Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение химического состава и фармакологической активности комплексов биологически активных веществ, выделенных из шрота полыни горькой.

На правах рукописи

СЕВЕРИН АЛЕКСЕИ ПЕТРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОМПЛЕКСОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ШРОТА ПОЛЫНИ ГОРЬКОЙ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

005050521

Курск-2013

005050521

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Сипливая Любовь Евгеньевна доктор фармацевтических наук, профессор Яцюк Валентина Яковлевна

Официальные оппоненты:

Киселева Татьяна Леонидовна - доктор фармацевтических наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры фармакогнозии

Сливкин Алексей Иванович - доктор фармацевтических наук, профессор, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет», заведующий кафедрой фармацевтической химии и фармацевтической технологии

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «¿о » 2013 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан «УС » с^а.0,2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета ^^ $ -— Пашни Евгений Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящий период развития российской медицины немало внимания уделяется проблеме применения лекарственных растительных средств, о чем свидетельствует наблюдающаяся в последнее время тенденция к расширению ассортимента отечественных фитопрепаратов. Известно, что лекарственное растительное сырье при достаточной фармакологической эффективности обладает меньшей токсичностью и аллергенностью. В связи с этим поиск новых источников сырья, совершенствование технологии производства, а также комплексное использование уже разрешенных к применению лекарственных растений является актуальной задачей отечественной фармации.

Растения рода Полынь занимают немаловажное место среди лекарственных растений, применяемых в официнальной и народной медицине. Аналитический обзор данных литературы показал, что в научной медицине РФ используется трава полыни горькой для приготовления настойки, применяемой в качестве желчегонного, способствующего усиленной выработке желудочного сока и усиливающего аппетит средства. В этой связи особое внимание привлекает возможность ресурсосберегающего использования отходов промышленной переработки (шрота) уже разрешенного к применению лекарственного растительного сырья, что требует совершенствования технологических схем производства как существующих, так и вновь разрабатываемых лекарственных препаратов.

Поэтому сравнительное исследование химического состава и фармакологической активности травы и шрота полыни горькой после получения настойки является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении возможности безотходного комплексного использования сырья полыни горькой в качестве потенциального источника для создания фитопрепаратов с различными видами активности.

Для достижения цели решались следующие задачи:

- провести сравнительный фитохимический анализ травы и шрота полыни

горькой после получения настойки;

- определить количественное содержание основных групп биологически

активных веществ в изучаемом сырье;

- исследовать некоторые виды фармакологической активности комплексов биологически активных веществ (БАВ), получаемых из шрота полыни горькой с помощью экстрагентов различной полярности.

Научная новизна. Проведен сравнительный фитохимический скрининг травы полыни горькой и шрота полыни горькой после получения настойки. Установлено, что фракции, полученные с использованием экстрагентов различной полярности, содержат разнообразный набор биологически активных веществ, отличающихся качественным составом и количественным содержанием.

Выделены и изучены с помощью хромато-масс-спектрометрического метода анализа липофильный и водорастворимый полисахаридный комплекс (ВПСК) шрота и травы полыни горькой.

В составе липофильной фракции травы и шрота полыни горькой установлено наличие 62 и 53 соединений соответственно: жирных кислот, стеринов, спиртов, тяжелых терпеноидов.

Определены качественный состав и особенности структуры ВПСК шрота полыни горькой; ВПСК шрота содержит моносахариды циклической (пиранозной, фуранозной) и линейной структуры, органические кислоты,

уроновые кислоты.

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) установлено, что трава и шрот полыни горькой отличается качественным составом и количественным содержанием полифенольных соединений. В шроте содержится 13 из 20 содержащихся в траве полыни горькой производных 2-фенилбензо-у-пирона, бензо-а-пирона, дубильных веществ и фенолкарбоновых кислот, количественное содержание которых в шроте в 3,1 раза меньше, чем в траве.

В траве и шроте полыни горькой методом ВЭЖХ установлено наличие не менее 15 аминокислот, 9 из которых являются незаменимыми. Определен широкий набор и значительные количества микроэлементов.

На основании проведенных исследований впервые для полыни горькой предложен новый вид сырья - шрот полыни горькой.

Для выделения комплексов БАВ из шрота полыни горькой подобраны условия оптимизации процессов экстракции (природа экстрагента, степень измельчения сырья, число ступеней экстракции, временной режим экстракции, соотношение сырья и экстрагента).

