекцией нэ были способны переносить реакцию ГЗТ к вирусу гриппа интактным сингенным рвцилиентам (группа В). Перенос сенсибилизированных сппенацитоа от кнтаетных и иммунных мышей приводил к выраженной реакции ГЗТ на вирус гриппа у реципиентов.

ДОНОРЫ

Мыши с ВГИ, сесибилизмро-ванные А/МБЫ

Иммунные мыши, сенсибилизированные А/У/БМ

С57В1Л5, сенсибилизированные АМЭЫ

М

13

15

СЦБ <И Ц15 02 Ц25

Рис.5. Локальный перенос реакции ГЗТ на вирус гриппа лимфоидными клетками мышой с ВГИ.

Приведенные на рис.5 результаты свидетельствуют о том, Что эффекторы реакции ГЗТ на вирус гриппа не могли быть индуцированы в организме мышей с ВГИ.

Одной из возможных причин того, что вирусспецифическую реакцию ГЗТ невозможно было индуцировать у мышей с ВГИ, могло быть наличие специфических и неспецифических супрессоров у таких мышей. Для выявления супрессороа в селезенке мышей с ВГИ была использована реакция супрессии эффекторной фазы ГЗТ, разработанная для алло- и ксеноантигенов Чтняховской и соавт (1985).

Как видно на рис.6, только спленоциты мышей с врожденной гриппозной инфекцией были способны сулрессироватъ реакцию ГЗТ на вирус гриппа.

Была показана специфичность супрессии реакции ГЗТ на вирус гриппа спленоцитами мышей с ВГИ, так как спленоциты мышей с ВГИ не являлись супрессорами аллогенной реакции ГЗТ в реакции локального переноса ГЗТ.

Известно, что одним из способов инактивации супрессоров ГЗТ является введение мышам до сенсибилизации низкой дозы циклофосфамида-(ЦФ)- 50 мг/кг (А(3а е1 а!.,1981).

Как оказалось, обработка мышей с ВГИ ЦО перед индукцией реакции ГЗТ на

вирус фиппа приводила к восстановлению у таких мышей способности

/

формировать реакцию ГЗТ на вирус гриппа (данные но представлены).

Результаты, полученные» при исспедозпнии специфического иммунного ответа на вирус гриппа у мышей с ВГИ, свидетельствуют о выраженном подавлении специфической иммунореактизностм у таких мышей с ВГИ In stlu. В ioy'i ораыл в реакциях адаптивного перекоса нами было обнаружена сохранность сирусслсцифических икнунокомпотентных клеток у мышэй с ВГИ.

! ПЕРЕНОС СУПРЕССОРЫ

14 ---

16---

слл8н0ц1пы 18 —--

C57BL0 :-

сплзноцкты . '

мышзй с ВГИ « __

О 0,1 0,2 0,3

Рис. 0. Супрессия локального переноса реакции ГЗТ на вирус гриппа сплено-цитами мышей с ВГИ. А - перенос реакции ГЗТ без переноса супрессоров); В ; отрицательный контроль; С - о качестве супрессоров перенесены елленоциты

интоктных C57BL/S; О - а качестве супрессоров перенесены спленоциты I, мышей с ВГИ. Слеза указано количество мышэй в фуппе. _____:___

III.Гиперплазия регионарного лимфатического узля v сингенных раиипиэнтов q ответ нп предение лимфоидных клеток мышей с прожданной гриппозной инфекцией.

¡Сак было показано ранее, лимфоидныо клетки мышей с врожденной гриппозной инфекцией несли из себе антигены оируса филла, и по-видимому, можно было также предположить наличие вирусиндуцированных антигонов на

¡А ♦

1 0 -

С +

о ♦

поверхности лимфоидных клеток таких мышей.В следующей серии экспериментов была предпринята попытка выявить антигенные различия между лимфоидными клетками мышей с ВГИ и лимфоцитами сингенных мышей С57В1.,'8. Для этого мнтактным сингенным реципиентам подкожно в правую заднюю лапку вводили 10т спленоцитов мышей с ВГИ и на 7 день измеряли отношение веса опытного подколенного лимфатического узла к контрлаторальному узл? (поплитеальный индекс).

