Автореферат и диссертация по медицине (14.00.45) на тему:Применение иммуноферментного анализа для выявления острой и хронической интоксикации метадоном

V 1 '

- - /

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ НАРКОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 616.89-008.441.13-17: 616.153.1-078.33-074

Дмитриева Ирина Геннадьевна

ПРИМЕНЕНИЕ И М МУ НОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ МЕТАДОНОМ

14.00.45 - наркология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор медицинских наук Н.Б. Гамалея

Москва - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Введение ............................................................................. 5

Глава 1 Обзор литературы.............................................. 11

1.1. Влияние антител к препаратам на их фармакологическое действие.................................... 13

1.2. Неспецифический иммунный ответ на введение опиатов........................................................ 17

1.2.1. Реакция иммунокомпетентных клеток на введение опиатов.................................................... 18

1.2.2. Неспецифическое влияние опиатов на гуморальный ответ.................................................... 21

1.3. Специфическое антителообразование к опиатам ...................................................................... 23

1.3.1. Специфический гуморальный ответ на стимуляцию метадоном............................................... 27

1.4. Методы лабораторной диагностики, используемые для анализа опиатов в биологических средах................................................................. 29

1.4.1. Физико-химические методы анализа................ 30

1.4.2. Иммунохимические методы анализа................ 31

Глава 2 Материалы и методы исследования................. 37

Глава 3 Разработка твердофазного иммунофермент-ного анализа для определения содержания ме-

тадона в биологических жидкостях............................42

3.1. Сравнение двух схем анализа для выявления

морфина............................................................ 42

3.2. Разработка твердофазного ИФА для опреде-

ления содержания метадона в моче..................

3.3. Получение высокоавидных кроличьих иммунных антисывороток к метадону........................ 58

3.4. Разработка твердофазного иммунофермент-ного анализа для определения содержания метадона в сыворотке (плазме) крови................... 59

Глава 4 Исследование феномена индукции антител к

метадону при поддерживающей терапии............ 67

4.1. Разработка методик выявления антител к метадону ................................................................. 68

4.2. Изучение классового состава и специфичности антител к метадону и морфину.................... 72

4.3. Исследование особенностей анамнеза больных, синтезирующих антитела к метадону...... 81

4.4. Анализ факторов, способствующих возникновению антител к наркотическим препаратам

(на примере морфина)....................................... 87

Глава 5 Обсуждение результатов................................... 100

Выводы ............................................................................. 116

Список использованной литературы................................... 118

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1ЕА - иммуноглобулин класса А

