Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Изучение тканеспецифической экспрессии сплайс-вариантов МРНК и IL-4 и IL-6 у мыши и человека

На правах рукописи

Яценко Ольга Петровна

ИЗУЧЕНИЕ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ СПЛАЙС-ВАРИАНТОВ мРНК 1Ь-4 И 1Ь-6 У МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА

14.03.09 -Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

13 ОКТ 2011

Новосибирск, 2011

4857286

Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

доктор медицинских наук, профессор Сенников Сергей Витальевич кандидат биологических наук Филипенко Максим Леонидович

доктор медицинских наук, профессор Кожевников Владимир Сергеевич

доктор медицинских наук, профессор Глушков Андрей Николаевич

Ведущее учреждение: ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, 197110 , Санкт-Петербург, ул. Пудожская, д. 7, Тел.: 8 (812) 235-12-25, тел./факс: 8 (812) 23049-48

Защита диссертации состоится «» 2011 г. в часов на за-

седании диссертационного совета Д 001.001.01 в НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН (630099,г. Новосибирск, ул.Ядринцевская, 14)

Автореферат разослан « 28 » сентября 2011 г.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Колесникова Ольга Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Общее количество генов, обнаруженное в геноме человека, в процессе выполнения проектов по секвенированию всего генома по разным подсчётам не превышает 30-40 тысяч, в то же время база экспрессирующихся последовательностей человека на порядок больше. Причины этого многообразия кроются в постгранскрипционных событиях. Одним из наиболее значимых посттранскрипционных событий является альтернативный сплайсинг. Альтернативный сплайсинг пре-мРНК, благодаря комбинированию порядка и количества экзо-нов, наряду с альтернативным полиаденнлированием позволяют продуцировать различные зрелые транскрипты от одного единственного гена без изменения его геномной организации. Белки, образующиеся вследствие трансляции альтернативно сплайсированных мРНК, могут выполнять как сходные, так и различные функции. Сплайсинг транскриптов некоторых генов может происходить по-разному в зависимости от типа ткани, стадии развития организма, пола [Сингер М., 1998]. Опубликовано много работ подтверждающих, что альтернативный сплайсинг представляет собой явление характерное именно для транскриптов генов цитокинов. Так, было продемонстрировано, что альтернативный сплайсинг вовлечен в процессинг пре-мРНК генов IL-lß, IL-la, IL-IRa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, M-CSF, G-CSF, TGF-a, c-kit, LIF, SCF, FasL, онкостатина M, IL-2R, IL-4R, IL-5R IL-6R IL-9R GM-CSF эритропоэтина, некоторых хемокинов (VCAM) и т.д., приводя к образованию тканеспецифических изоформ различной локализации (мембрансвязанных, секреторных, внутриклеточных) и функции [Сенников C.B. и др., 2001].

В этом отношении представляют интерес два иммунорегуляторных медиатора IL-4 и IL-6. Эти медиаторы имеют важное значение для регуляции многих клеточных процессов, в том числе гемопоэза и иммунопоэза на разных этапах онтогенетического развития [ChomaratP., 1997; Paul W.E., 1991; Banche-reau J., 1991; D'Andréa A, 1995; Ryan D.H., 1994], и для этих медиаторов показано, что их экспрессия происходит с участием альтернативного сплайсинга

[Alms W.J., 1996; Kestler D., 1995; Bihl M., 2002]. Так, например, показано, что ген IL-4 у человека экспрессируется в виде двух форм мРНК: полноразмерной формы, содержащей все 4 экзона и альтернативно сплайсированной, не содержащей 2-го экзона, названной IL-452 [Alms W.J., 1996; Glare Е.М., 1999; Seah G.T., 2001]. Установлено, что мРНК IL-452 детектируется в различных типах иммунокомпетентных клеток [Klein S.C., 1996]. Образование изоформ мРНК IL-4 у взрослого человека имеет тканеспецифический характер: обычно мРНК IL-452 обнаруживается в МНК ПК человека в минорных количествах [Alms W.J., 1996], однако в ряде случаев в МНК ПК [Alms W.J., 1996; Atamas S.P., 1996], а также в клетках тимуса и бронхо-альвеолярного лаважа [Atamas S.P., 1996], клеточных линиях В95/8 и HL60 [Klein S.C., 1996] обнаруживается преобладание мРНК IL-482 над полноразмерной формой. Рекомбинантный человеческий белок IL-452 (rhIL-452) способен связываться с рецептором IL-4 и инги-бировать действие rhIL-4 на иммунокомпетентные клетки [Arinobu Y., 1999; Atamas S.P., 1996]. В то же время, в отношении фибробластов легких и кожи человека rhIL-452 выступает как агонист IL-4 [Atamas S.P., 2000]. Установлено, что при ряде патологических состояний изменяется соотношение полноразмерной - IL-4 и альтернативной - IL-462 форм мРНК [Glare Е.М., 1999; Sakkas L.I., 1999; Seah G.T., 2000; Seah G.T., 2001], что, по мнению авторов, может играть существенную роль в патогенезе заболеваний. Для гена IL-6 показано существование у человека пяти сплайс-вариантов мРНК IL-6: hIL-б мРНК, hIL-6alt мРНК,ЫЬ-6Д2 мРНК, hIL-6A2,4 мРНК и hIL-6A4 мРНК [Bihl М.,2002; Kestler D.,1995]. Данных об их экспрессии мало, а сведения по биологической активности противоречивы. Только в двух альтернативных сплайс-вариантах мРНК -hIL-6alt и hIL-6A4, как было показано, сохраняется рамка считывания. Остаётся невыясненным имеет ли сплайсинг мРНК генов IL-4 и IL-6 особенности в различных тканях на разных этапах онтогенеза и как их экспрессия может меняться под действием других регуляторных молекул. Систематизированные данные по тканеспецифической экспрессии сплайс-вариантов мРНК могут прояснить физиологическую роль альтернативных вариантов этих цитокинов.

