Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение влияния алкоголя на развитие имммунного ответа при патологии печени

министерство здравоохранения российской федерации

курски?» государственный ордена трудового красного знамени • медицинский институт

На правах рукописи

смахгш михаил юрьевич

изучение влияния алкоголя на развитие иммунного ответа при патологии печени

14.00.36. Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Курск - 1992

Работа

выполнена в Курском государственном ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте.

Научный руководитель:

- доктор медицинских наук, профессор А. И. Конопля

Официальные оппоненты:

- доктор медицинскких наук, профессор 1й А. Блинков;

- кандидат медицинских наук В. Я Ишков.

Ведущее учреждение:

Институт иммунол гии МЗ РФ , г. Москва

Защита диссертации состоится в " 15 "час.

на васедании специализированного совета К 084.57.01 при Курском государственном медицинском институте ( 305033, Курск, ул. К. Маркса, 3} . . .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Курского государственного медицинского института ( 305033 , Курск, ул. К. Маркса, 3)

Автореферат разослан " -г " отжря 1992г.

\

Ученый секретарь \

специализированного совета, V Л \

Доцент , Е в- 'каиков 3

, ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЕ Актуальность темы. Злоупотребление алкоголем и алкоголизм являются одчими из важнейших причин смертности, населения.Одновременно с каждым годом возрастает вероятность экологических катастроф и токеи- ' ческих отравлений. В реальной жизни нередко возникают ситуации, когда токсическое поражение печени осложняется употреблением пациентом алкоголе, или когда йа фоне хронического алкоголизма организм подвергается воздействию гепатотропных веществ ( химическое производство, сельскохозяйственные работы с применением пестицидов, и гербицидов, бытовые отравления).

В этих условиях изучение иммуннологической реактивности организма приобретает особую актуальность,так как она.существенно нарушается при токсических или алкогольных поражениях печени (Алексеева H.R и др. ,1991, Hldaka К. 1988, Deviere V.at al.1988, Esperza Rät al. 1988). Это связано непосредственно с жлм.чти реактивность иммунной системы на различные антигены при разнообразных фЬрмах патологии печени или в условиях алкоголизации играет существенную роль в те организма от экао- и эндогенной инфекции,в развитии аутоиммунных ослс -мений.в эффективности восстановительных процессов в пораиенном органе (Мельников О. Ф. и др. ,1989, Арцимович Е Г. и др. ,1991).

Изменения иммунологической . реактивности на экзогенные и эндогенные антигены в условиях патологий' в значйтельной степени зависят от наличия и активности гуморальных иммуномодулирущих факторов (Конопля А. И. ,1989, Афанасьев В. А. ,1991). В развитии иммунього ответа при токсической гепатопатии или в условьлх потребления алкоголя, принимают участие сывороточные-и сплен'оцнтсрные иммуномодулирую-щие факторы (Авдеева Л. С. и др. 1989, Softie К. at al.1985). •

В настоящее время не до конца изученным остается вопрос с том, как будет изменяться иммунологическая реактивность организма при совместном поступлении в организм гепатотропных веществ и алкого-

"* - 2 -

ля. Открытым остается вопрос о механизмах взаимодействия иммуномоду-лирущих факторов при токсическом поражении печени на фоне алкогольной интоксикации. Не ясно, действие каких факторов окажется преобладающим в этих условиях и какими механизмами будет контролироваться их выделение,а также каким путем можно воздействовать на накопление юшуномодулирующих факторов с целью коррекции иммунного статуса организма в этих условиях.

Целью работы 'было изучение иммунного ответа, .индуцированного • Т-гависимш антигеном, при сочетанном действии на организм гепатот-ропкого яда и этанола,а также поиск средств коррекции иммунного ответа при этом состоянии.

Основные аадачи работы:

1. Изучение закономерностей развития гуморального иммунного ответа (ГШ), индуцированного .эритроцитами барана (ЭБ),при воздействии этанола в условиях острого и хронического токсического поражения печени.

2. Установление особенностей формирования гиперчувствительности замедленного типа (гзт) на ЭБ ,;ри сочетанном введении тетрахлормет»-на (ТХМ) и этанола. ' .

3. Изучение выделения иммуномодулирующих - факторов под влиянием этанола клетками селезенки животных с токсической гепатопатией.

4. Выяснение начичия и характера взаимосвязи между иммуномодули-РУ здши факторами селезенки у аякоголйзированных крыс в условиях "оксического сражения печени.

5. Получение аш выворотки ('-;) к белкам клеток селезенки, в состав которых входят иммуносупр-'ссйрушле ф-чторы,и использование ее для -»учения изменений иммунологической реактивности крыс под воздействием атанолч на фоне экспериментальной пат^ллгии печени,

Новые научные положения. выносимые ил 'защиту. . 0

. - Сочетадное введение ТШ и Зтанола значительно угнетает развитие

ГЙО и ГЗТ на ЭБ. "

В условиях алкогольной интоксикации и токсического поражения печешл клетки селезенки выделяют как иммуностимулирующие фаИторы.так и иммуносупрессирущие субстанции» отличающиеся по некоторым физи- ' ко-химическим свойствам. , '

филилающие к стеклу спленоциты животных, подвергнутых воз-дейст. лю ТХМ и этанола, выделяют а над осадочную жидкость клеток се-, лезенки (НЖКС)" иммуностимулирующие факторы, а неприлипаадие-имму-' носупресснрующие. '

Выделение иммуйостимулирущих и иммуносупрессируюцих факторов в условиях совместного введения гепатотропного яда и этанола контролируется системой обратньос отрицательных связей.

