Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Спектр антител к железорегулируемым белкам Neisseria meningitidis у здоровых лиц и больных менингококковой инфекцией

На правах рукописи

ГАМЗУЛИНА Леонтнна Николаевна

СПЕКТР АНТИТЕЛ К ЖЕЛЕЗОРЕГУЛИРУЕМЫМ БЕЛКАМ Neisseria meningitidis У ЗДОРОВЫХ ЛИЦ И БОЛЬНЫХ МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

14.00.36. - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в ГУ Научно-нсследовательсмом институте вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН

Научный руководитель:

Кандидат химических наук

Филатова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Краснонрошниа Людмила Ивановна

кандидат медицинских наук

Аллилуев Александр Павлович

Ведущая организация: Кафедра микробиологии с вирусологией и иммунологией Московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова

Защита состоится 22 сентября 2005 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01. при ГУ НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан ""/9п августа 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

И. В. Яковлева

ФЕЗ

¿/if!ff

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Менингококковая инфекция в виде острого назофарингита, гнойного менингита и менингококкцемии - заболевание преимущественно детского и юношеского возраста - возникает относительно редко, но протекает тяжело, с высокой смертностью (10-15%) и обладает эпидемическим потенциалом.

В России суммарная частота генерализованных форм менингококковой инфекции в последние 5 лет стабилизировалась на вполне благополучном уровне до 2,0-2,3 на 100 тыс. населения [Чернышова Т.Ф с соавт., 2004], однако существует несколько географических зон (на Дальнем Востоке по границе с Китаем и на севере европейской часта страны), в которых эпидемическое неблагополучие в виде 6-8 случаев заболевания на 100 тыс. населения сохраняется постоянно [Платонов А.Е. с соавт., 2004]. Несмотря на низкую заболеваемость, весьма широко, особенно в очагах инфекции с частотой от 5 до 40% распространено бессимптомное назофарингиальное носительство патогенных и слабопатогенных менингококков [Костюкова H.H., 1997; Robinson, К. et al., 2002], которое одновременно служит резервуаром инфекции и, вероятно, основой естественно приобретённого гуморального и клеточного менингококкового грундиммунитета [Платонов А.Е., 2004; Goiringe А. et al., 2005].

Менингококковая инфекция лишь отчасти контролируется вакцинопрофилактикой - имеются только полисахаридные вакцины, создающие иммунитет к менингококкам серогрупп А и С у детей старше 2 лет и взрослых, но ещё не разработана вакцина, защищающая от заражения менингококками серогруппы В, и отсутствуют вовсе достаточно эффективные вакцины для детей младше 2 лет. Конкретные механизмы естественного менингококкового грундиммунитета до сих пор остаются невыяснеными, хотя их анализ имеет ключевое значение в эпидемиологическом надзоре за менингококково ни

менингококковых вакцин нового поколения.

Контакт заселяющих слизистую оболочку носоглотки менингококков с эпителиальными клетками индуцирует дерепрессию 347 генов бактериального генома, в том числе 109 генов, которые кодируют белки наружной мембраны, обеспечивающие транспорт и усвоение кокками ионизированного и органическисвязанного железа в условиях дефицита этого макроэлемента /и vivo [Grifantini К, et al., 2002; Perkins-Balding D. et al., 2004; Ducey T. F. Et al., 2005]. Or синтеза железорегулируемых бежов (ЖРБ) зависит выживание, размножение и проявление патогенных свойств N. meningitidis, а специфические антитела (AT) к некоторым из них могут блокировать утилизацию железа менингококками и, следовательно, иншбировать размножение бактерий, т.е. функционируют как протективные. Различные штаммы N. meningitidis экспрессируют до двух десятков индивидуальных ЖРБ [Genco C.F. et al., Дельвиг АЛ. и соавт., 2000]. Поскольку ЖРБ патогенных N. meningitidis различных серогрупп, а также других представителей рода нейссерий, обладают общими В- и Т-клеточными эпитопами, в последнее десятилетие эти белки рассматриваются как вероятные «кандидаты» для включения в состав универсальной вакцины, которая будет эффективной в раннем детском возрасте независимо от вида и серогрупп патогенных нейссерий [Troncoso G. et al., 2000; Perkins-Balding D. et al., 2004; Ala'Aldeen DA. et al., 2005]. Например, перспективные экспериментальные вакцины, приготовленные из белков наружной мембраны менингококков, содержали от 1 до 10% FetA (ранее FrpB) -жеяезорегулируемого белка, который функционирует как рецептор энтеробактина у патогенных нейссерий [Frasch et al., 2001]. В связи с этим выявление антител к различным ЖРБ в крови практически здоровых людей и больных менингококковой инфекцией может служить не только методом идентификации потенциальных протективных антигенов - кандидатов в состав будущих вакцин, но и инструментом анализа специфичности и уровня

экспрессии естественно приобретённого менингококкового грундиммунитета.

?

>

Пель работы: охарактеризовать спектр специфичности антител к индивидуальным железорегулируемым белкам N. тептяНИёз в сыворотках крови здоровых лиц и больных менингококковой инфекцией.

Задачи исследования:

1. Выделить и охарактеризовать по составу железорегулируемых белков антигенные препараты 'Ы.тетщИШв.

2. Изучить спектр антител класса к ЖРБ менингококков в сыворотках крови практически здоровых людей.

3. Определить частоту выявления антител класса специфичных к различным ЖРБ менингококков в сыворотках крови больных, инфицированных менингококками разных серогрупп.

Научная новизна

Впервые охарактеризован спектр специфичности антител к ЖРБ менингококков у лиц, не имеющих в анамнезе тяжелых форм менингококковой инфекции. С различной частотой (1,7-90,9%) у лиц этой группы выявлены ДО антитела к 16 ЖРБ.

При анализе сывороток крови здоровых лиц установлено, что с возрастом увеличивается частота выявления антител класса к ЖРБ с м.м. 35 кД, что свидетельствует о постепенном формировании естественно приобретенного грундиммунитета.

У больных тяжелыми формами менингококковой инфекции спектр специфичности антител к ЖРБ не отличается от спектра антител здоровых лиц, но частота выявления антител к отдельным белкам (41,5; 43; 47; 76; 98; 107 и 116 кД) значимо возрастает.

Установлено, что в образцах сывороток крови больных, инфицированных менингококками серогрупп А и В, преобладали антитела к высокомолекулярным ЖРБ (98,107,116 кД).

Впервые установлено, что по мере выздоровления у больных происходит нарастание концентрации антител к ЖРБ с м.м. 35,43 и 47 кД.

