Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Динамика противоменингококковых антител разной специфичности у привитых полисахаридно-белковой менингококковой вакциной серогруппы В

-. '' ¿у. !-'''«

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР

НАУЧНО-ИССЛКЛОВАТБЛЬСШ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК им. К. И. МЕЧНИКОВ«

На правах рукописи УДК : 615. 371. 001.5: 576.851.232

МОРдаЦКИЯ Александр Михайлович

ДИНАМИКА ПРСТИВОЫЕШШГОКОККОШХ АНТИТЕЛ PA3hJ0 СПЕЦИФИЧНОСТИ У ПРИВИТЫХ ПОЛИСАХАРИД!»- БЕЛКОВОЙ МЕНИНГСКОККОВОЙ ВАКШШОЯ СЕРОГРУППЫ В

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ.

диссертации на соискание /ченой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1991

- г -

Работа выполнена в научно-исследовательской институте вакцин и сывороток им. И. К. Мечникова АЫН СССР

Научный руководите :ь - доктор медицинских наук

Л А. ЛЕВИНА ;

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук

Е А. АБАЛАКИН - кандидат медицинских наук Р. Ы. ТЕМПЕР

Ведущее учреждение, дашее отзыв о научно-практической ценности диссертации - Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича

Задала диссертации состоится "21" ноября 1991 г. в 14 часов на заседании специализированного совета (Д 001.38.01) научно-исследовательского института вакцин и сывороток иы. И. Л ¡Мечникова по адресу: 103064, г. Москва, пер. Мечникова, д. 5

С диссертаций можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток иы. И. И. Мечникова .

Автореферат разослан " 21 " октября 1991 г.

Ученый секретарь еп?ш'.ализироьанногс совета ¡сандидат /ледтынеких наук

Е Г. Кудрявцева

---- 3 -

.ЛГгА ОЕЗАЯ ХАРАХТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.....;,;.;г!5 Актуальность проблемы. Мениягагокковэл инфекция,обусловлеи-

ЗШ\№> а:епа теШпеШсИБ серогруппы В, продолжает оставаться

-'г I

актуальной проблемой здравоохранения в связи с высокой заболеваемость» в разных регионах и отсутствием эффективных препаратов для вэиашчопрофчлактикм этой инфекции (Демина А. А ,1990, Покровский Е И. с соавт, ,1987, ).

Успехи вакняйопрофилактики менингококковой инфекции с помощью полисахзридньк мояовагашн А и С, а такж поликомяоиентнсй вакцины А,С,У,У-135 свидетельствовали о прстективной роли каисулышх антигенов менингококков (Черкизова Т. Ф. с соавт. ,198?, Агтаги! с :оавт. ,1982).

Однако неудачи разработок вакцины для профилактики инфекций, обусловленных менингококками группы В, а также экспериментальные 1гнные о наличии перекрестных реакций между антителами к капсуль-юму полисахариду менингококков серогрушм в и оиалопептидами юг га новорожденных животных, сделай дискутабельиии вопрос о цв-есообрззиости включения калсулыгаго полисахарида в вакцину 1,е>попоп М. с ссавт. ,1983).

В кастояше время в СССР разработана вакцина менингоксккова.. грогруппы В из природного комплекса специфического полисахарида белков наружной мембраны. Проведены доклинические испытания ла-эраторных серий препарата. Это обусловило необходимость доподни-■льчьк исследований биологической активности препаратов, содер-.щик капсульный полисахарид менингококков серогруппы Е

В исследованиях последних дет при оценке гуморального имму-тотг} к менингококкам и иммуногенной. активности противоменинго-кковьк вакцин серогрупп А и С широко использую? реакцию пассив-'л гемэггдотикаиии (РПГА). Однако вопрос о целесообразности пользования РИГА дж сценки иммунологической структуры населения

и динамики антител у привитых менингококковыми вакцинами серогруппы В требовал дополнительного изучения.

Целью работы было определение информативности РЯГА при изучении иммунологичес! ~>й структуры контингента, подлежало вакцинации и оценки' иммуногенной активности полисахаридко-белковых менинго-кокковых вакцин серогруппы В.

В ходе работы необходимо было решить следующие аадачи:

1. Оценить общие и местные реакции добровольцев на введение полисахаридно-белковой менингококковой вакцины серогруппы а

2. Изучить динамику антител разной специфичности у вакцинированных и неБакцкнирозанньи добровольцев.

3. Определить зависимость между титрами антител и способностью эритроцитов человека агглютинироваться в присутствии тест-штамма менингококков серогруппы В.

4. Провести сравнительное изучение активности эритроцитарык диагностикумов, приготовленных на основе полисахаридно-белковых препаратов и очищенного калсульного полисахарида, при определении антител к менингококкам серогруппы В.

5. Выяснить зависимость интенсивности иммунного ответа человека на вакцинацию от исходного иммунного статуса.