Введение Ас к иммуносупрессирухадм факторам к Ж нормализует иммунологическую реактивность на ЭВ животных,одновременно получавших ТХМ и этанол.

• Практическая значимость. Рас трены представления о развитии различных форм иммунного ответа при сочетанием действии этанола и гепатотропного яда Получены данные о системном характере гуморальных, факторов' клеток- селезенки животных* под влиянием этанола на фоне токсического поражения печени, углубляющие' существующие представления * р механизмах сохранения иммунологического гомеостаза-в условиях патологии печени. ■ . / . • ■-. 4

Получека Ас к фракции белков спленоцитов, в состав которых входят иммуносупрессируящие субстанции. Обоснована целесообразность ис-польэования данной Ао для коррекции икмуно.:огь .еской реактивное^ -си . в услозиях , эксперимента при сочетшгаом поражении организма этанолом и гепатотропным ядом ,и в качестве инградиента по- дальнейшему изучению патогенеза заболеваний печени.. _ ...

Предложены и вне дрену " Способ коррекции иммунного ответа'

при алкогольной иммуноеупресеии" , "Способ коррекции иммунного ответа !.,,и токсической гепатопатии " ."Способ стимуляции гуморального иммунного отЕета

Апробация работы. Основные положения "диссертации были обсуждены на конференции молодых ученых Курского государственного медицинского института(Курск,1969}, на научно-практической конференции "Актуальные вопросы хирургической гастроэнтерологии" ( Курск, 1991 ), на научно-практической конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета Курского медицинского института (Курск, 1991 ),на итоговой научной конференции Курского государственного медицинского института,посвященной вопросам общей и прикладной иммунологии (Курск,1991), на 1 Российском съезде иммунологов (Новосибирск, 1992),на совместном заседании кафедр биологической химии и биоорганической химии Курского государственного медицинского института (1992).

Публикации.. По материалам диссертации опубликовано 4 работы. Обьем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 1 и 2), материалов и методов (глава 3), результатов собственных исследований (главы 4-8), заключения, выводов и списка литература

Работа изложена ни Л/ страницах машинописи. Текст включает 26 таблиц, 5 рисунков, б фотографий , указатель использованной литературы, содержащей /10 источников отечественна 1 и ист шиков зарубежной литературы.

содержание работы.

ЫЛ 2РИАДЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проведены нн 1645 крисах Вистар массой 120-200 г и .на 15 беспородных кроликах массой 2,0-3,0 кг. &ъоктами исследования

• - 5 -

¿хуж'ли сыворотка крови, »метки селезенки, ткань печени.

острую токсическую гепатопатию (ОТГ) вызывали введением 50Х раствора ТХМ в оливковом масле. Раствор вводили ^ мышцу бедра (меняя лапки черев день) по 3 мл/кг массы тела в течение 5 дней подряд.. • Зфоническое токсическое ьоражение печени вызывали путем внутримышечного введения. БО Г раствора ТХМ по 2 мл/кг в течение 8-22 нед с ин- . гервалом 72 ч.

40 X раствор этанола вводили внутрижелудочно через зонд ежедневно} в течение 10,15 либо 20 дней из расчета Т мл/кг.

В качестве антигена использовали ЭБ. Крыс иммунизировали однок-

9

ратио, внутрибрюшинио в виде 5Х взвеси из расчета 2*10 клеток/кг массн тела. Интенсивность развития ГШ оценивали на 5-й день после иммунизации по количеству клеток в селезенке, образующих антитела к ЭБ (АОК) (Мальберг К., Зигль X ,1987) и числу клеток, образующих иммунные розетки с ЭБ (РОК) (Зауэр X ,1997). ГОТ у крыс индуцировали введением ксеногенных клеток (ЭБ) (Черноусой А. Д. и др. ,1979).

Донорами сыворотки служили кролики, интактные, ^травленные ТЗ&, шюгодиаированннш крысы, а также крысы, подг ргнутне совместному юэдействию ТХМ и алкоголя. Собирали пул сыворотки от 5-6 однородных го опыту крыс и внутрмбргашшно однократно'вводи, л одновременно с ан-'игеном интактным аллогвянда реципиентам из расчета 5 мл/кг.

НЙКС готовили по методу, разработанному Прокопенко ЛГ. и Коноа-я А.Й. (1982). Слленоциты интактных и-опытных животных фракциониро-али. по их способности прилипать к стеклу (Полушкин Э. Ф. и р., 1983). Для Еоддеряакия стерильных условий использовался ламинарт же ЛЕВ (СНГ), Иммуноьзодулируювдто активность ИКС определяли путем деократного внутрибрюетнного введения ее интактным аллогенным реци-интам в дозе 5 мг белка на 1 кг массы.тела, с одновременной пмму-гзацяей ЭЕ Шред введением Н8НС истопили ЭБ.

