Автореферат и диссертация по медицине (14.03.05) на тему:Иммуно- и гепатотропная активность синтетических аналогов глюкозаминилурамилдипептида (экспериметальное исследование)

М МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ ЛЬВІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМУНО- ТА ГЕПАТОТРОПНА АКТИВНІСТЬ СИНТЕТИЧНИХ АНАЛОГІВ ГЛЮКОЗАМІНІЛМУРАМІЛДИПЕПТИДУ

(експериментальне дослідження) 14.03.05 — Патологічна фізіологія

Аотореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

На правах рукопису

ЧИКАЙЛО Ірина Петрівна

Львів — 1996

Робота виконана на кафедрах фармакології та патологічної фізіоло' гії Львівського державного медичного університету.

Наукові керівники:

Провідна організація: Івано-Франківська державна медична академія.

Захист відбудеться 1996 р. о *//. год. на за-

сіданні спеціалізованої ради К 04.19.01 у Львівському державному медичному університеті (290010, м. Львів, вул. Пекарська, 52).

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського державного медичного університету (м. Львів, вул. Січових Стрільців, 6).

Доктор медичних наук, професор РУДИЙ Р. В.

Доктор медичних наук, професор БІДЮК М. М.

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор КАЧОРОВСЬКИЙ Б. В.

Доктор медичних наук, професор

СКАКУН М. П.

Автореферат розіслани

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук

О. М. МОРОЗ.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. За останнє десятиріччя значно зросло зацікавлення імуностимулюючою терапією, що тісно пов’язано із запитами інфекційної патології та онкології. Перебіг інфекційного процесу стає дедалі важчим, чисельність онкологічних захворювань зростає - і все це відбувається в умовах дезорганізованого імунітету (наслідки хіміотерапії, екологічних катастроф, стресів та ін.). Необхідність і незаперечне значення імуностимуляції стали особливо очевидними після того, як у світі з’явились дві глобальні катастрофи - пандемія СНІДу та аварія на ЧАЕС. Імунна система сучасної людини терпить екстремальні навантаження і тому вимагає всебічної підтримки.

В публікаціях останніх років приводяться докази високої іму-номодулюючої активності структурних компонентів клітинних стінок бактерій (Лазарєва Д.Н., Альохін Є.K., 1987; ІІозур В.К. і співавт., 1992; Дранник Г.Н. і співавт., 1994). До таких перспективних імунокоректорів належать мурамілпептиди, а зокрема -глюкозамінілмурамілдипептид (ГМДП) (Андронова Т.М. і співавт., 1991; Медвєдєв А.Е. і співавт., 1992; Сетдикова Н.Х. і співавт., 1995; Adam A., 1985; Chedid L., 1986; Lederer E., 1988).

ГМДП проявляє себе як активатор імунної відповіді організму і функції імунокомпетентних клітин: стимулює утворення антитіл (Манько В.М. і співавт., 1988; Захарова Н.С. і співавт., 1991), посилює реакції гіперчутливості уповільненого типу (Ки-sumoto S., 1986) і неспецифічної резистентності до бактеріальних інфекцій (Носков Ф.С. і співавт., 1984; Щельцина Т.Л. і співавт., 1993) та пухлин (Валякіна Т.І. і співавт., 1993).

З моменту відкриття класу мурамілпептидів були проведені численні експериментальні дослідження, присвячені вивченню як механізмів дії, так і синтезу нових речовин цієї груші. Проте, багато властивостей мурамілпептидів залишаються не виясненими, а отримані їх аналоги не завжди відповідають існуючим вимогам.

Актуальність таких досліджень зумовлена як значним інтересом до пошуку нових біологічно активних речовин із спрямованим впливом на імунну систему, так і необхідністю поглиблення знань про механізми взаємодії її елементів.

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідження деяких проявів і окремих параметрів імунотропної та гепатотропної активності оригінальних синтетичних гетероциклічних аналогів ГМДП, у порівнянні з відповідними властивос-

тями їх прототипу, рекомендованого для клінічного застосування (Сетдікова Н.Х. і співавт., 1995), імуномодулятора глюкозамініл-мурамілдипептиду.

Для досягнення цієї мети потрібно було вирішити такі завдання:

1. Провести токсикологічне дослідження нових синтетичних гетероциклічних аналогів ГМДП.

2. В експериментах на тваринах дослідити здатність тих речовин модулювати імунологічні реакції.

3. Із декількох досліджених сполук виділити речовину з максимально вираженою імунотропністю.

4. Встановити оптимальні умови для виявлення імунотропної активності цієї речовини.

5. Дослідити наявність у виділеної сполуки гепатотропної активності.

6. Порівняти імуномодулюючу і гепатотропну активність досліджених речовин з відповідною активністю ГМДП.

7. Встановити можливу наявність та характер зв’язку поміж біологічною активністю та хімічною структурою синтетичних гетероциклічних аналогів ГМДП.

Наукова новизна роботи. У виконаній науково-дослідницькій роботі нами використовувались нові синтетичні речовини - гетероциклічні аналоги ГМДП. Оригінальність тих сполук полягає в тому, що амінокислоти та пептиди знаходяться в їх молекулах в ацильованій формі, а саме - їх отримували шляхом включення К-кінцевої амінокислоти в тіазолідиновин (роданіновий) гетероцикл, що є новим підходом у пошуку перспективних імуномоду-ляторів серед аналогів ГМДП.

В результаті нашої роботи серед досліджених аналогів ГМДП було виявлено активний імуностимулятор - глюкозамонійну сіль дикарбонової кислоти пептидної природи. Вперше проведена токсикологічна оцінка названої сполуки, порівняння її імунотропної активності з аналогічною властивістю відомого імуномодулятора цієї ж групи. Вперше вивчався, у порівняльному аспекті, вплив імуномодулятора ГМДП та його нового структурного аналога на функціональний стан печінки.

