Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунобиологические свойства рекомбинантного протимозина альфа человека

ДИССЕРТАЦИЯ
Иммунобиологические свойства рекомбинантного протимозина альфа человека - диссертация, тема по медицине
Ходякова, Анна Вячеславовна Москва 2000 г.
Ученая степень
кандидата биологических наук
ВАК РФ
14.00.36
 
 

Оглавление диссертации Ходякова, Анна Вячеславовна :: 2000 :: Москва

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Современные представления о структуре и иммунобиологических свойствах РгоТа--------------------—.

2.1. История открытия.

2.2. Первичная структура.

2.3. Гены РгоТа человека

2.4.Физико-химические свойства.

2.5. Эволюционная консервативность

2.6. Локализация в организме млекопитающих

2.7. РгоТа как фосфопротеин —.—.

2.8. Взаимодействие с гистоном Н1

2.9. Стимуляция фосфорилирования фактора элонгации 2 (ЕР-2)

2.10. Регуляция роста и пролиферации клеток.

2.11. Ген РгоТа как мишень для онкобелков . .-.

2.12. Рецепция РгоТа эффекторными клетками---------------—.

2.13. Иммунорегуляторные свойства

2.14. Роль РгоТа в развитии вирусных инфекций

2.15. Роль РгоТа в развитии бактериальных инфекций

2.16. Использование РгоТа для иммунокоррекции

2.17. Общая постановка задачи -.-.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ - -.- -

3.1. Реагенты и лабораторные животные

3.2. Методы учета иммунокомпетентных клеток

3.3. Получение эмбриональных тимоцитов человека

3.4. Выделение иммунокомпетентных клеток

3.5. Реакция бластной трансформации

3.6. Определение продукции 1Ь-2

3.7. Определение экспрессии рецепторов к 1Ь-2.-.-.-

3.8. Определение поверхностных маркеров на костномозговых предшественниках

Т-лимфоцитов

3.9. Реакция смешанной культуры лимфоцитов (MLC) —

3.10. Определение антителообразующих клеток.

3.11. Радиолигандный анализ взаимодействия rHuProTa -рецептор.

3.12. Определение противоопухолевой активности in vivo.

3.13. Оценка влияния на апоптоз.-.-.

3.14. Определение активности натуральных киллерных клеток (NK) и лимфокинактивированных киллеров (LAK).

3.15. Определение противовирусной активности —.

3.16. Оценка нейротропных свойств rHuProTa.

3.17. Испытание rHuProTa на острую токсичность.

3.18. Статистическая обработка результатов -.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.- - -.

4.1.Влияние rHuProTa на созревание и дифференцировку тимических и костномозговых предшественников Т-лимфоцитов.—.

4.2. Влияние rHuProTa на восстановление Т-клеточного иммунитета

4.3. Противовирусная активность rHuProTa.-.

4.4. Специфическое взаимодействие rHuProTa с рецепторами эпителиальных клеток тимуса (ТЭК)--------------------------.-.

4.5. Участие rHuProTa в регуляции апоптоза тимоцитов.

4.6. Действие rHuProTa на поведенческие реакции экспериментальных животных

4.7. Испытание rHuProTa на острую токсичность.-.—

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.- -.

 
 

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Ходякова, Анна Вячеславовна, автореферат

Одним из актуальных вопросов современной биологии и медицины является проблема профилактики и лечения иммунодефицитных состояний, как врожденных, так и вызываемых стрессом, отрицательным воздействием на организм экологических кризисов, бактериями, вирусами. Иммунная система особенно чувствительна к воздействию вышеперечисленных факторов.

По данным здравоохранения России в иммунокорригирующей терапии нуждаются в среднем по стране 30%, а в отдельных регионах с высокой концентрацией химической и металлургической промышленности — до 50% населения [Лопухин Ю.М. и др., 1997].

Исследования по разработке методов иммунокоррекции были начаты в середине 60-х годов. Первые эксперименты изучали заместительную терапию путем пересадки тимуса или, позже, комплекса тимус-грудина. Пересадка неонатального комплекса тимус-грудина больным с первичным или вторичным иммунодефицитом приводила к значительному улучшению иммунного статуса. Однако, эффективность хирургического метода лечения была непродолжительной из-за отторжения трансплантата. Клинический опыт трансплантации иммунокомпетентных органов указал на необходимость получения препаратов, замещающих функцию центральных органов иммунной системы.

Познее было показано, что многие заболевания человека протекают на фоне сниженной функции одного из центральных органов иммунитета — тимуса. Экспериментальные и клинические исследования привели к пониманию того, что вилочковая железа, синтезируя ряд иммунореактивных белков и пептидов, обеспечивает продукцию полноценных Т-лимфоцитов [Ярилин A.A. 1996, 1999].

Из тимуса получено несколько иммунотропных препаратов, которые в настоящее время разрешены к клиническому применению. Одним из них является Т-активин, содержащий комплекс пептидов из тимуса теленка [Arion V.Ya. 1989]. Неконтролируемый состав входящих в Т-активин пептидов создает проблемы при стандартизации препарата. Используется в клинике также синтетический аналог ai-тимозина, одного из компонентов Т-активина (Tal) [Hadden J.V. 1993; Bepler G. 1993].

Преимущество синтетического Tal - известный химический состав, а также контролируемая гомогенность и чистота. Однако, технология твердофазного синтеза пептида, состоящего из 28 аминокислотных остатков не рентабельна и не может обеспечить потребности здравоохранения. С другой стороны, трудности применения технологии рекомбинантных DNA для получения этого пептида связаны с необходимостью конструирования слитных белков с последующим протеолитическим расщеплением. Что приводит к потере рентабильности и технологии получения штаммов-продуцентов для препарата Tal.

Открытие протимозина a (ProTa) как предшественника Tal, создало перспективы разработки новых природных и рекомбинантных лекарственных препаратов для иммунокоррекции [Haritos A.A. et al., 1984].

За рубежом предпринимаются попытки применения РгоТа, выделенного из тимуса теленка для лечения иммунодефицитных состояний и злокачественных новообразований [Garbin F. et al., 1995; Eckert К. et al., 1994; 1995; Segade F. et al, 1999].

В Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова под руководством д.б.н. Вартапетяна А.Б. впервые были сконструированы рекомбинантные штаммы Е.соН - продуценты РгоТа человека [Evstafieva A. et al., 1995] и переданы в ОАО "Институт инженерной иммунологии" РАО Биопрепарат МЗ для разработки технологии получения рекомбинантного белка — rHuProTa. Иммунобиологические свойства rHuProTa ранее не исследовались, что и определило направленность данной работы.

Цель работы.

Изучить иммунобиологические свойства rHuProTa и возможности его практического применения.

Задачи.

• Изучить влияние rHuProTa на созревание и дифференцировку предшественников Т-лимфоцитов в системах in vitro и in vivo.

• Определить наличие противоопухолевой и противовирусной активности rHuProTa.

• Выяснить возможность участия РгоТа в регуляции апоптоза тимоцитов, индуцированного дексаметазоном.

• Оценить нейро-психотропное действие РгоТа.

• Провести испытание rHuProTa на острую токсичность.

Научная новизна результатов исследований.

• Показано, что rHuProTa является фактором созревания и дифференцировки Т-лимфоцитов из их предшественников.

• Показана иммунорегуляторная роль РгоТа на уровне эмбриональных тимоцитов человека.

• Показана эффективность использования rHuProTa для восстановления Т-клеточного иммунитета.

• Получены экспериментальные данные о противовирусной активности rHuProTa.

• Получены данные, свидетельствующие об участии РгоТа в регуляции апопотоза тимоцитов, индуцированного дексаметазоном.

• Показано участие РгоТа в обеспечении взаимодействия между иммунной и нейро-эндокринной системами.

Теоретическая значимость результатов исследований.

Обнаружение участия РгоТа в обеспечении взаимодействия между иммунной, нервной и эндокринной системами открывает новые перспективы в изучении механизмов гомеостаза в организме.

Практическая значимость результатов исследований.

Результаты наших исследований свидетельствуют о возможности применения гНиРгоТа при разработке новых эффективных препаратов для иммунокоррекции первичных и вторичных иммунодефицитных состояний. Такие препараты в дальнейшем могут быть использованы в онкологической практике для проведения регенерирующей терапии после лучевых и химиотерапевтических воздействий, профилактики метастазов после хирургического удаления опухоли, для экстракорпоральной терапии злокачественных новообразований с целью активации ТЧК и ЬАК-клеток, стимуляции процессов созревания дендритных клеток и формирования специфического противоопухолевого иммунитета. гНиРгоТа может быть использован для получения новых ноопсихотропных препаратов, повышающих адаптационные возможности организма в стрессовых ситуациях.

Положения, выносимые на защиту:

1. гНиРгоТа стимулирует созревание и дифференцировку Т-лимфоцитов из их предшественников и восстановление Т-клеточного звена иммунитета.

2. гНиРгоТа принимает участие в регуляции апоптоза тимоцитов, индуцированного дексаметазоном.

3. гНиРгоТа обладает противовирусной активностью;

4. гНиРгоТа проявляет нейро-психотропные свойства, повышая возможности адаптации организма в стрессовых ситуациях.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Иммунобиологические свойства рекомбинантного протимозина альфа человека"

6. Выводы.

1. rHuProTa стимулирует созревание Т-клеток из их предшественников в системах in vitro и in vivo.

2. rHuProTa обладает противовирусной активностью.

3. rHuProTa может препятствовать развитию апоптоза тимоцитов, индуцированного дексаметазоном.

4. rHuProTa проявляет нейро-психотропные свойства, регулируя адаптацию организма к стрессовым воздействиям.

5. rHuProTa не обладает острой токсичностью и может быть рекомендован для доклинических исследований.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2000 года, Ходякова, Анна Вячеславовна

1. Абрамов В.М., Василенко (Ходякова) A.B., Евстафьева А.Г. Сравнительное исследование некоторых иммунорегуляторных свойств рекомбинантного и природного препаратов протимозина а // Тез.докл. 1-го Съезда иммунологов России.- Новосибирск,-1992.-с.4.

2. Ашмарин И.П., Антипенко А.Е., Ашапкин В.В. и др. Нейрохимия // Изд-во Инта биомед.хим.РАМН.-1996.-с.469.

3. Буреш Я., Буренова Т.Л., Хьюсток Д.П. Методы и основные эксперименты по изучению мозга и поведения // М.-1991.

4. Галактионов В.Г. Иммунология // Изд-во МГУ, М.-1998.-479с.

5. Гацура В.В. Методы первичного фармакологического исследования биологически активных веществ // М.,Мед.-с. 143-158.

6. Гриневич Ю.А. Взаимосвязи нарушений в эндокринной и иммунной системах больных злокачественной меланомой // Экспериментальная онкология.-1987,-т.10.-№3.-с.51-54.

7. Гублер Е.В., Генкин A.A. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Критерий AU // 1973.

8. Долгих Д.А., Ходякова A.B., Мезенцева М.В. и др. Экспериментальное обоснование применения протимозина а, пептоферона а и альбеферона в качестве индукторов интерферонов // Межд. журн. по иммунореабилитации.-1999.-№11.-С.-22 .

9. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. Статистическая обработка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах по программам // М. «Медицина»,-1990.-С.29-52

10. Козловская Л.В., Николаев А.Ю. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования (под ред. Академика АМН СССР Е.М. Тареева) Москва «Медицина».-1984.-с.30-31.

11. Корнева Е.А., Шхинек Э.К., Фролов Б.А. и др. Нейроэндокринные механизмы регуляции функций иммунной системы // Иммунофизиология (под ред.Е.А.Корневой) (СПб.:Наука).-1993.-с.684.

12. Кузнецов В.П., Беляев Д.Л., Бабаянц A.A. и др. Препараты интерферона в комплексной терапии бактериальных инфекций // Антибиотики и химеотерапия1989.-№9.-с.691-695.

13. Лазарев H.B. Актуальные вопросы изучения действия адаптогенов, в том числе препаратов элеутерококка колючего // Материалы симпозиума по элеутероккоку и женьшеню (Владивосток)-1962.-с.7-10.

14. Лопухин Ю.М., Арион В.Я. Иммунодефицита, иммунокоррекция // Материалы конф.: „Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии".-1997.-с.113-119.