Спленоцнгарныё белки, находящиеся как в цельной НЖКС, так и в

- 6 - • НЖКС, полученных от фракций прилипающих (ИЖКСП) и неприлипающих {НЖКСН) к стеклу спленоцотоа, фракилоиировали на сефадексе 6-100. цул 1ШКС предварительно концентрировали в 10-12 раз с помощью полиз-тиленгликоля с Ш 40 кД, либо путем лиофшшзации и последующего растворения в определенном объеме буфера Для оценки Ш белков^ Ж!, ¡шкен и НЖКСП, полученных при их фракционировании на сефадексе (5-100, определяли объем выхода белков с известной Ш (Остерман Л. А. ,1983). Для последующего разделения и очистки высокомолекулярных спленоцитарных белкоь, полученных после гель-хроматографии на сефадексе С-1С0, использовалась ионнообменная хроматография на ОЕАЕ целлюлозе. Разделение проводили путем ступенчатого злюирования буферами с воврастающей ионной силой (Остерман Л. А. ,1983). Иммуномодулирующую активность х^оматографических фракций НЖКС, ЯЖКСП и НЖКСН определяли аналогично цельной НЖКС, доза вводимого белка аллогенным интактным реципиентам составила 2 мг/кг.

Для получения Ас к иммуносупрессируквдм факторам НЖКС использовался раэработаннный ранее способ иммунизации (Конопля А. И. и др., 1983). Ас использовали для о. работки НЖКС и внутривенного семикратного (с промежутком в 24 часа) введения ее здоровым и опытным живо1: •

*

ним в дозе 2.б.мл/кг.

Концентрацию белка а сыворотке определяли биуретовым методом»а в НЖКС, НЖКСП, НЖКСН и их хроыатографических фракциях ~ по методу Б{ ¿дфорд (Шишкин С.С. ,1982).

Состоян печени оценивали по активности в сыворотке крови аспартат-(АсТ) и ¡ланинаминотр нсфераа (АлТ), вдэлочной фосфатазь (Шф), концентрации обшрго билирубина, бета-гшопротеидов по Еурштей-ну, общего холестерина по Ильку .выраженности показателе . тимолово{ прсОн.а также по гистологическим исследованиям срезов печени.

Статистическую обработку цифрового 'материала, проводили и>Ч'е) вычисления, средних арифметичве'ких значений ^ их стандартных ошибок.

• - 7 -

Достоверность,различий средних величин оценивали с помощью критериев Стькщента и Внлкоксона- Манна- У:ггни. ,

РЕЗУЛЬТАТЫ МСС.;ЩОЙАНМ '

, ВЛИЯНИЕ Э7АНГ ЧА НА ИММУНОЛОГИЧЕСКУЮ РЕАКТИВНОСТЬ ОРГАНИЗМА В УСЛОВИЯХ ОСТРОГО И ХРОНИЧЕСКОГО ОТРАВЛЕНИЯ ТХМ. О возникновении патологии печени «при отравлении ТХМ в наших ; опытах судили по изменению.морфологический и биохимических показателей в печени и сыворотке крови, пятидневное введение ТХМ приводит к возникновению среднекапельной вакуольной дистрофии гепатоцитов, которая усиливаемся после 12 нед отрав-ения и сопровождается некрозами отдельных гепатоцитов. К 22 нед отравления обнаруживаются узлы регенерации и развитие прослоек соединительной ткани. В сыворотке крови через Б дней введения гепатотропного ада повышается активность АсТ, ' 'АлТ , Щф , развивается гипербилирубинемия, увеличивается концентрация бета-липопротеидов, повышается тимоловая проба, снижается концентрация .. холестерина. В условиях хронического травления организма ТХМ в сыворотке крови повышается активность АлТ и ВД>, наблюдается гипербилирубинемия, гиперхолестеринеми'я и снижение уровня бета-липоп- • ротеидов.В то кз время не отмечено изменения активности АсТ,на уров-. не контроля находится тимоловая проба..Изменения в описанных биохимических. показателях свидетельствуют о возникновении выраженных синдромов цито лгаа, холестааа, печен^чно-клеточяой недостаточности и воспалений как"в условиях острого,так и хроньчастого отравления организма ТХМ (З&занов А. И, 1988). .*

При изучении влияния ТХМ на развитие иммунного ответа установлено, что кратковременное (в течение 5 дней) и длительное (в течение 8 или 12 нед) введение гепатотропного' яда сопровождается усилением развития ГЙО и ГЗХ,индуцированных ЭБ. Введение ТХМ в течение 22 нед,

; • - 8 -..•;••■,. приводящее к раавитию цирротическмх изменений в печени, не влияло на

формирование ГИО и ГЗТ.

• Введение этанола в течение 10, 15 или 20 дней приводит к развитию гипертрофии гепатсццтов,увеличению их ядер и ядрышек, повшютш количества двуядерных гепатоцитов.что свидетельствует об активизации

■ восстановительных процессов в печени в о-хвзт на введение этанола.

При изучении влияния алкоголя ла иммунологическую реактивность установлено, что введение этанола в течение 10, 15 или 20 дней суп-рессирует развитие ГИО, причем более ■ выраженное, ингибируюшее действие алкоголь оказывает при его 15 и 20-дневном поступлении, кроме того наибольшее супр^ссирующее влияние этанола проявляется при его поступлении в организм как до, так и пссле введения антигена. Ш вс&й видимости это связано с прямым токсическим действием алкоголя

■ на иммунокомнетентные регуляторше клетки.