Теоретичне значення роботи. Встановлена у ході даного експериментального дослідження наявність кореляції поміж будовою синтетичних аналогів ГМДП та їх імунотропною активністю поглиблює уяву про наслідки взаємодії мурамілпептидів з компонентами імунної системи організму і може служити підставою

для розробки нового підходу у подальшому пошуку біологічно активних речовин в ряді гетероциклічних аналогів глюкозамініл-мурамілдипептиду.

У результаті проведених досліджень був встановлений факт гепатотропного впливу імуномодулятора, рекомендованого для клінічного застосування, а саме - зміни ферментного дзеркала крові, які свідчать про наявність медикаментозного холестазу. Отримані дані дають змогу внести уточнення в існуючу уяву про механізми дії мурамілпептидів та розширити відомий спектр фармакологічних ефектів, притаманних імуноісоректорам цього ряду.

Практична цінність роботи. Встановлені у ході науково-дослідницького пошуку факти, що стверджують наявність, характер та інтенсивність імунотропної активності у однієї із трьох досліджених сполук, віддалених гетероциклічних аналогів ГМДП, відсутність загальнотоксичної та гепатотоксичної її дії на організм при парентеральному введенні, вказують на перспективність спрямованого синтезу нових, практично цінних імуномодулято-рів цього класу.

Результати даної роботи можуть бути обгрунтуванням подальшого, поглибленого експериментального дослідження нового потенціального імуностимулятора - сполуки означеної лабораторним шифром ВГД 1398 ГА, і підставою для клопотання перед Фармакологічним комітетом МОЗ України, з метою отримання дозволу на проведення клінічної апробації цієї речовини.

Основні положеная дисертації, що виносяться на захист.

1. Серед трьох вперше синтезованих віддалених гетероциклічних аналогів глюкозамінілмурамілдипептиду (ГМДП) виявлений активний імуномодулятор - глюкозамонійна сіль дикарбоно-вої кислоти пептидної природи (сполука ВГД 1398 ГА).

2. Дія цієї біологічно активної речовини на макрофагальну ланку імунної відповіді носить стимулюючий характер і залежить від її дози.

3. Синтетична сполука ВГД 1398 ГА виявляє залежну від дози ад’ювантну дію на гуморальну імунну відповідь на тимусза-лежний антиген.

4. Вплив гетероциклічних аналогів ГМДП на функціональну активність лімфоцитів Т-ряду відсутній або слабо виражений.

5. Новий імуномодулятор позбавлений загальнотоксичної і гегіа-тотоксичпої активності.

З

6. Повторне введення еталонного препарату ГМДП, у дозі 5 мг/кг, призводить до зростання у сироватці крові вмісту ферментів-індикаторів холестазу, що свідчить про наявність застою жовчі в печінці.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались на І Національному з’їзді фармакологів України (м. Полтава, 1995); Міжрегіональній науково-практичній конференції «Актуальні питання фармацевтичної науки та практики» (м. Запоріжжя, 1995); II Національному конгресі патофізіологів України (м. Київ, 1996), II Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні проблеми клінічної імунології» (м. Львів, 1996), спільному засіданні Львівської обласної філії наукового медичного товариства фармакологів і патофізіологів (м. Львів, 1995).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 праць, які відображають основні її положення.

Декларація конкретного внеску дисертанта. Особистий внесок автора полягає в аналізі актуальності та ступеня вивчення проблеми, виборі та розробці методик, виборі умов дослідження, проведенні скринінгу хімічних речовин на наявність у них імуно- та гепатотропної активності, аналізі та узагальненні отриманих результатів, формулюванні висновків та положень роботи, які виносяться на захист.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 144 сторінках машинописного тексту. Робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків, практичних рекомендацій та бібліографічного покажчика, який включає 234 джерела. Робота ілюстрована 8 таблицями і 33 рисунками.

ЗМІСТ РОБОТИ

Етапи та умови досліджеппя. Матеріали і методи

Об’єктами даного експериментального дослідження були синтезовані доцентом кафедри фармацевтичної хімії ЛДМУ, кандидатом фармацевтичних наук Горішнім В.Я.* три оригінальні сполуки, гетероциклічні аналоги ГМДП. Названий автор, на основі

* В. Я. Горішній - науковий консультант з питань хімії та зв’язку між біологічною активністю та хімічною структурою вивчених сполук

структурних елементів ГМДП (аланіну, глютамінової кислоти та глюкозаміну) отримав розчинні у воді глюкозамонійні солі карбонової та дикарбонової кислот тіазолідинового ряду (відповідно - речовини ВГД 1395 ГА та ВГД 1396 ГА) і дикарбонової кислоти пептидної природи, утвореної із вказаних амінокислот (сполука ВГД 1398 ГА).

Дослідження імунофармакологічної активності оригінальних гетероциклічних аналогів ГМДП здійснювали у порівнянні з аналогічними властивостями еталонного препарату, самого ГМДП, синтезованого в лабораторії пептидів Інституту біоорганічної хімії РАМН ім. М.М. Шемякіна (м. Москва).

Робота виконана на 102 нелінійних мишах, 361 миші лінії СВА, 50 білих нелінійних щурах, 114 мурчаках, 27 кролях.

На початковому етапі запланованих досліджень проводили токсикологічну оцінку оригінальних сполук.

Параметри гострої токсичності встановлювали на 102 білих мишах, різної статі, масою 18-23 г, за методом графічного про-біт-аналізу Літчфілда та Уїлкоксона.

Сенсибілізуючу дію речовин у дозах, рівних 0.1 та 0.01 їх ЛД50, досліджували у порівнянні з аналогічною активністю ГМДП, у дозі 5 мг/кг, на 42 мурчаках-самцях, масою 250-300 г, в реакції загальної анафілаксії. Інтенсивність анафілактичного шоку виражали в індексах реакції за Weigle W.