4

При отсутствии антител способных специфически связывать изоформы или метода анализа мРНК in situ, который тоже может быть использован для оценки уровней экспрессии, оптимальным считается широко применяемый метод ОТ-ПЦР. Учитывая трудности получения образцов тканей от человека, представляется возможным в ряде экспериментов исследовать особенности экспрессии генов на животных. Исследование на животных моделях является одним из эффективных подходов для понимания функциональной роли альтернативного сплайсинга генов в силу ряда преимуществ, поскольку исключает использование тканей человека и трудности связанные с их получением, сводит к минимуму внутривидовые вариации (при использовании инбредных линий животных), позволяет быстро получить выборку особых состояний и стандартизовать условия исследований. Оптимальной моделью для исследований в иммунологии является мышь, которая имеет значительное сходство с человеком в геномной организации иммунной системы. Использование мышиной модели допустимо для изучения спектра сплайс-вариантов мРНК, так как имеющиеся в литературе данные о механизмах сплайсинга, говорят о том, что он происходит однотипно у человека и мыши в случае некоторых мРНК интерлей-кинов [Thanaraj Т.А., 2003; Sorek R., 2003]. В частности в работе Sorek R. and Ast G. было показано, что фланкирующие экзоны интронные последовательности, предназначенные для регулирования сплайсинга, аналогичны у мыши и человека [Sorek R., 2003]. Thanaraj Т.А. с соавт. показали, что более половины альтернативных сплайс-вариантов человека обнаружены и у мыши. Это говорит о высокой гомологии процесса альтернативного сплайсинга у человека и мыши. Следовательно, сравнительный анализ транскрибируемых последовательностей генов человека и мыши может быть полезен для изучения альтернативного сплайсинга [Thanaraj Т.А., 2003]. Изучение тканеспецифического распределения различных сплайс-вариантов мРНК цитокинов в онтогенезе может во многом поменять наши взгляды на регуляцию иммунных и дифференциро-вочных процессов.

В связи с вышеизложенным актуальным представляется изучение роли альтернативного сплайсинга в экспрессии генов интерлейкина-4 и интерлейки-на-6 как ключевых цитокинов в регуляции иммунных процессов. Цель работы

Поиск новых сплайс-вариантов мРНК IL-4 и IL-6 и изучение особенностей их экспрессии в разных тканях и на разных этапах онтогенеза у мыши и человека

Задачи исследования

1. Изучить экспрессию в клетках мышей сплайс-вариантов мРНК TL-4 и влияние митогенной стимуляции на уровень их транскрипции.

2. Исследовать тканеспецифичность в экспрессии сплайс-вариантов мРНК IL-4 на разных этапах онтогенеза мышей.

3. Выявить в клетках мышей сплайс-варианты мРНК IL-6 и изучить особенности их экспрессии в разных тканях и на разных этапах онтогенеза.

4. Изучить спектр сплайс-вариантов мРНК интерлейкина-4 в фетальных тканях человека и оценить уровень их экспрессии в тимусе, печени и селезёнке.

5. Исследовать влияние цитокинов in vitro на спектр экспрессируемых мРНК интерлейкина-4 в МНК периферической крови здоровых людей.

6. Изучить спектр сплайс-вариантов мРНК интерлейкина-6 в различных тканях человека.

Научная новизна работы

Впервые продемонстрировано наличие специфических мРНК IL-482, IL-653 и IL-655 в клетках мыши и выполнено систематизированное исследование экспрессии сплайс-вариантов мРНК IL-4 и IL-6 в различных тканях мыши. Установлено, что кинетика экспрессии сплайс-вариантов IL-4 при митогенной стимуляции аналогична в клетках мыши и человека. Впервые продемонстрирована экспрессия мРНК IL-4alt3 и мРНК IL-65264 в мононуклерных клетках человека. Доказан тканеспецифический характер экспрессии мРНК IL-4 и IL-6 в фетальных тканях человека.

