Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние гидроксида алюминия и детергентов на иммунологическую активностьантигенов Neisseria meningitidis серогруппы В

ь9 И

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК ИМ. И.И.МЕЧНИКОВА

На правах рукописи

БУГАЕВ Лев Владимирович

Влияние гидроксида алюминия и детергентов на иммунологическую активность антигенов Neisseria meningitidis серОГруППЫ В.

i4.oo.3 6 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1992

Работа выполнена в научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова АМН России

Научный руководитель: кандидат медицинских наук А.Б.Петров

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Л.И.Краснопрошина доктор биологических наук А.В.Санин

Ведущее учреждение - Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского.

Защита состоится 19 ноября 1992 года в 14 часов на заседании специализированного совета НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова АМН России по адресу юзоб4, Москва, переулок Мечникова, д.5а.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова АМН России.

Автореферат разослан 19 октября 1992 года.

Ученый секретарь

Специализированного совета

кандидат медицинских наук Н.Г. Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Известно, что примерно эо% всех случаев менингококковых инфекций, регистрируемых в мире, вызывается возбудителями серо-групп А, В, и С. В настоящее время разработаны эффективные вакци-' ны для профилактики менингококковой инфекции серогрупп а, с, y, wi3 5. Все эти препараты состоят из высокомолекулярных полисахаридов, выделенных из микробов соответствующих серогрупп. Попытки создать аналогичную полисахаридную В-менингококковую вакцину оказались неудачными из-за низкой иммуногенности очищенного кап-сульного В-полисахарида (В-ПС). Доля серогруппы В составляет более 50% всех случаев менингококковых инфекций во многих странах мира и продолжает увеличиваться. Поэтому проблема создания эффективной вакцины для профилактики менингококковой инфекции серогруппы В остается актуальной уже несколько десятков лет.

В настоящее время разрабатываются и проходят клинические и полевые испытания вакцины на основе нековалентных' комплексов из очищенных поверхностных антигенов менингококка - белков наружной мембраны (НМ) и капсульного В-ПС. Подобные препараты созданы в Кубинском Национальном центре менингококковой вакцины, в Норвежском Национальном институте общественного здравоохранения, и в Walter Reed Army Institute, США. ВО всех Предлагаемых Вариантах менингококковой В-вакцины в качестве адьвантов используются гели гидроксида алюминия (ГА).

В нашей стране была разработана В-менингококковая вакцина из природного бежово-полисахаридного комплекса менингококков, использовавшаяся без адъюванта (Кувакина В.И. с соавт., 1986). Препарат продемонстрировал хорошую иммунологическую активность в

опытах на животных (Баснакъян И.А. с соавт., 1990). Но опыты на добровольцах показали ограниченную способность вакцины индуцировать антитела к белковому компоненту и бактерицидные антитела (Кильдюшевская Т.В., 1990). Чтобы увеличить иммуногенность вакцины для людей, было необходимо применение адъюванта.

Цель настоящего исследования состояла в подборе адъювантов для белково-полисахаридной В-менингококковой вакцины и оптимальной формы ее приготовления. В качестве адъювантов исследовали ГА и группу поверхностно-активных веществ - детергенты разных классов.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Изучение иммунологической активности (антигенности и иммуно-генности) антигенов, входящих в состав менингококковой В-вакцины при сорбции на гели ГА и при обработке детергентами. Выбор наиболее активного адъюванта.

2. Определение оптимальной формы приготовления и применения менингококковой В-вакцины.

3. Изучение токсичности и иммунологической активности полученных препаратов.

4. Разработка методов контроля предложенной вакцины.

Научная новизна и практическая значимость проведенных исследований

В результате проведенной работы изучена иммунологическая активность антигенов, входящих в состав менингококковой В-вакцины при сорбции на гели ГА и при обработке детергентами.

На основе материалов диссертационной работы составлено "Дополнение к инструкции по изготовлению и контролю вакцины ме-

нингококковой группы В из природного комплекса специфического полисахарида и белков наружной мембраны, сухой, сорбированной на гидроксид алюминия ex tempore для подкожного введения".