Наявність подразнюючої дії виявляли у дослідах на 18 білих щурах, масою 200-225 г, та на 9 кролях, масою 2.5-3.5 кг, враховуючи появу та інтенсивність еритеми і набряку на місцях аплікації 10 % розчинів досліджуваних сполук.

Випробування речовин на пірогенність проведені на 18 кролях, різної статі, масою 2.0-2.5 кг, описаним у Державній Фармакопеї XI методом.

На етапі імунологічного дослідження синтетичні аналоги ГМДП застосовувались у широкому діапазоні доз (0.1, 0.01,

0.001 їх ЛДдо)» а еталонний препарат (ГМДП) - у дозі 5 мг/кг, при одноразовому внутрішньоочеревинному їх введенні.

Вибір оптимальних модельних систем проводили згідно методичних рекомендацій «Методические материалы по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств» (Москва, 1984).

■ Дію потенціальних імуномодуляторів на клітини системи мо-нонуклеарних фагоцитів оцінювали по фагоцитарній та міграційній активності перитонеальних макрофагів у 218 мишей ліній

СВА, різної статі, масою 16-23 г. Поглинальну і перетравлюючу здатність макрофагів визначали після їх інкубації з тест-речови-ною, латексом, в умовах in vitro. Спонтанну міграцію макрофагів враховували по зміні відносного радіусу міграції перитонеаль-них макрофагів інтактних та імунізованих БЦЖ мишей у капілярному тесті за George M., Vaughan J., 1962.

Здатність обстежуваних сполук впливати на первинну і вторинну гуморальну імунну відповідь визначали за титром антитіл у сироватці крові 143 мишей лінії СВА, масою 18-25 г, імунізованих бичачим сироватковим альбуміном (5 мг/кг), в реакції пасивної гемаглютинації за методом Boyden S.V., 1951.

Дію досліджуваних речовин на функціональну активність лімфоцитів Т-ряду тестували в реакції гальмування міграції макрофагів (РГММ) та по зміні шкірної реакції гіперчутливості уповільненого типу (ГУТ). Для моделювання реакцій клітинного типу використовували повний ад’ювант Фрейнда. Вивчення РГММ проводили на перитонеальних макрофагах 78 мишей лінії СВА, масою 15-23 г, а класичну експериментальну туберкулінову реакцію ГУТ моделювали у 72 мурчаків різної статі, масою 200320 г.

Досліди по вивченню впливу синтетичних пептидогліканів на деякі біохімічні показники сироватки крові, що відображають функціональний стан печінки, виконані на 32 білих щурах, різної статі, масою 170-220 г. Сполука ВГД 1398 ГА випробовувалась у двох дозах, а саме - 0.1 та 0.01 її ЛД5о; ГМДП у дозі 5 мг/кг, при триразовому внутрішньоочеревинному введенні. У досліджуваному біологічному матеріалі визначали активність аланінамінотрансферази (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ), лужної фосфатази (ЛФ), гамма-глютамілтранспептидази (ГГТП), лактатдегідрогенази (ЛДГ), а також визначали концентрацію загального білка, альбуміну, загального і прямого білірубіну, сечовини, холестеролу, тригліцеридів, глюкози.

Визначення біохімічних тестів проводились на аналізаторі «Spectrum» фірми ABBOTT (США), з використанням набору реактивів цієї ж фірми.

Результати досліджень піддавались варіаційно-статистичній обробці, з визначенням ступеня їх вірогідності, на персональному комп’ютері IBM. Вірогідність різниці визначали за критерієм Стьюдента, з рівнем значення Р < 0.05.

Здійснення задумів, пов’язаних з виконанням і представленням даної роботи, було б неможливим без висококваліфікованої допомоги, наданої автору науковими керівниками: професором

Р.В. Рудим та професором М.М. Бідюком, а також без сприяння і плідних консультацій по обмірковуванню отриманих результатів з кандидатом фармацевтичних наук В.Я. Горішнім. Автор висловлює щиру подяку всім, хто сприяв виконанню даної роботи.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

1. Токсикологічна оцінка оригінальних синтетичних гетероциклічних аналогів глюкозамінілмурамілдипептиду

Початковою ланкою, яка визначає не тільки перспективність подальших експериментальних і клінічних досліджень, але й сприяє створенню високоефективних конкурентноздатних лікарських засобів, є їх первинна токсикологічна оцінка. Від результатів цього етапу досліджень залежить, як доля нових біологічно активних речовин, так і, без перебільшення, майбутнє високоефективної фармакопрофілактики та. фармакотерапії.

Ефективність, нешкідливість та доступність для різних верств населення є головними сучасними вимогами як до нових, так і до добре відомих, традиційних лікарських засобів.

Було встановлено (табл. 1), що всім дослідженим нами оригінальним синтетичним гетероциклічним аналогам ГМДП притаманна низька токсичність. Враховуючи величини середніх летальних доз і базуючись на існуючій класифікації токсичності (Сидоров К.К., 1973), їх можна віднести до малотоксичних (сполука ВГД 1395 ГА), відноснонешкідливих (сполука ВГД 1396 ГА) та практично нетоксичних (сполука ВГД 1398 ГА) речовин.

Таблиця 1

Токсикологічна оцінка гетероциклічних аналогів глюкозамінілмурамілдипептиду

Речовина ЛД50 мг/кг Наявність або відсутність (+/-) дії

Місцевоподразнююча (10 % розчин) Сенсибілі- зуюча 0.1/0.01 ЛД?;п Пірогенна 0.1/0.01 лДбо

ВГД 1395 ГА 690 (642^742) - -/-

ВГД 1396 ГА > 3000 - ■ -/-

ВГД 1398 ГА 2560 (2359-2778) - +/-

Результати цих дослідів дозволяють констатувати наявність та характер поміж гострою токсичністю цих сполук та їх хімічною будовою.