Экспериментально установлено, что липофильный (комплекс А) и гидрофильный (комплекс В) комплексы, выделенные из шрота полыни горькой, при отсутствии токсичности проявляют анальгетическую, противовоспалительную, антиоксидантную, иммуномодулирующую и протективную активности.

Проведенные исследования показали перспективность применения ресурсосберегающих технологий в фармацевтической промышленности с целью создания новых лекарственных средств на основе сырья полыни горькой.

Практическая значимость работы. Научные исследования по расширению видов сырья полыни горькой проведены в рамках совместного научного сотрудничества по заказу ЗАО «Ярославская фармацевтическая фабрика».

В целях рационального и ресурсосберегающего использования сырья полыни горькой предложен новый вид сырья — шрот полыни горькой.

Выявлена перспективность использования комплексов БАВ из шрота полыни горькой для получения фитопрепаратов, обладающих различной фармакологической активностью.

Полученные результаты апробированы в ФГБУ ИМЦ ЭУАОСМП Росзд-равнадзора (курский филиал) и представлены на ЗАО «Ярославская фармацевтическая фабрика»; внедрены в учебный и научный процесс кафедр: фармакогнозии с курсом ботаники Рязанского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова, фармацевтической химии и фармакогнозии ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследователь-

ский университет», фармакогнозии и фармацевтической технологии Ярославской государственной медицинской академии.

Основные положения, выносимые на защиту. На защиту выносятся следующие положения, характеризующиеся научной новизной:

- результаты сравнительного химического анализа травы полыни горькой и шрота полыни горькой после получения настойки;

- результаты количественного определения БАВ в траве и шроте полыни горькой;

- результаты изучения некоторых видов фармакологической активности комплексов БАВ.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены на научной международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Бангкок, Паттайа (Таиланд), 2010 г.); 4-й Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование-2010» (Воронеж 2010 г.); II съезде натуротерапевтов России «Современная натуротерапия с позиции доказательной медицины» (Москва, 2011 г.); 77 Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность», проводимой в рамках «Недели медицинской науки» КГМУ (2012 г.); II Международной научно-практической конференции «Кластерные подходы фармацевтического союза: образование, наука и бизнес» (Белгород, 2012 г.), на конференции кафедры фармацевтической, токсикологической аналитической химии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 11 научных работах, в том числе 6 в рецензируемых журналах.

Личный вклад автора. Автор принимал участие в определении цели исследования и путей ее реализации, планировании и выполнении эксперимента. Автором проводились фитохимические и фармакологические виды исследования, анализ, статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Выполненная работа соответствует паспорту специальности 14.04.02 - «фармацевтическая химия, фармакогнозия» (фармацевтические науки): пункт 5 - «Изучение вопросов рационального использования ресурсов лекарственного растительного сырья с учетом влияния различных факторов на накопление биологически активных веществ в сырье» и пункт 6 - «Изучение химического состава лекарственного растительного сырья, установление строения, идентификация природных соединений, разработка методов выделения, стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на их основе».

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), собственных исследований (главы 3-4), общих выводов, списка литературы. В тексте содержится 29 таблиц, 4 рисунка. Список литературы состоит из 216 русскоязычных источников и 42 источников иностранной литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Для изучения использовали лекарственное растительное сырье - трава полыни горькой и шрот полыни горькой после получения настойки, представленное для исследования Ярославской фармацевтической фабрикой (партия № 8385/09), трава полыни обыкновенной, трава полыни эстрагон. Сбор сырья (трава) был проведен в течение 4 вегетационных периодов в окрестностях Белгородской области в июне-июле в фазу цветения растений.

Обнаружение биологически активных веществ проводили с помощью специфических качественных реакций: осаждения, окрашивания и комплексо-образования, а также физико-химическими методами.

- Для качественной и количественной оценки БАВ проводили спектрофо-тометрические исследования на спектрофотометре СФ-2000 в кюветах с толщиной слоя 10 мм с использованием ионизирующих и комплексообразующих реагентов (Литвиненко В.И., 1997; Петриченко В.М., 2002; Георгиевский В.П., 1990).

- Метод ВЭЖХ использовали для анализа качественного состава и количественного соотношения веществ спирто-водной фракции. Исследования проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы "Waters" с последующей компьютерной обработкой результатов с помощью программы «Мультихром» для "Windows" (Еремина A.B., 2004).

- Качественный состав и количественное содержание аминокислот определяли с использованием метода ВЭЖХ на автоматическом аминокислотном анализаторе Agilent 1200 Series (Лебедев A.B., 1999; Benson Y.R., 1975).