Апробация работы

Материалы диссертационной работы легли в основу отчета о доклинической апробации вакцины менингококковой группы В, сорбированной на гидроксид алюминия ex tempore, утвержденного Ученым советом НИИ вакцин и сывороток им. iИ.И.Мечникова АМН России 26 марта 1992 года.

Диссертация апробирована на научной конференции отдела средств и методов иммунопрофилактики и иммунотерапии НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова АМН России 5 июня 1992 года.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, иллюстрирована и рисунками и 12 таблицами.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. АНТИГеНЫ Neisseria meningitidis И аДЬЮВЭНТЫ.

Использовали высокоочшценные лиофилизированные препараты белков НМ менингококка, В-ПС и менингококковую В-вакцину. Вакцина представляла собой лиофилизированный белко-полисахаридный комп-

леке (БЕК), выделенный ИЗ микробной культуры Neisseria meningitidis серогруппы В штамма 125, содержащий высокомолекулярные белки НМ и капсульный В-ПС.

В качестве адъювантсв использовались детергенты разных классов: цвиттерионный Zwittergent 3-14 (Zw), неИОННЫЙ Octyl glucoside (OG) И КЭТИОННЫЙ Cetyltrimethylamonium bromide (СТАВ) И

гели ГА.

1.2. СорСционная активность гелей гидроксида алюминия.

О сорбции антигенов, входящих в. состав ВПК, судили по содержанию белка и В-ПС в надосадочной жидкости после центрифугирования смеси БПК - гель в течение 4 мин при 2000 об/мин. Количество белка определяли методом Lowry О.Н. et ai. (1951), а В-ПС - в реакции торможения пассивной гемагглютинации.

1.3. Иммунологическая активность препаратов. Иммунногенность изучали на инбредных мышах СВА/Са Lac sto

массой 16-18 г. Группам из ю мышей однократно или двукратно, с интервалом в 14 дней вводили внутрибркшинно по о,5 мл препаратов, содержащих в i мл ю мкг бежа, 50 мкг детергента и/или 200 мг ГА. Сыворотки тестировали через 14 дней после последнего введения препаратов. Уровни антител к белку и В-ПС определяли в реакции пассивной гемагглютинации и в реакции иммуноферментного анализа.

Иммунный ответ оценивали также, согласно рекомендациям ВОЗ, по титру бактерицидных антител к менингококкам серогруппы В в бактерицидном тесте (реакции иммунного бактериолиза).

Антигенность препаратов исследовали в реакциях торможения ИФА и РПГА.

1.4. Электрофорез в полиакриламидном геле.

Для характеристики белковых компонентов препаратов использо-

вали метод электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия В модификации Laemmli et al. (1970).

1.5. Токсичность сорбированной вакцины.

Токсичность менингококковой В-вакцшш, сорбированной на гели ГА, изучали согласно методике, изложенной в приказе Минздрава СССР №31 ОТ 13.1.83.

1.6. Статистический анализ.

Результаты исследования были статистически обработаны общепринятыми методами (А.П. Ашмарин, В.А. Воробьев, 1962).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Влияние детергентов и гидроксида алюминия на иммунологическую активность антигенов Neisseria meningitidis СврОГруППЫ В.

2.1.1. Иммунохимическая характеристика антигенов N. meningitidis, использующихся в работе.

Перед проведением иммунологических экспериментов было важно установить, соответствует ли состав белкового препарата белковому компоненту ВПК. Было проведено изучение очищенного белкового препарата и менингококкового БПК при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Белковый препарат и белковый компонент БПК представляли собой сходные смеси нескольких белков, с превалирующим содержанием белка с мол.весом 40-42 кД. По электрофоретичес-кому спектру очищенный препарат бежа был товдественен белковому компоненту БПК. В дальнейшем очищенный препарат бежа и белковый компонент ЕПК будут обозначены как белок НМ (БНМ).