Совместное введение ТХМ (5 дней) и этанола (15 дней) сопровождается более вырал-енным поражением печени, о чем свидетельствует образование участков крупиокапелъной (предиекротической) жировой дистрофии гепатоцитов и появление г ш>шого числа некрозов. В сохраненных участках а ответ на введение этанола развивается гипертрофический, процесс. Морфологические исследования подтверждается биохимически-«¡5. Так, совместное . введение этанола и ТХМ в течение 5 дней .сопровождается более выраженным повиакнием активности АлТ.АсТ уровня билирубина, бета-лияепротеидов и холестерина по сравнению с группой живот-• ных, отравленных ТЖ Также более ь. щаженное.поражение печени отмечается при совместном введении крысам этанола и ТХМ в течение 8 и 12 нед. Так ,при вьедении животным только ТХЦ в течение этого'срока фиброй»- изменений не ^наружено.при сочетанием же введении 1Ш и этанола данное явление 1шеет место. .

■ При научении сочетанного воздействия ТХМ и этанола на иммунологическую реактивность установлено / ,что она а значитёльной степени

■ • • - 9 -

снижена. Наиболее выраженной ингибирование ГИО на ЭБ наблюдается при совместном введении ТХМ и этанола, если этанол вводится как до, так и после яммунизацин. Об этом свидетельствует снижение количества АОК в этой группе в 1,7, а РОК соответственно в 2. 9 раза по сравнению с кры-' сами, которым вводилась кипяченая-вода и оливковое масло (таблица 1).

• ■ ' , Таблица 1;

Влияние этанола на развитие ГИО, индуцированного ЭБ, в условиях ОТГ.

н гр \, Ясло^ия опыта йОКдыс/орг. РОК, млн/орг.

1, Иммунизация 30, 22.5 + З.Б 82.9 ± 8.3

2. Введение кипяченой вода и

оливкового масла, 26.8 ± 4.9 89.5 8.6

3. Введение ТХН (ОТГ), 71.3 * 7,5 114.3 + 11.8

Р1,2 < 0,001 Р1.2 < 0,05

4. Введение этанола. ' ■■ 8.9 ± 0.9 • 26.. б + 2.5

Р1.6 < 0,001 Р1.2 < 0^001

5. Введение ТХМ й последующее ввеле- 14.6 ± 1.6 64.5 7.2

ние этанола до к после иммунизации. Р1,'> < 0.05 Р1.2 < 0.05.

6. Последовательное введение этанола - 23,4'ч± 4.2 99.9 + 12,1

и ТХЙ,иммунизация. РЗ V 0,05 РЗ < 0,05

7. •Совместное введение этанола и ТХМ '16.6 ± 2.8 9.1

до иммунизации. . ' . Р1,г < 0.05 РЗ < 0,05

8. Совместное введение ТХМ и этанола . '5 ± 1.4 • 31.4. + 3.4

до и после иммунизации.',. . - Р1.2 < 0.05 Р1.2 < 0.01 •

Йэриалпзация ГИО наблюдается только через 30 дней после последнего введения этанола. Снижение количества ним; нных АОК и РОК отмечается тага® и у животных, получавшие ТХМ в '.ечение 8,12,22 нед и под-, вергнутых 15-дневной алкоголизации. Совместное поступление в организм эхакодз н ГХЫ супреесиру т не только ГИО, но и угнетает развитиё реакция ГЗТ, индуцированной ЭБ.'

Таким образом, как при остром, так и при хроническом отравлевш

• - 10 - • . ' ' ' ТХЫ, введение этанола приводот Л развитию выраженной иммуносуп-рессии, которая носит стойкий характерная как нормализация иммунологической реактивности наступает только черев 30 дней после последней инъекции этанола .

ИШУНОЮД-ЛИРУКЩЕ ФАКТОРЫ СПЛЕН0Щ1Т0В КРЫС, ПОДВЕРГНУТЫХ # СОВМЕСТНОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ ТХМ И ЭТАНОЛА. |

Характер и направленность изменений ГИО в условиях токсического поражения печени ,равно как и при алкогольной интоксикации,в значи- • тельной степени контролируется иммуноыодудируицими факторами иммуно-цитов(Конодл51 А.И. .Прокопенко Л.Г. ,1988;5оП.Ю N. аЬ а1:1985). В связи с этим представляло большой интерес изучение выделяющихся сплено-циуарных факторов в условиях совместного введения в организм этанола и ТХЫ.

Установлено, что введение НККС крыс.отравленных гепатотропным ядом в течение б дней,8 и 12 нед интактным животиьвл,сопфвождаётся стимуляцией ГИО ла 35.1ЯК0 крыс , получавших ТХМ в течение! 22 нед, иммуномодулируицей активностью не обладает. КЖКС,полученная от ал-коголиаированных в течение 15 дней животных,супрэссирует при ' введении инуакткым алло геи ним реципиентам развитие ГИО на ЗБ..НЖКС крыс, подвергнутых совместному воздействию ТХЫ и этанола .также подавляет рааьитие ГИО, индуцированное ЭБ. / •

На основании полученных данных можно было предположить,что исчезновение иммуностимулирующего и появление иммуноаупресс. дующего эффектов связано с выделением, спленоцитами иммуносупрессируквдх • с^станций, при этой было не ясно продолжается ли в эт»х условиях вы-далеки- иммуностимулирующего фактора, В1 ьа: :ог .введением гепатот-ролного яда (Коно. л.А. И. Д&89Ч '

, - С .целью выяснения этих вопросов, было проведено гель-хроматогра-

фическое разделение ШКС на сефадексе G-100 и исследована иммуномо-' дулирукдая активность полученных фракций. При разделении НЖКС крыс, получавших этанол в течение 15 дней , на G-100 получено три фракции.