Практическая значимость

Разработана оригинальная технология препаративного выделения ЖРБ менингококков с м.м. 35 кД, который может быть использован при конструировании ИФА тест-систем для серологических исследований в системе эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Бактериальные лизаты N. meningitidis серо группы В характеризуются более широким спектром ЖРБ, чем препараты белков наружной мембраны (БНМ), поверхностных антигенов и цетавлоновых экстрактов.

2. В сыворотках крови здоровых лиц выявлены антитела к 16 ЖРБ менингококков, определяемые с различной частотой (1,7-90,9%). При этом с возрастом увеличивается частота выявления антител к ЖРБ с м.м. 35 кД.

3. В сыворотках крови больных тяжелыми формами менингококковой инфекции с частотой от 1,8 до 87,9% выявляются антитела к 15 ЖРБ менингококков. В ходе заболевания нарастает концентрация сывороточных антител к ЖРБ с м.м. 35, 43 и 47 кД. Сдвиг спектра специфичности антител в сторону низкомолекулярных ЖРБ и нарастание их концентрации может служить положительным прогностическим признаком при манифестированной менингококковой инфекции.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых НИИВС им. И.И.Мечникова (Москва, 2000, 2001, 2002), на сессии

Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2001).

Диссертация апробирована на межлабораторной научной конференции ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН 15 июня 2005г.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертанта

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 114 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и 9 таблицами. Список литературы содержит 47 отечественных и 67 зарубежных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для получения антигенных препаратов в работе использовали музейный штамм N. meningitidis В125 серогруппы В из коллекции ГНИИСК им. Л.А.Тарасевича.

Культивирование менингококков проводили в течение 20 ч при 37°С в избытке СС>2 на бессывороточной плотной питательной среде GC Medium BASE (Difco, США) с добавкой ростового фактора IsoVitaleX (BBL, США). Для получения биомассы использовали среды 2-х типов с избытком и недостатком железа [Филатова Т.Н., Замятина Т.А., 1991]. Избыток железа создавали добавлением FeCl3 (73,75 мг/л), а недостаток - синтетической комплексообразующей добавкой диэтипентриаминпента-уксусной кислотой (ДГПУ), связывающей железо в прочный хелато-комплекс (К устойчивости комплекса Fe+3 - ДГРУ составляет 1027).

Исследование иммунохимических свойств железорегулируемых белков

менингококков проведено на 65 образцах сывороток крови от 35 больных, перенесших менингококковую инфекцию, вызванную N. meningitidis серогрупп А, В, С на разных статях, болезни. Образцы сывороток любезно предоставлены сотрудниками ГКИБ №2 г. Москвы.

В качестве контроля использовали сыворотки крови лиц разных возрастных групп (121), в анамнезе у которых не было меиингококковой инфекции. Образцы сывороток предоставлены ГСПК КЗ г. Москвы и лабораторией аллергодиагностики НИИВС им. И.И.Мечникова (Москва).

В работе использовали отечественные сорбенты на основе силикогелей с химически привитыми функциональными группами, созданные на химическом факультете МГУ (фирма «БиоХимМак»).

Из микробных клеток N. meningitidis В125 получали различные антигенные препараты, которые использовали для характеристики ЖРБ менингококков и определения спектра антител к ним в сыворотках крови здоровых и больных меиингококковой инфекций.

Лизаты получали суспендированием микробных клеток в трис-буфере (рН 6,8), содержащем додецилсульфат Na (ДЦС-Na), глицерин и Р-меркаптоэтанол. Поверхностные антигены - диализом надосадка после центрифугирования кулыуральной жидкости. Белки наружной мембраны (БНМ) - по методике Frash С.Е. [1990] (экстрагирующий буфер содержал LiCl). Петавлоновые экстракты - из микробных клеток после ультразвуковой дезентеграции. Индивидуальные ЖРБ получены при помощи препаративного электрофореза и катионообменной хроматографии.

Содержание белка в образцах определяли с помощью модифицированного метода Лоури [Maricwell М. К., 1978].

Для характеристики белковых спектров использовали электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в модификации Laemmly [Остерман ЛЛ., 1981]. Концентрацию разделяющего геля варьировали в пределах от 7,5 до 15%. Относительную молекулярную массу белоксодержащих компонентов определяли по калибровочной кривой,

построенной по стандартам молекулярных масс.

Основным методом выявления специфического связывания антител с ЖРБ менингококков служил иммуноблотшнг [Филатова Т.Н. с соавт., 1993]. Электроперенос белков с геля проводили на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм, Sigma). Для проявления реакции использовали антитела диагностические против IgG (Н + L) человека, меченные пероксидазой хрена.

Полученные результаты подвергали статистической обработке общепринятыми методами для альтернативного распределения [Бойли М., 1962, Урбах В.Ю., 1975]. Значимость межгрупповых и внутригрупповых различий частоты определяли по критерию Пирсона (я2) и по формуле Фишера.

Результаты исследования и обсуждение

1. Содержание железо регулируемых белков в различных антигенных препаратах N. meningitidis B12S

В табл. 1 представлены результаты выявления ЖРБ с помощью вертикального электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Na в различных препаратах (лизаты, поверхностные антигены, белки наружной мембраны, цегавлоновые экстракты), приготовленных из культур N.meningitidis В125. Железорегулируемыми считали белки, синтез которых включался или увеличивался на средах с дефицитом железа. Для сравнения использовали аналогичные препараты, приготовленные из клеток менингококков, выращенных на среде с избытком железа.

Было проведено 12 серий опытов по получению бактериальной массы и приготовлению из неб препаратов ЖРБ. В связи с известным предположением [Carson S.B., 2000] о переходе некоторых железорегулируемых белков от состояния низкой экспрессии к высокой и наоборот, независимо от условий культивирования или содержания железа в

Таблица 1.

Содержание железорегулируемых белков в различных антигенных препаратах N. meningitidis В125

№ Условные обозначения выявленных ЖРБ Антигенные препараты Индивидуальные ЖРБ, выделенные с помощью

Бактериальные лизаты Поверхностные антигены Белки наружной мембраны Цетавлоновые экстракты препаративного электрофореза катионообменой хроматографии

1 ЖРБ-19 + - + - - -

2 ЖРБ-22 + + - + + - - -

3 ЖРБ-30 + + + + + + + - - -

4 ЖРБ-35 ++++++ + + + ++++++ ++++++ + + + + + ++++++

5 ЖРБ-38 + - - - -

6 ЖРБ-41,5* - - + - - -

7 ЖРБ-43* - - - - • -

8 ЖРБ-47 + + + +/- + - -

9 ЖРБ-58 + - +/- - - -

10 ЖРБ-68 + - - - -

11 ЖРБ-72 + + + + + + + - + + + -

12 ЖРБ-76* - - - - -

13 ЖРБ-87 + + + + + + - - -

14 ЖРБ-98 +/- - - - -

15 ЖРБ-107 + + - - -

16 ЖРБ-116* - + - - -

Примечание: * - ЖРБ, выявленные в составе лнзатов с помощью иммуноблотганга

+/- - оценка содержания ЖРБ в антигенных препаратах по интенсивности окрашивания полос на электрофореграмме

среде, полученные препараты ЖРБ были проанализированы в ДДС-Ыа-ПААГ. Оказалось, что в идентичных условиях культивирования при концентрации ДТПУ в среде 0,008% наборы и содержание ЖРБ в препаратах всех серий были вполне воспроизводимы.