Было также изучено, как соотносятся антигенность и иммуно-генность БНМ и В-ПС, находящихся в составе БПК и в очищенном

виде. Данные представлены в табл. i. Исследования показали, что при выделении БНМ и В-ПС из комплекса происходило значительное снижение иммуногенности, но при этом антигенность ЕНМ увеличивалась в 2 раза, а В-ПС - уменьшалась. Это явление может быть объ яснено следующим образом. У В-ПС наиболее значимыми являются так называемые конформационные антигенные детерминанты, которые определяются его трехмерной структурой (Lyfely M.R. at al. 1987). При образовании полисахаридом комплекса с БНМ происходит стабилизиза-ция его конформации, что приводит к увеличению числа детерминант. При этом повышается и иммуногенность и антигенность В-ПС. БНМ 2 класса - это интегральный белок, имеющий полярные и неполярные области и поэтому в полярных растворителях склонный к самоагрегации. Если он находится в комплексе с гидрофильным В-ПС, который присоединяется к неполярной, гидрофобной части молекулы, происходит солюбилизация бежа с уменьшением степени агрегирования.'Это ведет к увеличению его иммуногенности-, но при этом происходит уменьшение его антигенности.

Таблица i. Иммунологическая активность антигенов n. meningitidis разной степени очистки.

Антигенность Иммуногенность

Препараты Значения эффективной Уровень антител

константы связывания (в единицах ИФА) (МЛ/МКГ)

Белок НМ 5,0±0,20 ■ О,140±0,12

Белок НМ в составе ВПК 2,з±о,зо o,5so±o,i2

Полисахарид 4,o±o,is не определяли

Полисахарид в составе БПК 8,2±o,3i о,47б±о,зг

2.1.2. Влияние детергентов и гидроксида алюминия на иммуноген-ность и антигенность антигенов n. meningitidis серогруппы В.

2.1.2.1. Определение оптимальных условий действия гидроксида алюминия и детергентов на иммуногенность антигенов n. meningitidis серогруппы В.

Изучалась динамика иммунного ответа мышей (4,7,14 день после введения) при разных схемах введения препаратов (однократная или двукратная иммунизации с интервалом 2 недели) и разных дозах ВПК (содержащих i,5,io мкг белка). Вакцину сорбировали на гель 2, используемый для приготовления адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина.

Дозы ВПК, содержащие i и 5 мкг белка, оказались слабоиммунногенными. Результаты эксперимента с дозой, равной ю мкг белка, показаны на рис. i.

Наблюдался эффект иммунологической памяти - значительное усиление иммунного ответа на БНМ и В-ПС после двукратного введения. При этом сорбированные препараты вызывали более выраженный иммунный ответ к БНМ и В-ПС, стимулирующее действие ГА достигало, максимума к концу срока наблюдения - на 14 сутки.

Также было изучено стимулирующее действие одного из детергентов - og на иммунный ответ мышей к ЕНМ и антигенам ВПК на 14 сутки после однократного и двукратного введения препаратов. В качестве контроля использовали те же препараты, сорбированные на ГА (гель 4). og стимулировал ответ мышей только к очищенному препарату БНМ, не влияя на иммуногенность В-ПС и БНМ, входящих в состав ВПК. Детергент вызывал достоверное повышение уровней антител к белку после повторного введения комплекса белок/ос (рис. 2). ГА увеличивал иммунный ответ ко всем антигенам.

б

Рис. 1. Динамика иммунного ответа мышей после иммунизации менингококковым белково-полисахаридным комплексом.

а - уровни антител к B-ПС, б - к белку.

По оси абсцисс - время после введения препаратов (в сут), стрелка

- ревакцинация; по оси ординат: а - iog2 титров антител в РИГА, б

- единицы ИФА.

1 - иммунизация сорбированным препаратом, 2 - не сорбированным препаратом.

Рис. 2 Иммунный ответ мышей на различные препараты бежа наружной мембраны N.meningitidis.