Научна , новизна Впервые Еыяснено, что вакцина менингококко-ьая серогруппы В из природного комплекса специфического полжгахару д» м белков наружной мембраны, разработанная в НИИВО им. И. И. Мечникова и МНЖЖ им. Г. Ч. Габричевского, является слабо реактогегшой и обладает иммукогенноЛ активностью. Установлено, что несорбирован-шй ярэпарат, ссдгрдсатй калсульный полисахарид и белки наружной мембраны менкигокоикоз серогруппы В, обеспечивает синтез антикап-сульчк:; антител у добровольцев. Обнаружены принципиальнее различи, в янтт .крас.юзнаюшей способности иммуноглобулинов в натизнух

а

сыворотках и сыворотках, хранившихся затрояенными пгч минус 20 С

Выяснено, что при определении в РИГА динамики ачтптел к капсюльному полисахариду целесообразно использовать натяжные сыворотки и диагностику«, в котором в качестве сенситин-й для эритроцитов крови человека используется очиаэниьй капсу.'ьный полисахарид мэп;и-гококков серогруппы В. Новизна полуденных материалов подтверждена иоло«'г?льяым решением о выдаче авторского сшдетел>стаа по с-ляв-ке на изобретение " Способ получения полисахаридни-белкоьсЛ вакцины против Neisseria Meningitidis серогруппы Б " N 4837652/13 от 29.11.1990 г.

Практическая значимость работы:

1. Данные по реактогекности и иммукогенкости вакцины менипго-кокковой группы В из природного комплекса специфического полисахарида и «5-элков наружной мембраны вкхючьны в отчет о pi зу.штатах чен.м рзактогенности, безвредности и специфической ¡ютнвнооти га ограниченной группе людей, ¡соторнй утвержден Ученым« Советами 1ШИБС им. И. И. Мечникова и МШШ им. Г. Н. Габричевского 00.1991года

2. Реэультагы но определению способности эритроиитое чел. т-ка агглютинироваться в присутствии иеничгскокков включены в отчет о выполнении исследования по изучения препарата адгезии менинго-коккоьий - руппы В, диагностический „ сухой" Ленинградского ИИКВС, проставленный а Комитет ыедадетских иммунобиологических i. ре пиратов Минздрава ССОР 20.08.1S90 г.

3. Рекомендации о необходимости проведения оценки специфической активности полисахаридно-белковых менингококкогш 35кция серогруп-пн В на контингента добровольцев с относительно н№?;сми исходными титроии антикаясу.»ън1М антител использованы при составлении программы испытания вакцины менингококк.зоА группы Л т природного комплекса специфического полисахарида и бемюв пзрум:ой мембраны

с цель.ю р)^ора ирияиБочной доаы, утвержденной Учеными Советами Р'.'.йЮ им. Я Я. Мечникова и ШП:у№1 им. Г. Е к'абрг.чевского 0?. 1уЭ1года.

• - б -

Основные положения, выдвигаемые на защиту: |

1. Вакцина менингококковая серогруппы В из природного комплекса специфического полисахарида и белков наружной мембраны, разработанная в НИИВС им. V. \ Мечникова и МНШЭМ им. Г. Н. Габричевского, обладает умеренной реактогенностью и обеспечивает синтез специфических антител,тестируемых в РПГА и иммуноферментном анализе (ИФА),

2.При опенке иммуногенной активности вакцин к менингококкам серогруппы В необходимо учитывать различия'в антигенраспоэнаадей активности иммуноглобулинов в нативных и размороженных сшоротках.

3. РПГА с использованием диагностикумов на основе очищенного капсульного полисахарида является информативным методом определения антикапсульных антител к к-гчингскоккам серогруппы В.

Апробация работы. Материалы диссертащш обсуидены на бюро отделения гигиены, микробиологии и эпидемиологии АМН СССР 26.12.1989 г. ( г. Москва ) и на I V Всесоюзной конференции " Менингококковая инфекция и гнойные менингиты" 9-10.10.1990 г. ( г. Новосибирск). Диссертация апробирована на научной конференции отдела средств и методов иммунопрофилактики и иммунотерапии НИИВС им. И. И. Мечникова АМН СССР 14.06.1991 г.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 рзботы ( список приведен г. конце реферата).

Обьем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы,. 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на//'ъ'стр. ьчшнолисного текста, иллюстрирована 8 рнсун-

г ••

ками и 28 таблицам:;. В работе использовано 63 отечественных к 62 иностранных источников. .

- 7 -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы

Вакцина менингококковая серогруппы В из природного комплекса специфического полисахарида и белков наружной мембраны , сухая, для подкожного применения, разработана в НИИВС им. И. К Мечникова и МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского. Препарат содержит груплоспецифи-ческий В-полисахарид и белки наружной мембраны , в том числе 'уело к серотипа 2 с молекулярной массой 36 и 41 кД. Вакцина содержит жоло 5-5 ■7. белка, 34 1 сиаловой кислоты ( группоспецифического 3-полисахарида) и менее 1 7. нуклеиновых кислот ( Аллилуев А. П., Заснакьян И. А., Кувакина Е И. с соавт. , 1986 ). 5 работе использовали 7,0-и 9 серии препарата, В одной иммунизи-|уюзгей дозе ( 0,5 мл ) содержалось 50-65 мкг сиаловой кислоты и 0-100 мкг белка В качестве растворителя сухой вакцины использо-али 0,85 Z изотонический раствор хлорида натрия. Вакцину приме-яли подкожно.

Контингент. Работа была проведена в соответствии с програм )й испытания реактогенносги, безопасности и специфической актив-)сти вакцины менингококковой серогруппы В, утвержденной Комите-iM вакцин и сывороток при Минздраве СССР 02.03.1988 г. Под наблипнем находилось 83 практически здоровых добровольца мужского ла в возрасте 19-22 лет, которые ранее не прививались менинго-кковнми вакцинами. Все добровольцы находились в одинаковых ус-виях быта и труда. Разбивка наблюдаемого контингента на группы па проведена методом случайной выборки. Добровольцев иммунизи-зали дважды с интервалом 53 дня. Однократно были привиты вакци-! 56 и двукратно- 54 человека, 27 добровольцев двукратно яолу-м по 0,5 мл 0,85 % раствора хлорида натрия ( группа плацебо).