Теоретическая и практическая значимость работы

В работе продемонстрировано, что экспрессия генов 1Ь-4 и 1Ь-6 в клетках человека и мышей происходит с участием альтернативного сплайсинга. При этом у мышей альтерантивно сплайсированные варианты мРНК этих генов экс-прессируются как минорные варианты, а у человека наблюдается тканеспеци-фическая экспрессия сплайс-вариантов, которая имеет качественные и количественные различия. Полученные результаты расширяют представление об экспрессии генов цитокинов клетками различных органов и тканей, позволяют глубже понять взаимосвязи внутри цитокиновой сети и их взаиморегуляцию. В частности в период фетального развития человека экспрессия альтернативных сплайс-вариантов мРНК 1Ь-4 и 1Ь-6 может быть доминантной, что отражает особенности тканеспецифической регуляции гистогенеза. Представленные в работе факты экспрессии генов цитокинов в виде нескольких форм существенно дополняют представления о структуре и функционировании цитокиновой сети. Эти данные позволяют иначе взглянуть на организацию цитокин-опосредованных взаимодействий, поскольку механизм альтернативного сплайсинга также активно используется генами рецепторов 111-4 и 1Ь-6. Из полученных данных можно сделать предположение о возможности непосредственного участия изоформ цитокинов в иммунорегуляции. Выяснение спектра экспрессии генов цитокинов в различных тканях также может быть полезным для определения роли изоформ в норме и патологии.

Положения, выносимые на защиту 1.Экспрессия генов 1Ь-4 и 1Ь-б в клетках человека и мышей происходит с участием альтернативного сплайсинга, причем характер экспрессирующих последовательностей имеет как качественные, так и количественные различия. 2. Экспрессия мРНК 1Ь-4 и 1Ь-6 в клетках человека имеет тканеспецифический характер.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Новосибирск, 2002г.), 2) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003г.), 3) 7-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003г.), 4) 8-ом всероссийского научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004г.), 5) Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетичекие основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010г.), 6) Семинаре экспериментального отдела НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН (Новосибирск, 2011г.). По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в журналах рекомендованных ВАК для кандидатских диссертаций.

Структура работы

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 147 источников, из них 137 зарубежных, 10 - отечественных. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследований данной работы стали образцы тканей мышей (СВАхС57ВЬ/61)Р1, (ОВА/2;хС57ВЬ/61)П и человека (кровь условно-здоровых доноров, фетальные ткани).

Животные В работе использовались интактные животные, полученные из НИЛ ЭБМ Томского Научного Центра СО РАМН и лаборатории экспериментальных животных (моделей) ГУ НИИ КИ СО РАМН, а также особи иммунизированные эритроцитами барана и самки в I, II и III триместрах беременности.

Иммунизацию эритроцитами барана проводили внутрибрюшинно в дозе 4x109, 2x108 или 4x105 в 0.5мл RPMI-1640, селезёнку забирали через 24 часа.

Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, эмбрионов -ингаляцией эфира. Выделенные от мышей селезенки и костный мозг гомогенизировали шприцем, ресуспендировали в среде RPMI-1640, подсчитывали количество клеток и оценивали их жизнеспособность.

Мононуклеарные клетки выделяли на градиенте фиколла-урографина плотностью 1,082. Выделенные клетки использовали для культивирования или помещали в лизирующий раствор (1x106 кл.) и хранили при -20°С до использования.

Для изучения тканеспецифической экспрессии на холоду были взяты следующие ткани мыши: печень, тимус, ткань легкого, лимфатические узлы, плей-еровы бляшки, стенка кишечника, ткань мышцы, плацента и эмбриональные ткани: печень эмбриона на 11 и 15 сутки и мозг эмбриона после 14 суток геста-ции. Выделенную от каждой мыши ткань замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С до использования.

Культивирование спленоиитов и МНК КМ мыши in vitro Клетки в количестве 5x106 культивировали в чашках Петри в среде RPMI-1640, дополненной 2 мМ L-глутамином, 5%-ной инактивированной фетальной телячьей сывороткой, 50 мкМ ß-2-меркаптоэтанолом и гентамицином (80 мкг/мл), в течение 48 ч в С02-инкубаторе при 37°С. Растворы митогенов добавляли в культуральную среду однократно вначале культивирования в следующих концентрациях: Кон-канавалин А (КонА) из расчета 10 мкг/ 1 млн. клеток, LPS E.coli 055:В5 - 30 мкг/ 1 млн. клеток.

Ткани человека Образцы фетальных тканей человека были получены из абортивного материала при прерывании беременности по социальным показаниям в сроке 20-24 недели. Фетальные ткани исследовали на отсутствие основных инфекций (герпес 2 типа, гепатиты В и С, цитомегаловирус, ВИЧ, реакция на Hbs-Ag и RW). Исследования с фетальными тканями одобрены Локальным этическим комитетом и проводились при наличии информированного согласия

женщин. У всех доноров периферической крови было получено информированное согласие на процедуру забора биологического материала и разъяснены цели исследования.