На электрофореграмме бактериальных лизатов (рис.1) выявлено 12 железорегулируемых белков, синтезированных в условиях дефицита железа в среде культивирования и имеющих расчётную м. м. 19, 22, 30, 35, 38, 47, 58, 68, 72, 87, 98 и 107 кД. Наиболее интенсивно окрашенные полосы давали ЖРБ с м.м. 35 и 72 кД, что свидетельствует о преобладании этих белков в составе лизатов. Также достаточно широкие полосы были у ЖРБ с м.м. 30 и 87 кД. Остальные ЖРБ охарактеризованы, как минорные.

К Ре* Ре"

43.0 цД

ЖРБ-98, -107 ЖРБ-87

ЖРБ-72

ЖРБ-58 ЖРБ-47

ЖРБ-38 ЖРБ-35

ЖРБ-30

20,1 кД

ЖРБ-22 ЖРБ-19

14,4 «Д

Рис. 1. Результаты электрофореза бактериальных лизатов И.тетп^ШЛз В125 в 12% ПААГ

К- калибранты молекулярных масс; Ре - лизаты, полученные из бактерий, выращенных на среде с недостатком железа; Ре+- лизаты, полученные из бактерий, выращенных на среде с избытком железа.

Сопоставление выявленных на электрофореграммах ЖРБ с описанными в литературе проводили при сравнении относительных молекулярных масс (табл. 2). Для более четкого обнаружения минорных железозависимых белков и точного определения их молекулярной массы плотность геля варьировали от 7,5 % до 15 %; что позволило лучше разделить в одних случаях высокомолекулярные белки, а в других низкомолекулярные. С этой же целью варьировали концентрацию исходного антигенного препарата.

Таблица 2.

Сопоставление выявленных ЖРБ с известными по данным литературы

Условные обозначения выявленных ЖРБ Относительная м.м. по электрофорезу, кД Соответствующие по молекулярной массе ЖРБ и их функциональная роль

ЖРБ-19 18,6 ±1,2 BfrA (18 кД), бактериоферрин

ЖРБ-22 21,9 ± 1,9 BfrB (22 кД), бактериоферрин

ЖРБ-30 29,9 ±1,3 возможно это HpuA (-34 кД), рецептор гемоглобина

ЖРБ-35 35,0 ± 1,0 FrpA (33,5-37 кД) периплазматическнй транспортный белок

ЖРБ-38 38,0 ±1,4 FrpC (38 кД) - компонент периплазматической Fbp(ABC)

ЖРБ-47 47,5 ±1,5 Возможно относится к белкам 1 класса (44-47 кД), которые образуют катионоизбирательные поры

ЖРБ-58 57,6± 2,5 FbpB (56 кД) - компонент периплазматической Fbp(ABC)

ЖРБ-68 67,7 ±1,3 ТЪрВ изотип II (67-73 кД), трансферринсвязывающий белок

ЖРБ-72 72,0 ± 1,6 FrpB (70-77 кД), рецептор энтеробактина

ЖРБ-87 87,5 ± 2,7 ТЬрВ изотип I (85-88 кД), трансферринсвязывающий белок

ЖРБ-98 97,5 ±2,6 HmBPl (97 кД) - геминсвязывакмций белок; LbpA (IroA, 98-105 кД) рецептор лактоферрина, ТЪрА (98-100 кД) - рецептор трансферрина

ЖРБ-107 106,7 ± 1,5 LbpA (98-105 кД), рецептор лактоферрина

Примечание: относительные молекулярные массы в различных источниках литературы были получены по электрофорезу, гель-хроматографии или из расчета по аминокислотному составу.

Основные источники литературы: Оепсо С.Р. е1 а1.,1996; Дельвиг А.А. и соавт., 2000.

Препарат поверхностных антигенов представлял собой смесь белков с пребладанием ЖРБ 30 кД, 35 кД, 47 кД и 72 кД, а также серотипового белка (табл.1). ЖРБ-47 в некоторых случаях был экранирован БНМ класса 1.

Однако иммунохимический анализ выявил высокоиммуногенные минорные ЖРБ 98 и 107 кД, не обнаруженные в электрофорезе, но имеющие яркую реакцию в иммуноблоттинге.

Основную массу препарата, полученного с помощью цетавлоновой экстракции, составлял ЖРБ-35, которому сопутствовали около 13 минорных компонентов. Набор ЖРБ цетавлонового экстракта не имел преимуществ по составу ЖРБ перед другими антигенными препаратами, однако значительное содержание ЖРБ-35 позволило использовать его для выделения очищенного белка.

Препарата БНМ содержали 11 ЖРБ (19, 22, 30, 35, 41,5, 47, 58 72, 87, 107 и 116 кД). Состав ЖРБ этих препаратов во многом схож с составом лизатов, однако имелось различие в количественном соотношении полипешидов. Так, например, ЖРБ-72 и серотиповой белок при выделении БНМ практически полностью оставались в осадке и лишь незначительная их часть переходила в экстракт.

В одних и тех же сыворотках спектры специфичности антител, выявляемые лизатами, были богаче спектров антител, выявляемых БНМ (рис.2). При исследовании сывороток больных менингококковой инфекцией в трёх случаях из пяти были выявлены антитела к ЖРБ-43 лизата. Полоса соответствующая данному белку была ярко окрашена, тогда как при иммуноблоттинге экстрактов этот феномен отсутствовал (рис.2б).

Таким образом, бактериальные лизаты N. meningitidis В125, по сравнению с другими антигенными препаратами характеризовались не только более полным набором индивидуальных ЖРБ, но и позволяли выявлять антитела более широкого спектра специфичности. Поэтому дальнейшие исследования спектров специфичности антител к ЖРБ были проведены на лизатах бактериальных клеток менингококков.