Клинико-лабораторное обследование добровольцев. Все цобро-ьцы до и в течение 6 месяцев после первой вакцинации находи-

лись под врачебныы наблюдение«. У 75 добровольцев до вакцинации проведано одномоментное бактериологическое обследование носоглоточной слизи общепринятым методом в соответствии с приложением N 2 к приказу Ш'-драьа ССС1 N 98 от 29.01.1981 г. Учет общ« и местных реакций ка вакцинацию проводили до и через 1, 6-8, 24, 48 и 72 часа после инъекции путем опроса жалоб привитых, а также измерения температуры тела и артериального давления, величин локальной гиперемии и отечности места иньекции. До и через 24 часа после каждой иммунизации у 36 добровбльцев исследовали морфологический состай крови.

Иммунологическое обследование добровольцев. Для определения динам. а иммунологических показателей у добровольцев были исследованы сыворотки крови, полученные до иммунизации, через 10, 2-4 ; 53 дня после 1 иньекции и через к8 и 117 дней после 2 иньекида вакцины или плацебо.

Пробы нативных сывороток шифровали и исследовали в первые

о

7 суток хранения при 4 С, пробы " размороженных " сывороток иссл

о

довали спустя 1-4 месяца хранения ври минус 20 С. При постановке РПГА использовали следующие 4 типа эритроцит арных диагностикумов а/ коммерческий диагностику« серии 1, изготовленный в ШИШ им. Г. Е Габричевского, в котором очищенным капсульним полисахарид серогруппк В сенсибилизировали Формалинизированные эритроциты 0(1) группы крови человека,

б/ диагностику*!, изготовленный в МНШЭМ им. Г. Е Габричевеко! в которой очищенным капсудьныы полисахаридом серогруппы В еенои( лизировгия свежие эритроциты 0(1) группы крови человека,

в/ диагностихум, в котором в качестве сенситипа для формат:; визированных эритроцитов барана применяли полисахаридно-Оелховы препарат из »менингококков серогруппы В ( штамм N 125 ),

г/ диагностику«, в котором в качестве сенситина для формал

I низирсванных эритроцитов барана применяли полясахаридчо-белявый препарат из штамма Escherichia coll Л 20 а ( 02: R1: Ш ).

Постановку РПГА с диагностику*1ами на основе эритроцитов человека осупрствляли в полистироловых пластинах с вместимостью лунок 2 мл, используя 2-кратное разведение сшоротск с 1:10 в объеме 0,5 мл. Диагностикум в виде 0,25 % взвеси добавляли в каддум

о

лунку в обьеме 0,25 мл. Пластины инкубировали при 20 С. Пос гаиов-ку РПГА с диагностикумами на основе эритроцитов барана осуществляли микрометодом в U-образных планшетах аппарата "Такачи", используя 2-кратное разведение сывороток с 1:2 в обьеме 0,05 мл. Диагностикум в виде 0,25 % взвеси сенсибилизированных эритроцитов

о

добавляли в Лунки в обьеме 0,05 мл. Планшеты Еццер;швали при 4 С.

Опенку специфической активности вакцины в иммуноферментном анализе проводили совместно с Чулок Т. А. по разработанной ею методике. В качество твердой фазы (чин использованы планшеты фирмы "Нунк", которые были сенсибилизированы в карбонат-бикарбонатном Зуфере с рН 9,6 в течение 16 часов антигенами менингококков с^ • рогруппы В: белком наружной мембраны, капсульным полисахаридом в юзах 1 мкг/мл и лшоолигосахаридом в дозе 10 мкг/мл. В качестве ссньюгата использовали коммерческие кроличьи антитела к гамма-■лобулину человека, меченные персксидазой з разведении 1:8000, Фоизводства ВДИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи. Субстрактная смесь предстояла собой перекись водорода с ортофенилендиаминон. Положительным ; отрицательным контролем слуздли сыворотки крови доноров с по-ярными значениями содерашия противоменккгококковых антител, онтрольные и опытные образцы тестировали 4 разе на ваэдом алад-ете 9 одном разведении, которое составило при определении анти-ел к полисахариду и дипоолигосахариду 1:400, а к белку - 1:1600. лределение оптической плотности проводили на фотометре "Мулътис-;,и" при длине волны 492 нм.

Определение способности эритроцитов добровольцев к адгезии менингококков. Адгезивная активность эритроцитов крови добровольцев исследовалась в реакции прямой гемагглютинации (РГА) по мето-. дике, разработан: >й Румянцевым С. Н. с соавт. (1988), с использованием серии 3 препарата "адгезии менингококковый серогруппы В, диагностический, сухой", изготовленного в Ленинградском НИИВС, который состоит из лиофилизированной взвеси хорошо пилированных менингококков серогруппы В (штамм N 202). Для постановки реакции 25 мкл крови помешали в 350 мкл раствора Олсвера. Трижды отмывали забуференньм 0,85 Z раствором хлорида натрия (ЗФР) путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 5 мин. Отмытые эритроциты ресусьендировали в 350 мкл ЗФР, получая 3,6 % взвесь эритроцитов обследуемого лица. Содержимое ампулы с препаратом " адгезии" разводили с помощью ЗФР до содержания 8 гемагглюгияируодих единиц в . 1 мл (ГАЕ/мл) и готовили б последовательных 2-кратных разведений до 0,12 ГАЕ/мл. В каждую лунку горизонтального ряда планшета для иммунологических реакций вносили по 180 мкл препарата "адгезин" с содержанием от 8 до 0,12 ГАЕ/мл. 3 8-12 лунки вносили по 180 мкл ЗФР -контроль эритроцитов. Затем в каядузо лунку добавляли по 5 мкл 3,6 % отмытой взвеси эритроцитов обследуемого лица. Содерам-

о

мое лунок тщательно перемешивали и инкубировали 1 час при 37 С, а затем ночь при 4 0. Результаты учитывали на следующий день.