Найменшою токсичністю володіє глюкозамонійна сіль дикар-бонової кислоти тіазолідинового ряду, синтезована на основі глютамінової кислоти (сполука ВГД 1396 ГА). Незначно поступається їй речовина трипептидної природи, а саме - глюкозамонійна сіль діаміду ідентичної дикарбонової кислоти з двома альфа-аланіновими залишками в амідних субституентах (сполука ВГД 1398 ГА). Двом названим речовинам помітно поступається глюкозамонійна сіль карбонової кислоти тіазолідинового ряду, утворена на основі альфа-аланіну (сполука ВГД 1395 ГА). Названі дані свідчать про меншу токсичність сполук з включеною у тіазолідинову структуру глютаміновою компонентою, у порівнянні з речовиною, що в складі тіазолідинового ядра містить альфа-аланін.

В експериментах, метою яких було вивчення сенсибілізуючої активності досліджуваних сполук, було встановлено, що повторне введення трьох синтетичних аналогів ГМДП у використаних нами дозах не викликає жодних проявів анафілаксії. На відміну від своїх гетероциклічних аналогів, ГМДП сприяв виникненню у мурчаків проявів легкого шоку.

Останній факт свідчить про те, що оригінальні сполуки мають певну перевагу перед своїм структурним аналогом - препаратом ГМДП, оскільки, будучи позбавленими анафілактогенної активності, вони не здатні викликати алергічні ускладнення реагіново-го типу.

Досліджувані речовини позбавлені також місцевоподразнюючої дії, а їх обстеження на пірогенність показало, що із трьох тестованих речовин лише сполука ВГД 1398 ГА у дозі, рівній 0.1 її ЛД50, виявляє вказану активність. Проте, десятикратне зменшення цієї дози призводить до втрати разваною речовиною піро-генності.

Встановлені нами факти нешкідливості синтетичних гетероциклічних аналогів ГМДП дали змогу продовжити науково-дослідницьку роботу, а встановлені параметри гострої їх токсичності допомогли у виборі орієнтовних доз при дослідженні специфічного (імунофармакологічного) виду їх біологічної активності.

2. Імунотроппі властивості синтетичних гетероциклічних аналогів глюкозамінілмурамілдипептиду .

Оскільки в ініціації імунної відповіді провідна роль належить клітинам моноцитарно-макрофагальної системи, які беруть участь у включенні і регуляції механізмів імуногенезу, а також у безпосередньому захисті організму від сторонніх агентів (Петров Р.В. і співавт., 1988; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1995), нами спершу досліджувалась здатність синтетичних пептидогліка-нів впливати на макрофагальну ланку імуногенезу.

Аналізуючи результати цього фрагмента роботи (табл. 2), можна ствердити, що ГМДП проявляє притаманний мурамілпеп-тидам фагоцитозостимулюючий ефект. Нам вдалось також виділити одну із трьох оригінальних сполук, а саме - речовину ВГД 1398 ГА, яка хоча й поступається за аналогічною активністю еталонному препаратові - ГМДП, проте вірогідно стимулює функцію мононуклеарних фагоцитів.

Нами було показано, що при інкубації, in vitro, перитонеаль-них макрофагів з тест-речовиною латекс, на фоні попереднього введення тваринам ГМДП, або сполуки ВГД 1398 ГА у дозах, рівних 0.1 та 0.01 її ЛДдд, спостерігалась вірогідна стимуляція фагоцитарної активності макрофагів, яка полягала у посиленні активності, інтенсивності та завершеності фагоцитозу. Крім того, при застосуванні названих сполук в умовах антигенної стимуляції, зростав ще один показник функціональної активності цих імунокомпетентних клітин, а саме - їх здатність мігрувати.

Дві інші досліджувані нами сполуки (ВГД 1395 ГА та ВГД 1396 ГА), у використаному діапазоні доз, за умов проведе-, ного експерименту, не впливали суттєво на макрофагальну ланку імунного процесу, оскільки показники функціональної активності макрофагів, після введення цих речовин, мало відрізнялись від контрольного їх рівня. Лише в одному випадку досліджувана речовина ВГД 1396 ГА, введена у дозі, рівній 0.01 ЛДдд, вірогідно стимулювала поглинальну здатність мононуклеарних фагоцитів. Проте, посилене захоплення індиферентних часточок латексу не супроводилось стимуляцією їх перетравлюючої здатності.

Однозначно позитивним був вплив сполуки ВГД 1398 ГА та еталонного препрату-ГМДП на гуморальну імунну відповідь на введення тимусзалежного антигену (бичачого сироваткового альбуміну, БСА) (рис. 1). Це проявлялось у зростанні титру антитіл у сироватці крові мишей, які одночасно з імунізацією БСА, отримували названі речовини, у порівнянні з аналогічним показником сироватки крові лише імунізованих тварин.

Таблиця 2

Вплив гетероциклічних аналогів ГМДП на міграційну здатність та фагоцитарну активність перитонеальних макрофагів мишей лінії СВА (М ± т)

№ Умови досліду Радіус спонтанної міграції макрофагів Фагоцитарне Фагоцитар- Індекс завершеності

п/п інтактних тварин імунізованих тварин число, % ний індекс фагоцитозу

1. Контроль (0.9% розчин натрію хлориду) 16.7+3.14 — 43.3±2.73 3.60+0.29 0.977+0.057

