Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунный ответ на менингококковую вакцину серогруппы В у людей

Актуальность проблемы

За последние 10-15 лет зарегистрирован относительный рост заболеваемости, обусловленный вирулентными штаммами менингококков серогруппы В в России, США, странах Скандинавии и других европейских странах, а также в таких латиноамериканских странах как Аргентина, Бразилия, Колумбия, Куба, Уругвай (45,58,90,102,115,125). В разработке менингококковой вакцины серогруппы В за рубежом достигнут определенный прогресс, однако решающего прорыва в этой области еще не достигнуто. Клинические испытания препаратов, разработанных на Кубе, в Норвегии и Голландии показали, что вакцины, изготовленные только на основе белков наружной мембраны, оказались недостаточно иммуногенными, а данные о протективном эффекте подобных вакцин среди детей до трех лет по-прежнему отсутствуют (14,25).

В настоящее время многолетние зарубежные исследования по созданию менингококковой вакцины серогруппы В привели к разработке технологии приготовления иммуногенной везикулярной вакцины, состоящей из комплекса белков наружной мембраны менингококка серогруппы В и капсульного полисахарида (серогруппы В или серогруппы С или тетравалентной полисахаридной вакцины ACYW-135). Дальнейшие усилия ученых были направлены на оценку профилактической эффективности вакцин у взрослых и детей и определение перекрестной защиты от вирулентных штаммов менингококка иной серотиповой и серосубтиповой принадлежности (150). Решение этих вопросов было по-разному рассмотрено исследователями Норвегии, Кубы и Голландии при разработке основных современных менингококковых вакцин серогруппы В (14, 25). Однако до сих пор вопрос 6 создания эффективной менингококковой вакцины серогруппы В остается актуальным.

В МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского совместно с НИИВС им. И.И. Мечникова в течение ряда лет проводились планомерные исследования по созданию отечественной вакцины для профилактики менингококковой инфекции серогруппы В, в результате которых была разработана оригинальная технология приготовления В-вакцины, сорбированной на ГА, и предложены методы стандартизации и контроля препарата (8). В 1997 году были проведены ограниченные испытания данной вакцины на людях в соответствии с программой, согласованной с ГИСК им. JI.A. Тарасевича. В ходе испытаний, помимо изучения безвредности и реактогенности, необходимо было изучить иммунологическую и бактерицидную активность менингококковой В-вакцины.

Цель исследования: Изучить иммунный ответ к различным компонентам менингококковой белково-полисахаридной вакцины серогруппы В у добровольцев, привитых данной вакциной.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать методики проведения иммуноферментного анализа для выявления специфических антител у вакцинированных к различным антигенам менингококка серогруппы В.

2. Оценить специфичность и воспроизводимость разработанных иммуноферментных систем;

3. Изучить иммунный ответ у добровольцев, привитых менингококковой вакциной серогруппы В: к капсульному полисахариду, к белкам наружной мембраны, к нативному белково-полисахаридному комплексу. 7

Научная новизна.

Разработаны методики постановки твердофазного ИФА для определения IgG- и IgM-антител к различным антигенам менингококка серогруппы В. Иммуноферментные системы являюия высокоспецифичными и соответствуют требованиям, предъявляемым к диагностическим тест-системам.

С помощью разработанных методик проведения ИФА был изучен дифференцированный иммунный ответ у людей на введение нового отечественного сорбированного препарата - менингококковой белково-полисахаридной вакцины серогруппы В.

В результате исследований было впервые показано, что отечественный вариант менингококковой вакцины серогруппы В, сорбированной на ГА, стимулирует образование IgG-антител у 82% лиц к комплексному антигену и у 56% лиц - к белковому антигену. Вакцина обеспечивает создание напряженного иммунитета к гомологичному штамму, вызывая у 80% иммунизированных 4-х и более кратный прирост бактерицидных антител. Полученные в ИФА и РИБ результаты свидетельствуют о выраженной иммунологической и протективной активности нового отечественного вакцинного препарата.

Практическая значимость.