Статистические методы. Бри сопоставлении показателей использовали метод ранжированных разниц (Бирюков ЕВ. .Левина Л. А. .1967).

При оценке достоверности различий между показателями применяли ' ?

критерии Стьвденга(1) или критерий X . (Ашмарин И. Е .Воробьев а.а. 1SS2, Бе ГШ Н. ,1962).

- и -

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Данные литературы свидетельствует о взаимосвязи между реакто-генностью бактерийных препаратов и их способностью к поликлональ-ной активации иммунокомпетентных клеток ( Сауа11о Т. ,6галЬо1т К. А. , 1990 ). Для надежной оценки динамики антител у привитых новой поли-сахаридно-белковой менингококковой вакциной серогруппы В необходимо было изучить интенсивность обких и местных реакций на вак-'.нацню. 2.1 Реактогенность полисахаридно-белковой менингококковой

вакцины группы В. В нашем наблюдении при подкожюм введении вакцины или плацебо общие и местные реакции у добровольцев отмечали только в первые сутки после иммунизации (табл. 1).

Таблица N 1

Динамика общих и местных реакций у привитых вакциной и плацебо

Кз них с наличием реакций

£ я} та о п <0 « о о и\ Я к о О 0} ш ■ Я Е- 1 о X п5 т о ч: о Слабость д ч о чэ аз ч Ф Ен азо й». 03 ¡> осо ш 1 Болезненность места инъекции Гиперемия /мм/ Отечность /мм/ Уплотнение /мм/

г) Я Я 1-10 11-20 1-10 11-20 1-10 .1-20

о чэ о ч о С-. §' 1 Е-"СО

6-8 вакциной плацебо 56 27 0 1 1 0 12 4 5 1 15 2 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0

24 вакциной плацебо 56 27 0 0 1 0 0 0 1. 0 11 0 0 0 О 0 0 0 0 0 0 0

вакциной плацебо 54 27 0 0 0 0 3 0 11 0 б 0 4 0 3 0 2 0 0 с 1 0

24 пакциной плацебо 54 27 0 0 с 0 3 0 16 0 8 0 Э 0 г» с 0 4 0 1 0 1 о

I

- 12 -

о

Повышение температуры тела до 37,5 С отмечено после 1 инъекции у 12 из 56 привитых вакциной и у 4 из 27 лиц, получивших плацебо ( Р>0,05 ), а после 2 иньекции - только у 3 из 54 вакцинированных добровольцев. Síмыyl¡чзaция обусловила слабые местные реакции в виде болезненности, небольшой локальной гиперемии и отечности и не оказывала отрицательного влияния на показатели артериального давления и периферической крови, на состояние лимфатической, сердечно-сосудистой. дыхательной у. пищеварительной систем организма Наблюдаемые сохраняли трудоспособность в полном обьеме. Лица, привитые вакциной и плацеСо, при б-месячном наблюдении болели одними и теми же нозологическими формами и с одинаковой частотой.

Такьм образом, в нашем наблюдении было выяснено, что исследуемая вакцина обладает слабой реактогенностью и не обусловливает существенных изменений в клинико-лабораторном статусе добровольцев. Не было установлено различий в частоте и интенсивности общих и местных реакций между привитыми вакциной и плацебо. 2.2 Мммуногенная активность вакцины

При анализе нарастания антител у привитых вакциной и плацебо мы, в соответствии с рекомендациями ВОЗ (1978,1982.), определяли процент лиц, у которых тестировали 4-кратное увеличение титра антител. Результсуы определения антител при титровании блоков сывороток. хранившихся при минус 20°С в течение 1-4 месяцев. а/ Опыты с коммерческим диагностикумом.

Наибольшее число лиц с 4-кратным нарастанием титра антител в этой серии опытов отмечено на 10 день после 1 иньекции менинго-¡сокковой вг-щины. При этом 4-кратное увеличение титра антител было отмечено у 26 из 47 обследованных ( 55,317,3 %). Процент лиц с ■".-кратным нарастанием титра антител у вакцинированных был существенно больше гл сравнению с группой добровольцев, получивших плацебо. во вст исследованные сроки, то есть через 10, 24 и КЗ дня после

30-

40-

30 ~

20 ■

10 -

Рис.

10

й

i ¡SÉ

Pi

II

li

1

24

i i

É

ш :ÍI

Щ ЖЁ

33

¡Щ

s

ж

íiss Щ]

s

8Í»

оутки

I Розультаты ШГА с "рвзморожанннш" сыворотками я коммерческим *ди.агностик.умом £33- опыт, Щ- -контроль

по оси ординат -процант лиц с '4-кватннм нарастакиам титоэ антител по оси абсцисс--споки исследования/сутки/7 по отношанию.к I иньакции * --28 дкаЯ посла 2.яньакцли

1 иньекции и спустя 28 дней после 2 иньекции вакцины (рис.1). Ери сравнении процента лиц с 4-кратяьш нарастанием титра антител до 2 иньекции и спустя 28 дней существенных различий не было отмечено (t-0,26;P>0.05) .те зсть не было обнаружено эффекта 2 прививки.