2. Контроль (БЦЖ) — 26.7+3.85* — — —

3. ГМДП 5 мг/кг 16.5+2.95 38.3+1.64** 52.7+8.91* 4.28Ю.19* 0.68810.058*

4. ВГД 1395 ГА (0.1 ЛД*П) 13.912.52 29.7±3.85* 44.7±3.72 3.85+0.18 0.939+0.095

5. ВГД 1395 ГА (0.01 ЛД*п) 17.2+4.55 27.7+4.08* 44.5+4.99 3.84Ю.18 0.91010.064

6. ВГД 1395 ГА (0.001 ЛД*П) 14.7+3.06 26.7±5.78* 42.2+3.11 3.7710.33 1.01410.125

7. ВГД 1396 ГА (0.1 ЛД™) 18.0+4.34 29.0l4.37* 45.114.60 3.76+0.27 0.931Ю.083

8. ВГД 1396 ГА (0.01 ЛД*П) 16.5+5.58 28.9l3.71* 48.014.62 3.95+0.16* 0.94210.071

9. ВГД 1396 ГА (0.001 ЛД=;п) 15.6+4.95 26.513.49* 44.5+2.78 3.63і0.25 0.957+0.075

10. ВГД 1398 ГА (0.1 ЛД^п) 18.1+3.43 31.4+3.76** 49.0+5.17* 3.98Ю.34* 0.893+0.070*

11. ВГД 1398 ГА (0.01 ЛД*п) 17.0+2.72 32.8l3.26** 51.815.50* 4.07+0.17* 0.767+0.096*

12. ВГД 1398 ГА (0.001 Л,ІЦп) 14.5+2.82 23.5+3.11* 48.3+6.26 3.73±0.24 0.84210.116*

Примітка: * - Р < 0.05 у порівнянні з першим контролем

** - Р < 0.05 у порівнянні з першим і другим контролем

□ - первинна відповідь □ - вторинна відповідь

Рис. 1 Вплив гетероциклічних аналогів ГМДП на гуморальну імунну відповідь до БСА 1 - титр антитіл до БСА (контроль); 2 - до БСА + ГМДП;

З, 4, 5 - до БСА + ВГД 1395 ГА (0.1, 0.01, 0.001 ЛД50);

6, 7, 8 - до БСА + ВГД 1396 ГА (0.1, 0.01, 0.001 ЛД50);

9, 10, 11 - до БСА + ВГД 1398 ГА (0.1, 0.01, 0.001 ЛД50).

Рис. 2 Вплив дози гетероциклічних аналогів ГМДП на вторинну гуморальну відповідь до БСА 1 - контроль (БСА), 2 - ВГД 1395 ГА,

З - ВГД 1396 ГА, 4 - ВГД 1398 ГА.

В експериментах in vivo нами встановлено, що за характером впливу на гуморальну ланку імунітету речовина ВГД 1398 ГА та еталонний препарат-ГМДП, не відрізняються поміж собою. Обидві сполуки стимулюють як первинну, так і вторинну гуморальну імунну відповідь. Проте, і в цих тестах, ГМДП, при одночасному антигенному навантаженні, виявив більшу активність стосовно стимуляції антитілогенезу. Свідченням цього є значно вищі показники середнього log2 титру антитіл у сироватці крові мишей як після імунізації, так і після реімунізації.

За даними реакції пасивної гемаглютинації після введення речовини ВГД 1398 ГА, стимуляція вторинної гуморальної імунної відповіді складає 66.9 % а відповідної активності еталонного препарату - ГМДП.

В умовах проведених дослідів речовини ВГД 1395 ГА та ВГД 1396 ГА, у використаному діапазоні доз, не впливають суттєво на утворення антитіл до БСА. Так, стимулюючий ефект сполуки ВГД 1395 ГА склав лише 9.9 %, а сполуки ВГД 1396 ГА -19.1 % аналогічної активності ГМДП.

Поряд з тим, нами встановлено, що при застосуванні всіх трьох гетероциклічних аналогів ГМДП, простежується залежність інтенсивності їх дії від дози (рис. 2). Свій максимальний стимулюючий ефект речовини проявляли у дозі, рівній 0.01 їх ЛД50, а в десятикратно зменшеній дозі (0.001 ЛД50) середній log2 титру антитіл у сироватці крові мишей зменшувався до контрольного рівня.

Результати проведених досліджень показали, що жоден з оригінальних аналогів ГМДП не виявляє значущого впливу на специфічну реактивність клітинного типу (табл. 3). Зокрема, сенсибілізація мурчаків БЦЖ на фоні імуномодуляції гетероциклічними аналогами ГМДП, викликала, після введення туберкуліну, виражену шкірну реакцію гіперчутливості уповільненого типу, проте остання за ступенем вираженості, не відрізнялась від аналогічної реакції контролю. Показники клітинного імунітету визначені in vivo, корелюють з результатами досліджень in vitro, оскільки здатність синтетичних аналогів ГМДП, у всіх використаних дозах, стимулювати продукцію сенсибілізованими лімфоцитами фактора, що пригнічує міграцію макрофагів, була невірогідною.

Еталонний препарат-ГМДП, не впливаючи на шкірну реакцію гіперчутливості уповільненого типу до БЦЖ, виявив здатність стимулювати утворення фактора, який пригнічує міграцію макрофагів.

Таким чином, проведений імунологічний скрннінг гетероциклічних аналогів ГМДП дозволив нам виділити із трьох досліджуваних сполук одну - глюкозамонійну сіль дикарбонової кислоти пептидної природи, наділену фагоцитозостимулюючою та ад’ю-вантною активністю.