По оси абсцисс: i. иммунизация очищенным препаратом белком, 2. иммунизация комплексом бедок-де тергент, з. иммунизация сорбированным белком; по оси ординат - иммуногенность в единицах ИФА. Заштрихованный столбик - однократное введение препаратов, светлый столбик - повторное введение

2.1.2.2. Сравнение стимулирующего действия гидроксида алюминия и детергентов разных классов на иммуногенность антигенов n. meningitidis.

Затем было проведено сравнение стимулирующего действия ГА и детергентов (табл. 2). Наиболее активными адъювантом был ГА, который значительно повышал иммунный ответ к белковому и к полисахаридному компоненту БПК. Ни один из исследуемых детергентов достоверно не увеличивал иммуногенность БНМ и В-ПС, входящих в состав БПК. Детергенты стимулировали ответ мышей к очищенному препарату БНМ, самый активный из них - неионный Og повышал его иммуногенность примерно до уровня, соответствующего иммуногенности БНМ, соединенного с В-ПС или с ГА.

Синергизма в действии двух адъювантов отмечено не было.

Таблица 2. Влияние детергентов разных классов и гидроксида алюминия на иммуногенность антигенов N. meningitidis.

Уровни антител

Препараты

к белку

к В-полисахариду

1 Белок НМ

2 Белок HM-zw

3 Белок HM-og

4 Белок НМ—став

5 Белок НМ + ах

О,140 ±0,12 0,386 ±0,17

0,528 ±0,09

0,292 ±0,13

0,607 ±0,21

6 БПК

7 БПК-Zw з ЕПК-og

9 БПК-став

ю БПК + ах

О,550 ±0,11

0,523 ±0,09

0,709 ±0,17

0,596 ±0,08

0,814 ±0,14

О,476±0,32 О,457±0,26 О,442±0,31

0.484±0,29

1, 263±0, 41

в единицах ИФА

Похожие результаты были получены Роо1тап .Т.Т. еЬ а1 (1987) и ве^егу е.с. еъ а1. (1983). Изучалась иммуногенность менингокок-ковой ЕПК серогруппы В, содержащей белки НМ, детергент гч и а1ро4- Было показано, что иммуногенность белкового препарата, содержащего и детергент и а1ро4, выраженная в титрах бактерицидных антител и уровнях антител к белку, была такой же, как иммуногенность белка в составе природного менингококкового комплекса (содержащего белки НМ, В-ПС и липополисахарид), а без а1ро4 - тех же белков, солюбилизированных С-полисахаридом.

2.1.2.3. Влияние вида детергентов и соотношения белок/детергент на антигенность и иммуногенность белков наружной мембраны; изучение влияния гидроксида алюминия на антигенность белков наружной мембраны и В-ПС.

Было проведено изучение влияния детергентов на антигенность БНМ. Результаты представлены на рис.з.- Наиболее активным детергентом оказался цвиттерионный ъч. Солюбилизация детергентами значительно увеличивала антигенность БНМ в очищенном препарате, и в гораздо меньшей степени - антигенность БНМ в составе ЕПК. Это может быть объяснено тем, что в составе ЕПК БНМ уже солюбилизиро-ван В-ПС, который взаимодействуя с гидрофобной областью БНМ, придает ей гидрофильные свойства, и БНМ хуже встраивается в мицеллу, образованную детергентом.

Оценивалось также влияние сорбции на антигенную активность БНМ, В-ПС и антигенов БПК в РТПГА. Было установлено, что после сорбции БПК и очищенных антигенов на ГА антигенная активность белка и В-ПС во всех препаратах снижалась в 4-8 раз. Видимо, при сорбции происходит экранирование ГА эпитопов В-ПС и бежа, но тем

не менее иммунологическая активность in vivo увеличивается. Наиболее вероятно, что это несоответствие объясняется действием геля на уровне макроорганизма за счет изменения клиренса антигенов и воздействия на иммунокомпетентные клетки.

Л 6

Рис. з. Влияние детергентов на антигенную активность белков

НМ N.meningitidis.