15. Мезенцева М.В. Биологическая активность новых отечественных индукторов интерферона при экспериментальной гриппозной инфекции // канд.дисс.-1993.-152с.

16. Методические рекомендации по доклиническим испытаниям новых лекарственных препаратов. Изд-во "Фармавит", Санкт-Петербург.-1998.-157с.

17. Остерман Л.А. Тонкослойная хроматография // Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Бюл.эксп.биол.мед.-1976.-т.82.-№8.-с.953-956.

18. Птицын Л.Р., Смиров C.B., Альтман И.Б., Самсонова Н., Ходякова A.B., Василенко Р.Н. Продукция рекомбинантного hIL-452 природной изоформы интерлейкина-4 человека, в клетках Escherichia coli // Биоорган, хим.-1999.-т.25.-№8.-С.623-629.

19. Тесенков В. Реакция бласт-трансформации лимфоцитов селезенки под влиянием антигена in vitro II Иммунологические методы, под ред.Х.Фримеля / М.Мир.-1979.-с.80-92.

20. Ярилин A.A. Иммунологические нарушения у пострадавших от последствий Чернобыльской аварии и анализ их природы // В кн. „Последствия Чернобыльской катастрофы: здоровье человека". Под ред. Е.Б.Бурлаковой,М.-1996.-с.68-95.

21. Ярилин A.A., Беляков И.М. Тимус как орган эндокринной системы // Иммунология-1996.-№1.-с.4-10.

22. Ярилин A.A. Коррекция эндогенной выработки гормонов тимуса. Обоснование нового подхода к иммуномодуляции и иммунореабилитации // Межд.журн. по иммунореабилит.-1998.-№3.-с.8-18.

23. Ярилин А.А. Основы иммунологии // Изд-во Медицина, М.-1999.-599с.

24. Adler W.H., Takiguchi Т., Marsh В., Smith R.T. Cellular recognition by mouse lymphocytes in vitro. I: Definition of a new technique and results of stimulation by phytohaemagglutinin and specific antigens // J.Exp.Med.-1970.-vol.131.-№11.-p.1049-1078.

25. Aliverti A., Galaris D., Tsolas O. Superoxide anion generation by human peripheral blood mononuclear cells in response to prothymosin alpha // Arch. Biochem. Biophys.-1995.-vol.321.-p.108.-114.

26. Alvarez C.V., Zalvide J.В., Cancio E. et al. Regulation of prothymosin alpha mRNA levels in rat pituitary tumor cells // Neuroendocrinol.-1993.-vol.57.-p.1048-1056.

27. Arion V.Ya. Thymic peptides as immunoregulators, with special reference to T-activin // Soviet Medical Reviews are published by Yarwood Academic Publishers.-1989.-p.65.

28. Anderson K.L., Anderson G., Michell R.H et al. Intracellular signaling pathways involved in the induction of apoptosis in immature thymic T lymphocytes // J.Immunol.-1986.-vol.3(12).-p.4081-4091.

29. Arnheiter H., Thomas R., Leist T. et al. Physicochemical and antigenic properties of synthetic fragments of human leukocyte interferon //Nature.-1981.- v.294.-p.278-280.

30. Auger C., Stahli C., Fabien N. et al. Intracellular localization of thymosin alpha 1 by immunoelectron microscopy using a monoclonal antibody // J.Histochem.Cytochem.-1987.-vol.35.-p.l81-187.

31. Banchereau J. & Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity // Nature.- 1998.-vol.392.-№19.-p.245-252.

32. Barasoain I., Portoles A., Arambury J. et al. Antibodies against a peptiderepresentative of a conserved region of human IFN-a. Differential effects on the antiviral and antiproliferative affects of IFN // J.Immunol. -1989.-vol.143.-№2.-p.507-512.

33. Barcia M.G., Castro J.M., Jullien C.D., Frieire M. Prothymosin alpha is phosphorylated in proliferating stimulated cells // J.Biol.Chem.-1993.-vol.268.-p.4704-4708.

34. Barisone G.A., Vega F.V., Dominguez F., Cabada M.O. Detection of prothymosin alpha in oocytes and embryos of Bufo arenarum // Zygote.- 1998.-№6.-vol.-4.-p.-347-350.

35. Baterman A., Sigh A., Krai Th. Solomon S. The immune-hypothalamic-pituitry-adrenal axis // Endocr. Revs.-1989.-vol.l0.-№l.-p.92-l 12.

36. Baxevanis C.N. The biological effect of three thymosin fraction 5 polypeptides in the murine mixed lymphocyte reaction // Immunology-1987b.-vol.54.-№4.-p.728-730.

37. Baxevanis C.N., Anastasopoulos E., Reclos G.T., Papamichail M. Prothymosin-a enhances HLA-DR antigen expression on monocytes from patients with multiple sclerosis // J.of Neuroimmunol.-1990.-vol.27.-p.l41-147.

38. Baxevanis C.N. Thanos D., Reclos G.J. et al. Prothymosin alpha enhances human and murine MHC class II surface antigen expression and messenger RNA accumulation // J.Immunol.-1992.-vol. 148.-p. 1979-1984.

39. Baxevanis C.N., Gritzapis A.D., Dedoussis G.V.Z. et al. Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha // J.Cancer Immunol. Immunother.-1994.-vol.38.-p.281 -286.

40. Baxevanis C.N., Gritzapis A.D., Spanakos G. et al. Induction on tumor-specific T lymphocyte responses in vivo by prothymosin a II Cane.Immunol.Immunopath.-1995.-p.410-418.

41. Ben-Yosef T., Yanuka O., Halle D. et al. Involvment of Myc target in c-myc and N-myc induced human tumors // Oncogene.-1998.-№17.-vol.-2.-p.-165-171.

42. Bennet P., Yamamura H.I. Neurotransmitter, hormone, or drug receptor binding methods // Ed.byH.I.Yamamura et al.-Raven Press, New-York-London.-1985.-p.62-89.

43. Bepler G. Thymosin alpha-1 as adjunct for conventional therapy of malignant tumors: a review // Cancer Invest.-1994,-vol. 12(5).-p.491 -496.

44. Besedovsky H.O., Del Rey A., Klusman I. et al. Cytokines as modulators of thehypothalamuspituitary-adrenal axis // J.Steroid.Biochem.Molec.Biol.-1991.-vol.40.-№4-6.-p.613-618.