Таблиця З

Вплив гетероциклічних аналогів глюкозамінілмурамілдипептиду та еталонного препарату-ГМДП на клітинну імунну відповідь

на БЦЖ (М ± ш)

№ п/п Умови досліду Індекс шкірної реакції ГУТ Показники РГММ

міграційний індекс, % відсоток гальмування міграції

1. Контроль (0.9 % розчин натрію хлориду) — 101+4 —

2. Контроль (БЦЖ) 1.83+1.16 54±7 46.2±7.01

3. БЦЖ+ГМДП (5 мг/кг) 2.00±1.26 38+7* 62.4±6.68*

4. БЦЖ+ВГД 1395 ГА (0.1 ЛД^П) 2.17±0.41 49+7 51.5±7.29

5. БЦЖ+ВГД 1395 ГА (0.01 ЛД^Л) 2.00±0.63 46±7 54.4±6.99

6. БЦЖ+ВГД 1395 ГА (0.001 ЛД™) 1.67±0.52 55+6 45.2+5.67

7. БЦЖ+ВГД 1396 ГА (0.1 ЛД^П) 2.20±0.75 56±6 44.2±5.78

8. БЦЖ+ВГД 1396 ГА.(0.01 ЛД=;П) 1.50±1.05 . ,54+8 46.4±7.73

9. БЦЖ+ВГД 1396 ГА (0.001 ЛД^П) 1.67±1.21 56±4 44.1±3.58

10. БЦЖ+ВГД 1398 ГА (0.1 ЛД=;п) 2.00±0.76 48±4 51.6±3.93

11. БЦЖ+ВГД 1398 ГА (0.01 ЛД*П) 1.75+0.89 47±7 53.3+7.21

12. БЦЖ+ВГД 1398 ГА (0.001 ЛД^П) 1.50+1.07 51+8 49.1±7.52

Примітка: * - Р < 0.05 у порівнянні з другим контролем

Відомо, що інтенсивність та якість імунної відповіді принципово залежить від первинної фагоцитарної відповіді, яка спрямована на антигенну та імунологічну презентацію гетерогенного фактора з анитигенннми властивостями (Сохін A.A., 1984). Оскільки нами було показано, що названа сполука активно стимулює макрофагальну ланку імунного процесу, можна припустити, що наявність у неї ад’ювантної активності зумовлена саме цим фактом. У своїй оптимальній дозі - 25 мг/кг, вона здатна гарантувати фагоцитозостимулюючий ефект, що забезпечує подальші проліферативні та функціональні властивості імунокомпетентних клітин.

Одним із завдань нашого пошуку було встановлення наявності

та характеру взаємозв’язку поміж імунотропною активністю та хімічною структурою в ряді синтетичних аналогів ГМДП.

В результаті проведеного імунофармакологічного скринінгу гетероциклічних аналогів ГМДП було встановлено, що, в залежності від амінокислотного складу пептидних фрагментів молекул, розглянуті сполуки впливають неоднозначно на стан імуно-реактивності.

Так, сполука ВГД 1398 ГА, у пептидному фрагменті молекули якої містяться обидві амінокислоти, які входять до складу ГМДП (аланін і глютамінова кислота), наділена вираженою ад’ю-вантною активністю і здатна посилювати функціональну активність макрофагів. Заміна такого пептидного фрагмента молекули лише однією із двох амінокислот (альфа-аланіном у сполуці ВГД 1395 ГА та глютаміновою кислотою у речовині ВГД 1396 ГА) призвела до різкого зниження вказаних видів активності.

Встановлений нами факт взаємозв’язку поміж ад’ювантністю синтетичних гетероциклічних аналогів глюкозамінілмурамілди-пептиду, їх здатністю стимулювати фагоцитоз і наявністю в їх структурі одночасно обох амінокислот, а також значне зменшення імунотропної активності при заміні пептидного фрагмента на моноамінокислотний, узгоджується з відповідними даними літератури (Андронова Т.М., 1991).

3. Вплив синтетичних пептидогліканів на деякі біохімічні показники сироватки крові, що відображають функціональний стан печінки

З огляду на те, що виявлений на етапі специфічного (імунологічного) скринінгу біологічно активний гетероциклічний аналог ГМДП є оригінальною синтетичною сполукою, а випробування на гепатотоксичність є одним із найважливіших аспектів у вивченні нових біологічно активних сполук, останній етап нашої експериментальної роботи присвячено дослідженню, у порівняльному аспекті, впливу на печінку речовини ВГД 1398 ГА та еталонного препарату-ГМДП.

Оскільки дані літератури (Хазанов А.И., 1988) свідчать,' що медикаментозні гепатопатії найчастіше супроводяться цитол’ітич-ним, або холестатичним синдромами, то обрані нами для використання біохімічні тести передбачали визначення наявності, або відсутності цих синдромів:

У ході цих експериментів було встановлено (табл. 4), що обстежені нами сполуки впливають неоднозначно на ферментне Vдзеркало» сироватки крові та інші біохімічні показники функ-

ціонального стану печінки.

Таблиця 4

Вплив синтетичних пептидогліканів на функціональний стан печінки (М ± т)