а) - очищенный препарат БНМ, б) - белок в составе ВПК По оси абсцисс - соотношение белок/детергент, по оси ординат -значения эффективной константы связывания в мл/мкг 1 белок + zw, 2 белок + og, з белок + став,, пунктирная линия -препараты без детергентов.

Для двух наиболее активных детергентов - zw и og было изучено влияние разных соотношений белок/детергент на иммуногенность БНМ. Антигенность препаратов возрастала с увеличением количества детергентов, тогда как иммуногенность оставалась на одном уровне. Наиболее активно увеличивал антигенность бежа zw, но оказался менее эффективным, чем og при стимулировании иммунного ответа к

БНМ.

Таким образом, связь между изменениями антигенности и имму-ногенности изученных антигенов имела сложный характер и зависела от вида антигенов и модифицирующих их веществ.

2.2. Сорбция менингококкового белково-полисахаридного комплекса на гидроксид алюминия и иммунологическая активность сорбированных препаратов. Контроль сорбированной вакцины.

2.2.1. Сорбция менингококкового белково-полисахаридного комплекса на гели гидроксида алюминия.

Так как наиболее активным адъювантом был ГА, повышающий иммунный ответ к белковому и к полисахаридному компонентам комплекса, именно гели ГА были выбраны в качестве адъювантов для менингококковой В-вакцины.

Было проведено изучение оптимальных условий приготовления сорбированной вакцины (влияние физико-химических свойств гелей, соотношения белок/гель, рН гелей, времени сорбции).

2.2.1.1. Влияние физических свойств гелей и соотношения беЛОК/ГеЛЬ на ПОЛНОТУ СОрОЦИИ аНТИГеНОВ N. meningitidis.

Вначале была изучена сорбция антигенов БПК на один гель -гель 2. Установлено, что основное количество В-ПС (около эо%) сорбировалось в течение is-зо мин, максимальную сорбцию бежа (примерно 50% от исходного количества) наблюдали несколько позже - через зо-4о мин, затем в течение i суток концентрация несорбировавшихся антигенов в надосадке менялась незначительно.

Возможность более полной сорбции БПК изучали на гелях с

различными физическими свойствами и при разных соотношениях БНМ/гель. При инкубации смеси БПК и гелей в течение 1 часа установлено, что гели з и 4 с дисперстностью 1,1 и выше лучше сорбировали все антигены, особенно белок (табл. з). При соотношении 1:20 они сорбировали практически полностью В-ПС и около 80% бежа.

Таблица з. Сорбция бежа, входящего в состав ВПК, гелями ГА*

Гель Количество сорбированного бежа

(в % от исходного уровня) при соотношении белок/гель

1:10 1:20 1:30

1 26,0±б,0 45,0±11,6 50,4±10,4

2 27,0±5,5 46,0+18,0 60,8±14,5

3 56,1±8,9 84,0±7,2 86,0±10,3

4 54,4±10,6 79,3±1,2 87,0±3,8

*время сорбции 1 час

2.2.1.2. Динамика сорбции антигенов N. meningitidis на гели гидроксида алюминия.

Сорбция ex tempore - один из привлекательных способов приготовления сорбированных вакцин. Поэтому было проведено также изучение сорбции ex tempore вместе с динамикой сорбции антигенов ВПК в течение i часа. В качестве сорбентов использовали гели с высокой сорбционной активностью - з и 4, контролем служил ранее исследовавшийся гель 2. Результаты' сорбции бежа представлены на рис.4. Гели з и 4 сразу после смешивания с вакциной при

соотношении белок/гель 1:зо сорбировали около 80% белка и более 90% В-ПС. Таким образом, при сорбции ex tempore сорбировалось основное количество антигенов ВПК.

Рисунок 4. Динамика сорбции бежа ВПК гелями ГА. Соотношение белок БПК/гель 1:зо; 2,3,4 - номера гелей. По оси абсцисс - время сорбции (в мин); по оси ординат - количество сорбированного бежа (в % от исходного уровня).

2.2.1.3. Влияние рН гелей гидроксида алюминия на сорбцию антигенов N. meningitidis.