Разработанные методики проведения иммуноферментного анализа для определения антител к различным антигенам менингококка серогруппы В, позволили охарактеризовать динамику образования и изотипическую структуру специфических антител у привитых отечественной менингококковой В-вакциной и оценить иммунологическую эффективность этой вакцины. В дальнейшем данные методики могут быть использованы для изучения постинфекционного иммунитета у больных МИ серогруппы В. 8

Внедрение в практику.

Материалы диссертации использованы:

1) при составлении «Программы испытаний реактогенности, безопасности и иммунологической активности на ограниченной группе людей вакцины менингококковой группы В из природного комплекса специфического полисахарида и белков наружной мембраны, сухой, сорбированной ex tempore на гидроксиде алюминия, предназначенной для подкожного введения», утвержденной Комитетом МИБП от 8.04.1998г.

2) в «Отчете о выполнении программы испытания вакцины менингококковой группы В из природного комплекса специфического полисахарида и белков наружной мембраны, сухой, для подкожного применения с целью оценки ее реактогенности, безвредности и антигенной активности», который был утвержден ГИСК им. JI.A. Тарасевича от 4.10.2000г.

3) при составлении проектов нормативно-технической документации на менингококковую вакцину серогруппы В: временной фармакопейной статьи, экспериментально-производственного регламента, инструкции по применению вакцины.

Основные экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены автором лично. Исследования проводились также в соавторстве с сотрудниками ГУ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ: к.м.н. Головиной Л.И., к.м.н. Мишиной А.И., к.м.н. Скирдой Т.А., д.м.н. Чернышовой Т.Ф. 9

Часть I. Обзор литературы Глава I. Оценка иммунного ответа при исследовании мениигококковых вакцин серологическими и иммунологическими методами

Менингококковая инфекция является одной из опасных инфекций, которая передается воздушно-капельным путем и характеризуется тяжелым течением болезни, большим количеством смертельных исходов и наиболее серьезными постинфекционными осложнениями (29).

По антигенному составу менингококки разделяются на серогруппы, определяемые специфичностью капсульного полисахарида (А, В, С, X, Y, W-135 и т.д.).

Около 90% всех заболеваний мениигококковых менингитов в разных странах мира вызывается штаммами Neisseria meningitidis трех основных серогрупп А, В и С (60).

Gotschich Е.С. et al. в 1969 году были выделены в очищенном виде микробные полисахариды менингококков серогрупп А, В, и С; тщательно изучены и охарактеризованы (70).

Принято считать, что капсульные ПС менингококков относятся к тимус-независимым антигенам, так как продукция антител к ним осуществляется В-клетками, без участия Т-лимфоцитов (2). Однако имеются также данные лабораторных исследований, указывающие на то, что Т-лимфоциты в той или иной степени вовлекаются в различные иммунологические реакции на самые разнообразные Т-независимые антигены (42). Эти антигены индуцируют появление Т-супрессоров, которые активно участвуют в регуляции интенсивного иммунного ответа у мышей, что было продемонстрировано в работе А.И. Мокренко (26).

На основе очищенных капсульных полисахаридов, как за рубежом, так и в нашей стране, были разработаны и в настоящее время широко применяются менингококковые вакцины серогрупп А и С, которые обеспечивают

10 выраженную серогрупповую иммунную защиту против возбудителей соответствующих серогрупп (48,49,69). Было установлено, что уже на 5-7 день после однократной иммунизации обнаруживались специфические антитела к группоспецифическим ПС, которые достигали максимального уровня на 2-4 неделе, и сохранялись в течение 3-5 лет (32,41,44,46).

Для изучения иммуногенности менингококковых полисахаридных вакцин используются различные серологические и иммунологические методы: реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция иммунного бактериолиза (РИБ), радиоиммунологический анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА) и другие.

Наиболее распространенным, доступным и простым в постановке является РПГА. На протяжении более 50 лет РПГА успешно применяется для серодиагностики МИ и является одним из первых методов, используемых для изучения иммунного ответа на введение менингококковых полисахаридных вакцин.