Показник Умови досліду

Контроль ГМДП 5 мг/кг ВГД 1398 ГА 250 мг/кг ВГД 1398 ГА 25 мг/кг

Альбумін (г/л) 39.30±5.32 33.9012.18* 34.3012.89 35.5014.06

Загальний білок (г/л) 67.70±3.58 58.0014.25* 64.3014.11 64.8019.05

Загальний біліру-бін(мкмоль/л) 11.70+1.52 12.30+2.34 13.00+2.49 12.4012.28

Прямий білірубін мкмоль/л) 1.70±0.99 2.6010.99 2.50+0.80 2.2011.04

АлАТ (МО/л) 56.29±13.00 17.94115.71 47.02110.28 55.11114.61

АсАТ (МО/л) 245.46179.92 262.23189.88 283.61144.28 268.93+78.67

ЛДГ (МО/л) 2014.51380.2 2344.91499.8 2586.11205.8* 2202.71450.7

ЛФ (МО/л) 246.9165.8 538.11200.3* 265.8186.3 234.7199.0

ГГТП (МО/л) 4.1+2.1 12.316.3* 5.112.3 4.311.7

Сечовина (ммоль/л) 5.9010.80 4.10+1.51* 5.20+2.28 4.90+1.12

Холестерол (ммоль/л) 1.7310.29 2.2510.57* 1.7310.53 1.9610.41

Тригліцериди (ммоль/л) 1.2010.27 2.5511.16* 1.79+0.62 1.66+0.68

Глюкоза (ммоль/л) 6.4610.67 6.3010.58 5.4310.76* 6.5110.90

Примітка: * - Р < 0.05 у порівнянні з контролем

Так, ГМДП підвищував активність ЛФ у сироватці крові щурів у 2.2 рази, тоді як сполука ВГД 1398 ГА не змінювала активності названого ферменту ні у дозі 25 мг/кг (0.1 ЛД50), ні у десятикратно збільшеній дозі. Речовина ВГД 1398 ГА у двох використаних дозах не змінювала активності ГГТП, тоді як ГМДП посилював активність цього багатоцільового ферменту-індикатора у порівнянні з контролем у 3 рази. Вплив ВГД 1398 ГА на активність ЛДГ зводився до зростання активності ферменту при застосуванні цієї сполуки у дозі 250 мг/кг та зменшення активності ЛДГ до контрольного рівня після десятикратного зменшення дози. ГМДП не викликав суттєвих змін активності ЛДГ. Дослід-

жені синтетичні пептидоглікани, у використаних нами дозах, не змінювали активності амінотрансфераз. Під їх впливом активність АлАТ і АсАТ мало відрізнялась від контрольних показників. Незначне пониження активності АлАТ під впливом ГМДП і речовини ВГД 1398 ГА у дозі 250 мг/кг виявилось невірогідним.

Таким, чином нами встановлено, що із двох досліджуваних сполук лише ГМДП виявився здатним підвищувати активність сироваткових ферментів^індикаторів холестазу: ЛФ і ГГТП. При цьому показники активності головних і надійних показників печінкового цитолізу - амінотрансфераз не відрізнялись від контрольних. Поряд з тим, після повторних введень ГМДП у сироватці крові щурів помірно (проте вірогідно) зростала концентрація ліпідів - холестеролу та тригліцеридів. Відомо, що гіпер-ліпідемія супроводить явища холестазу, а її ступінь залежить від тривалості цього процесу (Подьімова С.Д., 1984).

Загальний і, особливо, кон’югований білірубін теж служить важливим індикатором цього типу ушкоджень печінки, оскільки, при гострому холестазі, їх вміст у крові суттєво зростає. Обидві досліджені нами сполуки не змінювали концентрації у сироватці названих показників пігментного обміну. Проте відомо, що в окремих випадках підвищення загального і кон’югова-ного білірубіну може помітно відставати від змін активності ГГТП, ЛФ та рівня гіперліпідемії (Хазанов А.И., 1988).

Встановлене нами зниження концентрації загального сироваткового білка та, зокрема, альбуміну під впливом ГМДП свідчить про ймовірний негативний вплив цієї сполуки на синтез печінкою протеїнів.

Однак, можна також думати і про інші причини гіпопротеїне-мії, виникаючої під впливом ГМДП. Відомо, що численним медикаментозним засобам притаманні властивості гаптенів. В організмі вони утворюють комплекси з білками сироватки крові або тканин. У вільному стані, не зв’язані з білком гаптени не здатні сенсибілізувати організм; ця властивість проявляється лише після з’єднання їх молекул з білками організму (Пьїц-кий В.И., 1984). Встановлені нами факти наявності сенсибілізуючої дії у ГМДП і пониження концентрації протеїнів у сироватці крові під впливом цього препарату, можливо взаємозв’язані між собою.

Аналіз встановлених фактів свідчить, що рекомендований Сет-діковою Н.Х. і співавт. для клінічного застосування ефективний імуномодулятор ГМДП може сприяти появі медикаментозного холестазу. Враховуючи те, що ГМДП не впливає на активність

ферментів-індикаторів цитолізу, а також беручи до уваги встановлений у наших попередніх дослідах та співпадаючий з даними літератури (Захарова Н.С. і співавт., 1991) факт його сенсибілізуючої дії, можна вважати, що виникаючий ^олестаз є результатом непрямого, алергенного впливу ГМДП на печінку.

ВИСНОВКИ .

1. Гетероциклічні аналоги глюкозамінілмурамілдипептиду, речовини ВГД 1395 ГА, ВГД 1396 ГА та ВГД 1398 ГА, є малотоксичними сполуками, позбавленими алергізуючої, місцевоподразнюючої та пірогенної активності.

2. Одноразове внутрішньоочеревинне введенення мишам лінії СВА, речовини ВГД 1398 ГА, у дозах 250 та 25 мг/кг, і еталонного препарату глюкозамінілмурамілдипептиду (ГМДП) у дозі 5 мг/кг, призводить до стимуляції макрофагальної ланки імунної відповіді, про що свідчить посилення здатності макрофагів перитонеального ексудату цих мишей мігрувати, захоплювати, переробляти і знешкоджувати антигенний матеріал.

3. Введення речовини ВГД 1398 ГА у дозах 250 та 25 мг/кг, або еталонного препарату-ГМДП, у дозі 5 мг/кг, одночасно з бичачим сироватковим альбуміном викликає стимуляцію первинної і вторинної гуморальної імунної відповіді, підвищуючи у сироватці крові мишей лінії СВА титр антитіл до названого антигену.

4. Досліджувана речовина ВГД 1398 ГА виявляє залежну від дози імуностимулюючу активність: її ад’ювантна і стимулююча фагоцитоз дія проявляється в діапазоні доз 250-25 мг/кг, є максимальною у дозі 25 мг/кг і не проявляється у десятикратно зменшеній дозі.

5. Характер дії ГМДП та сполуки ВГД 1398 ГА, на макрофагаль-ну та гуморальну ланки імунної відповіді якісно не відрізняється між собою, проте еталонний препарат-ГМДП проявляє дещо сильнішу ад’ювантну та стимулюючу фагоцитоз активність.