В связи с незначительной буферной емкостью раствора ВПК, значение рН смеси ВПК-гель определялось рН гелей (7,9). к гелям 2 и 4, имеющим разную сорбционную активность, добавляли фосфатный буфер. Изменение величины рН в интервале от 7,9 до б,о не влияло на сорбцию В-ПС независимо от способа внесения буфера. При изме-

нении рН после процесса сорбции количество связанного бежа оставалось на одном уровне. Однако при изменении рН гелей до смешивания их с ЕПК наблюдали снижение количества сорбированного бежа по мере сдвига рН в кислую сторону. Тагам образом, исходные значения рН гелей (7,9) являлись оптимальными с точки зрения их сорбционной активности, а отсутствие десорбции после процесса сорбции при физиологических значениях рН позволяет надеется, что десорбции антигенов с ГА не произойдет при введении препаратов в организм.

2.2.2. Иммунологическая активность сорбированного менингококково-го бежово-полисахаридного комплекса.

2.2.2.1 Влияние физических свойств гелей на иммунологическую активность антигенов n. meningitidis. Иммуногенность препаратов, сорбированных В течение 1 часа И ex tempore.

С целью определения физических свойств гелей, оптимальных с точки зрения стимулирования иммунного ответа, было проведено изучение адъювантного действия гелей с разной сорбционной активностью. Как видно из табл.4, гели з и 4 с меньшим размером частиц, обладающие лучшей сорбционной активностью, индуцировали более высокий ответ к бежу и В-ПС, чем гели с более крупным размером частиц.

Было также проведено сравнение иммуногенности препаратов, сорбированных на гели ГА серий 1,2,3,4 в течение i часа и ех tempore. Препараты, сорбированные в течение i часа имели тенденцию стимулировать более высокие уровни антител к бежам НМ и В-ПС, но статистически достоверных различий в иммуногенности

препаратов, сорбированных разное время, не отмечалось.

Таблица 4. Стимулирующее действие гелей ГА на иммунологическую активность, менингококкового белково-полисахаридного комплекса.

Уровень ) антител к белку Уровнь антител К В-ПС

Адъювант ИФА* РИГА ** ИФА РИГА

Гель 1 о, ,32±0 , 09 8 ,8±0 ,41 0,77±0, 44 7, ,6+1,32

Гель 2 0, ,35+0 , 12 8 , 7± 1 ,06 0,95±0, 31 7 , , 3 + 0,09

Гель з 1, , 05±0 , 28 9 ,0±0 ,31 1, 77± 0 , 54 7, ,4+0,69

Гель 4 0, ,92+0 , 23 10 .0 + 0 ,26 2,07±0, 60 8, ,9+0,54

Без сорбента о, ,17±0 , 13 7 ,5 + 0 ,92 0, 42±0, 17 5, ,3+0,25

* Единицы ИФА

**

1од2 титра антител

2.2.2.2. Десорбция антигенов и иммунологическая активность сорбированной менингококковой вакцины, хранившейся в жидком виде в течение в месяцев-и 1 года.

Для решения вопроса об оптимальной форме приготовления вакцины было также проведено изучение процессов десорбции антигенов и иммуногенности жидкого сорбированного препарата, хранившегося в течение 1 года. Сорбированную на гель з вакцину тестировали через ■6 и 12 месяцев с момента начала хранения. Контролем служила не-сорбированная лиофилизированная вакцина и вакцина, сорбированная в течение 1 часа.

Было установлено, что при хранении жидкой сорбированной вакцины в течение 1 года происходит значительное снижение ее иммуногенности - уровни антител к В-ПС у мышей после иммунизации

этой вакциной не отличались от уровней антител у мышей, иммунизированных несорбированной лиофилизированной вакциной (табл. 5). Видимо, это происходило вследствие деструкции В-ПС, так как имму-ногенность белкового компонента в процессе хранешш не уменьшалась. При этом десорбции антигенов с ГА не наблюдалось - количество антигенов в надосадке вакцины не увеличивалось (12% белка и менее 0,01% В-ПС).