Выделение и культивирование мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови проводили стандартными методами [Воушп А., 1968; Силков А.Н., 2007]. Растворы цитокинов и Конканавалин А добавляли в культуральную среду однократно вначале культивирования в следующих концентрациях: КонА из расчета 10 мкг/ 1 млн. клеток, гМЬ-2 - 10 нг/мл, гЫЬ-4 - 5 нг/мл, гЫЫЬ-452 - 100 нг/мл, гЫШу- 3 нг/мл, гЫЫ8 - 40 нг/мл, гЫЫО 15 нг/мл, ЕРО - 511/мл. В качестве контроля использовали культуры МНК без цитокинов с КонА и без него. Жизнеспособность клеток не изменялась в процессе культивирования и составляла не менее 98% по окраске трипановым синим.

Выделение суммарной клеточной РНК и получение кЦНК Суммарную РНК выделяли по методу СЬотогупБЙ Р. и БассЫ N. [СЬотогупвИ Р., 1987]. Качество суммарной РНК оценивали электрофорезом в 1,5% агарозном геле, количество определяли спектрофотометрически по поглощению при 260 им. РНК хранили при -70°С до момента использования. кДНК получали из I мкг суммарной РНК в реакции обратной транскрипции (ОТ) с использованием 5 мкМ (1(рТ),8 праймера и 100 ед. акт. МоМЬУ РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ИХБФМ СО РАН) в 20 мкл буфера, содержащего 20 мМ Тп5-НС1, рН 8,3, 2мМ МпС12, 5 мМ дитиотреитол, 100 мМ КС1, 400 мкМ сЮТР.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ПЦР проводили в объеме 20 мкл реакционной смеси с 1 ед.акт. Тая- полимеразы (ИХБФМ СО РАН). Амплифи-кационная смесь содержала 2 мкл (-50 нг) кДНК в качестве матрицы, 200 мкМ раствор сШТР, в стандартном буфере, содержащем 67 мМ трис-НС1 (рН 8.9), 16 мМ сульфат аммония, 1,5 мМ МяС12, 0,05% Т\уееп-20, 20 пкМ каждого праймера для амплификации. Условия ПЦР: денатурация 95°С - 3 мин; затем 40 циклов по 7сек при 95°С, 7 сек при 62°С и 12 сек при72°С. Заключительный цикл элонгации - 3 мин при 72°С. Для усиления чувствительности и специфич-

ности выполнялась «вложенная» ПЦР с продуктом первого раунда ПЦР в качестве матрицы.

Дезоксирибоолигонуклеотидные праймеры были синтезированы в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и имели

следующие последовательности:

Таблица 1

мРНК обозначение последовательность длина фрагментов (п.о.)

mIL-4 Out-UlL4 5' -gc ate tcttgataac ttaatt gtc- 3' IL-4-498

Out-RIL4 5'-gttaaagcatggtggctcag-3'

mIL-4 IL-4m-n 5 '-tggatgtgccaaacgtcc-3' 264

IL-4m-r 5 '-getctttaggctttccaggaag-3'

mlL-482 IL-4m-d 5 '-caggagaagggaacaceac-3' 254

IL-4m-r 5'-gctctttaggctttccaggaag-3'

mIL-6 U1 . 5 '-cgctatgaagttcctctctgc-3' 1L-6 - 640, IL-бДЗ - 582, IL-6A5 - 526

R3 5 '-ctaggtttgccgagtagatctc-3'

hIL-6 6huml 5'- cgaaagagaagctctatctccc -3' IL-6-711 IL-652 - 520 IL-652,4 - 373

6hum2 5'- tgcccattaacaacaacaatc -3'

hIL-4 MFIL-4up 5'- gaagatgcatatgcacaagtgcgatatcacc-tacc -3' 390

MFIL-4 rew 5'- gaaggalcctcagctcgaacactttgaatatttc - 3'

HIL-4e2 5'- cgagttgaccgtaacagacat -3' IL-4 - 239 IL-462 - 213

HIL-4el/3 5'- cagagcagaagaacacaaatg -3'

HIL-4R 5'- tggcttccttcacaggacagg -3'

hIL-4 AIL-4U 5'-caaaactttgaacagcctcacag-3' IL-4 - 288 IL-462 - 240 IL-4alt3 -215

AIL-4R 5'- ctctggttggcttccttcacag-3'

RPS26 m350 5'- gctgcggcctccactatg -3' 136

ш223 5'- agagaaggaacaatggtcgtgc -3'

п

Дизайн праймеров был проведен с помощью программы «PrimerPremier» на основе нуклеотидных последовательностей, опубликованных в базе данных GeneBANK.

Конкурентную ПЦР выполняли как описано ранее [Auboeuf D., 1997]. Конкурентные стандартные ДНК для определения количества кДНК IL-4 и IL-452 были получены амплификацией геномной ДНК фага Т7 с праймерами, специфичными для исследуемых кДНК, с использованием низкой температуры отжига на первых циклах.