б/. Опыты с экспериментальной серией свежеприготовленного диаг-ностикума к капсульному полисахариду менингококков группы Е

а

При титровании сыесроток, хранившихся при минус 20 С, свежеприготовленным диагностикухом наибольший процент проб с 4-кратным нарастанием титра антител у вакцинированных так же, как и в опытах с коммерческим диагностикумом, отмечен на 10 день после 1 иньекции препарата( табл. 2).

Таблица N 2

Результаты РПГА со све же приготовлению.! диапюстикудом к капо

сулыюму полисахариду ( сыворотки хранились при минус 20 С )

га К Cddk исследования по отноиению к I иньекции /дни/ о к ttl 8 W <D Распределения сывосоток в 38- вйсемосги os тигра антител Всего лиц с 4л-ксатным не-взсгвнием титоа по отношению к исходному СтагИСТИ-чбский ehs- лиз различий к гоуп-пе 3

U >: а F-t ч о хэ о до 1:80 1:1601:320 1:640 и зыке вбс Üin X2 F

до 25 20 5 0

I через 10 25 9 10 б 10 40.0Í10.0 7,5 ¿0,01

до ' 24 19 3 2

2 череа 10 24 3 12 4 11 45,0il0,4 9,4 <0,001

до 25 12 12 1

л через 10 25 12 12 1 1 4.0* 4,0

Примечание: группа 1 - вагаякированнае двукратно сер. 8 или 9 группа 2 - вакцинированные сер. 8 или 9 при

1 иньекции, сер. 7 - при 2 иньекции группа 3 - "олучиыпие двукратно плацебо

В этой серии опытов 4-'кратное увеличение титра антител было отмечено у 21 из 49 обследованных ( 42,8± 5,8 1 ). При этом , на 10 день после 1 иньекцяк вакцины 4-кратное нарастание титра антител отмечено у 10 из 25 обследованных в группе 1, у 11 из 24 обследованных в группе 2 и только у 1 из 25 обследованных из группы плацебо ( группа 3 ).

В этой серии опытов т. к хя, как и в серии опытов с коммерческим дигностикуысм, не было обнаружено эффекта второго введения вакцины. Несколько иные закономерности были выявлены в опытах титрования натлвных сывороток.

Результаты титрования нативных сывороток в опытах со свег"1-приготовлениым диагностикумом к капсульному полисахариду.

Эту серию опытов проводили путем одномоментного титрования сывороток , полученных в каждый из сроков от добровольцев из двух групп вакцинированных разными сериями мэнингококковой вакцины и группы плацебо. Такая пэстаноька опытов позволяла корректно проводить сравнения внутри групп в каждый из сроков исследования, ко затрудняла сравиенйе динамики антител, так как кевоэмо.чаю было в одном опыте сравнить сыворотки „ полученные з разные сроки. Сравнение процента добровольцев с 4-кратным нарастанием титроБ антител у вакцинированных и в группе плацебо показало, что существенные различия между группами определяются только в один срок -через 28 дней после 2 инъекции препарата ( спустя_81 день после 2 иньекции вакцины ). В табл. 3 представлены результаты сравнения

распределения лиц с 4- кратным нарастанием титра антикапсулмгы?

2

антител с помопч-ю критерия X , из которых видно, что з 1 и 2 группах двукратно вакцинированных добровольцев наблюдали сузкстьенное узели- эние количества лиц с 4-кратным наоастааием титра антител по сравнению с группой плацебо ( группа 3 ).

Таблица N 3

Результаты РИГА со свежэприготовленным диагностикумом к капсульному полисахариду ( нативные сыворотки )

га Срок лс-сладовв-нил по отношению е I иньекции /дни/ о гп со в Р=! а> »4 о •о о Распсецвленив сывоооток в зависимости ог титса янтигал Всего лиц с 4-ксетным наметанном титса по ртношиию к исходному .Статистический анализ различия к гауппе 3

С а .3 1: 80 1:160-1 I 1: 320 1 и :64С Еьие абс %± № X2 р 1

до 20 8 11 1

через 81* 20 0 11 9 12 60,0211,2 5,5 <0.02

ДО 21 8 12 1 С

с через 81 21 X 8 12 14 65,?£10,5 7,9 <0.01

3 ДО 24 10 14 0

через 91 24 3 14 п 1 5 20,8+8,5

Примечание: группа 1 - вакцинированные двукратно сер. 8 или Э группа 2 - вакцинированные сер. 8 или 9 при 1 инвенции, сер. 7 - при 2 иньекции группа 3 - получивиие двукратно плацебо

м - спустя 28 дней после 2 иньекции з отличие о" результатов титрования сывороток, хранившихся при минус 20°С, в нативных сыворотках нарастания антикапсульных антител после 1 иньекции вакцины не было обнаружено. В нативных сыворотках 4-кратное нарастание титра антител спустя 28 дней падле 2 иньекции препаратов было обнаружено у 26 из 41 заклинированных ( 63,4 £7.6 % ), и только у 5 из 21 обследованных ( 20,8 ±8.5 % ) и? группы плацебо.