Так, в исследовании Artenstein M.S. et. al. (1971) по изучению иммунного ответа на введение менингококковой А-вакцины на 458 добровольцах в РПГА было показано, что титр гемагглютининов повышался в четыре и более раза у 85% привитых. После введения полисахаридной вакцины серогруппы С обнаружено значимое повышение гемагглютинирующих антител к С-ПС у 100% привитых. Таким образом, было установлено, что РПГА является высокочувствительным методом (5).

В работе Туманян А.А. с соавт. (33) по изучению иммунного ответа у детей на введение отечественной менингококковой полисахаридной вакцины серогруппы А в РПГА было показано, что после иммунизации наблюдается четырех- и более кратный прирост титров антител у 90,9% привитых. Однако уже через четыре с половиной месяца после вакцинации уровень антиполисахаридных антител был таким же, как и до вакцинации.

11

Полученные результаты противоречили известным данным Gotshneider J. et al. (68), который использовал РИА для изучения иммунного ответа на введение А-вакцины. Согласно этим данным высокий уровень антител, после иммунизации полисахаридной вакциной, держится не менее одного года. Эти разногласия можно объяснить особенностями РПГА. Известно, что агглютинирующими свойствами обладают, как IgG, так и IgM. Антитела IgM более эффективны в реакции агглютинации, поскольку отличаются высокой валентностью. В связи с этим РПГА вполне может служить для массового изучения иммунного ответа у привитых в первые две недели после вакцинации, когда в организме функционирует «первая линия» гуморальной защиты, т.е. IgM, тогда как, для определения длительности сохранения иммунитета при иммунизации менингококковыми вакцинами более целесообразны другие методы, способные дать более глубокую оценку иммунному ответу.

До настоящего времени не разработаны надежные и адекватные лабораторные модели животных для характеристики иммунного ответа при менингококковой инфекции и вакцинации. В связи с этим метод определения бактерицидных антител занимает ведущее место при изучении напряженности менингококкового поствакцинального и постинфекционного иммунитета, так как известно, что бактерицидные антитела, которые вызывают комплементопосредованный иммунный лизис микробов, являются протективными.

Исследования, проведенные зарубежными авторами, показали, что полисахаридные вакцины серогрупп А и С в дозе 50 мкг иммуногенны и вызывают интенсивную продукцию бактерицидных антител уже через две недели после вакцинации у 80-100% привитых (5,41).

При изучении отечественной менингококковой полисахаридной вакцины серогруппы А в РИБ было установлено нарастание в 4 и более раз специфических бактерицидных антител у 80-94% привитых (12).

12

Следует, однако, отметить, что хотя выполнение РИБ и связано с определенными техническими трудностями, и метод очень трудоемок, он незаменим в научных исследованиях по оценке эффективности вакцин (65) и включен в «Требования ВОЗ к менингококковой полисахаридной вакцине» (5).

В настоящее время на смену трудоемким, малопроизводительным и часто недостаточно чувствительным методам, основанным на феноменах агглютинации, преципитации и связывания комплемента, пришли новые современные иммунологические методы, основные достоинства которых состоят в высокой чувствительности, специфичности и строгом инструментальном учете результатов.

Радиоиммунологический анализ впервые описали Ялоу и Берсон в 1960 году (3,35). Принцип реакции состоит в конкуренции определяемого немеченного антигена с известным количеством меченного радиоактивным изотопом антигена за специфические антитела. Построение стандартной кривой позволяет проводить количественный учет реакции. Высокая чувствительность РИА позволяет намного сократить расход применяемых в реакции дорогостоящих реагентов и тем самым дает возможность увеличить количество исследуемого материала, что особенно важно при проведении массовых исследований: изучении иммуноструктуры населения, контроле вакцинных препаратов (89,96).

При определении количества антител в РИА во время проведения полевого испытания менингококковой вакцины серогруппы А в Финляндии было установлено, что защитный уровень антител составляет не менее 2 мкг/мл в пересчете на содержание белка специфических антител, связавшихся с А-ПС, меченным 1251. По данным РИА при иммунизации взрослых уровень антител достигает приблизительно 15 мкг/мл для ПС серогруппы А и 35 мкг/мл для ПС серогруппы С (94).

