Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:IL-4δ2-альтернативная форма IL-4

'ОФ

На правах рукописи

□ил

2 О АВГ 2009

Башкатова Юлия Николаевна

1Ь-452 - альтернативная форма 1Ь-4: изучение структуры и разработка тест-системы

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2009

003475368

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Научные руководители:

доктор медицинских наук М.Р. Хаитов

кандидат химических наук С.М. Андреев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А. А. Ярилин доктор медицинских наук, профессор 3. Г. Кадагидзе

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.М. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится «» СХН^Г2009 г. в /У часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» по адресу: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2. Тел/Факс: (495) 617-10-27 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России».

Автореферат разослан «X4 » 2009 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эпидемиологические исследования свидетельствуют о том, что распространенность бронхиальной астмы в разных странах составляет около 10-15%, а аллергического ринита - более 20%. Каждое десятилетие происходит почти двукратное увеличение количества людей, страдающих аллергическими заболеваниями, причем детальные причины этого феномена еще неясны. Поэтому от состояния научных разработок в области фундаментальных исследований зависит как эффективность, так и появление новых направлений в диагностике, профилактике и лечении аллергии [DuBuske L.M., 2001; Kowal К, 2006].

Способность Т-клеток (CD4+) распознавать аллергены и отвечать выбросом определенных цитокинов является ключевым фактором в регуляции синтеза IgE, активации тучных клеток, базофилов и эозинофилов, генерации воспаления. На ряде моделей показано, что цитокины обычно продуцируются двумя различными субпопуляциями Т-хелперов - Thl и Th2, предшественниками которых являются клетки ThO. Эти клетки, в свою очередь, активируются Т-эпитопами аллергенных белков, которые нарезаются в антиген-презентирующих клетках и экспрессируются в виде комплексов с молекулами главного комплекса гистосовместимости второго класса (МНС-II). У ато-пических больных Т-клеточный репертуар, как в периферической крови, так и в местах контакта аллергена представлен субпопуляцией с Т112-фенотипом, который генерирует цитокины Th2-Tiraa: IL-4, IL-5, IL-10 и IL-I3. Эти цитокины модулируют функцию B-лимфоцитов, моноцитов, дендритных клеток и фибробластов, стимулируют переключение продукции антител B-клетками с IgG-изотипа на IgE-изотип. С другой стороны, клетки Thl-типа, задействованные в иммунной защите от чужеродных антигенов, секретируют цитокины с «антиаллергенными» свойствами: IL-2, IL-12, IFN-y. У лиц с аллергией число этих.клеток и их активность значительно снижается [Gushchin I.S, 1998; Kowalski M.L., 1998]. Таким образом, продукция IgE-антител, в основ-

ном, зависит от соотношения цитокинов IL-4 и IFN-y, а угнетение секреции IL-4 является, по-видимому, эффективным подходом к аллерготерапии.

IL-4 представляет собой белок с молекулярной массой 15 кДа, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами, тучными клетками и базофи-лами. Он обладает широким функциональным спектром, поэтому не удивительно, что изменение его активности во многом определяет исход ряда патологических состояний, например, при лейшманиозе, проказе, шистосомозе, аллергических заболеваниях и астме. В работах 1993-1996 гг. был описан механизм регуляции активности IL-4 с участием альтернативной формы этого белка — IL-482. Такой укороченный на 16 аминокислот IL-4 образуется в результате естественного альтернативного сплайсинга гена IL-4, как результат элиминация второго экзона, кодирующего аминокислотные остатки 22-37. В тимоцитах и клетках бронхиального экссудата уровень экспрессии мРНК IL-482 выше по сравнению с уровнем мРНК IL-4, что свидетельствует о тканевой специфичности IL-452. Установлено, что IL-452 (рекомбинант-ный) подавляет пролиферацию Т- лимфоцитов, а также конкурирует с полноразмерной формой белка за общие рецепторы на иммунокомпетентных клетках. Из имеющихся в литературе данных следует, что IL-482 экспресси-руется в основном в тимусе и дыхательных путях, ингибируя функции полноразмерной формы IL-4 [Alms W.J. , 1996; Sorg, R.V. , 1993; Sakkas L.I., 1999]. Предполагают, что IL-4S2 является регулятором синтеза IgE, приводящим к снижению его уровня в плазме/сыворотке и на поверхности клеток-мишеней - тучных клеток и базофилов. Таким образом, дельта-форма IL-4 может влиять на соотношение Th2/Thl в пользу Thl клеток, снижать чувствительность клеток-мишеней к специфическому аллергену и угнетать реакции ранней и поздней фазы аллергического ответа.

В связи с этими воззрениями, мониторинг IL-452 представляет большое теоретическое и практическое значение. Не исключено, что анализ динамики его концентрации в крови позволит прослеживать процессы реконва-

лесценции при атонической бронхиальной астме и аллергических ринитах, наиболее распространенных сезонных заболеваниях. Количественное определение обеих форм цитокина в клинических образцах может обеспечить новый подход в прогнозировании результатов в процессе терапии больных ато-пической астмой и поллинозами. Таким образом, работа по созданию тест-системы для количественного определения 1Ь-462 в форме белка является актуальной и перспективной.

Цель работы: анализ пространственной и антигенной структур цито-кинов 1Ь-4 и 1Ь-452 человека, поиск дискриминирущих моноклональных антител для обоих цитокинов, разработка системы для количественного определения 1Ь-452 в биологических образцах. Задачи исследования.

1. Моделирование трехмерных структур цитокинов 1Ь-4 и 1Ь-452.

2. Провести структурный анализ и предсказание вероятных В-клеточных эпитопов 1Ь-4 и 1Ь-452.

3. Синтезировать набор пептидов, имитирующих В-эпитопы обеих форм цитокина.