6. Вплив речовини ВГД 1398 ГА, у всіх використаних дозах, на клітинний імунітет виражений слабо, або відсутній, тоді як еталонний препарат-ГМДП, у дозі 5 мг/кг, не впливаючи на ступінь вираженості реакції гіперчутливості уповільненого типу, стимулює утворення синсибілізованими лімфоцитами фактора, який пригнічує міграцію макрофагів.

7. Імуностимулююча активність гетероциклічних аналогів ГМДП перебуває у взаємозв’язку з їх хімічною будовою і зумовлена

наявністю у складі пептидного фрагмента молекули цих сполук одночасно обох амінокислот (аланіну і глютамінової кислоти), що входять до складу ГМДП. Заміна пептидного фрагмента молекули на моноамінокислотний призводить до втрати сполуками ВГД 1395 ГА та ВГД 1396 ГА названої активності.

8. Синтетична сполука ВГД 1398 ГА, у дозах 250 мг/кг та 25 мг/кг, позбавлена значущого впливу на ферментну активність та інші біохімічні параметри сироватки крові, які віддзеркалюють функціональний стан печінки. ГМД11, у дозі 5 мг/кг, викликає зростання активності у сироватці крові щурів лужної фосфатази і гамма-глютамілтранспептидази, тобто ферментів-індикаторів холестазу.

9. Враховуючи виявлену нами імуномодулюючу активність сполуки ВГД 1398 ГА - гетероциклічного аналога ГМДП, та відсутність у цієї речовини загальнотоксичного та, зокрема, негативного впливу на печінку, можна вважати перспективними подальші пошуки активних речовин пептидної природи серед синтетичних гетероциклічних аналогів ГМДП.

СПИСОК РОБІТ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Імунотропні властивості синтетичних аналогів глюкозамінілмурамілдипептиду //II Українська науково-практична конф. «Актуальні проблеми клінічної імунології». - Львів, 1996. -С. 38.

2. Синтез та токсикологічне вивчення потенційних імуномодулю-ючих засобів, гетероциклічних аналогів мурамілпептидів // Міжрегіональна науково-практична конференція «Актуальні питання фармацевтичної науки та практики». - Запоріжжя, 1995. - С. 26 (співавт.: В.Я. Горішній, І.О. Нектєгаєв).

3. Токсикологічне дослідження синтетичних аналогів глюкоза-мінілмурамілдипептиду //І Національний з’їзд фармакологів України. - Полтава, 1995. - С. 181 (співавт.: ВЛ. Горішній, І.О. Нектєгаєв).

4. Синтез та імунотропні властивості гетероциклічних аналогів глюкозамінілмурамілдипептиду (ГМДП) // Фармацевтичний журнал. - 1996, № 4. - С. 61-66 (співавт.: В.Я. Горішній, ММ. Бідюк).

5. Вплив синтетичних глюкозамінілмурамілпептидів на функціональний стан печінки // Ліки. - 1996. - № 3. - С. 99-103 (співавт.: Р.В. Рудий, В.Я. Горішній).

6. Синтез, фармакологічна активність та імунотропні властивості гетероциклічних аналогів глюкозамінілмурамілдипептиду //

Актуальні проблеми медицини, біології, ветиринарії і сільського господарства. - Львів, 1996. - С. 64-65 (співавт В.Я. Горішній, Р.В. Рудий, М.М. Бідюк).

7. Вплив гетероциклічних аналогів глюкозамінілмурамілдипеп-тиду (ГМДП) на макрофагальну активність // Фізіологічний журнал. - 1996. - 42, № 3-4. - С. 52-53 (співаєш.: М.М. Бідюк, А.М. Гаврилюк, ВЛ. Горішній).

АННОТАЦИЯ

Чикайло И.П. «Иммуно- и гепатотропная активность синтетических аналогов глюкозаминилмурамилдипептида».

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 - патологическая физиология. Львовский государственный медицинский университет, Львов, 1996.

Среди трех гетероциклических аналогов глюкозамшшлмура-милдипептида (ГМДП) выявлен активный иммуностимулятор -глюкозамонийная соль дикарбоновой кислоты пептидного характера. В эксперименте на животных установлена способность этого оригинального вещества активировать фагоцитарную активность макрофагов и проявлять адъювантное действие на гуморальный иммунный ответ на тимусзависпмый антиген. Установлена корреляция между строением аналогов ГМДП, их дозой и адъювантностью. В отличие от своего структурного предшественника - препарата-ГМДП, обладающего аллергенными свойствами и способностью вызывать явления медикаментозного холестаза, новый потенциальный иммуностимулятор лишен общетоксической и гепатотоксической активности. Показана целесообразность и перспективность дальнейших изысканий новых иммунотроп-ных веществ среди гетероциклических аналогов ГМДП.

Ключевые слова: мурамилпептцды, иммунитет, адъювантность, фагоцитоз, гепатотропность.

SUMMARY

Chykailo I.P. Synthetic analogs of glucoaminilmuramyldipeptid immune activity and impact on liver.

The thesis lias been presented for the candidate of medical science degree in pathological physiology (14.03.05). L’viv State Medical University.

Among three heterocycled analogs of glucoaminilmuramyldipep-

tid (GMDP) active immunostimulator of peptic nature, glucoammo-nic salt of bicarbonic acid has been found.

Ability of that original substance to increase phagocytic activity of macrophages and display adjuvant impact on gumoral immune responce to thymic-dependent antigen has been revealed in animal experiments. Correlation between the structure of analogs of GMDP, their doses and adjuvant properties has been turned out. Unlike the previous structural analog of GMDP that had allergic properties and ability to oause cholestasis, the new potential immunostimulator did not show toxic activity in general and the he-patotoxic one in particular. Necessity and perspective for further investigations of new immunomodulators among the heterocycled analogs of GMDP has been proved

Key words: muramyl peptids, immunity, adjuvanticity,

phagocytosis, hepatotropism.