Kayhty Н. et. al. в 1980 г. было проведено исследование по сравнительному изучению иммунного ответа на менингококковую

13 полисахаридную вакцину серогруппы А с помощью РПГА, РИА и РИБ (88). После иммунизации около 60% привитых показали 32-х и более кратный прирост титров антител в реакции гемагглютинации, 25-и и более кратный прирост в РИБ и 4-х и более кратный прирост антител в РИА. Однако РПГА оказалась менее чувствительной, чем РИА, при изучении иммунного ответа на вакцинацию у подростков. По мнению автора, низкий титр в РПГА может быть обусловлен недостатком в сыворотках привитых концентрации IgM, которые, как уже было описано выше, главным образом определяются в реакции гемагглютинации, тогда как в РИА определяются все классы иммуноглобулинов. Методами РПГА и РИА выявляются антитела, специфичные к капсульному полисахариду, а РИБ определяет суммарное количество бактериолизинов, направленных как к ПС, так и другим поверхностным компонентам клетки (131). РИА и РПГА не позволяют выявить функциональную активность антител, синтезируемых в ответ на вакцинацию. Поэтому для изучения иммуногенности менингококковых вакцин сыворотки вакцинированных должны исследоваться не только на присутствие специфических к ПС антител, но и оцениваться по ее бактерицидному действию непосредственно на микробные клетки менингококка при помощи РИБ.

В исследовании, проведенном Wong К.Н. et al. в 1977 г., было показано, что однократное введение вакцины серогруппы А или С вызывает 4-х и выше кратное нарастание титра бактерицидных антител более, чем у 80% добровольцев (145). Параллельно увеличению титров бактериолизинов сопутствовало нарастание гемагглютининов, измеряемое в РПГА и антител, 1 определяемых в РИА при использовании ПС, меченного I. Однако полного соответствия в нарастании титров антител после вакцинации при оценке различными методами не было обнаружено.

Хотя РИА и являлся высокочувствительным и воспроизводимым методом оценки эффективности вакцин, и длительное время применялся во многих

14 лабораториях (71,88,90), поиски нового метода, обладающего высокой чувствительностью, но не связанного с радиоизотопами, привели к созданию иммуноферментного анализа (ИФА) (16,17,43,44,45). Оба метода являются простыми и сходны по своей чувствительности (78) и могут применяться для оценки уровня антител в сыворотках маленьких детей, которые имеют очень низкие уровни специфических антител как до, так и после вакцинации. Оба метода могут дать представление о количестве антиполисахаридных антител. Результаты этих методов хорошо коррелируют с бактерицидным тестом (45). Обычно в РИА определяют общий уровень всех антител. ИФА более подходит для раздельного измерения уровня антител трех основных классов иммуноглобулинов: IgM, IgG и IgA. Невыгодной стороной РИА являлась опасность применения изотопов и сравнительно высокая стоимость оборудования (88).

Обладая высокой чувствительностью и специфичностью, ИФА позволяет анализировать одновременно большое число проб, использовать полностью или частично автоматизированные системы или проводить анализ практически без оборудования; метод не требует очистки или обогащения проб, прост в выполнении; ферментная метка в отличие от изотопной обладает большим сроком годности, работа с ферментной меткой исключает облучение персонала, стоимость анализов существенно ниже (16).

Таким образом, благодаря ряду существенных преимуществ ИФА занял ведущее место среди других иммунологических методов исследования эффективности вакцин.

Существуют различные модификации ИФА для обнаружения антител. Наиболее широко применяются методы, основанные на использовании AT или АГ, адсорбированных на твердом носителе (гетерогенный иммуноферментный анализ). В зарубежной литературе этот метод получил название ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).

15

Гетерогенные варианты ИФА обладают высокой чувствительностью, специфичностью, точностью, надежностью, быстротой получения результатов, длительностью сроков хранения реагентов, универсальностью сфер применения, потенциальной возможностью автоматизации (17).

В настоящее время накоплены многочисленные данные, свидетельствующие о широком применении ИФА для оценки иммуногенности мениигококковых вакцин.

Так E.L. Anderson et. al. в 1994 г. в ИФА определяли уровень антител к А-ПС и С-ПС у привитых коньюгированной менингококковой полисахаридной А и С вакциной. Через 1 месяц после иммунизации они наблюдали увеличение общего уровня IgM, IgG и IgA у всех привитых, как к А-ПС, так и к С-ПС. Причем уровень антител к С-ПС был выше, чем к А-ПС (40).