4. Получить моноклональные и поликлональные антитела, специфичные к 1Ь-4 и 1Ь-452.

5. Разработать оптимальный вариант количественного определения 1Ь-452.

Научная новизна.

• Построена трехмерная модель 1Ь-452 и проведен анализ структурных отличий обоих цитокинов.

• С целью антигенного картирования синтезирован набор пептидов, имитирующих В-эпитопы изучаемых белков и наработаны соответствующие антипептидные антитела.

• Получены поликлональные и моноклональные антитела (МКА), специфичные для каждой формы цитокина.

• Установлено, что большая часть В-эпитопов IL-4 и IL-452 являются конформационно-зависимыми.

• Показано, что район сплайсинга IL-4 обладает повышенной иммуно-генностью.

• Создан метод количественного определения IL-452 в биологической среде.

• Зарегистрирована кинетика накопления IL-482 в супернатантах от стимулированных тимоцитов человека.

Практическая значимость. Ввиду того, что IL-452, является антагонистом полноразмерного IL-4, анализ динамики концентрации обоих цито-кинов в крови позволит прослеживать процессы реконвалесценции при аллергических заболеваниях, атопической бронхиальной астме и ринитах, в мониторинге других заболеваний, связанных с повышенной секрецией IL-4.

Количественное определение обеих форм цитокина в клинических образцах может обеспечить новый подход в прогнозировании результатов при терапии аллергических' заболеваний. Доступность количественного анализа открывает возможность изучения механизмов регуляции экспрессии и активности цитокинов группы IL-4, взаимосвязи между экспрессией мРНК и соответствующей белковой формой.

Разработанные в настоящей работе методы и подходы могут быть применены для разработки методических рекомендаций для врачей-клиницистов, занимающихся лечением аллергических больных с целью оценки качества проводимого лечения и контроля процессов реконвалесценции.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на II, III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (6-8 июня 2005 г, Санкт-

Петербург; 16-21 сентября 2007 г, Пущино, Россия); IV Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (11-14 сентября 2006 г, Москва, Россия); VIII Российском конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (27-29 июня 2007 г, Москва, Россия); II Международном конгрессе «Иммунитет и болезни» (10-14 сентября 2007 г, Москва, Россия); Объединенном иммунологическом форуме (30 июня-5 июля 2008 г, Санкт-Петербург, Россия); X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (20-23 мая 2009 г, Казань, Россия); XXVIII конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии (6-10 июня 2009 г, Варшава, Польша). Основные результаты диссертационной работы отражены в 7 публикациях.

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа построена по традиционному плану, изложена на 120 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, разделов, описывающих материалы и методы исследований, результаты, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 17 рисунками, включая фотографии. Список использованной литературы включает 144 источника, из них 13 отечественных и 131 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Собственные экспериментальные данные были получены с использованием 70 самок мышей линии BALB/c весом 18-20 г и 21 гибридной мыши линии CBAxC57BL/c (F1), полученных из питомника «Столбовая» ГУНЦБМТ РАМН. Вся работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с «Положением об этическом отношении к лабораторным животным» (приказ директора ГНЦ Института иммунологии ФМБА России от 07.07.2003 г.) и приказом МЗиСР РФ №267 от 19.06.2003 г. «Правила лабораторной практики в Российской Федерации».

1.1. Молекулярное моделирование. Молекулярная модель IL-452 была построена методом гомологичного моделирования с помощью сервера SWISS-MODEL Protein Modeling Server и вьюера Swiss-Pdb Viewer 3.7 (www.expasy.org). Используя полученные данные о вторичной и третичной структуре IL-4 и IL-4S2, предсказаны участки, формирующие вероятные доминантные В-эпитопы и выбраны пептиды для синтеза (таблица 1).

1.2. IL-4 и IL-452. Рекомбинантные IL-4 and IL-452 были получены в ОАО Институте инженерной иммунологии (пос. Любучаны МО) путем экспрессии в Е. colit как описано ранее (Птицын JI.P. и др. 1999). Их чистота по данным электрофореза в ПААГ и ВЭЖХ составляла около 95%.

1.3. Пептидный синтез. Синтез пептидов проводили твердофазным методом, используя протоколы Fmoc-химии с применением стартовых Fmoc-аминоацил-полимеров (смола Wang) и производных аминокислот (все от No-vaBiochem), где карбоксильные и гидроксильные группы защищались трет-бутильной группой (t-Bu), аминогруппа лизина - Вое, SH-группа цистеина -Асш и гуанидиновая функция аргинина - Mtr или Pbf . Стандартный цикл включал: промывку (ДМФА), удаление Fmoc-защиты (20% пиперидин в ДМФ), предварительное активирование Бтос-аминокислоты (DCC/HOBt) и кондесацию в среде ДМФ/М-метилпирролидон при 4-кратном избытке карбоксильного компонента (~1.5 часа). Финальный пептид отщепляли от полимера трифторуксусной кислотой в присутствии скавенджеров (тиоанизол, этандитиол, фенол, диметилсульфид). Сырой продукт высаждали сухим серным эфиром, и экстрагировали водной уксусной кислотой и экстракт лиофи-лизировали. Очистку проводили гель-хроматографией (Toypearl HW40) и ВЭЖХ (Vydac С18), очищенный продукт анализировали путем аналитической ВЭЖХ (Vydac С18) и масс-спектрометрией (Bruker Daltonics, MALDI-TOF MS в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН).