- Атомно-эмиссионная спектроскопия использовалась в анализе макро- и микроэлементного состава изучаемых видов сырья. Исследования проводили на дифракционном спектрографе ДФС-8-1.

- Определение химического состава липофильной фракции и ВПСК проводили с помощью хромато-масс-спектрометрического метода анализа на хро-мато-масс-спектрометре АТ-5850/5973 Agilent Technologies (США).

- При разработке способа получения суммы биологически активных веществ применяли модифицированный метод дробной мацерации.

- Острую токсичность определяли на здоровых животных по методике Б.М. Штабского, 1980. С этой целью мышам внутрибрюшинно вводили комплекс А в дозах от 3 мг/кг до 15 мг/кг или комплекс В в дозах от 50 мг/кг до 250 мг/кг в 0,1 мл соответствующего растворителя. Наблюдение за животными проводили в течение 24 часов. Исследование анальгетической активности комплексов А и В проводили на мышах с использованием методики «уксусных

корчей» и модели формалиновой болевой реакции (Тринус Ф.П., 1974; Гацу-раВ.В., 1974; Winstein S., 1946).

- Определение противовоспалительной активности проводили на модели острого асептического воспаления, которое воспроизводили введением в подушечку правой задней лапки 0,05 мл 3,5% раствора формалина на физиологическом растворе (Мохорт Н.А. и др., 1971). Результаты влияния комплексов А и В на тяжесть воспалительного отека оценивали через 24 часа после инъекции формалина по разнице масс воспаленных и контрольных лапок по отношению к массе животных.

- Иммунометаболическую эффективность комплексов оценивали по ан-тиоксидантной, иммуномодулирующей и протективной активностям. Антиоксидантную активность комплексов А и В определяли вначале in vitro по методике Т.В. Максимовой и др., 2000. Для оценки иммунометаболической активности комплексов in vivo опыты проводили на крысах массой 150-200 г и мышах массой 19-21 г. Модель генерализованной стафилококковой инфекции воспроизводили путем заражения животных суточной агаровой культурой Staphylococcus aureus, приготовленной на 0,9% растворе натрия хлорида. Животных инфицировали внутрибрюшинной инъекцией предварительно оттитрованных доз стафилококка, содержащих 1*108 или 2* 109 микробных тел (летальная доза) в объеме 0,1 или 0,5 мл, отдельным группам животных на фоне инфицирования внутримышечно вводили цефалексин в дозе 60 мг/кг. Для исследования использовали порошок цефалексина для приготовления инъекционного раствора, флаконы 1 г (Словакия, K.R.K.A.).

- Для оценки антиоксидантной активности комплексов in vivo определяли концентрацию малонового диальдегида (МДА) (Стальная И.Д., 1977), ацилгид-роперекисей (АГП) (Бенисевич В.И. и др., 1973), активность супероксиддисму-тазы эритроцитов (СОД) (Макаренко Е.В., 1988). Для определения влияния комплексов на развитие иммунного ответа у инфицированных стафилококком животных определяли интенсивность гуморального иммунного ответа (ГИО) по количеству антителообразующих клеток в селезенке (АОК) (Мальберг К., 1987) и выраженность гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) по раз-

нице масс подколенных лимфатических узлов (РМЛ) и разнице количества ка-риоцитов (РКЛ) (Федосеева Т.В. и др., 1993). Наблюдение за инфицированными летальной дозой мышами проводили в течение 10 дней с момента инфицирования. На протяжении этого периода определяли выживаемость мышей в процентах по отношению к контролю. Для исследования фармакологической активности комплекс А растворяли в оливковом масле, а комплекс В в воде.

- Статистическую обработку результатов проводили путем вычисления средних арифметических изучаемых показателей и их стандартных отклонений. Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюден-та и Вилкоксона-Манна-Уитни при Р<0,05 (Гублер Е.В., 1973; Гублер Е.В., 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительный фитохимический анализ травы и шрота полыни горькой после получения настойки

Для изучения качественного состава травы полыни горькой и шрота полыни горькой после получения настойки проводили извлечение и фракционирование природных соединений экстрагентами различной полярности. Качественными реакциями, методами хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента в различных системах растворителей, ВЭЖХ и хромато-масс-спектрометрии выявлены соединения различной структуры: в липофильной фракции - пигменты, жирные кислоты, стерины, спирты, тяжелые терпеноиды; в спирто-водной - производные 2-фенилбензо-у-пирона, бензо-а-пирона, дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты; в гидрофильной фракции — свободные сахара, полисахариды, органические кислоты, дубильные вещества.