45. Blalock J.E. A molecular basis for bi-directional communication between the immune and neuroendocrine system // Physiol.Rev.-1989.-vol.69.-№1.-p. 1-32.

46. Broome H.E., Dargan C.M., Krajski S. et al. Expression of Bcl-2, Bcl-x and Bax after T cell activation and IL-2 withdrawal // J.Immunol.-1995.-vol.l55.-p.2311-2317.

47. Bustelo X.R., Otero A., Gomez-Marquez J., Freire M. Expression of the rat prothymosin a gene during T-lymphocyte proliferation and liver regeneration // J.Biol.Chem.-1991.-vol.266.-p. 1443-1447.

48. Calvo J.R., Guerrero J.M., Goberna R. Interaction of thymic peptide thymosin alpha 1 with PHI and secretin // Gen.Pharmacol.-1989.-vol.20.-p.503-505.

49. Chakir J., Rouabhia M. & Deschaux P. In vitro effect of methionine-enkephalin and thymosin on murine expression of Thyl-2 antigen // Immunopharmacol.-1989.-vol.l7.-p.31-35.

50. Chenge E.H. Levine b., Boise L.M. et al. Bax- independent inhibition by Bc1-xl // Nature.-1996.-vol.375.-p. 554-556.

51. Clinton M., Graeve L., El-Dorry H. et al. Evidence for nuclear targeting of prothymosin a and parathymosin synthesized in situ II Proc.Natl.Acad.Sci.USA-1991,-vol.88.-p.6608-6612.

52. Conteas C.N., Mutchnick M.G., Palmer K.C. et al. Cellular levels of thymosin immunoreactive peptides are linked to proliferative events. Evidence for a nuclear site of action // Proc.Natl.Acad.Sci.USA-1990.-vol.87.-p.3269-3274.

53. Cordero O.J., Sarandeses C.S., Lopez J.L. et al. Prothymosin a enhances interleukin-2 receptor expression in normal human T-lymphocytes // FEBS.Lett.-1991.-vol.l3.-№8.-p.159-165.

54. Cordero O.J., Sarandeses C.S., Norueira M. Prothymosin alpha receptors on lymphocytes // J.Interfon Cytokine Res.-1995.-vol.l5:8.-731-731.

55. Cory S. Regulation of lymphocyte survival by the Bcl-2 gene family // Annu.Rev.Immunol.-1995 .-vol. 13 .-p. 513-543.

56. Costopoulou D., Leondiadis L., Czarnecki J. Direct ELISA method for the specific determination of prothymosin alpha in human specimens // J.Immunoassay.-1998.-vol. 19(4).-p.295-316.

57. Cunningham E.I., DeSuza E.B. Interleukin 1 receptor in the brain and endocrinetissues // Immunol.Tod.-1993.-vol. 14.-№4.-p. 171-176.

58. Dominguez F., Magdalena C., Cancio E. et al. Tissue concentrations of prothymosin alpha: a novel proliferation index of primary breast cancer // Eur.J.Cancer.-1993.-vol.29.-p.893-897.

59. Eckert K., Schmitt M., Garbin F. et al. Thymosin alpha-1 effects, in vitro, on lymphokine-aktivated killer-cells from patients with primary immunodeficiencies-preliminary results // Intern.J.oflmmunopharmacol.-1994.-vol.16.-p.1019-1024.

60. Eckert K., Garbin F., Maurer H.R. et al. Prothymosin alpha modulates tymphokine-activated killer-cells activity and IL-2 production by peripheral blood lymphocytes from melanoma patients in vitro II Int.J.of Immunopharmacol.-1995.-vol.17.-p.555-561.

61. Elliot K., Sakamuro D., Basu A. et al. Binl functionally interacts with Myc and inhibits cell proliferation via multiple mechanisms // Oncogene.-1999.-№18.-vol.24,-p.3564-3573.

62. Eilers M., Schirm S., Bishop J.M. The MYC protein activates transcription of the a-prothymosin gene//EMBO J.-1991.-vol.l0.-p.l33-141.

63. Eschenfeldt W.H., Berger S.L. The human prothymosin alpha gene is polymorphic and induced upon growth stimulation: Evidence using a cloned cDNA // Proc.Natl.Acad.Sei USA.-1986.-vol.83.-p.9403-9407.

64. Eschenfeldt W.H., Manrow R.E., Krugig M.S. et al. Isolation and partial sequencing of the human prothymosin alpha gene family // J.Biol.Chem.-1989.-vol.264.-p.7546-7555.

65. Evstafieva A.G., Chichkova N.V., Makarova T.N., Vartrpetian A.B., Vasilenko (Khodyakova) A.V. et al. Overproduction in Escherichia coli, purification and properties of human prothymosin alpha // Eur.J.Biochem.-1995.-vol.231.-p.639-643.

66. Favalli C., Jezzi T., Mastino A. et al. Modulation of natural killer activity by thymosin alpha 1 and interferon// Cancer.Immunol.Immunother.-1985.-vol.20.-p.189-192.

67. Fabris N., Mocchegiani E., Provinciani M. Plasticity of neuroendocrine-thymus interaction during aging // Exp.Gerontol.-1997.-vol.32.-p.415-429.

68. Finkeistain R.A. Cholera. In: Bacterial vaccines. (Ed. by Germanier R.) // Acad.Press.Inc.-1984.-p. 107-136.

69. Franco F.J., Diaz C., Barcia M. et al., Syntesis and apparent secretion of prothymosin a by different subpopulations o calf and rat thymocytes // Immunol.-1989.-vol.-p.263-268.

70. Frangou-Lazaridis M., Clinton M., Goodall G.J., Horecker B.L. Prothymosin a and parathymosin: amino acid sequences deduced from the cloned rat spleen cDNAs // Arch.Biochem.Biophys.-1988.-vol.263.-p.305-310.

71. Frasca D., Adorini L., Doria G. Enhanced frequency of mitogen-responsive T cell precursors in old mice injected with thymosin alpha // Eur.J.Immunol.-1987.-vol.l7.-p.727-730.

72. Gabrilovich D., Chen H., Girgis K. et al. Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendric cells // Nat.Med.-1996.-vol.2.-p. 1096-1099.