Последовательность Нумерация Шифр

TLC(Acm)TELTVTDIFAASK 22-37IL-4 NC-714

TLC(Acm)TELTVTDIFAASK~KLH 22-37 IL-4 AS-678

FYSHHEKDTRC(Acm)LGA 55-68 IL-4 NC-712

FYSHHEKDTRC(Acm)LGA~ KLH 55-68 IL-4 AS-688

GLNSC(Acm)PVKEANQSTL 95-109 IL-4 NC-715

GLNSC(Acm)PVKEANQSTL~ KLH 95-109 IL-4 AS-679

C-TEQKNTTE-C Цикло-бис-Cys 18-25 IL-452 YB-6

C(Acm)-TEQKNTTE-C(Acm) 18-25-бис Cys(Acm) IL-452 YB-5

TEQKNTTEKTFCRAAT 18-34 IL-452 YB-2

TEQKNTTEKE 18-27 IL-452 NC-736

1.4. Конъюгнрование пептидов и рекомбинантных белков с гемо-цнанином виноградной улитки (KLH). 7-10 мг пептида или белка растворяли в 500 мкл 0.1 М фосфатного буфера (ФСБ, рН 9.0) и раствор смешивали с 800 мкл раствора 18 мг KLH (Sigma) в ФСБ. Смесь перемешивали 30 минут и охлаждали до 4°С. Добавляли 1.5 мкл охлажденного до 4°С раствора глута-рового альдегида (Serva) в 250 мкл ФСБ и реакционную смесь перемешивали 1 час и оставляли на 22 часа при 4° С. Затем добавляли охлажденный свеже-полученный раствор 10 мг NaBH4 (Sigma) в 400 мкл дистиллированной воды и оставляли 1 час при комнатной температуре. Все содержимое переносили в диализную трубку (Servapore, 16 mm) и проводили исчерпывающий диализ против дистиллированной воды. Полученный диализат замораживали и лио-филизовывали.

1.5. Наработка поликлональных и моноклональных антител к ре-комбинантным белкам, пептидам и конъюгатам пептидов с КЬН. Для

наработки поликлональных антител использовались б-8-недельные мыши-самки линии ВАЬВ/с весом около 20 г (по 5 мышей в каждой группе). Препараты для иммунизации были смешаны с пептидным адьювантом МС-133 (1:1 по весу) и эмульгированы в неполном адьюванте Фрейнда (1:1 по объему). Мышей иммунизировали в подушечки задних лап четырехкратно с интервалами в 2 недели. Доза - ЗОмкг препарата/мышь в общем объеме 50 мкл. Группы (иммунизация препаратом): Группа 1: пептид УВ-2(18-341Ь-452); Группа 2: пептид УВ-5 (18-25-бис-Суз(Асш) 1Ь-452); Группа 3: пептид УВ-6 (цикло-бис-Суэ 18-25 1Г-452); Группа 4: пептид N0-736 (18-271Ь-452); Группа 5: пептид N0712 (55-68 1Ь-4);

Группа 6: А8-678 — N0-714 (пептид 22-37 1Ь-4), коньюгированный с КЬН; Группа 7: АБ-679 -N0-715 (пептид 95-109 1Ь-4), коньюгированный с КХН; Группа 8: рекомбинантный 1Ь-4; Группа 9: рекомбинантный 1Ь-452.

Моноклональные антитела получены вед. науч. сотр. Дубинкиным И. В. ( ГНЦ Институт иммунологии ФМБА, Гематологический научный центр РАМН).

1.6. Биотшшлирование очищенных моноклональных антител.

Моноклональные антитела уравновешивали 0.1 М №-фосфатом рН 8.0 с помощью диализа и добавляли ^гидроксисукцинимидный эфир аминокапро-ил-биотина в диметилсульфоксиде из расчёта 50 мкг на 1мг белка. Смесь инкубировали ночь в холодильнике при 4°С, блокировали оставшиеся активные группы лизином (1мг\мл 1 час при комнатной температуре) и удаляли свободный биотин гель-фильтрацией на колонке с сефадексом 0-25.

1.7. ИФА. Полученные образцы моноклональных и поликлональных антител анализировали твердофазным ИФА, используя конъюгат анти-IgG мыши с полимерной пероксидазой (Amersham) и высокочувствительный субстрат ТМВ (Sigma) согласно инструкции производителя. Величину фонового поглощения (Cut off) оценивали как среднее значение величины оптической плотности для нормальных сывороток (n=5)+3 SD. Сыворотки титровали, используя двоичное разведение, начиная с 1:50. Их титр определяли как конечное разведение, при котором оптическая плотность (OD) превосходила OD нормальной сыворотки в 2 раза.

1.8. Дот-блот с использованием в качестве конъюгата страптавдин-меченной полимерной пероксидазы и щелочной фосфатазы. В постановке анализа использовали нитоцеллюлозную мембрану Schleicher &Schuell, на которую пипетировали образцы IL-4 и IL-452 в различных концентрациях в объеме 5 мкл/пятно. На этапе внесения конъюгата использовали в целях сравнения два типа конъюгатов: полимерную пероксидазу и щелочную фос-фатазу, а также два типа субстратов: DAB/H2O2 и NBT/BCIP соответственно. Реакцию блокировали, после чего мембрану высушивали на воздухе и результаты фиксировали фотосъемкой.

1.9. Получение тимоцитов и эксперименты по стимуляции синтеза miTOKiiHOB IL-4 н IL-482 in vitro. Эксперименты выполнены сотрудниками Института инженерной иммунологии г. Любучаны МО.

1.10. Статистическая обработка результатов. Учитывая, что в медико-биологических исследованиях при малых выборках (менее 20) методы описательной статистики не могут адекватно отражать распределение, результаты наблюдений приведены в виде таблиц или диаграмм первичных данных. Для сравнения данных были использованы среднеарифметические

значения (для оптической плотности) и медиана (среднее из ранжированной группы значений титров).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Анализ трехмерной и антигенной структуры 1Ь-452. Используя белок 1Ь-4 как матрицу, с помощью метода гомологичного моделирования была простроена трехмерная модель 1Ь-452 и проведено ее сравнение со структурой 1Ь-4 (рисунок 1).