КРеэ+Реэ"Рек+Рек"К

КРеэ+РеэРек+Рек

58 кД

36.5 цД

26.6 кД

ЖРБ-87 ЖРБ-43

N --

•9

I

а б

Рис.2. Результаты иммуноблоттинга лизатов и БНМ с образцами сывороток крови здоровых лиц и больных МИ

К - контрольная смесь белков; Реэ+ - экстракт БНМ из клеток, выращенных на среде с избытком железа; Реэ" - экстракт БНМ из клеток, выращенных на среде с недостатком железа; Ре«+ - бактериальные лизаты, полученные в условиях избытка железа; Рек' бактериальные лизаты, полученные в условиях недостатка железа в среде культивирования; а - сыворотка здорового человека; б - сыворотка больного менингококковым менингитом.

2. Выделение индивидуальных ЖРБ

Бактериальные лизаты, полученные при недостатке железа в среде культивирования, содержали два количественно доминирующих ЖРБ с относительными м.м. 35 и 72 кД, что позволило выделить их в очищенном виде с помощью препаративного электрофореза.

Выход продукта от исходного содержания белков в препаратах составил 23 % и 13 % для ЖРБ-35 и ЖРБ-72 соответственно.

Контроль за чистотой антигенов осуществляли с помощью электрофореза и иммуноблоттинга. Каждый из выделенных ЖРБ давал

гомогенную полосу в электрофорезе и иммуноблотганге, соответствующую их м.м. и специфичности антител.

Высокое содержание ЖРБ-35 в цетавлоновых экстрактах также позволило использовать их для выделения данного белка с помощью катионообменной хроматографии. Для очистки ЖРБ-35 использовали отечественные сорбенты (табл.3).

Оптимальные результаты по сорбции и десорбции ЖРБ-35 были получены на сильнокислом катионообменнике - Диасорб-сульфо (табл.3), который был первоначально использован в виде миниатюрного стандартного патрончика, а затем для заполнения колонки. Разделение проводили в ЮмМ Ыа-фосфатном буфере (рН 8,0), элюирование осуществляли раствором того же буфера, содержащего 7 % изопропилового спирта и ступенчато увеличивающуюся концентрацию ИаС1 от 0,1 до 1М. На одном сорбенте удавалось провести разделение 4-6 загрузок препарата.

Таблица 3.

Характеристика сорбции и десорбции ЖРБ-35 на различных сорбентах

Краткая характеристика сорбента Средний диаметр пор сорбентов(А) Оценка качества

сорбции ЖРБ-35 десорбции ЖРБ-35

Диасорб-Сульфо сильнокислый катионообменник 130 + +

250 ++ ++

500 +/- +

Диасорб-Карбоксил слабокислый карбоксильный катионообменник 130 +/- +/-

250 +/- +

500 -/+ +/-

Диасорб-Диол гидрофильный нейтральный сорбент с привитыми диольными группами 130 - -

250 - -

500 - -

Примечание: ++ - хорошие показатели; + - средний уровень; +/- - слабый

уровень; - - отсутствует

При катионообменной хроматографии на "Диасорб-сульфо" был получен очищенный ЖРБ-35, гомогенный в электрофорезе и

иммуноблоттинге.

Таким образом, была разработана оригинальная технология препаративного выделения ЖРБ Ктетп&йсИв с м.м. 35 и 72 кД, которая может быть использована как основа конструирования ИФА тест-систем для серологических исследований в системе эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией и при определении клинического прогноза манифестированного заболевания.

3. Определение спектра антител к ЖРБ менингококков в сыворотках крови здоровых лиц

Серологическая диагностика менингококковой инфекции и «здорового» носительства - это рациональный способ слежения за циркуляцией возбудителя, поскольку она проще и чувствительнее бактериологического подхода, так как нередко выделяемые менингококки не растут на питательных средах и само культивирование и бактериологический анализ трудоёмки и требуют много времени. Кроме того, выявление антител к индивидуальным ЖРБ и определение спектра их специфичности несомненно расширит возможности серологического мониторинга менингококковой инфекции и популяционной оценки естественно приобретённого менингококкового грундиммунитета.

Следует подчеркнуть, что исследования в этом направлении практически не проводились. Опубликовано лишь несколько работ [А1а'АМееп О.А. е* а1., 1990; <Зоггище А.Я. <А а1., 1997, Тгопсозо в. <А а1., 2000, 2002;], в которых при исследовании небольшого количества донорских сывороток АТ к ЖРБ менингококков выявлялись в следовых количествах.

Первоначально с помощью иммуноблотгинга была проанализирована пуловая сыворотка от 100 доноров крови, в которой были обнаружены специфические антитела к ЖРБ менингококков 98; 87; 72; 43; 41,5; 35 и 30 кД (рис.3). Соответствующие полосы имели достаточно высокую интенсивность.

К ?е+

180кД

П6кД * "I . 84кД 58 кД -»► 48,5 кД

98 кД 87 кД

72 кД

43 кД 41,5 кД

36,5 «Д

35 кД

26,6 КД

30 цД 22 кД

ч

Рис. 3. Результаты иммуноблоттинга пудовой сыворотки с лизатами

К - контрольная смесь белков; Ре+ - бактериальные лизаты, полученные в условиях избытка железа; Ре" бактериальные лизаты, полученные в условиях недостатка железа.

В табл. 4 представлены данные по частоте выявления антител к различным железорегулируемым белкам в индивидуальных сыворотках крови лиц разного возраста, которые были определены с различной частотой к 16ЖРБ.

Значительная часть сывороток (45,4%) содержала антитела специфично связывающиеся одновременно с 2-3 различными ЖРБ. Несмотря на широкую представленность антител к ЖРБ, из 121 сыворотки доноров крови пять (4,1%) не реагировали ни с одним из ЖРБ, а одна (0,8%) - реагировала одновременно с 10 различными ЖРБ.

Наиболее часто выявляли специфические антитела к ЖРБ-87 и 72 кД. Антитела к ЖРБ-87 были обнаружены более чем в 50% образцов сывороток крови. Реакция на данный белок была очень интенсивной, что свидетельствовало о высоком уровне антител данной специфичности.

К ЖРБ-72 антитела выявлены более чем в 90% исследуемых сывороток. Высокую частоту выявления антител к этому белку, по-видимому, можно объяснить тем, что он имеет общие консервативные эпитопы с другими патогенными и условно патогенными микроорганизмами (Гончаренко А. В. 1997, Филатова Т.Н. 1994, Дельвиг А.А. 2000). Наличие антител к ЖРБ-72 в исследуемых сыворотках не зависело от возраста обследуемых лиц. Специфические антитела обнаруживали с одинаково высокой частотой как в сыворотках крови детей, так и взрослых (рис.4). При этом интенсивность реакции на данный белок была индивидуальной (от бледной до интенсивно окрашенной).