73. Gajewki T.F., Fitch F.W. Anti-proliferative effect of IFN gamma in immune regulation. IFN-gamma inhibits the proliferation of Th2 but not Thl murine helper T lymphocyte clones // J.Immunol.-1988.-vol.l40.-p.4245-4252.

74. Garbin F., Eckert K., Buttner P., Maurer H.R. Prothymosin alpha augments deficient antitumor activity of monocytes from melanoma patient in vitro II Anticancer research.-1994.-vol.l4.-p.2405-2411.

75. Garbin F., Eckert K., Buttner P. et al. Deficient antitumor activity of monocytes from melanoma patients in vitro II Oncol.reports.-1995.-vol.2.-p.469-472.

76. Garcia-Caballero T., Dominguez F., Roson E. et al. Distribution of prothymosin alpha in rat and human cortex // Anat.Rec.-1994.-vol.5:239:l.-p.88-94.

77. Garn H., Krause H., Enzmann V., Dröbler K. An improved MTT assay using the electron-coupling agent menadione // J.Immunol.Meth.-1994.-vol. 168.-p.253-256.

78. Gast K., Damaschun H., Ecket K. et al. Prothymosin a: A Biologically Active Protein with Random Coil Conformation // Biochem.-1995.-vol.34.-p. 13211-13218.

79. Gaubatz S., Meichle A., Eilers M. An E-Box Element localized in the first intron mediates regulation of Prothymosin a gene by c-myc // Molec.,Cell.Biol.-1994.-June.-p.3853-3862.

80. Gillis S., Smith K.A. Long term culture of tumor-specific cytotoxic T-cell // Nature-1977.-vol.268.-p. 154-156.

81. Gillis S., Baker P.E., Ruscelti F.W., Smith K.A. Long term culture of human antigen-specific cytotoxic T-cell lines // J.Exp.Med.-1978.-vol.l48.-p.l093-1099.

82. Goldstein A.L., Garaci C. Receptors for thymosin alpha 1 // Cell Immunol.-1990.-vol.91.-№l.-p.289-293.

83. Gomez-Marquuez J., Segade F. Prothymosin a is nuclear protein // FEBS Lett.-1988.-vol.226.-p.217-219.

84. Gomez-Marquuez J., Segade F., Dosil M. et al. The expression of prothymosin a gene in T lymphocytes and leukemic lymphoid cells is tied to lymphocyte proliferation // J.Biol.Chem.-1989.-vol.264.-p.8451-8454.

85. Gomez-Marquez J., Rodriges P. Prothymosin a is a chromatin-remodeling protein in mammalian cells // Biochem J.-1993.-vol.333.-p. 1-3.

86. Goya R.G., Takahashi S., Quiglu K.L. et al. Immunoneuroendocrine interactions during aging: Age-dependent thypotropin-inhibiting activity of thymosin peptides // Mech. Ageing.Dev.-1987.-vol.41.-p.219-227.

87. Goya R.G. The immuno-neuroendocrine homeostatic network and ageing //Gerontol.-1991.-vol.37.-p.208-213.

88. Grechko G.K., Panchenko E.L., Khodyakova A.V. et al. New epithelial human cell lines of fetal origin as target cells for prothymosin a and y-interferon action // Immunol.Lett.-1997.-vol.56.-p.419.

89. Hadden J.V. Thymosin al. An immunoregulatory concept // Immunol.Today.-1993.-vol. 14.-№6.-p.275-280.

90. Hall N.R.S., O'Grady M., Menzies R.A. Thymic regulation of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis // Int.J.Immunopharmac.-1992.-vol.14.-p.353-359.

91. Haritos A.A., Goodall G.J., Horecker B.L. Prothymosin a: isolation and properties of the major immunoreactive from of thymosin a in rat thymus // Proc.Natl.Acad.Sci. USA-1984.-vol.81.-p.l008-1011.

92. Haritos A.A., Tsolas O., Horecker B.L. Distribution of prothymosin a in rat tissues //

93. Proc.Natl.Acad.Sci. USA-1989.-vol.81 .-p. 1391-1393.

94. Herberman R.B., Nunn M.E. , Lavrin D.H. Natural cytotoxic reactivity of mouse lymphoid cells against syngeneic and allogeneic tumors. I.Distribution of reactivity // Int. J.Cancer.-1975.-vol. 16.-p.216-221.

95. Herberman R.B., Ortaldo J.R., Mantovani A. et al. Effect of human recombinant interferon on cytotoxic activity of natural killer (NK) cells and monocytes // Cell.Immunol.-1982.-vol.67.-№1.-p. 160-167.

96. Hernadez-Caselles T., Martinez-Esparza M., Sancho D. et al. Interleukin 7 rescues human activated T lymphocytes from apoptosis induced by glucocrticoide and regulates Bcl-2 and CD-25 exression // Human.Immunol.-1995.-vol.43.-p.l81-189.

97. Hewlet G., Stunkel K.G. & Schlumberger H.D. A method for the quantitation of interleukin -2 activity // J. of Immunol.Meth.- 1989.-№117.-p.243-246.

98. Hoffbrand A.V. Effect of thymosin on glucocorticoid receptor activity and glucocorticoid sensitivity of human thymocytes // Clin. And Exp. Immunol.-1984,-vol.55.-№2.-p.273-280.

99. Hunter W.M., Greenwood F.C. Preparation of iodine-131 labeled human growth hormone of high specific activity //Nature.-1962.-vol. 194.-p.495-497.

100. Janeway C.A., Travers P. Immunology. The Immune system in Health and Disease (3d ed.). Current biology Limited / Garland Publishing Inc.-1997.

101. Jerne N.K., Nordin A.A. Plaque formation in agar by single antibody-producing cells // Science.-1963,-vol.40.-p.405-409.

102. Karetsou Z, Sandaltzopoulos R, Frangou-Lazaridis M, et al. Prothymosin alpha modulates the interaction of histone HI with chromatin // Nucleic Acids Res.- 1998.-№26.-vol.l3.-p.3111-3118.

103. Kashara T., Hooks J.J., Dougherty S.F. , Oppenhein J.J. Interleukin 2-mediated interferon (IFN-gamma) production by human T cells and T cell subsets // J.Immunol.-1983.-vol. 130.-p. 1784.