18 о - иммуноглобулин класса О

18 М - иммуноглобулин класса М

АтМ - антитела к морфину

АтМет - антитела к метадону

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

гжх - газожидкостная хроматография

гзт - гиперчувствительность замедленного типа

ДМФА - диметилформамид

дцк - дициклогексилкарбодиимид

ЕКК - естественные клетки-киллеры

ЗФР - забуференный фосфатами физиологический раствор

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН - интерферон

Ка - константа аффинности

КВ - коэффициент вариации

КЖ - культуральная жидкость

КММ - карбоксиметилморфин

Кон А - конканавалин А

Мон Ат - моноклональные антитела

ОП - оптическая плотность

ОФД - ортофенилендиамин

пх - пероксидаза хрена

РИА - радиоиммуный анализ

РОК - розеткообразующие клетки

РПК - реакция поглощения комплемента

ТНБС - тринитробензолсульфокислота

тех - тонкослойная хроматография

УФ - ультрафиолетовый

ФГА - фитогемагглютинин

ФИО - фактор некроза опухоли

ц-АМФ - циклический аденозин-монофосфат

ЧСА - человеческий сывороточный альбумин

ЭБ - эритроциты барана

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы: Тенденция к увеличению потребления наркотических веществ в немедицинских целях в настоящее время продолжает прослеживаться во всем мире. За рубежом одной из составляющих комплексного лечения больных героиновой наркоманией является заместительная терапия метадоном. Использование этого препарата обусловлено его пролонгированным временем полураспада - метадон обычно насыщает опиатные рецепторы в течение 24-36 часов, не вызывая при этом эйфории, что создает возможность достижения клинической стабильности и социальной реабилитации пациентов при приеме препарата один раз в сутки. Важным достоинством метадона является также его эффективность при пероральном приеме (К.Э. Воронин, 1994; Novick, Ochshorn et Kreek, 1989). Однако препарат вызывает стойкое привыкание и, по разным данным, оказывает неоднозначное воздействие на иммунную систему пациентов, и без того ослабленную героиновой наркоманией. Lazzarin, Mella et al. (1984) сообщают, что метадоновая терапия нормализует некоторые иммунологические показатели, однако Carballo-Dieguez, Sahs et al. (1994) наблюдали при этом изменения в Т- и В-системах иммунитета, сходные с происходящими под влиянием других опиатов. Нужно отметить, что последние авторы исследовали одни и те же группы пациентов в динамике, поэтому их данные вызывают больше доверия.

Для опиатов в целом (и других видов психоактивных веществ, включая алкоголь) характерно супрессорное действие на клеточное звено иммунитета, причем вызываемые ими нарушения принципиально схожи (К. Д. Плецитый, Т. В. Давыдова, 1989; Yahya, Watson, 1987; Fischer, 1988). Влияние наркотических препаратов опийной группы на гуморальные факторы иммунитета, напротив, выражается,

в основном, в повышении уровней сывороточных иммуноглобулинов, что интерпретируется как следствие хронической антигенной стимуляции (Matsuyama et al., 1980; Heathcote, Taylor, 1981).

Контроль за состоянием больных, проходящих курс метадоно-вой терапии, осуществляют на основе анализа уровня препарата в периферической крови. Но несмотря на каждодневную потребность в экспресс-анализе метадона в биологических жидкостях, до сих пор не разработано отвечающего требованиям дешевизны и надежности метода определения этого вещества в крови и моче - что, безусловно, осложняет своевременную корректировку терапевтических доз в клинике и проведение токсикологической экспертизы. Кстати, на российский «черный рынок» метадон уже поступил, а значит с проблемой его обнаружения сталкиваются и российские эксперты. Таким образом, разработка современных методов как инвазивной, так и неинвазивной количественной диагностики употребления метадона обеспечит решение актуальных для наркологической клиники и токсикологии прикладных задач.

Диагностика острой интоксикации метадоном ограничена временем выведения препарата с мочой, которое составляет до 7-9 суток (Liu, Adler, 1973). Для анализа этого синтетического опиата обычно используются физико-химические методы анализа - тонкослойная или газожидкостная хроматография. Сравнительно недавно стали применяться менее дорогостоящие, но обеспечивающие достаточную чувствительность иммунохимические методы, в частности иммунофлуоресцентный анализ. Но и он требует достаточно дорогого оборудования и реагентов (Kell et Techman, 1996).

Иммуноферментный анализ, основанный на специфическом связывании наркотика с антителами к нему и последующей визуали-

зации произошедшей реакции благодаря наличию ферментной метки на одном из участников образующегося комплекса, отвечает требованиям надежности, дешевизны и экспрессности, поэтому часто применяется в лекарственном мониторинге и скрининговых тестах биологических жидкостей, предположительно содержащих наркотическое вещество. Именно он был выбран нами при разработке тест-систем для выявления метадона в крови и моче.

К сожалению, оценка состояния больного на основе уровня метадона в крови недостаточно адекватна. Существует много сообщений об отсутствии корреляции между этими двумя параметрами (Borg, Но et al., 1995; De Vos, Geerlings et al., 1995). Поскольку для многих терапевтических агентов - как высоко-, так и низкомолекулярных - при многократном введении наблюдалась возможность выработки антител к ним, вызывавшая толерантность к проводимой терапии (Waldhaus, Bratusch-Marrain et al, 1985; И.Е. Ковалев, О.Ю. Полевая, 1985; JI.A. Гилядова, 1980), мы предположили, что и в случае заместительной терапии метадоном у части пациентов могут образовываться антитела к нему. Это приведет к снижению концентрации активного метадона, способного связываться с опиатными рецепторами, и может уменьшать эффективность терапии, вызывая проявления абстиненции, хотя уровень метадона в крови будет достаточно высок. Возможность антителогенеза при длительной заместительной терапии метадоном ранее не исследовалась, и изучение этого феномена, безусловно, представляет не только практический, но и научный интерес.