Таблица 4.

Частота выявления антител к ЖРБ менингококков в сыворотках лиц, не имеющих в анамнезе менингококковой инфекции

М.м. ЖРБ, (кД) Частота выявления антител (%)

Вся группа п= 121 дети до 5 лет п=27 дети 5-14 лет п=43 взрослые п=51

19 6,6 ±2,6 - - 15,7 ±5,1

22 5,0 ±2,0 7,4 ±5,1 4,7 ± 3,2 3,9 ±2,7

30 5,0 ±2,0 3,7 ±3,7 2,3 ±2,3 7,9 ±3,8

35 28,1 ±4,1* 7,4 ±5,1** 28,0 ±6,9** 39,2 ±6,8°

38 3,3 ± 1,6 3,7 ±3,7 2,3 ±2,3 3,9 ±2,7

41,5 28,1 ±4,1* 33,3 ±9,2 25,6 ±6,7 27,5 ±6,3

43 18,2 ±3,5 18,5 ±7,6 9,3 ±4,3** 25,5 ±6,1**

47 6,6 ±2,6 7,4 ±5,1 - 11,8 ±4,5

58 3,3 ± 1,6 7,4 ±5,1 2,3 ± 2,3 2,0 ±1,9

68 2,5 ± 1,4 7,4 ±5,1 - 2,0 ±1,9

72 90,9 ±2,6» 92,6 ±5,1 95,4 ±3,2 86,3 ±4,9

76 1,7 ± 1,2 3,7 ±3,7 - 2,0 ±1,9

87 58,7 ±4,5* 33,3 ± 9,2** 69,8 ±7,0** 62,8 ±6,8°

98 28,9 ±4,1* 29,6 ±9,0 30,2 ± 7,0 27, 5 ± 6,3

107 7,5 ±2,4 7,4 ±5,1 2,3 ±2,3 11,8 ±4,5

116 25,6 ±4,0 14,8 ±7,0 34,9 ±7,3 23,5 ±6,0

Примечание: * - различия достоверны в группе (р<0,05)

** - различия достоверны между группами (р<0,05) ° - отличия достоверны от группы детей до 5 лет (р<0,05)

Частота выявления в сыворотках крови здоровых лиц антител ко второму количественно доминирующему белку (ЖРБ-35) нарастала с возрастом: 7,4% у детей до 5 лет, 28,0% - от 5 до 14 лет и достигала 39,2% у

взрослых лиц (рис.4).

Xf&72

Z дети до 5 лет

Шдеггиат5до14 лет

Нвзрссгьв

Рис.4. Частота выявления специфических антител к доминирующим ЖРБ 35 и 72 кД в сыворотках здоровых лиц разного возраста

Поскольку известно из данных литературы, что белок FbpA (аналог ЖРБ-35) в условиях дефицита железа синтезируют также непатогенные нейссерии (N. cinerea, N. lactamica, N. subflava, N. kochii и N. polysacchareae), можно предположить, что наличие антител к ЖРБ-35 - это ответ на транзиторное здоровое носительство.

В ходе работы было обнаружено, что специфические антитела к ЖРБ-35 в ~40% случаев встречались в сыворотках (взрослых и детей) одновременно с антителами к минорному ЖРБ 43 кД. Возможно, этот минорный белок идентичен одному из предполагаемых гем-рецепторов (НтВРА) - белку с м.м. 44 кД, выявленному у гонококков. Предполагается, что транспорт гема, «захваченного» гем-рецептором, через периплазматическое пространство осуществляется именно посредством FbpA-белка. В литературе имеются данные, подтверждающие это участие [Genco С.А., Desai HJ. 1996]. Показано, что основная часть радиоактивного

железа из гема была обнаружена в связанном виде с ЖРБ-35. Возможно, такой функциональный механизм утилизации гема и объясняет в какой-то мере выявляемое совместное присутствие специфических антител к этим белкам.

При анализе сывороток доноров крови выявлены антитела к 16 ЖРБ, тогда как в бактериальных лизатах на электрофореграмме различимы только 12 ЖРБ. Можно предположить, что эти «минорные» белки обладают достаточно высокой иммунологической активностью, т.к. в ряде сывороток крови антитела к ним проявлялись на мембране в виде четких, интенсивно окрашенных полос.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют, что спектр специфических антител к железорегулируемым белкам менингококков у лиц, не имеющих в анамнезе мениш «кокковой инфекции, представлен достаточно широко. Однако частота выявления антител к отдельным белкам различна и изменяется в зависимости от возраста обследованных лиц.

Выявляемые «нормальные» антитела к ЖРБ могут быть свидетелями (маркёрами) или эффекторами естественно приобретенного противоменингококкового груидиммунигета. Для выяснения их роли требуются дальнейшие исследования. Однако уже в настоящее время анализ спектров специфичности антител к ЖРБ в сыворотках крови здоровых лиц может служить новым инструментом эпидемиологического слежения за циркуляцией нейссерий среди населения.

4. Спектр антител к ЖРБ в сыворотках больных менингококковой инфекцией

При исследовании 55 образцов сывороток крови от 25 больных с менингококковой инфекцией (менингит, менингококкцемия), вызванной бактериями различных серогрупп, были обнаружены антитела к 15 ЖРБ (22, 30, 35, 38, 41,5, 43, 47, 58, 68, 72, 76, 87, 98, 107 и 116 кД). Наиболее часто

выявляли антитела к ЖРБ-72 (87,9%), ЖРБ-87 (72,7%), ЖРБ-98 (50,9%), ЖРБ-107 (52,7%), ЖРБ-116 (50,9%) (табл.5). У больных по сравнению с лицами, не имеющими в анамнезе менингококковой инфекции, достоверно чаще (р < 0,05) были выявлены антитела к ЖРБ-41,5; 43; 47; 76; 98; 107 и ИбкД.

Таблица 5.