В 1996 году Скирдой Т.А. с соавт. было установлено, что по данным ИФА через 1 месяц после иммунизации отечественной полисахаридной менингококковой вакциной серогруппы А уровни суммарных Ig(M+G+A) антител возрастали у 100% в 4-112 раз. Через 1 год после вакцинации 4-х и более кратный прирост суммарных антител сохранялся у 66,7% привитых, через 2 и 3 года после иммунизации у 50,0%. Наблюдалось 4-х и выше кратное нарастание IgM-, IgA-антител у 100% привитых, IgG- у 90% привитых, причем уровень IgM-антител увеличивался у отдельных лиц в 5-112 раз, IgA - в 4-338 раз и IgG - в 5-315 раз. Наибольший прирост антител был у лиц с низкими исходными титрами и у серонегативных лиц (32).

Кроме того, при сравнительном изучении иммунного ответа в РПГА, РИБ и ИФА у привитых тем же вариантом вакцины было показано, что динамика выработки специфических антител, выявляемых этими методами, была сходной. Максимального уровня антитела достигали через один месяц после иммунизации, при этом 4-х кратный и более прирост гемагглютинирующих антител отмечался у 88,9% привитых, бактерицидных - у 85%, специфических антител в ИФА - у 100% лиц. Иммунитет сохранялся в течение 3-х лет. Была

16 отмечена хорошая корреляция результатов, полученных методами РПГА, РИБ и ИФА (31).

В 1985 г. А.И. Мокренко был разработан модифицированный метод пассивного локального гемолиза в геле для выявления антителобразующих клеток (АОК), синтезирующих антитела против полисахаридов серогрупп А и С. Было установлено, что мыши способны формировать выраженный иммунный ответ на менингококковые полисахариды. Это выражалось в появлении значительного количества АОК в их селезенках и накоплении группоспецифических антител в сыворотках. В результате исследования было обнаружено, что иммуногенность А-ПС для мышей высоко коррелирует с их иммуногенностью для человека. Разработанный метод рекомендовался автором для контроля выпускаемых вакцинных препаратов на предприятии, но дальнейшего распространения он не получил (26).

Таким образом, можно сделать следующее заключение. Все описанные в данной главе серологические и иммунологические методы имеют свои преимущества и недостатки. Наиболее простым и доступным методом является реакция гемагглютинации. Однако данный метод полуколичественный и выявляет преимущественно IgM-антитела. РИБ является основным методом, определяющим протективные антитела, образующиеся в результате вакцинации. Тем не менее, РИБ так же не лишена недостатков. По мнению ВОЗ, результаты бактерицидной реакции трудно воспроизводятся, и воспроизводимость результатов зависит от источника комплемента и от питательной среды, используемой для культивирования менингококка. ИФА является одним из самых высокоспецифичных и чувствительных методов и в настоящее время широко используется в иммунологии благодаря ряду преимуществ, которые были рассмотрены выше.

17

Следовательно, для всестороннего изучения иммуногенной и протективной активности менингококковых вакцин необходимо использовать комплексный подход, который включает в себя совокупность методов, таких как ИФА и РИБ, обладающих наибольшей информативной ценностью.

18

Глава 2. Иммуногенность менингококковых вакцин серогруппы В

Выводы.

1. Разработаны методики проведения иммуноферментного анализа для оценки иммунного ответа к различным антигенам менингококка серогруппы В у людей, привитых отечественной менингококковой белково-полисахаридной В-вакциной.

2. Показано, что иммуноферментные системы для выявления антител к антигенам В-менингококка высокоспецифичны, дают хорошую воспроизводимость результатов, которые значимо коррелируют с данными о концентрации соответствующих антител, полученными в реакции гемагглютинации.

3. Введение менингококковой вакцины серогруппы В, сорбированной на гидроксиде алюминия, вызывает разную степень нарастания IgG антител к исследуемым антигенным компонентам вакцины. У 82,0 % привитых синтезируются антитела к комплексному антигену, у 56,0% - к белкам наружной мембраны (р<0,05), к группоспецифическому полисахариду антитела практически не образуются.