[ЮНОРЫ

А - спленоииты мышей с ВГИ Ъ

В - облученные спленоииты 8

мышей с ВГИ

С -тнмоцнты мышей с ВГИ Т

О -спленоииты ннтактных эе

мышей С57Виб I

Е -тимоциты ннтактных 7

мышей С57ВЬ/6

Г - инфекционный вирус 7

(3 -инактнвнрованный вирус 8

Н -вирус на ннтактных 6

спленоцитах

I -вирус на иммунных (

спленоцитах

1Э-

1

4

Рис.7. Индукция гиперплазии регионарного лимфатического узла сингенных реципиентов после введения им лимфоидных клеток мышей с ВГИ.

По оси абсцисс - поплитеальный индекс Слева от рисунка количество мышей в группе

Как видно на рис.7, введение спленоцитов и тимоцитов мышей с врожденной гриппозной инфекцией (группы А-С) давало достоверное увеличение лоплитеального индекса по сравнению с введением спленоцитов и тимоцитов

интастных животных (группы D, Е). Вваденио облученных спленоцитоз мышей а ВГИ тпгсхе давало выраженное увеличение поллитеального индекса.

Зависимость реакции гиперплазии регмонирмого ли>.4фатичасксго узла о емнгенкой систамэ от урспня экспрессии еирусных антигенов на лимфоидных клзттах мышей с ВГИ показана на рис. 8.

j поплнтоальиый i индекс

% клеток, несущих вирус

Рис.0. Засшашостъ урозня , лперплазии регионарного лимфатического узла реципиента от уровня экспрессии вирусных антигенов на тимоцитах (А) и сплоноцитах (В) донора (мышей с 8П4).

Как видно из рис.8 . уровень реакции гиперплазии регионарного лимфатического узла логарифмически зависел от уровня экспрессии вирусных антигенов на лимфоцитах донора.

Поскольку механизмы наблюдаемой гиперплазии регионарного лимфатического узла при введении сингенным реципиентам клеток мышей с ВГИ выяснены не до конца, мы решили проанализировать состав популяции регионарного лимфатического узла реципиента через 7 дней после подкожного введения донорских клэток. Для этого суспензию лимфоцитов регионарного лимфатического узла в опыте и контроле обрабатывали моноклональными антителами против различных маркеров Т-лимфоцитов (С04, С08), а также

против оф и у5 Т-клеточных рецепторов), меченными флюоресцентной ьитой. Количество клеток, несущих те или иные маркеры подсчитывали в флюоресцентном микроскопе.

Таблица 1. Анализ популяции регионарного лимфатического узла на 7 день после введения спленоцитов мышей с ВГИ.

Введение спленоцитов мышей с ВГИ

Введение спленоцитов интактных C57BL/6

аР-Т клетки I уб-Т клетки

Г*

16,14

32,6%

56,4%

4,9%

CD4* Т клетки

25%

7.3%

CD8* Т клетки

8.8%

10%

Как видно из таблицы 1, для регионарного лимфатического узла реципиента после введения эму спленоцитов мышей с врожденной гриппозной инфекцией быпо характерно значительное увеличение Т-клеток, несущих уб Т рецептор, а также возрастание уровня С04*Т клеток по сравнению с контролем, которому вводили спленоциты от интактных сингенных доноров. Полученные данные позвопяют предположить роль уб Т-клеток в развитии гиперплазии регионарного лимфатического узла в сингенной системе.

VI, Анализ функциональной активности спленоцитов мышей с врожденной гриппозной инфекцией In vitro.

Ранее многими авторами было показано (СазаП et al.. 1986), что вирусное заражение может приводить к нарушению способности лимфоидных клеток таких животных пролиферировать на различные митогены и и антигены. В нашей работе было показано, что спленоциты мышей с ВГИ не пролиферировали на вирус гриппа (рис.9 В), а также не были способны презентировать вирус гриппа иммунным клеткам (рис.9 А). У мышей с ВГИ сохранялась спосЬбностъ пролиферировать в ответ на аллогенные клетки (рис.10), а также наблюдался

высокий уровень спонтанной пролиферации. 8 целой можно сделать вывод о том. что у мышей с ВГИ о большей степени нарушена способность, к специфической пролиферации.