Продукты реакции амплификации (10 мкл) подвергали разделению электрофорезом в 6% полиакриламидном геле или в 1,5%-м агарозном геле. Гель окрашивали бромистым этидием (0,5мг/мл) и визуализировали ДНК под УФ-светом. Изображение фиксировали с помощью CD-камеры Watec AD-901 (Wa-tec Co., LTD, Япония). Количество ДНК высчитывали по плотности полос с помощью программы Scionlmage [http://www.scioncorp.com]. Строили график линейной регрессии, откладывая по оси ординат логарифм отношений количества конкурентной ДНК к исследуемой кДНК, а по оси абсцисс логарифм начальных концентраций конкурентной ДНК, в которых она добавлялась в ПЦР. Определяли точку эквивалентности, в которой логарифм отношений количества конкурентной ДНК к кДНК был равен 0, и изначальное количество исследуемой кДНК соответствовало начальному количеству конкурентной ДНК. По результатам трех повторных измерений для каждой кДНК высчитывали среднее значение, а также стандартную ошибку среднего.

Исследование уровня экспрессии мРНК ИЛ-4 и ИЛ-452 в ткани тимуса, печени и селезёнки 24-недельных фетусов проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (РТ-ПЦР) на приборе ICyclerlQ (Bio-Rad Laboratories, США) с применением интеркалирующего флуоресцентного агента SYBR Green I. Амплификацию всей серии образцов проводили одновременно, по две точки на каждый образец кДНК, анализ проводили два раза. Нормировку количества кДНК, взятой в анализ проводили, измеряя количество кДНК рибосомного белка S26 человека.

Секветюование Продукты амплификации элюировали из геля как описано ранее [Маниатис Т, 1984]. Секвенирование проводили по методу Сэнгера с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Amersham) в соответствии с рекомендациями фирмы производителя. Электро-форетическое разделение продуктов секвенирования проводили на автоматическом ДНК секвенаторе ABI310. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с использованием пакета программ VectorNTI (Informatics).

Гидролиз эндонуклеазшш рестрикции и секвенироваиие ДНК Гидролиз ДНК проводили в 1х буфере, соответствующем выбранной эндонуклеазе рестрикции, согласно рекомендаций производителя ферментов. Результат оценивали после электрофоретического разделения продуктов рестрикции в 6% ПААГ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Первой задачей данного исследования был поиск в клетках мыши мРНК IL-452 - аналогичной варианту, обнаруженному у человека и других видов животных. Система олигонуклеотидных праймеров была разработана таким образом, что позволяла селективно детектировать полноразмерный вариант мРНК IL-4 и альтернативно спланированный IL-452. Для поиска мРНК IL-452 мыши были использованы суммарные кДНК из спленоцитов и мононуклеарных клеток костного мозга, культивированных in vitro с КонА, LPS и без митогенов. Фрагменты соответствующие мРНК IL-452 мыши (нуклеотидная структура определена прямым секвенированием по методу Сэнгера) присутствовали в образцах клеток селезенки и костного мозга, стимулированных КонА (Рис.1) и не были выявлены ни в одном из образцов кДНК из культур клеток без митогенов или при стимуляции LPS (Присутствие минорных количеств мРНК IL-452 в ин-тактных клетках костного мозга и селезенки обнаруживалось только при проведении «вложенной» двухстадийной ПЦР, которая характеризуется более высокой чувствительностью. Данные не приводятся).

3 ч 6 ч 12 ч

К КонА К КонА К КонА М

У

Рис. 1 Экспрессия мРНК т!Ь-452 спленоцитами мыши в культуре клеток. К - без стимуляции митогенами, КонА - со стимуляцией конканавалином А. М - маркер рВ1ие.чспрГ II КБ (-)/ Нае III. Стрелкой обозначен фрагмент ДНК размером 254 п.о., соответствующий кДНК т1Ь-452.

При изучении кинетики экспрессии мРНК 1Ь-4 и мРНК 1Ь-4й2 в культурах спленоцитов мыши, показано, что при стимуляции КонА в них происходила индукция экспрессии как мРНК 1Ь-4, так и мРНК 1Ь-482. Максимальный уровень мРНК 1Ь-482 наблюдался через 3 часа после добавления КонА с последующим резким падением уровня экспрессии. Незначительный уровень мРНК 1Ь-452 продолжал определяться в клетках вплоть до 48 часов культивирования. Пик индукции мРНК 1Ь-4 наблюдался через 6 часов после начала стимуляции, и далее уровень мРНК постепенно снижался (Рис,2).

О 3 6 12 24 48 Время инкубации в часах

~#~мРНК И.4аеИа2 -»-мРНК 11.4

Рис. 2 Кинетика экспрессии мРНК 1Ь-4 и мРНК 1Ь-452 в культурах спленоцитов мыши.

С помощью конкурентной количественной ПЦР показано, что на пике индукции (6 часов) уровень мРНК полноразмерной формы был в 14 раз выше, чем уровень мРНК IL-452. Эти результаты согласуются с опубликованными в литературе работами, где также наблюдали повышение уровня экспрессии обеих изоформ интерлейкина-4 (полноразмерного варианта - в большей степени) и через несколько часов возвращение к базовому уровню.