1-а фракция,соотавлявшая около 60% от. общего количества белка, выходила в свободном объеме колонки и содержала белки с Ш более 100 кД,

2-я (около 10Х белка) содержала белки с Ш 60-80 кД и 3-я (около 307. белКа)-белки с ММ 10-25 кД и менее. Установлено, что иммуносучрее-сирующим эффектом обладает 1-я фракция. - 2-я и 3-я фракции не влияли на раз® тие ГИО, индуцированного ЗВ. .

При разделении на G-100 НЗЖС крыс, получавших зтанол и ТХМ, так-ке получено 3-й франций с тем же процентным содержанием в них белка. 1-я фракция оказывает зыраакнное иммуноеупрессирущее действие на развитие ГЯ0,а 3- 5- Фракция , содержащая белки с Ш 10-25 кД,обладает иммуностимулирующим аффектом .( таблица 2 ). Аналогичные результаты получены при исследовании иммуномодулирующей активности гель-хрома-тографичееких фракций (ГХФ) НЖКС крыс, получавших этанол и подвергнутых хроническому отравлению ТХМ в течение 8 и 12 кед . 1-я фракция НЖКС .алкоголизированных крыс и" отравленных ТХМ в течение 22 нед обладает иммуносуцрессирующим эффектом, 2-я и 3-я фракции иммуномоду-лирувдей активностью,не обладают.

■ ' Интересно было выгнить - какие клетки селезенки выделяют имму-номодулирующие факторы. Для этого спленоциты крыс с ОТГ, получавших -зтанол в ,течение 15 дней,разделяли по'способности прилипать к стеклу г! получали ШЖ.СП и НЖКСН . Установлено, что 3-я ГХФ фракция НЖКСП [содеркаиэя белки с Ш 10-25 кД и менее) обладает иммуностимулирующем }ффе'ктом,в то время как 1-я ГХФ НЖКСН ( содержащая белки с ММ более .00 кД) обладает иммуносупрессируклцей активностью.

Тач»>м образом, при сочетанием действии на организм ТХМ и этано-ia неприлипащие к стеклу спленоциты выделяют высокомолекулярный им-|уносупрессирукадй,фак?ор (факторы) с ММ более 100 кД, а прилипающие

йкидномоддлирдвагая активность гель-хройатографических фракций ИКС

крае с ОТГ.получавших этанол. ' Таблица 2.

В г;;. • Условия опыта АОК,тыс/орган Р'ОК, млн/орган

1, . Ишкцннзация ЗБ ' • 19,6 £ 2-.9 83.2 ± 8.7

2. Введение буфера 24.1 ± 3,6 85.3 ± 8.3

3. Введение Н8КС интакга<х крыс ' 22.8 ± 3,2 87,6 £ 8,9 .

4. ' ; Введение НВКС отравленных ТХМ' крыс 98,7 ± 10,8 147,8 ± 18,6 ;

Р1-3 < 0,001 Р1-3 < 0,01

5. Введение, Н1КС алкоголизированных крыс 7.4 ± 1,1 54,3 +5,8

Р1-3 < 0.05 . Р1-3 < 0,05

6. Введение Й8КС отравленных й алкоголизированных

крыс ; 12,3 1 1.8 62,4 ± 1.7

Р1-3 <0,05 Р1-3 <0,05 '

7. Введение 1-й.фракций Н8КС иктактных крае - 18,6 ± 2,9 . 82,4 ±8.1

8. Введение 2-й фракции НЕКС-интактных крыс- * 19,8 ± 3,1 80,9 ±7,6

• Введение 3-й фракции Н2КС интактных крыс ?0,7 ± 4,1 • , 79,7 ± 8,4

Введение 1-й Фракции НЗКС отравленных и . 8,9 4 1,3 52.6 ± 6.1

И.. алкоголизированных крыс . : . . . Р1-3.7 < 0,05 Р1-3.7 < 0,05

Введение 2-й фракции НЗКС отравленных и 28.5 ± 4-,6 92,3 ± 14,6

алкоголизированных крыс

52, Введение.3-й фракции Н5КС отравлеиых и 114,2 ± 16.2 '

1 алкоголизированных.крыс ; «*.;"- 72,3 ± 9,1

1 , ■ ——:---—-:—» .' ».............•—к—;.— Р1-3.9 < 0.01 Р1-3.3 < 0,03

к стеклу спленоцитн - . ишуностимулирующй фактор (факторы) ' с Ш 10-25 кД. Исходя из полученных и литературных данных, по ЕсеЛ видимости, низкомолекулярный иммуностимулирующий фактор является описанным ранее рабонуклеопроте'идом с Ш 10-12 кД, выделяющийся спленоци-тами в условиях токсического поражения печени ( Конопля А. И. и др. , 1985). •