104. Kasting N.W. Simultaneous and independent release of vasopressin and oxitocin in the rat // Canad.J.Physiol.Pharmacol.-1988.- vol.66.-p.22-37.

105. Khodyakova A.V., Khromykh L.M., Evstafieva A.G.et al. Immunomodulatory effect of human recombinant prothymosin-a // J.Interfer.Cytok.Res.-1995.-p.S138.

106. Kinoshita T., Shirasawa H., Shino Y. et al. Transactivation of prothymosin alpha and c-myc promoters by human papillomavirus type 16 E6 protein // Virology-1997.vol.26.-p.53-61.

107. Kirsh A.H., Mahmood A.A., Endres J. et al. Apoptosis of human T-cells: induction by glucocorticoids or surface receptor ligation in vitro and ex vivo II J.Biol.Regul.Homeost. Agents.-1999.-vol. 13.-№2.-p.80-89.

108. Kishida T., Uno K., Kishi A. et al. A new approach to immunotherapy of cancer using interferon-activated NK Lymphocytes (IFNANK-Therapy) // Eur.Cytok.Netw.-1996.-vol.7.-p.469.

109. Knöpfer T., Kuhn R., Allgeier H. Metabotropic glutamate receptors: novel targets for drug development // J.Medic.chemistry-1995.-vol.38.-№9.-p.l417-1426.

110. Komiyama T., Pan L.X., Haritos A.A. et al. The primary structure of rat parathymosin // Proc.Natl.Acad.Sci.USA-1986.-vol.83.-p.1242.

111. Kruger J.M. Sleep and immune function // Karger Gazette.-1997.-№61.

112. Kubota S., Adachi Y., Copeland T.D., Oroszlan S. Binding of human prothymosin alpha to the leucine-motif/activation domains of HTLV-1 REX and HIV-1 REV // Eur. J.Biochem.-1995.-vol.233.-p.48-54.

113. Lay C.Y. The chemistry and biology of cholera toxin // CRC Crit.Rev.Biochem.-1980.-vol.9.-p. 171-206.

114. Le J., Prensky W., Yip Y.K. et al. Activation of human monocyte cytotoxicty by natural and recombinant immune interferon // J.Immunol.-1983.-vol. 131 .-p.2821 -2826.

115. Leichtling K.D., Serrate S.A., Sztein M.B. Thymosin alpha 1 modulates the expression of high affinity interleukin-2 receptors on normal human lymphocytes // Int. J.Immunopharmacol.-l 990.-vol. 12.-p. 19-29.

116. Loidi L., Vidal A., Zalvide J.B., et al. Development of ELISA to estimate thymosin alphal, the N terminus of prothymosin alpha, in human tumors // Clin. Chem.- 1997.-№43.-vol.1.-p.59-63.

117. Low T.L.K. & Goldstein A.L. Thymic hormones: an overview // Methods Enzymol.-1985.-vol.116.-p.213-215.

118. Low T.L.K., Pan T.L., Lin Y.S. Depression of prothymosin a production in murine thymus correlates with staphylococcal enterotoxin-B-induced immunosuppression // FEBS Lett.-1990.-vol.273.-p. 1 -5.

119. Lowenthal J.W., Cerotini J.C., MacDonald H.R. Interleukin-1 dependent induction of both interleukin-2 secretion and interleukin-2 receptor expression by thymoma cells

120. J.Immunol.- 1986.-vol.137.-p. 1226-1231.

121. Lydon N., Favre C., Bove S. et al. Immunochemical mapping of a-2 interferon // Biochemistry.-1985 ,-vol.24.-p.4131-4137

122. Makarova T., Grebenshikov N., Egorov C. et al. Prothymosin-alpha is an evolutionary conserved protein covalently linked to a small RNA // FEBS Lett.-1989.-vol.257.-p.247-250.

123. Manrow R.E., Sburlati A.R., Hanover J.A., Berger S.L. Nuclear targeting of prothymosin a // J.Biol.Chem.-1991 .-vol.266.-p.3916-3924.

124. Manrow R.W., Leone A., Krug M.S. et al. // The human prothymosin a gene family contains several processed pseudogenes lacking deleterious lesions // Genomics.-1992.-vol. 13.-p.319-331.

125. Manrow R.E., Berger S.L. GAG triplets as splice acceptors of last resort. An unusual form of alternative splicing in prothymosin a pre-mRNA // J.Mol.Biol.-1993.-vol.234.-p.281-288.

126. Marie D., Jankovis B.D., Veljic J. Immunostimulatory activity of prothymosin alpha in senescence //Ann.N.Y.Acad.Sci.-1991.-vol.621.-p.48-58.

127. McClure J.E., Lameris N., Wara D.W. et al. Immunochemical studies on thymosin: radioimmunoassay of thymosin ai // J.Immunol.-1981.-vol.128.-№1.-p.368-375.

128. Merill J.E., Moblstram C., Vittenbogart C. et al. Responce to and production of interleukin 2 by peripheral blood and cerebrospinal fluid lymphocytes of patients with multiple sclerosis // J.Immunol.-1984.-vol.l33.-p.l931-1937.

129. Mishell B.B., Shiigi S.M. Selected Methods in cellular immunology // W.H. Freedman and Company, San Francisco.-1980.-p. 16-18/

130. Mocchegiani E., Santarelli L., Muzzioli M. et al. Reversibility of the thymic involution and age-relate peripheral immuno-dysfunction by supplementation in old mice // Int.J.Immunopharmac.-1995.-vol.l7.-p.749-757.

131. Mol P.C., Wang R.H., Batey D.W. et al. Do products of the proto-oncogene play a role in transcriptional regulation of the prothymosin a gene? // Mol.Cell Biol.-1995.-vol. 15 .-p.6999-7009.

132. Morgan D.A., Ruscetti F.W., Gallo R.C. Selective „in vitro" growth of T-lymphocytes from normal human bone marrow // Science-1976.-vol. 193.-p. 10071008.

133. Mori M., Barnard G.F., Staniunas R.J. et al. Prothymosin-mRNA expression correlates with that of c-myc in human colon cancer // Oncogene-1993.-vol.8.-p.2821-2826.