Следующим этапом работы стало изучение тканеспецифического распределения сплайс-вариантов мРНК интерлейкина-4 у мышей. Были исследованы ткани мыши: печень, тимус, легкое, лимфатические узлы, плейеровы бляшки, стенка кишечника, мышца, плацента и эмбриональные ткани: печень эмбриона на 11 и 15 сутки и мозг эмбриона после 14 суток гестации.

Матричная РНК полноразмерного варианта IL-4 детектировалась в большинстве образцов (печени, лимфатических узлов, плейеровых бляшек, стенки кишечника, мышцы, плаценты и фетальной печени) при одностадийной ОТ-ПЦР. Матричная РНК IL-4S2 не определялась в нативных тканях методом одностадийной ПЦР и была обнаружена только более чувствительным методом «вложенной» двухстадиной ПЦР. На этом основании было заключено, что сплайс-вариант мРНК IL-452 у мыши в обследованных образцах тканей является минорной формой, по отношению к доминантной полноразмерной форме мРНК IL-4.

В следующей серии экспериментов была предпринята попытка изучить особенности экспрессии гена интерлейкина-6 мыши, для которого на сегодняшний день у человека описано уже четыре альтернативных варианта мРНК и ни один из них не был показан у мыши.

Для исследования использовали те же образцы кДНК, что и в экспериментах по изучению экспрессии гена интерлейкина-4, полученные из тканей мыши: печени, тимуса, легкого, лимфатических узлов, плейеровых бляшек, стенки кишечника, мышцы, эмбриональных тканей: печени эмбриона на 11 и 15 сутки и мозга эмбриона после 14 суток гестации, плаценты во II и III триместрах, а также селезенки мыши через 24 часа после иммунизации эритроцитами

барана в малой (4х 109 клеток), средней (2х 108 клеток) и большой (4х 105 клеток) дозах. Для увеличения специфичности и чувствительности метода использовали двухстадийную («вложенную») ПЦР.

3

Рис. 3 Электрофореграмма результатов ОТ-ПЦР мРНК гена IL-6 в клетках мыши. А - кДНК из клеток селезенки, мыши через 24 часа после иммунизации эритроцитами барана в дозе 4x10"; В - кДНК из клеток печени интактной мыши; С - кДНК из клеток плаценты мыши во II триместре беременности; D -кДНК из клеток плаценты мыши в III триместре беременности. Стрелками отмечены фрагменты: 1 - 640 п.о. (mIL-6), 2 - 582 и.о. (mIL-6A5), 3 - 526 п о (mlL-6ДЗ).

Из представленной на рис. 3 электрофореграммы видно, что помимо основного фрагмента ДНК размером 640 п.о., соответствующего полноразмерной форме мРНК mlL-б, в образцах присутствуют дополнительные фрагменты меньшей величины, соответствующие альтернативным сплайс-вариантам мРНК интерлейкина-6. Фрагменты ДНК выделены из геля и просеквенированы. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей показал, что фрагмент 2 содержит делецию участка экзона 5 размером 58 п.о., а фрагмент 3 - делецию экзона 3, размером 114 п.о. (Рис.41.

IL-бДЗ мРНК

-6 пре-мРНК

1 ИНТроН 2 интрон 3 интрон 4 интрон 5

IL-645 мРНК

Рис. 4 Схема сплайсинга пре-мРНК IL-6 мыши.

Соответствующие сплайс-варианты были обозначены как т1Ь-6Д5 и т!Ь-6ДЗ. Матричную РНК т1Ь6ДЗ и мРНК т1Ь-6Д5 детектировали в селезенке мыши через 24 часа после иммунизации эритроцитами барана в дозе 4x109 и в плаценте во II и III триместрах. Кроме того, мРНК т!Ь-6Д5 обнаружена в печени интактной мыши.

Описанная выше серия экспериментов продемонстрировала, что сплайсинг у различающихся видов может иметь нюансы, критичные для суждения о значении обнаруженных транскринтов. Сплайсинг матричных РНК интерлей-кина-4 и интерлейкина-6 у человека и мыши происходит видоспецифично. Поэтому дальнейшие исследования особенностей экспрессии сплайс-вариантов матричных РНК интерлейкина-4 и интерлейкина-6 выполнялись на тканях человека, в том числе фетальных.

Для исследования спектра сплайс-вариантов мРНК интерлейкина-4 в фетальных тканях человека использовали подход, позволяющий амплифициро-вать последовательности всех возможных сплайс-вариантов - система прайме-ров включала два олигонуклеотида (МР1Ь-4ир, МПЬ-4гс\у) фланкирующих исследуемый регион транскрипта. Присутствие специфических последовательностей констатировали по наличию в геле полос ожидаемого молекулярного веса. В проведённых экспериментах выявлены два варианта матричных РНК интср-лейкина-4: мРНК 1Ь-4 и мРНК 1Ь-452. В ткани щитовидной и поджелудочной желёз постоянно присутствовали оба варианта мРНК. В некоторых образцах сердечной мышцы и лёгкого определялись только фрагменты, соответствующие полноразмерному варианту, в то время как в ткани почки, ребра и скелетной мышцы, напротив, была только мРНК альтернативного варианта. В трёх из четырёх образцов ткани яичника присутствовали оба варианта мРНК. Во всех образцах мозга присутствовала мРНК 1Ь-452, в то время как мРНК полноразмерного варианта была только в одном из них.

Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Присутствие специфических последовательностей сплайс вариантов мРНК гена в фетальных тканях человека. Приведены результаты исследования 2-4 образцов каждой ткани. «+» - ПЦР-продукт присутствовал во всех образцах, «-» - отсутствие специфического ПЦР-продукта, «+\-» - ПЦР-продукт присутство-

Ткань мРНК

IL-4 IL-452

Поджелудочная железа + +

Мозг +/- +

Кожа

Почка ■ - +/-

Легкое +/- _

Печень + +

Селезенка + +

Тимус + +

Щитовидная железа + +

Надпочечник- - _

Скелетная мышца - +/-

Миокард +/- _

Яичник +/- +/-

Яичко - _

Костная ткань - +/-

В фетальных тканях, имеющих непосредственное отношение к гемопоэзу и иммунопоэзу (тимус, печень, селезёнка) была предпринята попытка количественно охарактеризовать уровень матричных РНК 1L-4 и IL-452. Измерения проводили методом ОТ-ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов в «реальном времени». Результаты представлены на рис. 5. Показано, что экспрессия полноразмерного варианта в тимусе в среднем на 1-2 порядка выше, чем в печени и селезёнке. Это согласуется с данными Klein S.C. с совт. и Atamas S.P., которые наблюдали слабую экспрессию мРНК IL-4 в клетках тимуса [Klein S.C. et all., 1996; Atamas S.P., 1996]. Количественный анализ мРНК IL-452 показал, что в печени его в среднем в 2-5 раз больше, чем в селезёнке или тимусе. В то же время в тимусе у эмбрионов мРНК IL-452 даже чуть больше, чем в селезёнке (рис.5).

0,001 1 — — - ------- ----------------u.ui

__печень „ селезенка тимус_| |____печень ____________селезенка _______тимус

Рис. 5 Относительные количества мРНК IL-4 и IL-452 в фетальных тканях человека. Данные приведены в относительных единицах как среднее ¿стандартное отклонение для четырех образцов печени, селезенки и тимуса.

Также было исследовано влияние некоторых цитокинов в культуре in vitro МНК периферической крови здоровых людей на спектр экспрессируемых ими мРНК интерлейкина-4, поскольку известно, что продукция цитокинов и их изоформ в культуре клеток может меняться под воздействием цитокинов и ростовых факторов [Chomarat Р., 1997; D'Andréa А.. 1995; Hart Р.Н., 1989; Силков А.Н., 2005; Douay L., 1994]. В культуре клеток использовалась панель рекомби-нантных цитокинов человека, включающая IL-2, IL-4, IL-452, IL-10, IL-18, IFNy и эритропоэтин. Выделенные от условно здоровых доноров МНК периферической крови культивировались в течение 6 часов в присутствии и в отсутствии цитокинов и КонА. Констатировано присутствие в культурах клеток мРНК IL-4 и мРНК 1L-462. В МНК некоторых доноров, культивированных в присутствии rhIL-18 был обнаружен дополнительный фрагмент ДНК меньшего размера (рис.6), соответствующий мРНК IL-4alt3, что было определено методом RFLP и прямого секвенирования.

; ' i 4 6 7 8 M

IL-4S2 мWIK (2-»0 Ii о ) IL-4 мРНК Г2.Ч8.....

' - - ' ¡¡¡¡В

I .

ч IL —f ill i мГИ1ъ I — I и.о.).

Рис. 6 Электрофореграмма результатов ОТ-ПЦР мРНК гена IL-4 в МНК ПК человека, культивированных в присутствии рекомбинантных цитокинов: 1 - без цитокинов, 2 - rhIL-2, 3 - rhIL-4, 4 - rhIL-452, 5 - rhIL-10, 6 - rhIL-18, 7 - rhlFNy и 8 - EPO, М-маркёр молекулярного веса pBluscriptll/ Mspl. Стрелками отмече-

19

ны: 1 - полноразмерный вариант. 1Ь-4 мРНК (288 п.о.), 2 - 1Ь-452 мРНК (240 и.о.), 3 - 1Ь-4акЗ мРНК (215 п.о.).

В экспериментах по изучению спектра экспрессируемых мРНК интер-лейкина-6 у мыши были обнаружены два новых сплайс-варианта: 1Ь-6ДЗ и 1Ь-6А5. Поскольку в литературе приводятся противоречивые сведения о спектре сплайс-вариантов интерлейкина-6 у человека, была сконструирована система праймеров, позволяющая выявить все возможные сплайс-варианты мРНК интерлейкина-6 у человека.

На рисунке 7 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР, где в качестве матрицы использовали кДНК из МНК периферической крови свежевы-деленных от условно здоровых доноров, а также МНК периферической крови, культивированных в течение 48 часов спонтанно, в присутствии КонА или в присутствии гЫЬ-18. Все образцы содержат фрагмент ожидаемой длины (711 п.о.), соответствующий мРНК 11,-6. Кроме того, во всех дорожках присутствует фрагмент меньшей длины (520 п.о.).