Таким образом, при постановке различных•модификаций РИГА с зритроцитар.чымл диагностикумами на основе отданного капсульного полисахарида менингококков серогручпи В Ошга рыясяечо наличие

иицуногекоза активности у новой нени:-гскок.совой полисахаридно-бел-ковой вакцины серогрулпы В. При гтсм бнли выявлена нс-котооые различия в антигенраспознажиеЯ акгив.чсста шгмкапсульных ш:титсл в

о

нативных сыворотках и пробах, хранившихся при минус 20 С. В нативных сыворотках не удалось тестировать рамииз антитела, а в сы-

с

воротках, хранившихся при минус 20 С, не ол'-счэно приросла антител после 2 инъекции накцины. Б связи о тем, что яиагксстикум, в котором очищенным :сапсульн^м полисахаридом сь-нскбилиг.ировали сае-.кие эритроцит!* человека, использовался .-ак прл титро:ании нативных, так и сывоооток, хранившихся при минус 20°0, момю полагать, что обнаруженный наш феномен не зависит от диагкостикума, а, вероятно, связан с особенностями природы ант тел к капсульному по-чисахариду менингокежов серогрулпы К Как известно, антикапсуль-ные антитела изотипа М обладают нивкой авидкостьв и при хранении относительно быстро теряют1 способность связываться с антигенньон детерминанта».« ( 5а1аг: 1 А. ,1082 ).

Наши материалы свидетельствуют о необходимое? проведения дополнительных исследований с целью выбора оптимальных условий хранения сывороток при определении динамики антитпеульаых антител. 2.3 Антитела разной специфичности в зависимости от гено-

и фенстипических особенностей у добровольцев В наших исследованиях проведено сопоставление титров ачти-капсульнах антител в зависимости от носительства менингококков в носоглотке и способности эритроцитов добровольцев к адгеаии менингококков серогрулпы В.

Сопоставление титров антител у добровольцев в зависимости от мениигоносительства

Результаты бактериологического обследования свидетельствовали о высокой частоте мениигоносительства ь наблюдаемом к ллекти-ве. Так, из 75 обследованных положительный результат получен у 23

Чч лоаек ( ЗГ 7 % ). При этом, не бь„о выделено ни одного штамма мэ^'/нгикокков серогруппы А, только 1 штамм менингококков серогруппы ВиЗ штамма - серогруппы С. При титровании исходных сывороток в группе бактерионосителей отмечено существенно меньшее число л д с относительно низкими титрами антител к Е. coli kl. Так. среди бактерионосителей обнаружено 5 человек с титрами антител к Е. coli kl, равными 1: 8 и ни®, а среди лиц с отрицательным результатом бактериологического обследования - у 26 из 56 2"

обследованных (X -5,8; Р< 0,02 ). В связи с тем. что бактериологическое обследование удалось провести только однократно, мы сочли целесообразным сопоставить титры антител разной специфичности-не только у лиц с зарегистрированным или незарегистрированным носите льством менингококков, но и у лиц с разной способностью к колонизации менингококков серогруппы В, об интенсивности которой мы судили по данным РГА с препаратом "адгезин менингококковый серогруппы 3". Предварительно"было проведено сопоставление результатов бактериологического обследования и гемаггдйтинирукяцей активности зр.:троцитов.

Сопоотавлото результатов РГА с другими показателями По результатам РГ.а все добровольцы были разделены на 2 группы: V лица, эритроциты которых обладали относительно высокой способностью агглютинироваться в присутствии менингококков серогруппы? ( агглютинацию наблюдали в лунках, содержащих 1 "АЕ/мд и менее препарата " адгезин") и

б/ лица, эритроциты которых обладали относительно низкой способность» агглютинироваться в присутствии менингококков серогруппы В ( агглютинацию наблюдали в лунках, содержэодах 2 ГАЕ/мл и болаэ препарата. " ацгезин"}.

При сравнении распрецеления лиц с рачной активностью в РГА в гаеисимост'л от результата микробиологического исследования было.

выяснено, что в группе бактерионосителей существенно меньше лиц с относительно низкой способностью к адгезии менингококков. Так, из 12 обследованных бактерионосителей к группе с активностью 2 ГАЕ/мл и более принадлежали только 3 человека, тогда как среди 31 добровольцев с незарегистрированным менингокосительством такое свойство эритроцитов было отмечено у 20 лиц ( х"»7,1; Р< 0,01 ). К началу наших исследований по определению способности эритроцитов добровольцев к адгезии менингококков серогруппы Б не баю сведений о наличии или отсутствии динамики в показателях РГА при многократных обследованиях одного и того хе добровольца. При проведении 4-кратного обследования 44 добровольцев в нашем наблюде-. нии было выяснено, что только у 15 ( 34,1 /. ) активность в .РГА . оставалась на одном и том же уровне. Наиболее четкая тенденция к увеличению количества добровольцев с гемагглхгсинирущей активностью на уровне 1 ГАЕ/мл и менее прослеживалась в группе невг--цинированных добровольцев. С^арный анализ результатов РГА в разные сроки в зависимости от группы крови ABO свидетельствовал о статистически существенном увеличении к концу наблюдения количества лиц с высокой активностью ( 1 ГАЕ/мл и менее ) в РГА среди

2

добровольцев с О (1) группой крови ( X » 3,9; Р< 0,05 ).

Эти материалы свидетельствовали о целесообразности проведения сопоставлений данных РГА и других показателей раздельно по кэдзому из сроков: обследования.

Сопоставление динамики антител разной епещф.юности' у ч^кци-нировакных добровольцев ъ зависимости от гемаггдогиккруудай активности эритроцитов.