иидеяя пролиферецим

20 18 10 в 0

(Яндекс схрсгмферецут

0

*

" rh rh rh rh

в м < —111 i ——i

1 1 S 4

Pwc.9 Анализ способности спленоцитоэ мышей с ВГИ процентировать вирус гриппа иммунным сингенным спленоцитам (А), и пролиферировать на вирус фиппа (В). В качестве отвечающих клеток использованы: А - спленоциты иммунных к вирусу гриппа мышей линии C57BL/0, В - спленоциты мышей с ВГИ.В качестве етимулнрующих клзток испальзооакы: 1 - спленоциты интектных сингенных мышей (без вируса); 2 - спленоциты интз,ттных сингенных мышей с адсорбированным на них вирусом фиппа; 3 - спленоциты иммунных к вирусу фиппа мышей с адсорбированным на них вирусом гриппа; 4- спленощтш мышей с ВГИ с адсорбированным на них вирусом гриппа.

12 Ю е в 4 2 О

3 4

Рис.10 Анализ способности мышей с ВГИ проЛиферировать на.аллогенные клетки (А), и быть стимулирующими клетками в смешанной культуре лимфоцитов (В). Пролиферация слленоцитов -1 - мышей с ВГИ; 2 • мышей С57Вив в ответ на спленоциты СВА. Пролиферация слленоцитов СВА на - 3 слленоциты мышеи С57В1./6; 4 - слленоциты мышей с ВГИ.

У.Фенотипический анализ лимфоидных клеток селезенки мышей с врожденной гриппозной инфекцией.

Известно (Schooley et al., 1983), что вирусная инфекция в значительной мере изменяет субпопуляционный состав лимфоидных органов и функциональную активность различных субпопуляций лимфоидных клеток (Sissons, 1993). Нами было показано, что у мышей с ВГИ в 10-15 раз снижена клеточность тимуса и селезенки, снижено относительное количество Т клеток в селезенке (18% по сравнению с 32% в контроле). При анализе субпопуляционного состава Т клеток селезенки мышей с ВГИ показано: выраженное снижение количества CD4* Т клеток (около 1% по сравнению с 25,7% в контроле), появление в селезенке двойных негативных Т клеток (CD4" CD8"), а также увеличение количества у5 Т

клеток по сравнению с интактными контролями (5% по сравнению с 14 в кснтропе).

Выводы.

1. У мышей с ВГИ выявлена аплазия лимфоидной ткани, выраженная а уменьшении общего количества клеток в лимфоидных органах, а также в уменьшении относительного и абсолютного содержания Тклеток. В селезенке обнаружено увеличение уровня у5 Т-клетох, а также уменьшение количества CD4* Т-клеток.

2. У мышей с ВГИ показана экспрессия вируса гриппа на клетках селезенка и тимуса.

3. У мышей с ВГИ резко ослаблена способность формировать специфические АО К и отвечать ГЗТ на антигены возбудителя.Введение циклофосфлмида восстанавливает реакцию ГЗТ на вирус гриппа.

4. В реакциях адоптивного переноса показана сохранность предшественников вирусспецифических АОК у мышей с ВГИ и наличие специфических супрессоров ГЗТ.

5. Лимфоциты мышей с ВГИ сохраняют способность реагировать пролиферацией на аллоантигены in vitro.

в. Локальное вводе ие клеток лимфоидных органов мышей с ВГИ интактным сингемным реципиентам приводит к увеличению веса регионарного лимфатического узла и накоплению в нем уЬ и CD4* Т клеток. Показана зависимость этой реакции от уровня экспрессии вирусных антигенов клетками лимфоидных узлов донора.

Основные положения диссертации отражены в следующих печатных работах:

1. И.Ю.Черняховсхая. Н.В.Кобец, Е.П.Мирчинк, Л.Н.Фонталин. В А.Зуев. Особенности иммунного отпета на вирус гриппа у мышей с медленной гриппозной инфекцией.//Вопросы оирусологуи.-1990. N2-C.112-115

2. И.Ю.Черняховская, Н.В.Кобец. Специфическая иммунологическая грз активность у «ышэй с оро;кдэнной гриппозной инфекцией.// Тезисы Всесоюзного Конгресса общества эпидемиологов, микробиологов,

паразитологов и инфекционистов памяти И.И.Мечникова, Alma-Ata, 188fr, C.24S-249

3.1.Yu Chernyakhovskaya, N.V.Kobets. The possible mechanisms of pathology In mice with congenltally acquired Influenza Infection. Abstracts of 9th International Congress of Immunology, San Francisco, July 23-29,1995, N 04166, P.

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Поди, к печати ih. 8.9 9 Заказ 15?

Тираж 1 00 экз.