1Х-4»2 11-4

Рисунок 1. Пространственные структуры 1Ь-452 (рассчитанная модель) и 1Ь-4 (данные рентгеноструктурного анализа). А: топология а-спиралей и петель; Б: Ван-дер-Ваальсовская модель поверхности белка (визуализация с помощью ЯазМо!).

В молекуле IL-452 остаток Cys-65 уже не участвует в образовании внутримолекулярной дисульфидной связи и имеет несвязанную меркапто-группу, две другие дисульфидные связи такие же, как и в IL-4. Данные Фу-рье-ИК-спектроскопии и кругового дихроизма показывали, что обе формы белка имеют очень сходные спектры (Vasiliev А. М. et al. 2003), указывающие на сходную топологию цепей, что находит отражение в этой модели. Одним из важных критериев правильности предсказанной модели дельта-формы является сходство геометрии рецептор-связывающих сайтов на обоих белках, поскольку при связывании с рецепторами на тимоцитах обе формы сильно конкурируют между собой. Поэтому, две критически важные в связывании аминокислоты, Glu-9 и Arg-88 (Arg-72 для IL-452), должны на одной стороне поверхности белковой глобулы в антипараллельных спиралях А и С. Т. е. топология а-спиралей обоих белков одинакова и их ход соответствует направлению up-up-down-down.

IL-4 имеет три экспонированные петли 22-37, 55-37 и 95-110, локализованные между четырьмя а-спиралями. Они достаточно гидрофильные, содержат ß-изгибы и неупорядоченные структуры. У IL-452 аминокислотная последовательность 22-37, соответствующая гипотетическому В-клеточному эпитопу IL-4, отсутствует и петля А-В при этом резко укорачивается (рис. 1). И все же, несмотря на делецию 16 аминокислот, трехмерная структура IL-452 имеет заметное сходство с IL-4 и, вероятно, оба белка обладают небольшими отличиями в отношении антигеннной структуры.

Наиболее заметные изменения связаны с N-концевым участком. Мы предположили, что именно здесь возможна локализация В-эпитопов, уникальных для IL-452. В попытках экспериментальной их локализации, мы синтезировали набор пептидов, перекрывающих участок сплайсинга (таблица 1). Полученными пептидами в форме конъюгатов с KLH и рекомбинантными IL-4 и IL-462 иммунизированы лабораторные животные и получены поли-клональные антитела, специфичные к каждому из белков и пептидов. Поли-клональные антитела к обоим белкам и их пептидным фрагментам использо-

13

ваны для анализа реактивности анти-белковых антител к пептидам и, наоборот, - анти-пептидных антител к белкам. Антисыворотки к белку IL-4 были получены с титрами от 25600 до 409600 (группа из 7 мышей). Они хорошо реагировали и с IL-452 (таблица 2), но в то же время пуловая антисыворотка почти не реагировала с пептидными фрагментами. Небольшая реактивность зафиксирована лишь с пептидом, вычленяемым при сплайсинге IL-4 - NC-714.

Картина с реактивностью антипептидных антител (к линейным эпито-пам) была следующая. Антитела хорошо реагировали с аутологичными пептидами за исключением пептида NC-712 (титр 1:200) и не показывали между собой перекрестной реактивности. Конъюгат NC-714 с KLH давал значительно больший титр по сравнению со свободным пептидом. Все антипеп-тидне антитела умеренно реагировали с IL-4, но не реагировали с IL-482. Наиболее активное связывание с белком IL-4 наблюдалось для антител к пептиду NC-714. Связывания анти-NC-H антител с IL-452 практически не происходит. Таким образом, наиболее активными в антигенном отношении оказались N- и С-концевые области белка IL-4, но, очевидно, что большая часть эпитопов является конформационно-зависимыми, так как антибелковые антитела, в том числе и полученные МКА, плохо реагировали с линейными пептидами,

2. 2. Иммунохимический анализ района сплайсинга IL-452. Анализ трехмерной структуры IL-452 показал, что на поверхности белковой глобулы имеется уникальная аминокислотная последовательность22-25 NTTE, которая предположительно могла бы формировать специфический В-эпитоп, который отсутствует в полноразмерном белке. Анализ вторичной структуры показывает, что выбранный участок представляет собой неупорядоченную петлю с элементами а-спирали. Для синтеза были выбраны пептиды, включающие фрагмент с неупорядоченной структурой QKNTT (20-24), обрамленный короткими а-спиральными участками ТЕ (18-19) и EKETFCRAAT (2534). Они включали пептид TEQKNTTEKTFCRAAT и более мелкие фрагмен-

14

ты с последовательностями от 18-25 до 18-34, в том числе и циклический УВ-6, имеющий жесткую структуру. Все пептиды из этого участка (контактная зона сплайсинга) выбирались с учетом их минимального сходства с последовательностями из 1Ь-4, для того, чтобы полученные антипептидные антитела могли бы взаимодействовать исключительно с 1Ь-452 (таблица 1). Т. е. чем длиннее пептид, тем более он гомологичен последовательностям из 1Ь-4.

Таблица 2. Реактивность в ИФА синтезированных фрагментов 1Ь-4 и их коньюгатов.