4. Менингококковая вакцина серогруппы В из природного белково-полисахаридного комплекса, сорбированная на гидроксиде алюминия, обладает выраженной иммунологической и бактерицидной активностью в отношении вакцинного штамма. Уровень антител к нативному комплексному антигену, выявляемый в иммуноферментном анализе, коррелирует с уровнем бактериолизинов, синтезируемых к гомологичному штамму менингококка серогруппы В.

Ill

Заключение

Исследования по созданию менингококковой вакцины серогруппы В ведутся в течении многих лет в разных странах. Как известно, первые попытки создать менингококковую вакцину на основе очищенного В-ПС не увенчались успехом, так как В-ПС оказался низко иммуногенным (70,142). Причины низкой иммуногенности В-ПС подробно рассмотрены в обзоре литературы.

В настоящее время можно выделить несколько основных направлений поиска оптимального варианта В-вакцины.

Во-первых, разрабатываются вакцины на основе белков наружной мембраны с преимущественным содержанием белков серотиповой и субтиповой специфичности. Данные вакцины конструировались на основе везикул, к которым добавляли или не добавляли очищенные ПС серогрупп В, С или тетравалентную менингококковую полисахаридную вакцину ACYW-135. Подобные вакцины были разработаны и изучены Zollinger W.D. и Frasch С.Е. в США, а также норвежскими и кубинскими исследователями (63,108, 123,151,152).

Следует также отметить многочисленные исследования по выделению индивидуальных БНМ с выраженными протективными свойствами. К ним относятся основные белки наружной мембраны: РогА - субтиповой специфичности, РогВ - серотиповой специфичности, Rmp - антитела к которому тормозят бактерицидные свойства РогА, Ора и Орс - общевидовой специфичности (54,74,82,112,125,128).

В Голландии была разработана генно-инженерная менингококковая В-вакцина, которая включала одновременно несколько субтиповых детерминант белка 1 класса и несколько детерминант иммунотипов ЛПС, которые наиболее часто обнаруживаются в штаммах, выделенных от больных МИ серогруппы В (77,82).

Однако очевидно, что везикулярные белковые вакцины имеют серотиповую специфичность и, следовательно, создают ограниченную

100 защищенность от инфекции, направленную лишь против штаммов, принадлежащих к тому же серотипу, что и вакцинный штамм (116).

Вторым направлением является разработка вакцин на основе конъюгатов из химически модифицированного В-ПС (с заменой ацетиловых групп на пропиониловые) с белковым носителем - дифтерийным или столбнячным анатоксином. Такие исследования прочились в течение ряда лет в Канаде в лаборатории Jennings H.J (85,87).

Еще одним из направлений получения эффективных менингококковых вакцин группы В является разработка препарата на основе естественного (природного) комплекса БНМ и В-ПС. Такой вакцинный препарат был создан и исследован Moreno et al. (110). Иммунизация данной вакциной стимулировала у людей образование специфических антител как к БНМ, так и к В-ПС. По сравнению с вакцинами на основе БНМ этот тип вакцины обладал более выраженной иммунологической активностью. Однако индуцированные вакцинацией В-антитела относились к IgM классу и уровень их быстро падал (100).

Таким образом, в настоящее время не создано коммерческого варианта менингококковой вакцины серогруппы В, в связи с чем работы по созданию эффективного препарата продолжаются и остаются актуальными.

В нашей стране в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского совместно с МНИИВС им. И.И. Мечникова была разработана оригинальная технология приготовления менингококковой белково-полисахаридной вакцины серогруппы В, сорбированной на гидроксиде алюминия (8). С учетом того, что антиген выделялся исключительно мягким щадящим методом без применения каких-либо кислот, щелочей или детергентов, его обозначили как нативный (природный) белково-полисахаридный комплекс - НБПК. Основанием для изучения НБПК, как перспективного кандидата в В-вакцину, послужили исследования А.П. Аллилуева и О.В. Котельниковой (1) в результате которых было установлено, что В-ПС в естественном комплексе с БНМ, очищенный от

101 примеси нуклеиновых кислот и ЛПС, в отличие от полностью очищенного В-ПС, обладает выраженной иммунологической активностью для мышей и формирует у них иммунологическую память.