Присутствие антител к метадону в периферической крови пациентов мы устанавливали также при помощи ИФА. Преимущество этого вида анализа состоит в возможности выявления не только вы-

сокоаффинных антител (как в случае радиолигандного связывания), но также и низкоаффинных. Антитела к морфину, например, образующиеся in vivo у лиц, злоупотребляющих опиатами, относятся к классу Ig М и отличаются сравнительно низкой аффинностью (М.А. Мягкова и соавт. 1989; Biagini et al.,1990; Н.Б. Гамалея и соавт., 1991, 1993).

Актуальность для наркологии разработки эффективных и не дорогостоящих методик определения уровней метадона в биологических жидкостях и иммунологических последствий длительного употребления этого препарата по медицинским показаниям и без них обусловила постановку цели настоящей работы.

Цель исследования: Разработка способов диагностики острой и хронической интоксикации метадоном с применением иммунофер-ментного анализа.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать методики получения и выявления специфических антител к метадону.

2. Разработать иммуноферментную тест-систему для обнаружения метадона в биологических жидкостях при диагностике острой опийной интоксикации и для мониторинга при проведении заместительной терапии больных опийной наркоманией.

3. Изучить феномен индукции антител к метадону у больных опий-

ной наркоманией, длительно получающих метадон, и их клини-ко-фармакологическую значимость.

4. Исследовать возможные причины индукции синтеза антител к наркотическим веществам.

5. Обработать полученные данные с помощью методов математической статистики.

Научная новизна. Впервые установлено, что у части пациентов, длительно получающих метадон, могут вырабатываться антитела к нему. Образование антител к метадону влияет на фармакокинетику препарата, в частности, способствуя связыванию больших концентраций метадона в кровяном русле, что может привести к снижению его фармакологической активности.

В плазме пациентов обнаружены антитела двух классов - высоко аффинные ^О, не реагирующие перекрестно с морфином, и ^М, охотнее связывающиеся с морфином, чем с метадоном, взаимодействие которых с обоими препаратами ненасыщаемое и слабое.

Впервые установлено, что у пациентов, у которых вырабатывались антитела к морфину, с большей вероятностью запускается механизм выработки антител к метадону при заместительной терапии. Кроме того, впервые отмечено, что в группе ВИЧ-инфицированных опийных наркоманов вероятность обнаружения антител к морфину и метадону составляла соответственно - 75 и 88 %, что является косвенным подтверждением предположения о связи иммунодефицита Т-клеточного типа с запуском механизма выработки антител к наркотикам.

Практическая значимость результатов. Впервые разработана высокочувствительная (10 нг/мл) иммуноферментная тест-система для выявления метадона в крови. Аналогичная система адаптирована для неинвазивной диагностики употребления метадона - по анализу мочи (ее чувствительность 50 нг/мл). Разработанные способы применимы как в токсикологическом анализе для подтверждения факта употребления препарата, так и в мониторинге состоя-

ния наркологических больных при поддерживающей терапии мета-доном.

На основе твердофазного иммуноферментного анализа разработаны способы определения в периферической крови антител к мета-дону как связанных в комплексы с метадоном, так и свободных. Эти способы применимы как в токсикологическом анализе для подтверждения хронической метадоновой интоксикации, так и в клинической практике при поддерживающей терапии опийных наркоманов метадоном для коррекции терапевтических доз.

Глава 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Метадон - синтетический наркотический анальгетик, отличающийся от морфина более продолжительным анальгетическим эффектом и купированием синдрома отнятия от наркотика, не вызывая при этом эйфории. Он является агонистом опиатов, несмотря на весьма отдаленное сходство структур метадона и морфина (см. рис. 1).