Иммуноген Реактивность (титр) к сорбированным антигенам

N0-714 ЫС-712 N0-715 1Ь-4 И-452

N0-714 <1600 <50 <50 800 100

М>715-КШ <50 <50 25600 400 <100

МС-714-КЬН 12800 <50 >100 1600 <100

МС-712-КЬН <50 200 <50 800 100

1Ь-4 (пул, п=7) 200 <50 100 >25600 >25600

Синтезированные пептиды в виде смеси с ПАФ использовали для 4-кратной иммунизации мышей ВАЬВ/с с 2-недельными интервалами. Анализ в ИФА полученных антисывороток показал, что самый высокий антипептидный титр (25600) имела антисыворотка к самому длинному пептиду УВ-2, однако, антитела оказались неактивными как по отношению к 1Ь-482, так и по отношению к 1Ь-4. Полученные антисыворотки к более коротким пептидам УВ-5, УВ-6 и N0-736 вообще не реагировали ни с пептидами, ни с белками. В случае последних, еще дополнительные 2 иммунизации смесью пептидов с ПАФ также не привели к индукции антипептидного ответа (таблица 3).

Рисунок 2. Проекция 1Ь-482 с выделенным фрагментом 18-34 1 ТЕОККТТЕКТРСКААТ.

Таким образом, короткие пептиды оказались неиммуногенными. Возможно, это связано с отсутствием у более коротких пептидов Т- хелпер-ных последовательностей, Отсутствие реактивности анти-УВ-2 с 1Ь-452 связано либо с недостаточным экспонированием данного пептидного фрагмента, либо линейный пептид не способен моделировать эпитоп в составе белка.

Таблица 3. Реактивность в ИФА пептидов-фрагментов 1Ь-432 (приведены титры антител и оптическая плотность хромогена при 450 нм).

Иммуноген Антиген на планшете

N0-736 УВ-2 УВ-5 УВ-6 1Е-4 1Ь-452

N0-736 50 (0,140) >50 (0Д18) <100 (0Д99) 50 (0,154) <50 (0,103) <50 (0,096)

УВ-2 50 (0,139) 25600 (1,152) <100 (0,273) 100 (0,202) >50 (0,118) <50 (0Д15)

УВ-5 <100 (0,179) 200 (0,279) 200 (0,315) 100 (0,246) >50 (0,128) 50 (0,126)

УВ-6 <50 (0,095) <50 (0,088) <50 (0,104) >50 (0,152) <50 (0,078) <50 (0,090)

К/к 0,044 0,050 0,048 0,053 0,044 0,058

2.3. Получение моноклоиальных антител (МКА). Для разработки системы для количественного определения 1Ь-4§2 и 11-4 были получены МКА, специфичные для каждой формы белка. Для этого мыши были иммунизированы конъюгатами рекомбинантных цитокинов с КЬН, тестирование культур на антителопродукцию проводили ИФА. Клонирование и реклони-рование положительных культур осуществляли методом предельных разведений, в итоге было проведено 25 гибридизаций с использованием клеточных линий Х63 и N8-1 в присутствии 50% ПЭГ-1500. В результате скрининга отобрана лишь одна гибридома, продуцирующая антитело, специфичное только для 1Ь-452. Кроме того, отобраны 7 гибридом, имеющие специфичность к 1Ь-4 и 24 гибридомы с двойной специфичностью - к 1Ь-4 и 1Б-452. Отобранные клетки были дважды реклонированы и использованы для наработки МКА в виде клеточных супернатантов и асцитных форм. Дальнейший отбор клонов происходил с учетом,эффективности образования асцитов, их специфичности и реактивности в ИФА (разведение не менее чем 1:10"6 при оптической плотности более 1,0) и к соответствующим антигенам.

Таким образом, было продуцировано только одно антитело с шифром 012, показывающее высокую специфическую реактивность по отношению к 11.-462. выявлено также четыре клона, реагирующие только с 1Ь-4 - АИ-Ш4Я)11, Е7, Б5-1 и НЗ. Остальные 14 отобранных клонов реагировали с обоими белками. Оценка реактивности в ИФА полученного набора МКА с пептидами из 1Ь-4 (N0-712, N0-714, N0-715) продемонстрировала полное отсутствие какого-либо взаимодействия.

2.4. Анализ 1Ь-4 и 1Ь-4б2 с помощью моноклональных антител в формате дот-блота. Для оценки пригодности антител и выбора фермент-субстратной пары для дизайна тест-системы, вначале было проверено два варианта анализа 1Ь-4 и 1Ь-452 в формате дот-блота. Связывание антигенов с антителами оценивали с помощью двух типов ферментных конъюгатов - щелочной фосфатазы и полимерной пероксидазы, обе меченные стрептавиди-ном (соответствующие субстраты ИВТ/ВОР и БАВ/НгОг). В ходе экспериментов оценивали влияние разведения антител и количества антигена в пятне на визуальную картину.

Рисунок 3. Результаты дот-блота с щелочной фосфатазой и полимерной пе-роксидазой. В каждой паре: слева 11.-4, справа 1Ь-4§2. В левой части фото: стрипы, проявленный стрептавидин-фосфатазой, в правой: стрипы, проявленный стрептавидин-пероксидазой

Дот-блот система с использованием полимерной пероксидазы в качестве конъюгата оказалась более чувствительной (позволяет определять концентрацию обоих цитокинов порядка 600 нг/пятно) по сравнению с системой с щелочной фосфатазой (чувствительность для 1Ь-4 до 1-10 мкг/мл, а для 1Ь-452 - более 10 мкг/мл). Хотя система дот-блот является качественной и не позволяет провести анализ концентрации цитокинов 1Ь-4 и 1Ь-452 в биологических и клинических образцах, она позволяет оценить ее отдельные

компоненты, применяемые также и в ИФА. Например, очевидно, что в качестве детектирующего конъюгата лучше использовать полимерную перокси-дазу.