Представляло большой интерес дальнейшее разделение высокомолекулярных иммуиомодулирующих субстанций ШС. С этой целью 1-я ГХФ НЖКСП и 1-я ГХФ НЕКОЕ (содержащие белки с Ш более 100 кД) были подвергнуты ступенчатому фракционированию на ОЕАЕ целлюлозе. При разделении 1-й ГХФ НЖКСП на ОЕАЕ целлюлозе, получено 4 фракции. 1-я фрак-' ция составила 10 % от общег~ количества белка и-содержала субстанции, имеющие самую высокую г.воэлектрическую точку (р!) среди веек белков ШЖСП. Следующие фракции выходили в порядке увеличения ионной силы элюентов, а, бледовательно, в порядке уменьшения изоэлектрнчзских точек белков, содержащихся в этих фракциях. На долю 2-й, 3-й и 4-й фракций приходилось соответственно по 10 %, ' 20 % и 60 X от общего количества белка. Дальнейшее увеличение ионной силы элюента не приводило к появлению в нем белка. Таким образом, .весь белок НйКСП был десорбироваь е колонки. Основная масса белка выходила в составе 4-й фракции, которая условно была названа наш фракцией "кислых" белков. При. разделении 1-й ГХФ ШКСН на БЕДЕ целлюлозе так;«э получено 4-е фракции,с тем ив процентным содержанием белка а них. Основная масса бе ка (60%) выходила,в составе "кислых" белкоз. При изучении иммуномодулирущей активности полученных ионообменных фракций установлено, что 3-я ионообменная фракция НЖКСП обладает иммуностимулирующей активностью на развитие ГШ, индуцированного ЭБ у штатных крыс, а 1-я и 4-й фракции ШКСН обладают выраженным иммуносупресси-

л

рующим действием. Необходимо отметить,что цельная 1-я ГХФ НЖКСП не вызывает статистически- достоверного повышения ГКО на ЗБ у интактных

- И'-". _

крыс, что, видимо, связано с присутствием в ней иммуносупресси-рующих примесей,которые выделяются неприлипающими к стеклу спленоци-тами и лишь дальнейшее разделение; и очистка позволяют выявить иммунс стимулирующий фактор. Полученные в тех же условиях фракции ШКС крыс с хроническим поражением печени ТХМ в течение 8 нед й алкогольной интоксикацией,оказываю? те же иммуномодулирующие эффекты.

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что в условиях как острого, так и хронического-отравления организма ТХМ и введения этанола спленоцитами выделяется ряд факторов. Причем два высокомолекулярных ишуносупресеируюадй фактора с ММ более 100 кД ("кислый" и "основной") выделяются неприлипаюшями к стеклу спле-ноцитами. Прилипающими к стеклу клетками селезенки выделяются высокомолекулярный с ММ более 100 кД и низкомолвкулярный с ММ 10-25- ^иммуностимулирующие факторы. Иммуносупрессорные субстанции в целом,по-видимому, или более активны,или их количество преобладает, поскольку цельная ШКС, подвергавшаяся хроматографическому разделению обладает вьфаженной иммуносупрессируювдей активностью. : ; '

Длительное устойчивое подавление иммунного ответа, .обусловленное иммуносупресеорными спленоцитарными фшсторами в условиях соче-танного воздействия гепатотропного яда и этанола может привести к возникновению вторичных инфекций, снижению уровня регенераторных процессов в пораженном органе, что в целом осложнит течег;:е и, исход патологического процесса в печени.

взаимосвязь тгаомодулирувдих факторов сгашнрдитов у животных,

ПОДВЕРГНУТЫХ СОЧЕТАННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ ТХМ И.ЭТАНОЛА.

Выявление спденоцитарных иммуномодулирувдих факторов алкогодй-экрованных кры: с Токсическим поражением печени, " закономерно поста-гг.-.: ..-.--¡рос о взаимосвязи этих-Факторов и механизмах, контролирует*« 1'л . •.. -л^чий. Нами было изучено влияние супреосирующих факторов (СО)

(выходящих в составе 1-й ГХФ НЖКОН) и иммуностимулирующего (НИФ) (выходящего в составе 3-й ГХФ НЖКСП) на развитие ГКО у крыс раздельно или сочетаний получавших ТХМ и этанол.

Пятикратное введение крысам с ОТГ фракций ННКС,содержащих СФ или ШФ приводит к существенному снижению ГКО у животных с ОТГ. Введение СФ алкогодизираванным крысам,практически не влияло на развитие ГШ у них, показатели которого были ниже контрольных вследствие введения этанола. Введение же фракции НЖКС, содержащей ШФ.алкаголизи-рованиым тавотнил отменяло возникающую в результате введения алкоголя иммуносупреесию. ' •