Анализ липофильной фракции травы и шрота полыни горькой методом хромато-масс-спектрометрии показал наличие 62 и 53 соединений соответственно: жирных кислот, стеринов, спиртов, тяжелых терпеноидов (табл. 1).

Таблица 1

Результаты исследования состава липофилыюй фракции травы и шрота полыни горькой методом хромато-масс-спектрометрии

№

Время удерживания, мин

6,688

6,993

7,169

9,475 10,384

Вещество (кислота)

лауриновая

азелаиновая

элемицин (триметоксиаллилбензол)

миристиновая

Состав от суммы, %

Шрот

0,488

1,209

изо-пентадекановая

0,062

Трава

0,556

0.122

0.427

1,834

0,121

10,520

антеизо-пентадекановая

0,220

0,232 0,379

10,906

пентадекановая

0,497

11,218

гексагидрофарнезол-ацетон

0,517

11,802

изо-гексадекановая

0,286

0,727

0,217 1,480

10

И

12

13

14

15

16

12,053

гексадеценовая

0,722

12,337 12,459 13,314

гексадекановая

6,874

3-гидрокси-миристиновая

0,129

изо-гептадекановая

0,397

13,395

антеизо-гептадекановая

0,345

13,531

циклопропан-гептадекановая

0,243

13,687

гептадекановая

0,642

8,611

0,156

0,146

0,363

0,191

0,709 12,326

17

18

19

20

21

22

23

14,670

линолевая

6,943

14,738

олеиновая

15,023

стеариновая

15,091

2-гидрокси-пальмитиновая

15,396

октадеканол

16,922

октадекатриеновая, конъюгированная

17,031

октадекатриеновая, конъюгированная

5,980

2,664 0,074 0,289

5,846

3,931

0,103

0,196

0,169

0,277

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

17,078

октадекатриеновая, конъюгированная

17,166

н-триэйкозан

0,697

17,254

эикозеновая

17,533

эикозановая

1,559

17,824

эйкозанол

0,823

18,360

н-пентакозан

0,407

18,719

генэйкозановая

0,357

18,991

генэикозанол

19,520

н-гексакозан

2,225

19,764

3-гидрокси-эйкозановая

19,872

докозановая

2,706

20,096

докозанол

2,968

20,619 20,971

н-гептакозан

0,458

трикозановая

0,892

21,161

трикозанол

0,480

0,202 0,854

0,137

1,944

0,783

0,385

0,256

0,145

3,394

0,143 2,320

1,713

0,693

0,652

0,300

39

40

21,704

н-октакозан

3,524

21,826

тетракозеновая

4,324

0,191 1,056

41

42

43

44

21,907

2-гидрокси-докозановая

1,169

22,050

тетракозановая

4,103

22,212

тетракозанол

4,864

22,728

н-нонакозан

0,649

2,650

2,097

0,652

45 22,918 2-гидрокси-трикозановая 0,641 0,588

46 23,074 пентакозановая 0,505 0,428

47 23,203 пентакозанол 0,524 0,317

48 23,759 н-триаконтан 8,235 6,710

49 23,908 2-гидрокси-тетракозановая 3,186 1,941

50 24,077 гексакозановая 1,881 1,884

51 24,179 гексакозанол 1,497 0,773

52 24,695 н-гентриаконтан 1,018 0,612

53 24,844 2-гидрокси-пентакозановая 0,424 0,428

54 25,041 гептакозановая 0,272 0,410

55 25,664 н-дотриаконтан 7,974 4,350

56 25,773 2-гидрокси-гексакозановая 0,749 0,386

57 25,976 октакозановая 1,535 1,837

58 26,316 октакозанол 0,425 0,812

59 27,665 эргостенол 0,972 0,640

60 27,991 стигмастерол 2,827 3,219

61 28,689 ситостерол 8,875 8,315

62 29,463 ланостадиенол 1,998 2,340

сумма 100 100

Таким образом, химический состав липофильной фракции шрота полыни горькой представлен широким спектром биологически активных соединений, определяющим актуальность дальнейшего изучения их фармакологической активности.

Следующим этапом исследования было проведение сравнительного анализа полифенольных соединений травы и шрота полыни горькой методом ВЭЖХ.

Установлено, что спирто-водная фракция изучаемых видов сырья содержит от 13 (шрот) до 20 (трава) веществ: флавоноидных соединений, кумаринов, фенолкарбоновых кислот (табл. 2, 3).