Таблица 5. Изменение иммуногенности жидкой сорбированной менингококковой В-вакцины в течение 1 года.

Уровни антител*

Препараты _

к белку к В-полисахариду

1. Вакцина сорбированная в течение 1 ч. о, , 770±0, 035 0, ,894±0, 048

2 . Вакцина сорбированная хранение б мес. о, ■787±0, 049 0, ,718+0, 043

3. Вакцина сорбированная хранение 12 мес. о, ,754+0, 055 0, ,598+0, 088

4. Вакцина лиофилизированная 0, ,327±0, 027 0, ,474±0, 045

* в единицах ИФА

Таким образом, приготовление сорбированной вакцины в жидком виде нецелесообразно вследствие снижения ее иммуногенности в процессе хранения.

Возможный путь сохранениия иммуногенности вакцины - лиофили-

зация ее или вместе с ГА, или без ГА с последующей сорбцией ех tempore. Однако при лиофилизации геля может измениться его структура, что приведет к снижению его адъювантной активности. Наиболее рациональным решением проблемы нам представлялась сорбция ех tempore. При этом лиофилизированный препарат и жидкий ГА, играющий роль растворителя и сорбента, хранятся раздельно и смешиваются непосредственно перед введением. Возможность использования вакцины в такой форме подтверждается данными литературы об успешных испытаниях в опытах на животных и добровольцах аналогичной в-менингококковой вакцины, сорбированной ex tempore и результатами собственных исследований: гели ГА с высокой сорбционной активностью при сорбции ex tempore сорбировали основное количество антигенов ВПК, препараты, приготовленные таким образом, не были токсичны и не уступали по иммуногенности препаратам, сорбированными в течение i часа.

2.2.2.3. Индукция бактерицидных антител менингококковой В-вакциной, сорбированной ex tempore на гидроксид алюминия.

Иммунитет при менингококковой инфекции коррелирует с наличием бактерицидных антител, уровни которых являются важнейшим критерием для оценки эффективности менингококковых вакцин. Иммуно-генность сорбированного ВПК оценивалась по уровням антител к В-ПС и белку. Поэтому было важно определить также и уровни индуцируемых бактерицидных антител. Эти исследования были проведены в рамках работы по доклинической апробации менингококковой ' В-вакцины, сорбированной ex tempore на ГА. Использовали вакцину, сорбированную на гели ГА серий 13,14,15. В сыворотках мышей, иммунизированных вакциной, определяли уровни антител при помощи

МФА и бактерицидного теста (табл. 6).

Сорбция ВПК на ГА способствовала значительному увеличению титров бактерицидных антител и уровней антител к В-ПС и белку, индуцируемых вакциной. Отмечалась прямая корреляционная зависимость с заметной степенью связи (r=o,675) между титрами бактерицидных антител и уровнями антител к В-ПС, тогда зависимость мевду бактерицидными антителами и антителами к БНМ отсутствовала.

Таблица 6. Уровни бактерицидных антител и антител к белку и В-ПОЛИСахарИДУ ПОСЛе введения сорбированной ex tempore ченингококковой белково-полисахаридной В-вакцины

Уровни антител* Титры бактерицидных

^дъювант к белку к В-полисахариду антител

Гель 13 о, 750 + 0, 075 1,558 + 0, 220 1:2666 (1: 1801-1:5128)

Гель 14 0, 790 + 0, 236 1,331 + 0, 383 1:770 (1: 373-1:1879)

Гель is о, 779 + 0, 080 1,261 + 0, 210 1:666 (1: 488-1:997)

Зез сорбента о, 288 + 0, 159 0,513 + 0, 426 1:32 (1: 17,5-1:202)

* в единицах ИФА

2.2.2.4. Токсичность менингокоюсовой В-вакцины, сорбированной ех tempore на ГИДООКСИД ЭЛЮМИНИЯ.

Вце одна проблема, возникающая при разработке нового препарата - это его возможная токсичность. Поэтому были проведены эксперименты по изучению токсичности В-менингококковой вакцины, сорбированной ex tempore на все 4 использующихся в исследованиях "еля ГА по методике, изложенной в приказе Минздрава СССР

631 от 13.01.83.