. Введение фракции, содержащей СФ, адкогслизкрованным животным с ОТГ приводило не только к отмене иммуиосупрессии, но и к вырамэнкому повышению ГЙО на ЭБ, по сравнению с контрольной группой. Введение фракции содержащей ШФ, алкогбазированным животным с ОТГ не отменяло кммуносупрейсии, развивающуюся вследствие алкоголизации на фоне токсического поражения печени. Так как накопление СФ, содержащихся в НЖКС алкоголизированных и отравленных ТХМ крыс, в организме животных с ОТГ, получавших этанол не только не приводит к усилению отмечаемой в этих условиях иммушсупрессии, а, наоборот, сопровождается выраженной стим. ляцией ГИО на ЭБ, можно предполагать, что выделение им-мун(}ЕУпрессирующих субстанций контролируется по механизму обратной отрицательной свяаи. Чем больше в организме накапливается СФ, эндогенных и экзогенных, тем меньше их синтевируется и выделяется спле-ноцитами, что приводит к относительному увеличению количества выде-ляемыл иммуностимулирующих субстанций и ус., .ениш ГИО на ЭБ. У животных, получавших только этанол, иммуностимулирующие субстанции не обнаружены, поэтому введение иммуносупрессируэдих факторов,по-видимому, приводит к снижению их выработки спденоцитами, в то время как сохраняется прямое токсическое действие алкоголя на иммуноциты, что в известной степени объясняет отсутствие, нормализации ГИО в этих

условиях.

Вероятно в условиях совместного воздействия на организм этанола и ТХМ, выделение НКФ также контролируется по механизму обратной отрицательной связи. Об этом могут свидетельствовать следующие факты: 1) Введение экзогенного НИФ в организм крыс о ОТГ ингибирует у них развитие ГЙО на ЭВ;?) Введение экзогенного НИФ в организм крыс с ОТГ, получавших этанол не приводит к отмене, возникающей в эти? условиях иммуносупрессии; 3) Введение экзогенного НИФ алкоголизирован-ним крысам, у которых эндогенный НИФ не выделяется,отменяет имму-косупрессию,выаванную введением этанола.

Таким образом, характер и направленность^развития ГШ в условиях сочетанного действия на организм эяанола и ТХМ зависит от степени накопления иммуносупрессиругащих (СФ) и иммуностиму лирушдх , (ШФ) Фчкторов спленоцитов. В свою очередь степень накопления а организме' и тух и других контролируется системами обратных отрицательных связей. ' , • .,

ВЛИЯНИЕ АНТИСЫВЭРОТКЙ К СПЛЕЮЦИТ АРНЬШ ЮШШСУПРЕССИРУЮОда

ФАКТОРАМ НА РАЗЗИГИЕ ИШШШОГО ОТВЕТА У АЛКОГОЛШИРОВАННЫХ .

КВОТНЫХ С ТОКСИЧЕСКИМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ .

•После иммунизации кроликов 1-й ГХФ белков НЖКСН интактных крыо (Aril) или алкоголиаированных крыс с ОТГ (АгО) получены соответствующе антисьшоротки - АсИ и АоО, содержаще антитела в. титрах 1:64 -1:128 (по данным реакции пассивной гемагглотинации).

Сначала была исследована возможность связывания СФ ШЙЗ аакого-лк~ированных и отравленных TJCM крыс с помощью антител, содержался в АсО. , Установлено, что ШКО крыс с ОТГ, получавших этанол, после инкубации с • АсО -при соотношении объемов 1:1 и 2:1 теряла свойства оуг.:>. ...:иг.;вать развитие ГКО у иктактных крыс, иммунизированных ЭБ и п?;^ ,. ч иммукостимулируши^ свойства. В случае инкубации HJKC

крыс с ОТГ, получавших этанол,с АсО в соотношении объемов 10: г и последующего введения инкубата интактным аллогепным реципиентам, установлено угнетение у них развития ГИО на ЭВ. Обработка Н^КС алко-годиэированяых крыс с ОТГ Асй в соотношении 1:1,- 2:1, 10:1 не отменяло иммуйосупреосируювдй эффект НЖКС, Инкубированная НЖКС здоровых кивотних с АсИ и АсО в соотношении 1:1, не влияла г i развитие ГИО у интактннх аллогенных реципиентов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при: инкубации ШКС отравленных ТВ! и алкоголизиро-ванных :рыс с АсО происходит связывание СФ специфическими антителами.

Интересно было выяснить, влияет ли полученная АсО на иммукомо-дулнрующую активность сыворотки крыс, получавших ТХМ и этанол. Обработка сыворотки Ас./ а соотношении 1:1 отменяет ее супрессирувдий зф~ феет, в то время, как инкубация сыворотки с АсО в соотношении 1:2 и 1:10 не приводит к отмене ее супрессирующего эффекта. По Есей видимости, более выраженный супреесирующий эффект сыворотки обусловлен не' только проникающими в кровь 00 спденоцитов, но также и другими иммуносупрессиругаадми сывороточными факторами.

Учитывая изложенное, закономерно встает вопрос о возможности влияния полученной АсО на развитие иммунного ответа у .тавотных,получавших этанол,с экспериментальной патологией печени. С, этой целью исследовано влияние АсО и АсИ на развитие ГИО к SB у интактных и отравленных ТХМ крыс, получавших этанол. Установлено, что семикратное енутривенное введение АсО отменяют возникариую иммуносупрессию у крыс с ОТГ, получавших этанол. Истощение АсО фракцией, содержицей СФ, приводит к тому,что АсО теряет способность нормализовать у них ГИО. Истощение же АсО АгИ не лишает ее способности отменять иммуносупрессию, возникающую у алкогслизированных крыс с ОТГ (таблица 3 ).