Сопоставление антител разной специфичности у закцинирср?. лых с ""^зульгатами РГА 5ыло проведено методом ранжированных разниц. Пр;; таком анализе суцестзекнс более высокие титры антител в ?П;'А были обнаружены у лиц с гемзгглотинкрувдгй активностью на уровне

?, ^АЕ/мл и б"лее. Так, в опытах определения, антикапсульных антител све^приготовленным диагностикумом в натавных сыворотках было обнаружено существенное превосходство в показателях для лиц с активностью 2 ГАЕ/мл и более как в исходных пробах (Д -65,0;$¿-22,1; Р<0,001 так и пробах, полученных в конце наблюдения (5 -101,0; ¿Эд-45,2; Р0.05 ).

В связи с тем, что РЛРА определяет, в основном, антитела лэотипа М, для определения различий в антителах изотипа Б был использован ИФА. В нагих исследованиях бшш сопоставлены данные ИФА, чолученны? Чулок Т. А. , с результатами РГА, полученными в наших опытах. Анализ результатов определения антител в нативных сыво- • ротках к антигенам менингококков ( капсульному полисахариду, белку и лшюолигосахариду ) выявил следующие закономерности.

Вакцинированное с активностью 1 ГАЕ/мл и менее превосходили по титрам антител т всем исследуемым антигенам как вакцинированиях с активность« ьа уроЬне 2 ГАЕ/мл и более, так я кевакциниро-ванных ( группа плацебо ) лиц, с активностью на уровне 1 Г'АЕ/мл и мок.'е.

Таким образом, в опытам ИФА так. ж, как и в опытах РПГА,

обнаружены различия в содержании антител у лиц с разной способ-

ностьг эритоои^ов агглютинироваться в присутствии менингококков

еерогруппы В. Кроме того, в ИФА выявлены существенные различия

между содержанием антител у вакцинированных добровольцев и лиц из

1 руппы плацебо с одинаковой иктшгостыо в РГА, что явилось допол-

í

петельным свидетельством наличия инмуногенной активности у исследованного вакцинного препарата. В то яа гремя, в опытах РПГА и №'» установлены различия в титрах антител у лиц с разной аетчв-носг.1 ю в РГА. Так, в РПГА при использовании эритроцитарного диагностику»« к счищенному полисахариду монингокогкоь еерогруппы В '■сл^е рысоки-з титры аити! ел ( 1кМ ) бнлв обнаружены у ли:; с низ-

той активностью в РГА ( 2 ГАЕ/.мл и более ), а в ИФЛ при определении ^-антител более высокие тигры антител обнаружены у л'"( с относительно высокой активностью в РГА ( 1 ГАЕ/мл и менее ). Эти материалы позволяют ожидать более интенсивный !еМ-ответ у лиц с меньшей способностью к колонизации менингококков и, вероятно, с низкими исходными титрами антител, а более интенсивный ¡¿6-ответ у лиц с более выоаженной способностью к адгезии менингококков и. возможно, относительно высоким-! исходных® титрами антител.

Полученные результаты свидетельствовали с целесообразности специального анализа интенсивности ответа на вакцинации от исходных титров антител.

Зависимость интенсивности антителоос^азоввнля от исходных титров антител

Анализ динзыики антикалсульных антител по результатам РПГА свидетельствовал о зависимости эффекта вакцинации от исходног уровня антител (табл.

При сопоставлении результатов титрования нативных сывороток со свежеприготовленным диагностикумом к капсульному полисахариду до и спустя 23 дней после 2 прививки (табл.4, сер. 1) выяснено, что все 16 вакцинированных с исходны),! титром до 1:80 отвечали на вакцинацию. В то же время, 4-кратное нарастание титра антител было отмечено только у 10 из 23 ( 43,5+ 10.6 X ) ли а с ксходшлч титрам!, 1:160 - 1:320. Близкие данные были полукны при сопоставлении результатов титрования сывороток, хранившихся при минус 20°С. ь опытах с коммерческим диагностикумом (табл. 4, с^р. 2). 3 этой с?-р:ш опытов только / 1 из 17 вакцинированных с исходным титром 1:640 отмечено 4-кр^тное нарастализ титра антител. В опытах с сыворотками,хранившимися при минус 20°С, зависимость эффекта вакцинации от исходного титра выявлялась не только спустя 23 дней после 2 инъекции вакцинк, но такхе в более ранние сроки.

Таблица N 4

Сопоставление результатов РПГА в разных опытах

(П О с- к о (Ч о <3 р о и' О) Исходные тит-ри рчтител у добровольцев Распределение добровольцев Распределение привитых по титрам антител спустя 81 день после I инъекции Всего с 4-кратным нарастанием титра по отношению к исходным

& 0> g До 1:80 I: 160 1: 320 1:640 и выше абс %±т

до 1:80 16 1 И 4 16 100,0

1 41 1: 160-J: 320 23 0 8 15. 10 43,0¿10,0

1- 64С и выше 2 0 0 2 0 0,0

до 1:80 4 0 з 1 3 75,0+25,0

о 45 1:160-1-, 220 24 0 4 20 15 62,5+10.1

1:640 и ьыше 17 0 О 15 1 5,9+ 5.9

Примечание: 1 серия-опыты с йативными сыворотками и свежеприготовленным диагностикумом.