Таблица 2

Результаты исследования фенольных соединений методом ВЭЖХ

№ Время удерживания, сек Количественное соотношение, % Наименование вещества

1 176,46 4,80 танин

2 189,24 12,26 галловая кислота

3 217,08 1,96 невдентифиц.

4 228,30 3,60 неидентифиц.

5 244,20 7,63 эпигаллокатехин галлат

6 307,80 17,20 хлорогеновая кислота

7 399,78 6,24 кофейная кислота

8 479,10 6,32 феруловая кислота

9 536,52 1,82 дигидрокумарин

10 572,94 3,08 неохлорогеновая кислота

11 680,40 4,60 эпикатехин

12 882,60 6,18 гесперидин

13 961,20 4,12 гиперозид

14 1084,20 2,59 рутин

15 1217,40 1,95 неидентифи ц.

16 1417,80 5,57 коричная кислота

17 1840,20 4,73 3-метоксикумарин

18 2103,60 0,97 неидентифиц.

19 2430,60 2,04 катехин

20 2707,20 2,36 неидентифиц.

Таблица 3

Результаты исследования фенольных соединений методом ВЭЖХ _1_в шроте полыни горькой_

№ Время удерживания, сек Количественное соотношение, % Наименование вещества

1 190,80 22,54 галловая кислота

2 202,90 30,11 неидентифиц.

3 310,50 10,12 хлорогеновая кислота

4 384,20 4,90 кофейная кислота

5 424,50 3,42 неидентифиц.

6 475,90 6,51 феруловая кислота

7 579,60 10,87 неохлорогеновая кислота

8 887,10 3,45 гесперидин

9 1076,00 2,42 рутин

10 1245,00 1,70 неидентифиц.

И 1366,00 0,87 неидентифиц.

12 1403,00 2,64 коричная кислота

13 1813,00 0,45 3-метоксикумарин

В траве полыни горькой установлено наличие отсутствующих или находящихся в минимальных количествах в шроте танина, эпигаллокатехина галла-та, эпикатехина, катехина, дигидрокумарина и гиперозида. В шроте и траве полыни горькой из фенолкарбоновых кислот преобладают галловая й хлорогеновая, а из флавоноидов - гесперидин и рутин.

Проанализировав в сравнении состав и количественное содержание флавоноидов спирто-водной фракции шрота полыни горькой и травы полыни горькой, можно сделать вывод, о достаточном извлечении флавоноидных соединений из травы полыни горькой при производстве из нее настойки. Следователь-

но, дальнейшее изучение шрота при разработке комплексного использования сырья, является актуальной задачей для других классов биологически активных соединений.

Гидрофильную фракцию изучали на присутствие веществ первичного обмена (моно- и полисахаридов, аминокислот).

Хромато-масс-спектрометрическим методом определен качественный состав водорастворимого полисахаридного комплекса шрота полыни (табл. 4).

Таблица 4

Результаты исследования состава ВРПС шрота полыни горькой методом _хромато-масс-спектрометрни_

№

10

Время удерживания, мин

5,913

8,050

8,124

8,314

8,586

8,911

8,986

9,338

9,508

9,596

10,037

Вещество

лимонная кислота

арабинопираноза

ликсопираноза

изолимонная кислота

арабинопираноза

рибоза

Состав от суммы, %

арабинопираноза

дезоксиманноза

ликсопираноза

маннопираноза

маннофураноза

38,024

0,546

2,282

8,187

2,855

1,034

1,252

4,834

0,726

0,823

0,969

12

13

14

15

16

17

19

20

21

10,315

10,491

10,864

11,828

11,970

12,357

12,560

12,648

12,804

13,143

арабинопираноза

галактопираноза

альтроза

глюко-пиракуроновая кислота

альтроза (линейный изомер)

глюкопираноза

глюкопираноза

галактуроновая кислота

глюкуроновая кислота

глюкоза (линейный изомер)

сумма

0,729

2,116

4,414

6,685

5,551

5,188

0,955

6,547

5,081

1,203 100,00

Установлено, что полисахаридный комплекс шрота полыни горькой имеет сложную структуру и состав полимерной цепи, содержащей моносахариды циклической (пиранозной и фуранозной) и линейной структуры, уроновые кислоты (не менее 21 вещества).

Биологическую роль аминокислот, микро- и макроэлементов трудно переоценить. Они участвуют в различных биохимических процессах, стимулируют и нормализуют обмен веществ. Многие аминокислоты и микроэлементы выполняют строго определенные функции, являясь своеобразными катализаторами биохимического процесса в организме человека и животных, обладают иммуномодулирующими свойствами и оказывают гиполипидимическое действие. Методом ВЭЖХ проведено исследование аминокислотного состава травы и шрота полыни горькой. Установлено наличие как заменимых, так и незаменимых аминокислот (табл. 5).