В опытах использовали беспородных белых мышей массой 15-20 г и морских свинок массой 250-300 г. Одна доза соответствовала одной максимальной разовой дозе для иммунизации человека и содержала юо мкг белка и 50 мкг В-ПС и/или г мг ГА. После иммунизации за состоянием здоровья животных велось наблюдение в течение 7 дней. К концу периода наблюдения все животные оставались здоровыми и не отмечалось снижения их массы. Таким образом, ЕПК, сорбированный на все серии гелей ГА не был токсичен.

Выводы:

1. Гидроксид алюминия по сравнению с цвиттерионным, анионным и катионным детергентами оказался более активным адъювантом для аНТИГеНОВ беЛКОВО-ПОЛИСахарИДНОГО комплекса (ВПК) N. meningitidis серогруппы В. Сорбция ВПК на гидроксид алюминия значительно повышала синтез бактерицидных антител и антител, специфичных к В-полисахариду и бежам наружной мембраны. Поэтому гидроксид алюминия был рекомендован в качестве адъюванта для В-меннигококковой вакцины.

-2. С целью сохранения в стабильной форме антигенов ВПК и геля гидроксида алюминия .предлагается менингококковую В-вакцину сорбировать ex tempore. Препараты, приготовленные, таким образом,- не были токсичны и не уступали по иммуногенности препаратам, сорбированными в течение i часа.

3. Изученные детергенты способствовали увеличению и антигенности и иммуногенности очищенных белков наружной мембраны менингококка, при этом максимальное повышение иммуногенности происходило до определенного уровня, соответствующего иммуногенности белков в составе БПК или сорбированных на гидроксид алюминия. Детергенты повышали антигенность белкового компонента, но не влияли на имму-ногенность антигенов БПК.

4. Связь между изменениями антигенных свойств и иммуногенностью изученных антигенов имела сложный характер и зависела от степени очистки антигенов и вида модифицирующих антиген веществ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. "Сорбция белково - полисахаридного комплекса, выделенного ИЗ Neisseria meningitidis серОГруППЫ В, На ГвЛИ ГИДООКСИДа ЭЛЮМИ-

ния и иммунологическая активность сорбированных препаратов.", Л.В.Бугаев, Ю.П.Вартанян, В.И.Карабак, Т.В.Кильдюшевская, В.И.Кувакина, И.А.Баснакъян, А.П.Аллилуев, К.В.Мачульская, В.М.Боровкова, А.Б.Петров - "ЖМЭИ", 1990, №и, стр. 50-56.

2. "Факторы, влияющие на сорбцию белково - полисахаридного комплекса, выделенного ИЗ Neisseria meningitidis СерОГруППЫ В, гелями гидроксида алюминия и иммунологическая активность сорбированных препаратов.", Л.В.Бугаев, Ю.П.Вартанян,, И.А.Баснакъян,

К.В.Мачульская, А.Б.Петров, "Менингококковая инфекция и гнойные менингиты. (Диагностика, профилактика, лечение)", стр. 83-84, Новосибирск, 1990 Г.

3. "Иммунологическая активность белково-полисахаридной мени-нгококковой вакцины серогруппы В при сорбции на гидроксиде алюминия", Л.В.Бугаев, К.В.Мачульская, Ю.П.Вартанян, И.И.Валериус, В.И.Кувакина, В.И.Карабак, И.А.Баснакъян, А.Б.Петров, В кн. "Проблемы медицинской иммунобиотехнологии" Материалы всесоюзной научной конференции, (октябрь 1988г.) Ленинград, 1990, стр. 107108.

4. "Влияние детергентов на иммунологическую активность антигенов Neisseria meningitidis СерОГруППЫ В.", Л.В.Бугаев, Е.А.Шкурина, В.И.Карабак, А.П.Аллилуев, А.Б.Петров - "ЖМЭИ", 1992, №8, стр.

Соискатель Л.В. Бугаев