о

2 серия-опыты с сыворотками,хранившимися при минус 20 С, и коммерческим диагностикумом.. Tai*., спустя Ю'дпей после 1 иньеквди вакцины 4-кратное нарастание титра антикат.-ульнчх антител было отмечено у всех 5 обследованных с исходным титром до'1:80, у 10 из 25 ( 64,019,8 г ) лиц с исходным титром 1:160-1:320 к только у 5 из 17 (29,4111,4%) лиц с исходным титром 1: 540 ч выше. Таким образом, в наших исследованиях установлен более интенсивный ответ из вакцинацию лиц с относительно низкими исходными титрами знтикалсулькых антител, что позволяет рекомеадспать при изучении иммукногеньой активности препарате в на r.f больчкм/ .контингенте, проводить предварительный отбор лии о относительно низами исходными титрами актитед к капсудоно-у.у ;юли. эхиризу менингококков церогруопы В.

- 23 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ

3 кашей работе было установлено, что новая несортированная вакцина менингококковая серогрунпь. В из природного комплекса специфического полисахарида и белков наружной мембраны является слабо реактогенкой и обладает иммуногенной активностью. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о целесообразности использования- РИГА при изучении им' унолсгической структуры коллектива и оценки иммуногенной активности >.;енингококксвоЯ' вакцины , содержал капсульный полисахарид менингококков серогрулпы а Установлены принципиальные различия в антигенраспознаюией активности иммуногло-

<5

булинов в нативных сыворотках и пробах, хранившихся при минус 20 0. Результаты работы цоззоляют рекомендовать ..¿пользование свежеприго-.овленного диагностикума к очищенному полисахариду серогруппы В для определения динамики антикапсульных антител в нативных сыьоротках. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что для оценки ш у- • ногенной активности вакцин, содержащих капсульный полисахарид менингококков серогруппы В, в организованных коллективах необходимо предварительно проводить отбор добровольцев с отрицательными результатами бактериологического обследования, относительно низкой способностью к адгезии менингококков и с исходным титров ан-тикапсульнкх антител в РПГА 1:80 и менее.

ВЫВОДЫ

1. Вакцина из природного комплекса капсулыюго полисахарида и белков наружной мембраны N. ггеп'г^и^з серогруппы В обладает умеренной реактогенностью и обеспечивает у иммунизированных добровольцев нарастание антикаксульных антител.

2. РПГА с использованием эритроиу.тов, сенсибилизированных очипгчным капсу.гным цо/ксахаридом менингококксв серогрулпы В,

I

является информативны),! тестом при определение динамики ан.ител к капсульному полисахариду менингококков сгрогруппь' Е.

- 2-1 -

3. Мнтеке^лссть иммунного отпет-. на лньекцил» вакцины кз природного ,.-оып7:5кса -ап^ульного поллсахарида' и белков наружной мембраны :.!енийгококко»: оерогр>«гы В завись от ¡¡сходного титра антител. У все* ват"ппровоиньй доброзогвиов. с исходньм титром антикапсу-оных еитител 1:80 и ниже выявлено 4-кратное нарастание титра антител

4.Условия обработки сыворсток крови отражаются на антиген-р /¡познающей эг-тглиосги ^н.-нтел к 5;9Нилгококг.ам серогруппы В. При тестировании »-.лтивных сывороток наиболее высокая агачгеность обнаружена а пробам. пол><каных спустя 28 дней после 2 иньекшш. При теет;'иава:1>п; лроС, продваритель'лэ подвергнутых еачораживани». ' наиболее о:-изаяпиь о:ллроролуче-яные спустя 10 пней после 1 мкьекнии вакцины.

5.Среди лице 0 (1) группой крози установлено статистически существенное у^личеяиз числа добровольнее,эритроциты которых приобрели к концу срока ваблс-Лоння относительно высокую способность

к адгезии неииигепокков серо.-руапы В.

6. По дачным- МЧ, в£.гац;нироваинне лица, эритроциты которых обладали ""¡й^йт^чио высокой способностью к адгезии менингококков, превосходили невак1Шмрован"ьк по сод^рханию антител к капсульно-му полисахариду, Солку п зипоолигесахариду менингококков серогруппы Е

7. Сцоику иямуяггевксли ченч^гококкозой вакцины сорогр;, лпы В

необходимо приводить с /четом исходи!«, титров автиказеульшх гити-

г.

.•ел и ратличлй-в г лтигенрйслс??г*кж':Я актив,гости имьтно;л^булинов ь нативаих к подвергшихся пгмораживянкю сыг.о;откэх.

- 25 -СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

1. Защитная активность сыворотки крови, содержащей антитела к К1-антигену эшерихий ( соавт.: Зайцева Е. В.. Гончаров В. С. , Боровкова R М. , Левина Л. А.) Ж. микробиол.. 1989, N12, с. 111-112.

2. Реактогенность и а нтигенная активность вакцины менинго-кокковой серогрупгш В из природного комплекса специфического полисахарида и белков наружной мембраны ( соавт.: Васнакьян И. А. , Аллилуев A. IL , Кувакина В. И. и др.) Ж микробиол. , 1990, Ч 12,

с. 50-55.

3. Безвредность и антигенная активность менипгококковой полиса-.^аридко-белковой В-вакцины ( соавт.: Басиакьян И. Д., Кувакина В. И., Левина Л. А. и др.) Менингококковая инфекция и гнойные менингиты. -тез. докладов. Новосибирск, 1990, т. 1, с. 68-70.

4. Антитела к Neisseria .«ninfjitidis серогруппы В у людей с различной способностью к адгезии менингококков ( Cuibt. ': Левина JL А. . Зайцева Е. Е , Гончаров BlC. ) И. микробиол., 1990, N 8, с. 114-115.

Соискатель