2.5. Конструирование сэндвнч-ИФА тест-снстемы. Для разработки ИФА тест-системы в формате «сэндвич» для IL-452 и IL-4 необходимо иметь подходящие пары моноклональных антител, специфически распознающие различные эпитопы IL-482, стерически не мешающих друг другу, при этом хотя бы одно из них не должно реагировать с IL-4. Одно антитело является захватывающим (Capture (С) МКА), оно иммобилизовано на твердой фазе, другое конъюгировано с ферментом (Detection (D) МКА) и детектирует связавшийся цитокин после реакции образуемого комплекса с субстратом.

С целью оценки пар антител, пригодных для сэндвич-ИФА, были выбраны следующие МКА:

• D12 (специфичность - IL-482);

• 3D5 (специфичность - IL-4 и IL-452);

• AF-1D4/D11 (специфичность-IL-4);

• D1 (специфичность-IL-4 и IL-452);

• Н8-1 (специфичность - IL-4 и IL-452);

• 4A7/F3 (специфичность - IL-4 и IL-452)

2.6. Анализ IL-4. Для определения IL-4 были использованы следующие пары захватывающих (С-МКА) и биотинилированных детектирующих (D-MKA) антител на планшетах Costar. В качестве отрицательного контроля использовали IL-452:

а) С-МКА - AF-1D4/D11, D-MKA - D1;

б) С-МКА - AF-1D4/D11, D-MKA - Н8-1;

в) С-МКА - DI, D-MKA - AF-1D4/D11;

г) С-МКА - Н8-1, D-MKA -AF-ÍD4/D11

В первых трех вариантах мы получили отрицательные результаты, а в последнем варианте (г) результат определения IL-4 был положительный.

Захватывающее антитело AF-1D4/D11 имеет высокую специфичность для IL-4, не связываясь с IL-452, и используемое сочетание пары H8-1/AF-1D4/D11 оказалось пригодным для дальнейшей отработки сэндвич-ИФА определения IL-4. На рисунке 4 приведена зависимость оптической плотности от концентрации IL-4, которая в интервале концентраций от 1 до 500 пг/мл имеет линейную зависимость. Данный вариант по чувствительности определения IL-4 (5пг/мл) не уступает коммерческим тест-системам фирм Lineo, BioSource, Bender.

2.7. Анализ IL-482. Как и в случае IL-4, для выбора наилучшей системы определения IL-452 были использованы несколько вариантов ИФА:

а) С-МКА D12 (специфичность IL-452), D-MKA D1 (специфичность IL-4 и IL-452);

б) С-МКА D12 (специфичность IL-482), D-MKA Н8-1 (специфичность IL-4 и IL-452);

в) С-МКА D12 (специфичность IL-452), D-MKA 4A7/F3 (специфичность IL-4 и IL-452).

В качестве отрицательного контроля был использован IL-4. Во всех случаях (а, б, в) были получены отрицательные результаты. Можно предположить, что это связано с особенностями МКА D12. Это антитело эффективно связывалось с IL-452, сорбированным на пластике планшета, и слабо взаимодействовало, если цитокин находился в растворе. Поэтому, использование DI2 в качестве захватывающих антител, сорбированных на пластике оказалось неэффективным,

ОБ 450

Пг4 (пг/мл)

Рисунок 4. Калибровочный график определения 1Ь-4 твердофазным сэндвич-ИФА. Ось абсцисс - концентрация 1Ь-4 в образце (пг/мл); Ось ординат - оптическая плотность хромогена в лунке (450 нм).

Поэтому, ориентируясь на положительные результаты специфического определения 1Ь-4 для пары антител Н8-1 /АР-104/Т) 11, где в качестве С-МКА используются МКА Н8-1, связывающие как 1Ь-4 так и 1Ь-482, мы продолжили изучение вариантов сэндвич-ИФА. Для этого были проверены две следующих системы:

а) С-МКА (специфичность 11-4 и 11,-452) Б-МКА Ш2 (специфичность 1Ь-482);

б) С-МКА Н8-1 (специфичность 1Ь-4 и 1Ь-452) Б-МКА Ш2 (специфичность 1Ь-452),

Первый вариант ИФА дал отрицательный результат, а вариант б, наконец, дал специфическое определение 1Ь-482 (Рис. 5). Возможно, взаимодействие антител клона Н8-1 с 1Ь-452 приводит к раскрытию уникальной детерминанты, которую распознают антитело Б12. В данном случае как бы ими-

21

тируются условия иммобилизации 1Ь-452 на пластике или мембране, где под влиянием гидрофобных взаимодействий изменяется конформация белка, результат которой, как было отмечено выше, отменно фиксируют антитела Б12.

Был также проверен вариант использования пары антител С-МКА ЗБ5 (специфичность 1Ь-4 и 1Ь-4б2) и О-МКА Ш2, меченное биотином (рисунок 5). Система, в которой были использованы антитела ЗБ5\В12 оказались менее чувствительной (вариант В, рисунок 5), по сравнению с системой (вариант А), где используются МКА Н8-1, имеющие специфичность к обоим белкам (1Ь-4,1Ь-482) и МКА Б12, специфичные к 1Ь-452. Система А проявляла высокую специфичность.

При замене 1Ь-452 на 1Ь-4 определяемые значения оптической плотности не превышали фоновых значений, что говорит о том, что 1Ь-4, захваченный антителами Н8-1 не определяется в этой тест системе антителами Б12. Чувствительность определения 1Ь-452 для этой тест-системы (А) составляет 20-30 пг/мл.