Частота выявления антител к индивидуальным ЖРБ в сыворотках крови больных менингококковой инфекцией разных серогрупп

Расчетная м.м. ЖРБ, (кД) Частота выявления антител по серогрушшм (%)

А + В + С п = 55 А а=24 В п=20 С п=11

19 0±0 0±0 0±0 0±0

22 1,8 ±1,8 0±0 0±0 9,1 ±9,1

30 10,9 ±4,2 12,5 ±6,8 10,0 ±6,9 9,1 ±9,1

35 43,6 ±6,7 41,7 ± 10,3 60,0 ±1 и** 18,2 ±12Д**

38 7,3 ± 3,5 4,2 ±4,2 15,0 ± 8,2 0±0

41,5 14,6 ±4,8 20,8 ±8,5 15,0 ±8,2 9,1 ±9,1

43 34,6 ±6,4 25,0 ±9,0 50,0 ±11,5 27,3 ± 14,1

47 30,9 ± 6,2 25,0 ±9,0 35,0 ±10,9 36,4 ±15,2

58 5,5 ±3,1 4Д±4,2 10,0 ±6,9 0±0

68 7,3 ± 3,5 12,5 ± 6,8 0±0 9,1 ±9,1

72 87,9 ± 4,5* 91,7 ±5,8 90,0 ±6,9 72,7± 14,1

76 18,2 ±5,2 25,0 ±9,0 10,0 ±6,9 18,2 ±12Д

87 72,7 ±6,0» 70,8 ±9,5 80,0 ±9,2 63,6 ± 15,2

98 50,9 ±6,7 54,2 ± 10,4 40,0± 11,2 63,6 ±15,2

107 52,7 ±6,7 54,2 ± 10,4 65,0 ±10,9** 27,3 ±14,1**

116 50,9 ±6,7 66,7 ±9,8** 45,0 ±11,4 27,3 ± 14,1**

Примечание: *- различия достоверны между собой и но отношению к другим

белкам внутри группы (р<0,05);

** - различия достоверны (р<0,05) между группами для белка определенной мл.

В сыворотках крови каждого больного обнаружен индивидуальный спектр специфичности антител к ЖРБ. Лишь в одной сыворотке (1,8%) не удалось выявить антител ни к одному из ЖРБ, все остальные содержали антитела к 1 - 10 ЖРБ. Наиболее часто (26,8%) как у взрослых, так и детей индивидуальный спектр состоял из антител к б ЖРБ, в отличие от здоровых лиц, у которых в 45,5% индивидуальный спектр антител выявлялся к 2-3 ЖРБ.

При сравнение спектра антител к ЖРБ в сыворотках крови больных, инфицированных менингококками различных серогрупп (А, В, С) было выявлено, что у больных, инфицированных менингококками серогруппы В, чаще регистрировали антитела к ЖРБ-35 и ЖРБ-43, но реакция при этом была менее интенсивной, чем в сыворотках крови больных, инфицированных менингококками других серогрупп. Для больных, инфицированных менингококками серогруппы С, была характерна более низкая частота выявления антител к ЖРБ с м.м. 35,107 и 116 кД.

Частота выявления антител к отдельным ЖРБ в сыворотках крови детей и взрослых с менингококковой инфекцией достоверно (р > 0,05) не отличалась.

Динамика иммунного ответа была исследована у 21 больного (51 образец сывороток), инфицированых в 10 случаях менингококками серогруппы А, в 7 - серогруппы В и 4-х - серогруппы С. Исследуемые образцы сывороток получали - на 2-4, 5-10 и после 14 суток от начала болезни.

Следует отметить, что у всех больных (100%) на 5-7 сутки выявлялся высокий уровень антител к белкам класса 5 с м.м. 30 кД и ниже. Данные литературы [Hoiby, 1991; Rosenqvist 1993, 1995] свидетельствуют, что иммунизация "норвежской" менингококковой вакциной у большинства добровольцев вызывала увеличение содержания специфических антител к белку Орс (белок 5 класса). Кроме того, достаточно часто наблюдалась динамика нарастания антител к минорному нежелезорегулируемому белку с м.м. »50 кД (47%), а в единичных случаях к минорным белкам с м.м. »60 и »82 кД (рис.5).

Было выявлено нарастание специфических антител к ЖРБ у 38% бальных к ЖРБ-35, у 52%-к ЖРБ-43 и у 38% больных - к ЖРБ-47. Индукция синтеза антител не зависела от групповой принадлежности инфицирующего штамма, а также от возраста пациентов. При этом увеличение содержания специфических антител у больных наблюдалось как к одному из указанных

белков, так и в различных сочетаниях.

К ре* Ре Ре* Ре" К Ре* Ре"

26,6 кД

48,5 кД

36,5 кД

180 кД

ИбкД

58кД

84 кД

50 кД ЖРБ-47

ЖРБ-87 ЖРБ-72 60 кД

белки 5

класса

л

3 сутки 10 сутки 14 сутки

Рис. 5. Результаты иммуноблоттинга с сыворотками больного, инфицированного менингококками серогруппы В в разные сроки от начала заболевания

К - контрольная смесь; Ре+ - яизаты, полученные в условиях избытка железа; Ре" - лизаты, полученные в условиях недостатка железа.

В ходе исследования было зарегистрировано нарастание уровня антител в процессе развития заболевания к ЖРБ-87 в двух случаях (9,5%), тогда как в сыворотках у 12 (57,1%) больных из 21 антитела к этому белку присутствовали изначально и видимой динамики нарастания антител не выявлено. Эти данные полностью совпадают с результатами анализа сывороток контрольной группы, в которой у 58,7% здоровых лиц были обнаружены антитела к ЖРБ-87. Наличие специфических антител к ЖРБ-87 (рецептору трансферрина - ТЬрВ) не повлияло на инфицирование указанных лиц менингококками.

Таким образом, вероятно, ЖРБ-87 не является протективным антигеном, что подтверждается и работами других авторов [НепиМ-Мснщеше в. е1 а!., 2004], в которых показано, что белок ТЬрВ не влияет на вирулентность штаммов менингококков. Штаммы мутанты по данному белку вели себя аналогично дикому типу.

Антитела к ЖРБ-72, являющегося количественно доминирующим при выбранных условиях культивирования у данного штамма, были выявлены в 87,9% сывороток. При этом содержание специфических антител оставалось без изменений на разных сроках заболевания. Эти данные, с одной стороны, совпадают с результатами работы А1а'АМееп Б. А. Л а1. (1990), в которой авторы определяли антитела к РгрВ как в острой фазе заболевания, так и спустя 4 недели у больных с менингококковым менингитом; а, с другой стороны, с результатами, полученными при анализе сывороток контрольной группы, в которой специфические антитела к ЖРБ-72 присутствовали в 90,9% сывороток крови.

В ходе заболевания у некоторых больных наблюдалось увеличение содержания антител к ЖРБ 38; 41,5; 58; 68; 76; 98 и 116кД.

Таким образом, в сыворотках крови больных тяжелыми формами менингококковой инфекции определен широкий спектр антител к ЖРБ менингококков. Полученные данные свидетельствуют о высокой иммунологической активности ЖРБ и их возможной роли в патогенезе менингококковой инфекции.