В настоящее время в связи с необходимостью применения высокочувствительных методов для всесторонней оценки иммунологической активности менингококковых вакцин с успехом используется иммуноферментный анализ. Поскольку коммерческих иммуноферментных тест-систем для определения антител к различным антигенам менингококка группы В не существует, первоочередной задачей нашей работы явилось разработка методик проведения ИФА.

Подбор стандартных условий постановки ИФА включал: посадку антигена, оценку адсорбционной способности планшетов разных производителей, выбор оптимальных концентраций антигенов, временных и температурных режимов, подбор коньюгатов. В качестве антигенов при сенсибилизации планшетов использовали В-ПС, БНМ и НБПК. Поскольку вакцинный препарат представляет собой не механическую смесь двух антигенов менингококка серогруппы В: В-ПС и БНМ, а НБПК, мы сочли целесообразным изучить иммунный ответ у добровольцев, привитых В-вакциной не только к В-ПС и БНМ, но и ко всему комплексному антигену в целом, предполагая, что такой ответ не будет лишь суммой ответов к отдельным компонентам.

На первом этапе исследования была изучена адсорбционная способность планшетов разных производителей: PolySorb и MaxiSorb фирмы «Nunk» и фирмы «Linbro». Адсорбционные свойства исследуемых планшетов изучались к трем выше перечисленным антигенам менингококка группы В, которые отличались по своей химической природе и относились к различным классам биологически активных веществ. В ходе исследования было установлено, что планшеты PolySorb фирмы «Nunk» обладают оптимальной емкостью при максимальной воспроизводимости результатов.

102

Сенсибилизирующую дозу В-ПС, БНМ и НБПК подбирали путем десятикратного разведения препаратов в интервале от 100 мкг/мл до 0,0001 мкг/мл. Исследования показали, что наиболее высокие уровни связывания В-ПС и БНМ с полистиролом наблюдались при концентрации 0,5 мкг/мл, НБПК -0,05 мкг/мл.

При выборе оптимального температурного режима адсорбции антигенов на поверхности полистирола, изучались два варианта сенсибилизации планшетов антигенами: при 4°С и 37°С. Время сенсибилизации составляло 1618 часов. Было установлено, что средние значения ОП положительного и отрицательного контролей выше при 37°С, чем при 4°С для всех исследуемых антигенов. При этой температуре наблюдалась и максимальная разница между положительной и отрицательной контрольными сыворотками.

После изучения конъюгатов фирмы «Sigma» (анти-IgG и анти-IgM), НИИЭМ им. Гамалеи РАМН (анти-IgG) и ГНЦ Института иммунологии МЗ РФ (анти-IgG и анти-IgM) для ИФА был выбран анти-IgG конъюгат Института иммунологии и анти-IgM конъюгат фирмы «Sigma», как наиболее специфичные и чувствительные. Оптимальным разведением анти-IgG конъюгата являлось 1:8000, анти-IgM конъгата - 1:2000.

Таким образом, в результате проведенных исследований были определены следующие оптимальные условия непрямого варианта ИФА: наиболее подходящими были полистироловые планшеты фирмы «Nunk» PolySorb; оптимальная концентрация В-ПС, БНМ составляла 0,5 мкг/мл, НБПК - 0,05 мкг/мл; сенсибилизация плашетов проводилась при температуре 37°С в течение 16-18 часов; за рабочее разведение коньюгатов было выбрано: для анти-IgG - 1:8000, анти-IgM - 1:2000.

Для оценки качества разработанных иммуноферментных систем необходимо было охарактеризовать ошибку и воспроизводимость результатов повторных измерений. При многократном исследовании одиннадцати референс-сывороток, было подсчитано, что ошибка опыта при определении

103 антител к В-ПС, БНМ и НБПК не превышала 5%. Другим существенным показателем является измерение точности (коэффициет вариации - Кв). При анализе данных было получено, что Кв составляет 6,8% (р<0,05), что отвечает требованиям, предъявляемым к точным иммунохимическим методам (4,35).