Таблица 5

Содержание аминокислот в сырье полыни_

№ Наименование аминокислоты Содержание аминокислот, %

Трава полыни горькой Шрот травы полыни горькой Трава полыни обыкновенной Трава полыни эстрагон

1 треонин* 0,37 0,36 0,42 0,40

2 аспарагиновая кислота 0,30 0,28 0,40 0,39

3 серии 0,28 0,27 0,31 0,30

4 глутаминовая кислота 0,58 0,52 0,54 0,53

5 глицин 0,23 0,18 0,24 0,26

6 аланин 0,20 0,17 0,30 0,28

7 валин* 0,06 0,04 0,22 0,24

8 метионин* 0,04 0,03 0,01 0,05

9 изолейцин* 0,07 0,06 0,10 0,12

10 лейцин* 0,34 0,29 0,44 0,45

11 тирозин 0,25 0,24 0,21 0,19

12 фенил аланин* 0,45 0,43 0,46 0,48

13 гистидин* 0,34 0,33 0,37 0,36

14 лизин* 0,31 0,26 0,31 0,32

15 аргинин* 0,34 0,31 0,43 0,45

сумма аминокислот 4,16 3,77 4,76 4,82

* - незаменимые аминокислоты

Полуколичественным спектральным методом анализа (испарения) на дифракционном спектрографе ДФС-8-1 в изучаемых видах сырья обнаружены макро- (К, Са, Р, №) и микроэлементы (Бе, А1, М§, Б!, Си, Ъх\, РЬ, Ад, Мо, Ва, Бг, В, Мп, N4, Т1, V, Сг, 7л, ва, Ве), 10 из которых относятся к эссенциальным (К, Ыа, Са, М§, Р, Ре, Си, Тп, Мо, Мп). Исследуемые объекты содержат значительные количества макроэлементов, в особенности фосфора, калия и кальция. Среди микроэлементов преобладают: железо, магний, алюминий, кремний, марганец; в меньшей степени: медь, цинк, барий, стронций, бор, титан.

Для выявления и расширения перспективных видов рода Полынь проведен сравнительный фитохимический анализ травы полыни обыкновенной и полыни эстрагон произрастающих в Центрально-Черноземном регионе.

Проведенные исследования показали, что растения рода Полынь подобны по химическому составу биологически активных веществ, но отличаются содержанием отдельных компонентов и могут быть использованы как перспективные источники для получения фитопрепаратов (табл. 6).

Таблица 6

Количественное содержание БАВ в сырье полыни (М±м)_

Группа БАВ Количественное содержание

Трава полыни горькой Шрот полыни горькой Трава полыни обыкновенной Трава полыни эстрагон

каротиноиды, мг/100 г 4,74±0,24 3,27±0,15 4,14±0,31 4,88±0,18

хлорофиллы, мг/100 г 11,93±0,92 8,07±0,76 9,86±0,87 12,04±0,85

флавоноиды, % 0,44±0,04 0,14±0,02 0,52±0,04 0,91±0,07

органические кислоты, % 0,76±0,06 0,12±0,02 0,68±0,05 0,40±0,03

аскорбиновая кислота, % 0,22±0,01 0,09±0,01 0,18±0,01 0,16±0,01

дубильные вещества, % 10,50±0,93 7,50±0,63 8,00±0,71 3,00±0,24

аминокислоты,% 4,1б±0,32 3,77±0,21 4,78±0,16 4,82±0,13

полисахариды (водорастворимые), % - 3,40±0,28 3,42±0,24 4,59±0,37

пектиновые вещества, % - 3,84±0,21 5,60±0,46 6,53±0,50

Изучение фармакологической активности биологически активных комплексов шрота полыни горькой

Для изучения фармакологической активности сырья методом дробной мацерации с использованием экстрагентов различной полярности были получены комплексы БАВ. Установлено, что оптимальными условиями для получения липофильного комплекса являются: экстрагент - смесь ацетон-гексан (1:1), время экстракции - 24 часа, число ступеней экстракции - 3, гидромодуль - 1:15; гидрофильного комплекса - экстракция водой очищенной в течение 2 часов при соотношении твердой и жидкой фаз 1:20.