Выводы

1. Охарактеризован спектр железорегулируемых белков (ЖРБ) бактериальных лизатов, поверхностных антигенов, белков наружной мембраны и цетавлоновых экстрактов Ктепт^НеИз штамма В125. Наиболее полный набор ЖРБ обнаружен в бактериальных лизатах (12-16).

2. Разработана воспроизводимая технология препаративного выделения индивидуального железорегулируемого белка 1Ч.тешщ5Ш<1Ь с мл. 35 кД с помощью хроматографии на отечественном катионообменном сорбенте.

3. В сыворотках крови практически здоровых лиц, не имеющих в анамнезе тяжелых форм менингококковой инфекции, в иммуноблотгинге обнаружены антитела к 16 различным ЖРБ менингококков. По частоте выявления преобладали антитела к ЖРБ 72 кД (90,9%) и ЖРБ 87 кД (58,7%).

4. У практически здоровых лиц с возрастом увеличивалась частота выявления антител к ЖРБ 35 кД (7,4% - у детей до 5 лет, 27,9% у детей 514 лет, 39,2% - у взрослых).

5. Спектр специфичности антител к ЖРБ у больных генерализованными формами менингококковой инфекцией не отличался от спектра антител здоровых лиц. Однако частота выявления антител к отдельным белкам (с м.м. 41,5; 43; 47; 76; 98; 107 и 116 кД) значимо возрастала.

6. При анализе спектра антител к ЖРБ в сыворотках крови лиц, инфицированных менингококками различных серогрупп (А, В, С), обнаружено более частое (60,0%) выявление антител к ЖРБ-35 у бальных менингококковой инфекцией, вызванной возбудителями серогруппы В, чем у лиц, инфицированных менингококками серогруппы С (18,2%). Антитела к ЖРБ-116 у лиц, инфицированных менингококками серогруппы А, выявлялись чаще (66,7%), чем серогруппы С (27,3%).

7. У больных по мере выздоровления нарастает содержание антител к доминирующему ЖРБ-35, а также минорным ЖРБ 43 и 47 кД, что свидетельствует об их роли в индукции синтеза специфических антител.

8. Выявление антител к ЖРБ и анализ спектра их специфичности могут быть использованы в серологических исследованиях в системе эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией, а также

при определении клинического прогноза манифестированного заболевания и оценке естественно приобретенного противоменингококкового грундиммунигета.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Филатова Т.Н., Гамзулина Л Л., Бугаев Л.В. Железорегулируемые белки менингококков как потенциальные кандидаты для создания иммунопрофилактических препаратов. Дальневосточный медицинский журнал. 1996,4:87.

2. Филатова Т.Н., Гамзулина Л.Н. Выделение и иммунохимическая характеристика основного железорегулируемого белка менингококков. Журн. микробиол. 1997,2:24 - 29.

3. Филатова Т.Н., Гамзулина Л.Н., Бугаев Я.В. Железорегулируемые белки менингококков как потенциальные компоненты менингококковой вакцины. Материалы. П Международ, науч. конф. "Современная вакцинология", посвященная 100-летию Пермского НПО "Биомед", Пермь, 1998, с. 125- 127

4. Филатова Т.Н., Гамзулина Л.Н., Бугаев Л.В. Культивирование, способы выделения и иммунологическая характеристика железорегулируемого белка менингококков 37Ы). Материалы УП съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. 1998, Т. 1, с. 250 -251.

5. Филатова Т.Н., Гамзулина Л. Н. Антитела к белкам менингококков в сыворотках больных и доноров. Журн. микробиол. 2000,3:58 - 62.

6. Гамзулина Л.Н., Филатова Т.Н. Антитела к железорегулируемым белкам менингококков в сыворотках крови здоровых лиц разных возрастных групп. Журн. микробиол. 2002,2:37 -41.

7. Гамзулина ЛЛ., Филатова Т.Н. Антитела к железорегулируемому белку (БЪрА) и минорным белкам менингококков в сыворотках больных менингококковым менингитом. Журн. микробиол. 2003,1: с. 68 -71.

1 5053

РНБ Русский фонд

2006-4 12189

Заказ №784. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Актуальность проблемы

Менингококковая инфекция в виде острого назофарингита, гнойного менингита и менингококкцемии — заболевание преимущественно детского и юношеского возраста — возникает относительно редко, но протекает тяжело, с высокой смертностью (10-15%) и обладает эпидемическим потенциалом. [23].

Несмотря на низкую заболеваемость, весьма широко, особенно в очагах инфекции с частотой от 5 до 40% распространено бессимптомное назофарингиальное носительство менингококков [12, 21], которое одновременно служит резервуаром инфекции и, вероятно, основой естественно приобретённого противоменингококкового иммунитета. Конкретные механизмы естественного менингококкового грундиммунитета до сих пор остаются невыяснеными, хотя их анализ имеет ключевое значение в эпидемиологическом надзоре за менингококковой инфекцией и в создании менингококковых вакцин нового поколения.

Своевременная иммунопрофилактика позволяет управлять заболеваемостью этой инфекцией [36; 45]. Однако существующие вакцинные препараты, сконструированные на основе капсульного полисахарида, неэффективны, когда инфекция протекает у детей до года, а так же когда заболевание вызвано менингококками серогруппы В [1].

Так как состав циркулирующих штаммов периодически изменяется, важным является поиск видовых антигенов, которые могли бы быть использованы для вакцины широкого спектра действия.

Антигенная структура менингококков сложна и представлена антигенами различной локализации и природы. Значительное место в ней занимают железорегулируемые белки, синтезируемые микробами в условиях недостатка железа в среде обитания и являющихся жизненно необходимыми для бактерий.

Специфические антитела к некоторым ЖРБ могут блокировать утилизацию железа клетками менингококков и, следовательно, приводить к нарушению процесса размножения бактерий. Кроме того, некоторые индуцированные генетические нарушения в системе утилизации железа приводят к неспособности бактерий использовать определенные источники железа, снижая вирулентность штаммов [12].

Поскольку только патогенные Neisseria способны усваивать железо из организма хозяина, можно предположить, что ЖРБ должны играть важную роль в патогенезе менингококковой инфекции. Установлено [72], что различные штаммы менингококков могут индуцировать до двух десятков различных ЖРБ, которые, вероятно, вносят различный вклад в иммунный ответ организма хозяина к менингококковой инфекции [40].