Анализ супернатантов от стимулированных тимоцитов на наличие 1Ь-4 и 1Ь-452. Для оценки пригодности разработанной ИФА-системы были использованы препараты супернатантов от стимулированных тимоцитов, полученных нашим коллегами в Институте инженерной иммунологии г. Любучаны МО. Образцы представляли собой результаты трех экспериментов, отличающихся по времени инкубации и контрольные образцы нестиму-лированных клеток для каждого из трех экспериментов. Учитывая недостаточную чувствительность ИФА-системы, супернатанты были сильно сконцентрированы. Количественное определение цитокинов в супернатантах было проведено с помощью разработанной ИФА системы на 1Ь-452, и параллельно, с помощью коммерческой тест-системы фирмы «Вюзоагсе» (с 1 июля 2009 г «В1а8оигсе») для анализа 1Ь-4. Как показывает таблица 4, обе сис-

темы выявляют высокие концентрации цитокинов в представленных образцах супернатантов от стимулированных тимоцитов. СЮ 450

1Ь-462,пг/мл

Рисунок 5. Зависимость оптической плотности от концентрации 11.-452 в твердофазном сэндвич-варианте ИФА.

Таблица 4. Результаты ИФА (ИФА Вюзоигсе) определения 11,-4 и сэндвич-ИФА определения 1Ь-452 в супернатантах стимулированных тимоцитов человека.

Время 1Ь-4 11,-452

активации ИФА сэндвич-ИФА

(час) ВюБоигсе пг/мл

пг/мл

24 30±3 не выявляется

48 220 + 20 80 ±10

72 230 ± 22 120 + 20

Таким образом, впервые удалось зарегистрировать секрецию клетками белка 1Ь-452, очевидно, как результат сплайсинга гена 1Ь-4.

23

выводы

1. С помощью методов гомологичного моделирования построена трехмерная модель 1Ь-482.

2. Синтезированы пептидные фрагменты 1Ь-4 и 1Ь-482, имитирующие их В-эпитопы.

3. Получены поликлональные антитела к синтетическим пептидам и реком-бинантным белкам 1Ь-4 и 1Ь-482.

4. Установлено, что наиболее активными в антигенном отношении являются ■ И- и С-концевые области белка 1Ь-4, но большая часть эпитопов является

конформационно-зависимыми.

5. Получена панель моноклональных антител, специфичных к 11,-4,1Ь-4о2 и к 1Ь-4ДЬ-452.

6. Показана большая чувствительность стрептавидин-меченной полимерной пероксидазы при анализе 11.-4 и 1Ь-482 методами ИФА и дот -блота.

7. Разработана тест-система для количественного анализа 1Ь-4 и 1Ь-452 в биологических образцах в формате сэндвич-ИФА. Чувствительность определения в случае 1Ь-4 ~5 пг/мл, в случае 1Ь-482- 20-30 пг/мл.

8. Впервые зарегистрировано накопление белка 1Ь-452 в супернатантах от активированных тимоцитов человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Башкатова Ю.Н., Петрухина А.О., Дубинкин И.В., Андреев С.М. 1Ь-4с32-альтернативная форма IL-4: анализ структуры и разработка тест-системы.//Аллергология и иммунология.- 2006'.- Том 7,- №3.-С. 251-252.

2. Andreev S., Petrukhina A., Bashkatova Y., Dubinkin L, Vasiliev A., Ba-bakhin A., DuBuske L. Development of an assay to detect IL-4d2. // Clinical Immunology.- 2006.-Volume 119.- S. 1.- P. sl24.

3. Башкатова Ю.Н., Петрухина A.O., Дубинкин И.В., Бабахин А.А., Васильев A.M., Андреев С.М. Развитие системы для анализа IL-4d2, альтернативной сплайсинговой формы IL-4 человека.// Российский аллергологический жур-нал.-2007.-№3(1).-С.75-76.

4. Башкатова Ю.Н., Андреев С.М., Бабахин А.А., Хаитов М.Р., Петрухина А.О. Анализ эпитопной структуры IL-4 и IL-4d2 в свете развития специфической тест-системы.// Российский аллергологический журнал.- 2008,- Том 2(11).-№2-3.- С.129-130.

5. Башкатова Ю.Н., Петрухина А.О., Андреев С.М., Хаитов М.Р. Разработка сэндвич-ИФА тест-системы для анализа IL-452. // Российский аллергологический журнал,- 2009.-№3(1).-С.131.

6. Bashkatova Yu. N., Petrukhina А. О., Andreev S. M., Kryuchkov N.A., Khaitov M.R. An assay to detect IL-4d2. // Allergy.- 2009.-Volume 64.-S. 90,-P. 45.

7. Андреев С. M., Башкатова Ю. Н., Петрухина А. О., Дубинкин И. В., Васильев А. М., Абрамов В.М.,.Куликова H.JL, Хаитов М. P. IL-452 человека: структура и количественный анализ. // Иммунология,- 2009. -№6-С.365-370

Подписано в печать 2 5.04.09 г- Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ 5 0 8 Отпечатано в службе множительной техники . . РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш.,24

Эпидемиологические исследования свидетельствуют о том, что распространенность бронхиальной астмы в разныхнах составляет около 10-15%, а аллергического ринита - более 20%. Каждое десятилетие происходит почти двукратное увеличение количества людей,дающих аллергическими заболеваниями, причем детальные причины этого феномена еще неясны [67]. Поэтому, от состояния научных разработок в области фундаментальных исследований зависит как эффективность, так и появление новых направлений в диагностике, профилактике и лечении аллергии [25,49,50,51,52,53, 88, 89].