Оценку специфичности разработанных систем проводили на сыворотках больных с диагнозом менингококковая инфекция (МИ). Для исследования были взяты парные сыворотки, полученные от больных в начале заболевания и на 812 день от начала болезни. Сыворотки были изучены двумя методами: РПГА с коммерческими менингококковыми эритроцитарными диагностикумами серогрупп А, В, и С и в ИФА с тремя антигенами менингококка серогруппы В. В результате исследований было показано, что у всех больных МИ группы В в РПГА наблюдалось 4-х - 32-х кратное увеличение титров гемагглютинирующих антител к В-ПС. В ИФА также наблюдалось значимое нарастание IgM антител ко всем трем антигенам менингококка группы В и IgG-антител к В-ПС и БНМ (рис. 24). Причем прирост IgM был значительно выше по сравнению с приростом IgG-антител, что обусловлено, по-видимому, ранним сроком повторного исследования. У больных МИ серогруппы А или серогруппы С прироста антител как в РПГА так и в ИФА обнаружено не было.

В связи с тем, что иммунный ответ у больных менингококковой инфекцией изучался как в РПГА так и в ИФА, то представлялось целесообразным определить степень корреляции между этими двумя методами. Коэффициенты корреляции между РПГА и ИФА с В-ПС для IgM- и IgG-антител составили 0,79 и 0,96 (р<0,05) соответственно, что свидетельствовало о высокой положительной связи между этими методами.

Полученная высокая корреляция результатов между РПГА и ИФА (В-ПС) позволяет выбирать тот или иной метод исследования в зависимости от поставленных задач. Применение традиционной РПГА обосновано, например, при массовых обследованиях больных или вакцинированных на ранних сроках

Рис. 24. Специфичность иммуноферментных систем.

105 наблюдения, так как этот метод, являясь наиболее доступным и простым, выявляет преимущественно IgM-антитела, которые формируются в этот период. При проведении научных исследованиий необходим более информативный метод, который дает более широкую дифференцированную оценку иммунного ответа, как больных, так и вакцинированных лиц. Таким методом является иммуноферментный анализ.

Таким образом, в результате исследований были разработаны высокоспецифичные иммуноферментные системы для выявления антител к различным антигенам менингококка серогруппы В в сыворотках людей.

Следующим этапом исследования являлось изучение дифференцированного иммунного ответа привитых менингококковой вакциной группы В, сорбированной на ГА, с помощью разработанных методик проведения ИФА.

Для иммунизации добровольцев была использована менингококковая вакцина серогруппы В. Иммунизирующая доза содержала 50 мкг группоспецифического В-ПС в 0,5 мл гидроксида аллюминия. Препарат был изучен на 121 добровольце (83 вакцинированных и 38 человек составили контрольную группу) в возрасте 18-20 лет. Иммунизация проводилась двукратно с интервалом в 1 месяц. Кровь у добровольцев была взята до иммунизации и через 1 месяц после повторной иммунизации. Все взятые в исследование сыворотки были зашифрованы в ГИСК им. JI. А. Тарасевича.

В ходе исследований была установлена статистически значимая разница между средними уровнями IgG-антител к НБПК до вакцинации и через 1 месяц после второй вакцинации. Через месяц после завершения курса иммунизации прирост антител, равный 0,2 ед. ОП и выше, наблюдался у 75% привитых. Поскольку известно, что интенсивность иммунного ответа вакцинированных в значительной степени зависит от исходного уровня специфических антител, все привитые были разделены на две группы: 1-е высоким исходным уровнем менингококковых В-антител и 2-е низким исходным уровнем антител.

106

Установлено, что число лиц, ответивших на вакцинацию, в 1 группе было ниже и составило 61%. Увеличение уровня IgG в этой группе было менее выражено, чем по всей группе привитых, и статистически недостоверно (р<0,05). Во 2-ой группе наблюдался более выраженный прирост специфических IgG-антител, который составил в среднем более 0,4 ед. ОП. Вакцинация обеспечивала статистически значимое нарастание уровней антител у 82% лиц в этой группе (р<0,05) (табл.11).