Исследование острой токсичности показало, что липофильный и гидрофильный комплексы в дозах от 3 мг/кг до 15 мг/кг и от 50 мг/кг до 250 мг/кг не вызывают гибели опытных животных, и поэтому они могут быть отнесены к классу «малоопасные вещества».

При изучении анальгетической активности комплексов БАВ установлено, что они обладают достоверной активностью в отношении центрального компонента формирования боли и снижают чувствительность болевых рецепторов к действию медиаторов воспаления, что коррелирует с их активностью при кининовой болевой реакции.

Одним из определяющих показателей эффективности фармакологического средства является его влияние на иммунометаболические процессы, нарушенные при различных видах стресса, и в частности при стафилококковой инфекции.

Установлено, что инфицирование стафилококком усиливало свободно-радикальные процессы и снижало иммунологическую реактивность организма на эритроциты барана. Инъекции цефалексина усиливали указанные процессы. Введение животным, инфицированным стафилококком и получавшим цефалек-син, комплексов А и В снижало интенсивность окислительных процессов и стимулировало иммунологическую реактивность (табл. 7).

Таблица 7

Иммунометаболическая активность комплексов А и В у животных _при введении стафилококка (М±м)__

Условия опыта сод, ЕД/мл эритроцитов МДА, мкмоль/л АОК, 103/орган РМЛ, мг

1. Контроль 57,2±5,1 38,1±3,2 28,4±2,7 5,1 ±0,5

2. Введение стафилококка 35,1±4,2"' 63,1±5,4"' 14,2±1,5'' 3,1±0,3"'

3. Введение стафилококка и це-фалексина 27,2±2,8*2 76,4±6,1*2 10,8±1,3'2 2,6±0,2-2

4. Введение стафилококка, це-фалексина и комплекса А 52,1±6,4-3 44,8±5,1*3 27,8±2,7*3 4,1±0,5*3

5. Введение стафилококка, це-фалексина и комплекса В 53,2±5,9"3 45,1±5,2*3 30,1±3,Г3 4,0±0,б'3

Оценка протективной активности комплексов А и В показала, что в группах мышей, инфицированных летальной дозой стафилококка, к 10 дню погибло 100% животных, в группе животных, получавших комплекс А, - 45%, а в группе мышей, получавших комплекс В, - 35%.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что липофильный и гидрофильный комплексы, выделенные из шрота полыни горькой, проявляют анальгетическую, противовоспалительную, антиоксидантную, иммуностимулирующую и протективную активности.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный химический анализ различных фракций травы и шрота полыни горькой после получения настойки показал наличие широкого спектра биологически активных веществ, отличающихся по качественному составу и количественному содержанию отдельных компонентов.

2. Хромато-масс-спектрометрическим методом анализа в составе липофильной фракции травы и шрота полыни горькой установлено наличие 62 и 53 соединений соответственно: жирных кислот, стеринов, спиртов, алканов, тяжелых

терпеноидов, хлорофиллов, а-, р- и у-каротиноидов. Содержание кароти-ноидов в траве' и шроте полыни горькой составило 4,74±0,24 и 3,27± 0,15 мг/100 г, содержание хлорофиллов - 11,93±0,92 и 8,07±0,76 мг/100 г соответственно.

3. На основании анализа полифенольных соединений травы и шрота полыни горькой методом ВЭЖХ установлено, что спирто-водная фракция изучаемых видов сырья содержит от 13 (шрот) до 20 (трава) веществ (производных 2-фенилбензо-у-пирона, бензо-а-пирона, дубильных веществ и фенолкарбо-новых кислот). По данным спектрофотометрического анализа количественное содержание суммы флавоноидов в сырье в пересчете на рутин составило 0,44±0,04% н 0,14±0,02% для травы и шрота полыни горькой соответственно.

4. Хромато-масс-спектрометрическим методом определен химический состав ВПСК шрота полыни горькой и установлено, что полисахаридный комплекс шрота имеет сложную структуру и состав полимерной цепи, содержащей не только моносахариды циклической (пиранозной и фуранозной) и линейной структуры, уроновые кислоты, но и органические кислоты (не менее 21 вещества). Выход ВПСК шрота - 3,40±0,28%.

5. Методом ВЭЖХ установлено наличие в траве и шроте полыни горькой не менее 15 аминокислот, 9 из которых являются незаменимыми - треонин, ва-лин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, аргинин, гистидин.