Способность Т-клеток (СЭ4+) распознавать аллергены и отвечать выбросом определенных цитокинов является ключевым фактором в регуляции синтеза 1§Е, активации тучных клеток, базофилов и эозинофилов, и генерации воспаления. На ряде моделей показано, что цитокины обычно продуцируются двумя различными субпопуляциями Т-хелперов - Тх1 и Тх2, предшественниками которых являются клетки ТхО. Эти клетки, в свою очередь, активируются Т-эпитопами аллергенных белков, которые нарезаются в антиген-экспрессирующих клетках и экспрессируются в виде комплексов с молекулами главного комплекса гистосовместимости второго класса (МНС-П). У атопических больных Т-клеточный репертуар, как в периферической крови, так и в местах контакта аллергена представлен субпопуляцией с Тх2-фенотипом, который генерирует цитокины Тх2-типа: 1Ь-4,1Ь-5,11-10 и 1Ь-13. Эти цитокины модулируют функцию В-лимфоцитов, моноцитов, дендритных клеток и фибробластов, стимулируют переключение продукции антител В-клетками с ^О-изотипа на 1^Е-изотип. С другой стороны, клетки Тх1-типа, задействованные в иммунной защите от чужеродных антигенов, секретируют цитокины с «антиаллергенными» свойствами: 1Ь-2, 1Ь-12, №N-7. У лиц с аллергией число этих клеток и их активнось значительно снижается [67,90]. Таким образом, продукция

Е-антител, в основном, зависит от соотношения цитокинов 1Ь-4 и у-интерферона, а угнетение секреции 1Ь-4 является, по-видимому, эффективным подходом к аллерготерапии.

1Ь-4 представляет собой белок с молекулярной массой 15 кДа, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами, тучными клетками и базофилами. Он обладает широким функциональным спектром, поэтому не удивительно, что изменение его активности во многом определяет исход ряда патологических состояний, например при лейшманиозе, проказе, шистосомозе, аллергических заболеваниях и астме. Недавно был описан новый механизм регуляции активности 1Ь-4 с участием альтернативной формы этого белка — 1Ь-452. Альтернативная форма белка 1Ь-482 образуется в результате естественного альтернативного сплайсинга гена 1Ь-4, при котором происходит элиминация второго экзона, кодирующего аминокислотные остатки 22-37, при этом экзоны 1, 3, 4 гена 1Ь-4 образуют одну открытую рамку считывания. В тимоцитах и клетках бронхиального экссудата уровень экспрессии мРНК 1Ь-482 выше по сравнению с мРНК 1Ь-4, что свидетельствует о тканевой специфичности 1Ь-482. Установлено, что 1Ь-482 (рекомбинантный) подавляет пролиферацию Т- лимфоцитов, а также конкурирует с полноразмерной формой белка за общие рецепторы на иммунокомпетентных клетках. Из имеющихся в литературе данных следует, что 1Ь-482 экспрессируется в основном в тимусе и дыхательных путях, ингибируя функции полноразмерной формы 1Ь-4 [14, 120, 126]. Предполагают, что 1Ь-482 является регулятором синтеза ^Е, приводящим к снижению его уровня в плазме/сыворотке и на поверхности клеток-мишеней - тучных клеток и базофилов. Это, в свою очередь, может сопровождаться изменением соотношения Тх2/Тх1 в пользу Тх1 клеток, снижением чувствительности клеток-мишеней к специфическому аллергену и угнетением реакций ранней и поздней фазы аллергического ответа с подавлением выброса соответствующих медиаторов, гистамина и лейкотриенов.

В связи с этими воззрениями мониторинг, 1Ь-452 представляет большое теоретическое и практическое значение. Анализ динамики его концентрации в крови позволит прослеживать процессы реконвалесценции при атопической бронхиальной астме и аллергических ринитах, наиболее распространенных в мире сезонных заболеваниях. Количественное определение обеих форм цитокина в клинических образцах может обеспечить новый подход в прогнозировании результатов в процессе терапии больных атопической астмой и поллинозами.

Цель работы: анализ пространственной и антигенной структур цитокинов 1Ь-4 и 1Ь-482, поиск дискриминирущих моноклональных антител для обоих цитокинов, разработка системы для количественного определения 1Ь-452 в биологических образцах.

Задачи:

1. Изучить трехмерную структуру цитокинов 1Ь-4 и 1Ь-452.

2. Провести анализ и предсказание наиболее вероятных В-доминантных эпитопов белков 1Ь-4 и 1Ь-452.

3. Синтезировать набор пептидов, имитирующих В-доминантные эпитопы обоих изучаемых белков.

4. Получить моноклональные и поликлональные антитела, специфичные к 1Ь-4 и 1Ь-452.

5. Изучить варианты дизайна тест-системы для количественного определения 1Ь-452.

Научная новизна работы:

Проведен анализ антигенной и трехмерной структур цитокинов человека - 1Ь-4 и его альтернативного сплайсинг-варианта 1Ь-482. Используя наработанные моноклональные и поликлональные антитела и синтетические пептидные фрагменты этих цитокинов, локализованы доминантные В-эпитопы. Впервые получено моноклональное антитело, специфичное для 1Ь-482. Полученная информация использована для разработки системы для количественного определения 1Ь-482 в биологических образцах. Доступность количественного анализа открывает возможность изучения механизмов регуляции экспрессии и активности цитокинов группы 1Ь-4, взаимосвязи между экспрессией мРНК и соответствующей белковой формой.

Практическая значимость:

Ввиду того, что 1Ь-452, является антагонистом полноразмерного 1Ь-4, анализ динамики концентрации обоих цитокинов в крови позволит прослеживать процессы реконвалесценции при аллергических заболеваниях, атопической бронхиальной астме и ринитах, наиболее распространенных в мире сезонных заболеваниях. Количественное определение обеих форм цитокина в клинических образцах может обеспечить новый подход в прогнозировании результатов при терапии аллергических заболеваний.

Разработанная тест-система для количественного определения концентрации 1Ь-452 в биологических образцах может быть использована в мониторинге заболеваний, связанных с повышенной секрецией 1Ь-4.

Сконструированная тест-система является хорошей моделью для создания систем определения сплайсинг-форм других белков.