Наиболее хорошо изучен рецептор трансферрина. Показано, что, специфические антитела к белкам ТЬрА и ТЬрВ, входящим в состав рецептора, выявлены в сыворотках больных, реконвалесцентов и носителей менингококковой инфекции [77]. У вакцинированных добровольцев отмечали повышенное содержание антител к ТЬрВ менингококков, принадлежащих к разным серогруппам. Бактерицидные свойства этого белка изменялись в зависимости от применяемых адъювантов. Обнаружена также его способность к выработке протективных бактерицидных антител [12].

В сыворотках крови лиц, переболевших менингококковолй инфекцией, были выявлены антитела специфичные к белку FrpB, перекрестно реагировавшие с гетерологичными штаммами менингококков [51].

Периплазматический ЖРБ — FbpA (34-37 кД) может индуцировать выработку специфических антител у мышей и кроликов и является общим белком для большинства нейссерий [7, 67, 73].

Общие Т- и В-клеточные эпитопы ЖРБ N.meningitidis с другими представителями рода нейссерий позволяют высказать предположение, что большая часть здорового населения должна обладать высоким уровнем естественного иммунитета против менингококков, т. к. основу нормальной микрофлоры носоглотки человека составляют непатогенные представители рода Neisseria [46, 47]. Выявление антител к различным ЖРБ в крови практически здоровых людей и больных менингококковой инфекцией может служить не только методом идентификации потенциальных протективных антигенов - кандидатов в состав будущих вакцин, но и инструментом анализа специфичности и уровня экспрессии естественно приобретённого менингококкового грундиммунитета.

Цель работы; охарактеризовать спектр специфичности антител к индивидуальным железорегулируемым белкам N. meningitidis в сыворотках крови здоровых лиц и больных менингококковой инфекцией.

Задачи исследования:

1. Выделить и охарактеризовать по составу железорегулируемых белков антигенные препараты N. meningitidis.

2. Изучить спектр антител класса IgG к ЖРБ менингококков в сыворотках крови практически здоровых людей.

3. Определить частоту выявления антител класса IgG, специфичных к различным ЖРБ менингококков в сыворотках крови больных, инфицированных менингококками разных серогрупп.

Научная новизна

Впервые охарактеризован спектр специфичности антител к ЖРБ менингококков у лиц, не имеющих в анамнезе тяжелых форм менингококковой инфекции. С различной частотой (1,7-90,9%) у лиц этой группы выявлены IgG антитела к 16 ЖРБ.

При анализе сывороток крови здоровых лиц установлено, что с возрастом увеличивается частота выявления антител класса IgG к ЖРБ с м.м. 35 кД, что свидетельствует о постепенном формировании естественно приобретенного грундиммунитета.

У больных тяжелыми формами менингококковой инфекции спектр специфичности антител к ЖРБ не отличается от спектра антител здоровых лиц, но частота выявления антител к отдельным белкам (с м.м. 41,5; 43; 47; 76; 98; 107 и 116 кД) значимо возрастает.

Установлено, что в образцах сывороток крови больных, инфицированных менингококками серогрупп А и В, преобладали антитела к высокомолекулярным ЖРБ (98, 107, 116 кД).

Впервые установлено, что по мере выздоровления у больных происходит нарастание концентрации антител к ЖРБ с м.м. 35, 43 и 47 к Д.

Практическая значимость

Разработана оригинальная технология препаративного выделения ЖРБ менингококков с м.м. 35 кД, который может быть использован при конструировании ИФА тест-систем для серологических исследований в системе эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Бактериальные лизаты N. meningitidis серогруппы В характеризуются более широким спектром ЖРБ, чем препараты белков наружной мембраны (БНМ), поверхностных антигенов и цетавлоновых экстрактов.

2. В сыворотках крови здоровых лиц выявлены антитела к 16 ЖРБ менингококков, определяемые с различной частотой (1,7-90,9%). При этом с возрастом увеличивается частота выявления антител к ЖРБ с м.м. 35 кД.

3. В сыворотках крови больных тяжелыми формами менингококковой инфекции с частотой от 1,8 до 87,9% выявляются антитела к 15 ЖРБ менингококков. В ходе заболевания нарастает концентрация сывороточных антител к ЖРБ с м.м. 35, 43 и 47 кД. Сдвиг спектра специфичности антител в сторону низкомолекулярных ЖРБ и нарастание их концентрации может служить положительным прогностическим признаком при манифестированной менингококковой инфекции.

Часть I. Обзор литературы

Выводы

1. Охарактеризован спектр железорегулируемых белков (ЖРБ) бактериальных лизатов, поверхностных антигенов, белков наружной мембраны и цетавлоновых экстрактов N. meningitidis штамма В125. Наиболее полный набор ЖРБ обнаружен в бактериальных лизатах (12-16).

2. Разработана воспроизводимая технология препаративного выделения индивидуального железорегулируемого белка N.meningitidis с м.м. 35 кД с помощью хроматографии на отечественном катионообменном сорбенте.

3. В сыворотках крови практически здоровых лиц, не имеющих в анамнезе тяжелых форм менингококковой инфекции, в иммуноблоттинге обнаружены антитела к 16 различным ЖРБ менингококков. По частоте выявления преобладали IgG антитела к ЖРБ 72 кД (90,9%) и ЖРБ 87 кД (58,7%).

4. У практически здоровых лиц с возрастом увеличивалась частота выявления антител к ЖРБ 35 кД (7,4% - у детей до 5 лет, 27,9% у детей 5-14 лет, 39,2% - у взрослых).

5. Спектр специфичности антител к ЖРБ у больных генерализованными формами менингококковой инфекцией не отличался от спектра антител здоровых лиц. Однако частота выявления антител к отдельным белкам (с м.м. 41,5; 43; 47; 76; 98; 107 и 116 кД) значимо возрастала.

6. При анализе спектра антител к ЖРБ в сыворотках крови лиц, инфицированных менингококками различных серогрупп (А, В, С), обнаружено более частое (60,0%) выявление антител к ЖРБ-35 у больных менингококковой инфекцией, вызванной возбудителями серогруппы В, чем у лиц, инфицированных менингококками серогруппы С (18,2%).

Антитела к ЖРБ-116 у лиц, инфицированных менингококками серогруппы А, выявлялись чаще (66,7%), чем серогруппы С (27,3%).

7. У больных по мере выздоровления нарастает содержание IgG антител к доминирующему ЖРБ-35, а также минорным ЖРБ 43 и 47 кД, что свидетельствует об их роли в индукции синтеза специфических антител.

8. Выявление антител к ЖРБ и анализ спектра их специфичности могут быть использованы в серологических исследованиях в системе эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией, а также при определении клинического прогноза манифестированного заболевания и оценке естественно приобретенного противоменингококкового грундиммунитета.