Полученные факты об отмене иммуносупресеируюЕэго и появлении иммуностимулирующего зффекгой НККС алкоголиэированных и отравленных

Влияние антисыворотки к иммуносупрессирдади* факторам спленоцитов на развитие ГКО д крыс с ОТГ, полдчазвих этанол.

" Таблица 3.

к: гр. Ясловия опита. ЙОК. тыс/орган РОК, илн/орган

1. ¿иидниззция ЗБ. 19.6 ± 1,8 82,3 ± 8,3

2. Введение кипяченой воды, оливкового касла и йсИ. 21,8 ± 2.2 85,5 ^ 9,1

3. Введение кипяченой воды, оливкового касла н АсО. 24,1 + 3.1. 87,6 ± 9,4 '

4. Введение ТХК и зтанола. ; 14,1 + 1,6 36.4 4,3

Р1-3 < 0,05 Р1-з < о,о5

5. Введение ТХЙ, зтанола и йсй. 12.2 ± 1,4 33,2 + 4.2

Р.1-3 < 0,05 Р1-3 < 0,05

6. Введение ТХИ, этанола и йсО. . 28.8 ± 2,2 68.7 + 7,1

Р4.5 < 0,05 Р4,5 < 0,05

7. Введение ТХМ.; этанола и ЙсО,предварительно

источенной ЙгК.. • 22,9 г 2,7 71,3 ± 7.8

Р4.5 < 6,03 Р4.5 < 0,05

3. Введение ТХК, этанола и ЙсО,предварительно •

источенной АгО. . ' " 13,8 ± 1,6 34.7 ±4,8

Р1-3.6.7 < 0,05 Р1-3.8.7 < 0,05

ТХМ крыс после обработки этой АсО, а также нормализующее влияние Ас О на развитие ГИО у животных с ОТГ, получавших этанол позволяют предполагать существенную роль СФ спленоцитов в супрессии ГИО.индуцированного ксеногенными эритроцитами при токсическом поражении печени и алкогольной интоксикации. Нормализующее действие Ас к С <5 спленоцитов может быть использовано для коррекции иммуннологической реактивности организма на Т-зависимые антигены в условиях эксперимента при соче-танном поражении этанолом и гепатотропиим ядом.

выводы

1. Введение этанола экспериментальным животным.усилиьает токсичность тетрахлорметана (ТХМ),что ос провожается более выраженным пораже-' нием печени на морфологическом и биохимическом уровнях. 2.Отравление ТХМ усиливает развитие гуморального иммунного ответа (ГИО)- и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), индуциро-, ванных эритроцитами барана (ЭБ). Этанол оказывает иммуносупреесор-ный эффект. Сочетанное введение гепатотропного яда и этанола угнетает развитие ГИО и ГЗГ на ЗБ.' 3. Клетки селезенки крыс с острым и хроническим токсическим поражением печени ^ условиях алкогольной интоксикации выделяют в надоеа-доцную жидкость клеток селезенки (НЖКС) как иммуностимулирующие факторы ( Ш 10-25 кД и более 100 кД)„ так и иммуносупресеирущдае субстанции ( ММ более 100 кД ),резко отличающееся по изоэлектри-ческим ■ Jчкaм.

I; Иммуностимулирующие факторы спленоцитов лрыс, получавших ТХМ и этанол, выделяются прилипающими к стеклу клетками селезенки,а им-муноеупрессируодге-неприлшащкми.

. Выделение иммуностимулирующих и иммуносупрессирующих факторов в условиях совместного введения гепатотропного яда и этанола контролируется системами обратных отрицательных связей.

- 20 - .

6. Получена антисыворотка (Ас) к иммуносупрессирующим факторам НЖКС алкоголмзированных и отравленных ТХМ крыс. Обработка НЖКС крыс, получавших ТХМ и этанол, данной Ас приводит к отмене иммуносупресси-руадих и появлению иммуностимулирующих свойств НЖКС. Инкубация Ас с сывороткой отравленных и алкоголиаированных крыс отменяет имму-иосупрессируодие свойства этой сыворотки.

?. Введение Ас животным, одновременно получавшим гепатотропный яд и, этанол, нормализует развитие ГИО, индуцированного ЭВ. .

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЯ

1. йммуномоАудирующее действие сыворотки и надосадочиой жидкости снленоцитов крыс, подвергнутых воздействию'гепатотропного ада и этанола. //Актуальные вопросы хирургической гастронтерологик. -Курск, 1991-С.-139-140. ' -

2. Коррекция иммунного ответа полисахаридами растительного происхождения.//Tes. докл. научно-практической конференции, посвященной £5~летию фармацевтического факультета Курского медицинского института. Часть 2. Курск, 1991-с. 205-206 (соавт. Конопля E.R).

3. Воздействие этанола на иммунологическую реактивность в условиях токсической гелатопатии. //Тезисы докладов, - 1 съезд иммунологов России.-'Новосибирск, 1992-с. 443-444 (соавт. Конопля А. И. ).

4. Иммуномодулируетие факторы спленоцитов крыс, подвергнутых :.-Р.с7вкк< ч-тыреххлористого углерода и этанола

Ку;-ек. гос. I*.;;. ин- т. - Курск, 1992- 11 с,' Деп. в ВИНИТИ 2?. 03. 92.