В наркологической практике метадон используется в двух случаях: для купирования абстинентного синдрома у больных опийной наркоманией и для поддерживающей терапии у этих больных. Де-токсикация с использованием уменьшающихся доз метадона может быть краткосрочной (сроком менее одного месяца) и длительной (месяц и более). Поддерживающая терапия метадоном (ПТМ) также подразделяется на краткосрочную, когда пациенты получают стабильные дозы метадона до 6 месяцев, и долгосрочную, когда стабильные дозы они получают от 6 месяцев до нескольких лет (H.A. Должанская и соавт., 1994).

Вопрос о целесообразности поддерживающей заместительной терапии наркоболь ньгх на Западе продолжает дискутироваться, но ПТМ заняла прочное место в арсенале наркологов. Горячие противники метадоновых программ утверждают, что использование метадона недопустимо, т.к. замена одного наркотика другим принципиально не решает проблем борьбы с наркоманией (Lux, 1988). Сторонники метадоновой терапии считают ее целью не лечение наркомании как таковой, а снижение вреда от незаконного употребления наркотиков и установление контакта между медицинскими и социальными работниками и больными наркоманией (Ward et al., 1992).

и

К положительным сторонам ПТМ относится контролируемое постепенное снижение дозы препарата и предотвращение распространения ВИЧ-инфекции - неизбежного спутника внеклинического внутривенного введения наркотиков. Последнее обстоятельство заставляет задуматься о целесообразности поддерживающей терапии и российских наркологов, т.к. в 1996 г. вспышка ВИЧ-инфекции была зарегистрирована среди наркоманов в ряде регионов СНГ, а в 1997 г. аналогичный подъем наблюдался и у социально стабильного населения в тех же регионах. Таким образом, легализация и поддерживающее лечение наркоманий, и, в особенности, наиболее распространенной - опийной наркомании - необходимая уже мера защиты от ВИЧ-инфекции и в нашей стране.

В первых наркоклиниках метадон вводился внутривенно и в дозах, недостаточных для снятия явлений абстиненции, поэтому большинство пациентов отказывались от участия в метадоновых программах. «Второе рождение» терапия метадоном пережила в 60-е гг., когда М. Nyswander и V. Dole (1965) в США ввели лечение, основанное на пероральном употреблении метадона. Такие клиники и по сей день обеспечивают наивысшие показатели ремиссий (H.A. Дол-жанская и соавт., 1994; Gerstein, Harwood, 1990).

В 1998 гг. Kraft, Rothbard и соавт. в США опубликованы результаты оценки экономической эффективности комбинированной терапии, включающей в разных пропорциях поддерживающее лечение метадоном и консультации социального работника. По данным авторов, затраты на курс лечения группы больных, отнесенные к количеству наблюдавшихся пациентов, не возобновивших прием наркотика в течение года после проведенной терапии, оказались оптимальными при сочетании курса метадона с некоторой психологической под-

держкой (затраты на 1 воздерживающегося составили 9804 доллара). Для сравнения можно вспомнить, что расходы на лечение 1 больного СПИД составляют 15-20 тысяч долларов ежегодно.

Однако, если целесообразность поддерживающей терапии наркоманов практически не оспаривается, то метадон как терапевтический агент вызывает много нареканий в связи с тем, что 1) сам вызывает стойкое привыкание и 2) обладает некоторым иммуносупрес-сорным действием. Поэтому во всем мире ведется поиск препаратов, обладающих положительными свойствами метадона, но лишенных его отрицательных сторон. Поиску заменителей метадона посвящено несколько интересных работ (выходящих за рамки нашего обзора), но в большинстве из них речь идет об экспериментах in vitro, поэтому в ближайшие десять лет клиницистам придется строить терапию так, чтобы свести к минимуму побочные эффекты метадона, пока ему не будет найдена достойная замена.

В этом обзоре мы остановимся на неспецифических и специфичных к данному веществу иммунологических последствиях введения опиатов - в особенности, морфина и метадона, - затрагивающих клеточное