6. Атомно-эмиссионным методом анализа в траве и шроте полыни горькой обнаружены макро- (К, Са, Р, №) и микроэлементы (Ре, А1, М§, 51, Си, Хп, РЬ, Ag, Мо, Ва, Бг, В, Мп, "Л, V, Сг, Ъх, йа, Ве), 10 из которых относятся к эс-сенциальным (К, Ыа, Са, М§, Р, Ре, Си, Хп, Мо, Мп).

7. Скрининговые фармакологические исследования показали, что липофиль-ный и гидрофильный комплексы, выделенные из шрота полыни горькой, проявляют анальгетическую, противовоспалительную, антиоксидантную, иммуностимулирующую и протективную активности.

Список публикаций по теме диссертации

1. Северин, А.П. Растения рода полынь - источники получения полиенов / А.П. Северин, Л.Е. Сипливая, В.Я. Яцюк // Материалы 4-й Всерос. с меж-дунар. участием науч.-метод. конф. «Фармобразование 2010» (20-22 апр. 2010 г., Воронеж). - Воронеж: ВГУ, 2010. - С. 338-339.

2. Северин, А.П. Перспективы использования полыни обыкновенной для получения фитопрепаратов / А.П. Северин, Л.Е. Сипливая, В.Я. Яцюк // Материалы междунар. науч. конф. «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (20-28 февраля 2010 г., Бангкок, Па-тайа (Таиланд)) // Современные наукоемкие технологии. - 2010. - № 2. -С. 113-114.

3. Северин, А.П. Изучение химического состава водных извлечений растения рода ARTEMISIA L. / А.П. Северин, Л.Е. Сипливая, В.Я. Яцюк // Междунар. журн. прикладных и фундаментальных исследований - 2011. -№ 3. - С. 144.

4. Северин, А.П. Изучение полисахаридного комплекса Artemisia vulgaris L. Artemisia dracunculus L. / А.П. Северин, Л.Е. Сипливая // «Современная натуротерапия с позиций доказательной медицины». II съезд натуротера-певтов России (19-20 апреля 2011 г., Москва). : сб. науч. тр. - М., 2011. -С. 28-29.

5. Северин, А.П. О комплексном использовании сырья полыни горькой (Artemisia absinthium L.) для получения фитопрепаратов / А.П. Северин, Л.Е. Сипливая, В.Я. Яцюк // Науч. ведомости» Белгородского гос. унив. (НИУ «БелГУ»). -2011. - № 4(99), вып. 13/2. - С. 134-137.

6. Ботов, A.IO. Элементный состав некоторых растений семейства As-teraceae / А.Ю. Ботов, А.П. Северин, В.Я. Яцюк, Л.Е Сипливая // Науч. ведомости» Белгород, гос. унив. (НИУ «БелГУ»), - 2011. - № 22 (117), вып. 16/2.-С. 159-160.

7. Изучение химического состава липофилыюй фракции некоторых видов семейства Asteraceae / А.П. Северин, В.Я. Яцюк,

Г.В. Сиплнвый, Л.Е. Сипливая, АЛО. Ботов // Современные проблемы науки и образования [Электронный ресурс] : электрон, науч. журн. - 2012. -№ 2.- URL: www.science-education.ru/102-5807.

8. Северин, А.П. Изучение фенольных соединений травы н шрота полыни горькой / А.П. Северин, Л.Е. Сипливая, В.Я. Яцюк // Традиционная медицина. - 2012. - № 1(28). - С. 39-41.

9. Северин, А.П. Иммунометаболическая эффективность комплексов шрота полыни горькой (Artemisia absinthium L.) при стафилококковой инфекции / А.П. Северин, Л.Е. Сипливая, В.Я. Яцюк // Науч. ведомости» Белгород, гос. унив. (НИУ «БелГУ»). - 2012. - № 22(141), Вып. 20/1.-С. 121-123.

10. Северин, А.П. Полынь горькая (Artemisia absinthium L.) как источник получения фитопрепаратов / А.П. Северин, Л.Е. Сипливая, В.Я. Яцюк // «Кластерные подходы фармацевтического союза: образование, наука и бизнес» : сб. материалов II междунар. науч.-практ. конф. (26 апр. 2012 г.; г. Белгород). - Белгород, 2012. - С. 175.

11. Исследование углеводного состава некоторых растений семейства Asteraceae / А.Ю. Ботов, А.П. Северин, В.Я. Яцюк, Л.Е. Сипливая // Росс. мед.-биолог. вест. им. академика И.П. Павлова. - 2012. - № 4. -С. 142-145.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 4.02.2013 г. Подписано в печать 6.02.2013 г. Формат 30x42Vg Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 231 "А". Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.