134. Nathan C.F., Prendergast T.J., Wiebe M.E. et al. Activation of human macrophages. Comparison of other cytokines with interferon-gamma // J.Exp.Med.-1984.-vol.l60.-p.600-605.

135. Nguen Toan D., Sheving L.A. Thymosin al: amino acid homology with peptide T from the human immunodeficiency virus envelope // Biochem.Biophys.Res.Commun.-1987.-vol. 145.-№2.-p.884-887.

136. Ohta Y., Tamura S., Nihira S., et al. Thymosin alpha 1 enhances haemopoietic colony formation by stimulating the production of interleukin 3 in nu/nu mice // Int.J. Immunopharmacol.-1986.-vol.8.-p.773-779.

137. Oates K.K., Naylor P.H., Goldstein A.L. Localization of thymosin alpha 1 production to thymus medullary epithelial cells by use of monoclonal antibodies // Hybridoma-1987.-vol.66.-47-59.

138. Oates K.K., Erdos M. Biochemical identification of thymosin alpha-1: Its phylogenetic distribution and evolutionary implications // Comp.Biochem.Physiol.-1989.-vol.94B.-p.7559-763.

139. Pan L.X., Haritos A.A., Wideman J. et al. Human prothymosin a: aminoacid sequence and immunologic properties // Arch.Biochem.Biophys.-1986.-vol.250-p. 197-201.

140. Pannerselvam C., Haritos A.A., Caldarella J., Horecker B.L. Prothymosin a in human blood // Proc.Natl.Acad.Sci.USA-1987b.-vol.84.-p.4465.

141. Papamarcaki T., Tsolas O. Prothymosin alpha binds to histone HI in vitro // FEBS Lett.-1994.-vol.345.-p.71-75.

142. Peres-Estevez A., Jullien C.D., Covelo G. et al. 180-kDa protein kinase seems to be responsible for the phosphorilation of prothymosin alpha observed in proliferating cells // J.Biol.Chem.-l997.-vol.272, p. 10506-10513.

143. Porsolt R.D., Anton G., Blavet N. & Yaltre M. Behavior despair in rays, a new model sensitive to antidepressants // Arch. Int. Pharmacodyn.-1997.-№229.-p.327.

144. Provost le F., Lepinge A. & Martin P. A survey of the goat genome transcribed in the lactating mammary gland // Mamm.Gen.-1996.-vol.7.-p.657-666.

145. Reddy A., Sapp M. Feldman M., Subklewe M. & Bhardway N. A monocyteconditioned medium is more effective than defined cytokines in mediating the terminal maturation of human dendritic cells // Blood.-1997.-vol.90.-p.3640-3646.

146. Robb R.J., Greene W.C., Rusk Low and high affinity cellular receptors for interleukin-2. Implications for the levels of Tac antigen // J.Exp.Med.-1984.-vol. 160,-p.l 126-1146.

147. Rodriguez P., Vinuela J.E., Alvarez-Fernandez L. et al. Overexpression of prothymosin a accelerates proliferation and retards differentiation in HL-60 cells // J.Biochem.-1998.-vol.331.-p.753-761.

148. Rodriguez P., Vinuela J.E., Alvarez-Fernandez L., Gomez-Marquez J. Prothymosin a antisense oligonucleotides induce apoptosis in HL-60 cells // Cell Death Dier.-1999.-vol.6.-p.3-5.

149. Roitt I. Essential Immunology (9thed.). Blackwell Science. - 1997.

150. Romani R. Generation mature dendritic cells from human blood: An improved method with special regard to clinical applicability // J.Immunol.Meth.-1996.-vol. 196.-p.137-151.

151. Roson E., Gallego R., Garcia-Caballero T. et al. Prothymosin alpha expression is associated to cell-division in rat testis // Histochem.-1990.-vol.94.-iss.6.-p.597-599.

152. Roson E., Garcia-Caballero T., Heimer E.P. et al. Cellular-distribution of prothymosin alpha and parathymosin in rat thymus and spleen // J.of Histochem.Cytochem.-1990.-vol.38.-iss.l2.-p.l889-1894.

153. Sato H., Hanada M., Bodrug S. et al. Interactions among the members of the bcl-2 family with a yeast two hybrid system // proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1994.-vol.91.-p.9238-9242

154. Sburlati A.R., Manrow R.E., Berger S.L. Prothymosin alpha antisense oligomers inhibit myeloma cell division // Proc.Natl.Acad.Sci.USA-1991.-vol.88.-p.253-257.

155. Schulof R.S., Navlor P.H., Sztein M.B. et al. Thymic physiology and biochemistry // Adv.Clin.Chem.-l 987.-vol.26.-p.203-292.

156. Sedlak T.W., Oltvai Z.N., Yang T. et al. Multiple Bcl-2 family members demonstrate selective dimerization with bax // Proc.Natl.Acad.Sci. USA.-1995.-vol.92.-p.7834-7838.

157. Segade F., Gomez-Marquez J. Prothymosin a. // The Int.J. Biochem. & Cell Biol.-1999.-vol.31.-p. 1243-1248.

158. Serrate S.A., Schulof R.S., Leondaridis L. et al. Modulation of human natural killercell cytotoxic activity, lymphokines production, and interleukin 2 receptor expression by thymic hormones // J.Immun.-1987.-vol.139.-p.2338-2343.

159. Shimonkevitz R.P., Husmann L.A., Bevan M.J., et al. Transiet expression of IL-2 receptor precedes the differentiation of immature thymocytes // Nature.-1987.-vol.392.-№6135.-p. 157-159.

160. Shimizu S., Egudhi Y., Kamike W. et al. Bcl-2 expression prevents activation of the ICE protease cascade // Oncogene.-1996.-vol.12.-p.2251-2257.

161. Smith M.R., al-Katib A., Mohammad R. et al. Prothymosin alpha gene expression correlates with proliferation, not differentiation, of HL-60 cells // Blood.-1993,-vol.82.-p.l 127-1132.

162. Smith M.R. Prothymosin a: in search of a function // Leuk. Lymphoma.-1995.-vol.18.-p.209-214.

163. Spangelo B.L., Judd A.M., Call G.B. et al. Role of the cytokines in the hypothalamic-pituitary-adrenal and gonadal axes // Neuroimmunomod.-№2.-p.299-312.

164. Studzinsky G.P. Cell Growth and Apoptosis. // IRL Prress, Oxford.-1996.-p.l2-16.

165. Su Y.L., Ho K.L. Dalakas M.C. et al. Localization of immunoreactive thymosin alpha 1 in astrocytes of normal human brain // Ann.Neurol.-1989.-vol.26.-p.277-280.

166. Szabo P., Ehleiter D., Whittington E., Weksler M.E. Prothymosin alpha expression occurs during G1 in proliferating B or T lymphocytes // Biochem.Biophys. Res.Commun.-l 992.-vol. 185.-p.953-959.

167. Szabo P., Paneerselvan C., Clinton M., et al. Prothymosin alpha gene in humans: organization of its promoter region and localization to chromosome 2 // Hum. Genetics.-1993 .-vol.90.-p. 629-634.

168. Sztein M.B., Serrate S.A. Characterization of the immunoregulatory properties of thymosin alpha 1 on interleukin-2 production and interleukin-2 receptor expression in normal human lymphocytes // Int.J.Immunopharmacol.-1989.-vol.11 .-p.789-800.

169. Tao L., Wang R.-H., Enkemann S.A. et al. Metabolic regulation of protein-bound glutamyl phosphates: Insights into the function of Prothymosin a// J.Cell.Physiol.-1999.-vol.178.-p. 154-163.

170. Telford W.G., King L.E. & Fraker P.J. Evaluation of glucocorticoid-induced DNA fragmentation in mouse thymocytes by flow cytometry // Cell Prolif.-l 991.-vol.-24,-p.447-459.

171. Thompson C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease // Science.-1995.-vol.267.-p. 1456-1462.

172. Trinchieri G., Kubin M., Bellone G., Cassatella M. Interleukin-12 and its role in the generation of Thl cells // J.Immunol.Today-1993-vol. 14.-p.335-337.

173. Uversky V.N., Gillespie J.R., Millett I.S., Khodyakova A.V. et al. Natively unfolded human prothymosin a adopts partially folded collapsed conformation at acidic pH // Biochemistry.-1999.

174. Vareli K., Tsolas O., Frangou-Lazaridis M. Intracellular position of prothymosin a in cells going through the cell cycle // Cell Biol.Int.Rep.-1994.-vol.18.-p.581a.

175. Vareli K., Frangon-Lazaridis M., Tsolas O. Prothymosin alpha m-RNA levels vary with c-myc expression during tissue proliferation, viral infection and heat shock // FEBS Lett.-1995.-vol.371.-p.337-340.

176. Vareli K., Tsolas O., Frangou-Lazaridis M. Regulation of prothymosin a during the cell cycle // Eur.J.Immunol.-1996.-vol.238.-p.799-806.

177. Vartapetian A.B., Chichkova N., Lyakhov L. et al. Segments of Escherichia coli genome similar to the exons of human prothymosin-a gene // FEBS Lett.-1992.-vol.313.-p.95-97.

178. Vasilenko R., Khodyakova A., Ptitsyn L. The recombinant aglycosilated IL-462 participates in the regulation of the IFN-y and IL-4 activities // Abstr. 7th Ann Conf.

179. S, South. Carolina.-1999.-V.l 1.-№11.-P.950.

180. Vega F.V., Vidal A., Hellman U. et al. Prothymosin a stimulates Ca2+ -dependent phosphorylation of elongation factor 2 in cellular extracts // J.Biol.Chem.-1998.-vol.273.-Iss.17.-apr.24.-p. 10147-10152.

181. Watts J.D., Cranerobinson C., Cary P.D. Prothymosin-alpha is a nuclear protein // FEBS Lett.-1989.-vol.245.-iss. 1 -2.-p. 17-20.

182. Watts J.D., Cary P.D., Sautiere P., Crane-Robinson C. Thymosins: both nuclear and cytoplasmic proteins // Eur. J.Biochem.-1990.-vol. 192.-p.643-651.

183. Weigert D.A., Stanton G.J., Johnsont H.M. Interleukin 2 enhances natural killer cell activity through induction of gamma interferon // Infect. ,Immun.-1983.-vol.41.-№3.-p.922-927.

184. Wilckens T. Glucocorticoids and immune function: physiological relevance and pathogenic potential of hormonal dysfunction // Trends in pharmacological sciences.-1995.-vol.-16.-№6.-p. 193-197.

185. Wiltrout R.N., Herberman R.B., Zhang S.-R. et al. Role of organ-associated NK cells in decreased formation of experimental metastases in lung and liver // J.Immunol.-1985.-vol.134.-p.4267-4275.

186. Wolf G.T., Hudson J., Peterson K.A., et al. Interleukin 2 receptor expression in patients with head and neck squamous carcinoma // Otolaryngol. Head Neck Surg-1989.-vol.115.-p.1345-1349.

187. Wu C.-L., Shiau A.-L., Lin C.-S. Prothymosin a promotes cell proliferation in NIH3T3 cells//Life Sci.-1997.-vol.61.-p.2091-2101.

188. Wu G.G., Habib N.A., Mitry R.R., et al. Overexpression of hepatic prothymosin alpha, a novel marker for human hepatocellular carcinoma // Br. J. Cancer.- 1997.-№76.-vol.9.-p. 1199-204.

189. Yialouris P.P., Evangelatos G.P., Soteriadis-Vlahos C. et al. The identification of prothymosin a-like material in vertebrate lymphoid organs by a radioimmunoassay for the N-terminal decapeptide // J.Immunol.Meth.-1988.-vol.l06.-p.267-275

190. Xiao Q., Claassen G., Shi J., et al. Transactivation-defective c-MycS retains the ability to regulate proliferation and apoptosis // Genes Dev.- 1998.-№12.-vol.24,-p.3803-3808.

191. Zatz M.M., Low T.L.K., Goldstein A. Role of thymosin and other thymic hormones in T-cell differentiation // Biol.Resp.Cancer-1982.-vol.1.-p.219.93

192. Zyryanova I.M., Korobko V.G., Grechko G.K. Search for homologies of the prothymosin-a gene in Halobacteria// Eur.Cytok.Netw.-1996.-vol.7.-№3.-p.234.