' • - ■ • *-РШ-б (711 п.о.)

Г".;-''".'■ .Д —ИЛ-652(52011.0.)

з 4 : 5; :: б 7 8 ?м

- ИЛ-66264 (373 п.о.)

Рис. 7 Электрофореграмма в 6% ПААГ продуктов ПЦР с праймерами 6huml/6hum2 на матрицах кДНК из нативных и культивированных МНК ПК. 1-4 - донор 1,5-8- донор 2. M - маркер молекулярного веса pGK3/HaeIII (видны полосы 734, 525, 503. 404). 1 и 5 - нативные МНК, 2 и 6 - МНК после культивации, 3 и 7 - МНК культивированные с добавлением КонА (10 мкг/мл), 4 и 8 - МНК культивированные с добавлением IL-18 (40 нг/мл).

Методом RFLP было установлено, что он соответствует мРНК IL-662 (Рис.8), в которой отсутствует второй экзон. В образцах из свежевыделенных МНК периферической крови присутствует дополнительный фрагмент (373 п.о.), соответствующий мРНК IL-652S4. что также было определено методом RFLP (Рис.8).

А. 1 2 3 4 М В. 1 2 3 4 5 6 М

Рис. 8 КРТР-анализ фрагментов ПЦР, соответствующих разным изоформам 1Ь-б человека. А.) Электрофореграмма разделения продуктов гидролиза эн-донуклеазой рестрикции Кэа1 в 6%-ном ПААГ ПЦР фрагментов соответствующих: 1 - 1Ь-6 полноразмерный, 2- 1Ь-652, 3 - 1Ь-682,4, 4 - неспецифический ДНК фрагмент. М - маркер рВ!и2К8(-)/НаеШ. В.) Компьютерная эмуляция разделения продуктов гидролиза фрагментов ПЦР эндонуклеазой рестрикции Ява! в 6%-ном ПААГ. 1, 2, 3 - негидролизованные и 4, 5, 6 гидро-лизованные фрагменты ПЦР: 1 и 4 - 1Ь-6 полноразмерный, 2 и 5 - ИЛ-662, 3 и 6 - ИЛ-652,4. М - маркер рВ1и2К8(-)/Нае11Т.

В процессе культивирования МНК ПК человека происходит изменение спектра экспрессируемых сплайс-вариантов матричных РНК интерлейкина-6: изоформа мРНК 1Ь-65254 (373 п.о.) исчезает. Таким образом, в МНК периферической крови человека присутствуют мРНК 1Ь-6. мРНК ГЬ-652 и мРНК 1Ь-65254. Присутствие мРНК 1Ь-65254 в МНК периферической крови человека показано впервые.

Далее были исследованы фетальные ткани человека на предмет присутствия в них сплайс-вариантов мРНК интерлейкина-6. В тканях фетусов был обнаружен тот же спектр матричных РНК интерлейкина-6, что и в предварительных экспериментах с митоген-стимулированными МНК периферической крови человека (Таблица 3).

Таблица 3

Присутствие специфических последовательностей мРНК в фетальных тканях человека. Приведены результаты исследования 2-4 образцов каждой ткани. «+» - ПЦР-продукт присутствовал во всех образцах, «-» - отсутствие специфического ПЦР-продукта, «+\-» - ПЦР-продукт присутствовал не во всех исследованных образцах.

Ткань\мРНК 1Ь-6 1Ь-652 111-652,4

Поджелудочная железа +

Мозг + _ _

Печень _ + +

Яичник- - + +

Кожа - + +

Почка + + „

Легкое + + _

Селезенка + + _

Тимус + +

Щитовидная железа + + _

Надпочечник + + _

Скелетная мышца +/- +/-

Миокард + + _

Яичко + +

При этом в ткани поджелудочной железы и мозга обнаруживался только полноразмерный вариант, мРНК 1Е,-6; в яичнике, печени и коже - только альтернативные варианты: мРНК 1Ь-632 и мРНК 1Ы>52,4. В тканях щитовидной железы, надпочечника, легких, селезенки, тимуса, миокарда, яичка и почки выявлялись мРНК 1Ь6 и мРНК 1Ь-652, причём интенсивность сигнала была приблизительно одинаковая для обеих изоформ.

По результатам проделанной работы были сделаны следующие выводы: ВЫВОДЫ

1. Показано, что в сплеиоцитах и мононуклеарных клетках костного мозга мышей ген интерлейкина-4 экспрессируется в виде двух форм мРНК: полноразмерной и альтернативно сплайсированной по 2 экзону.

2. Продемонстрировано, что в культуре спленоцитов, стимулированных Конка-навалином А происходит индукция как мРНК гп1Ь-4, так и мРНК ш1Ь-452, причем максимальный уровень мРНК 11.-452 наблюдается через 3 часа после

добавления КонА с последующим резким падением уровня экспрессии, а пик индукции мРНК т1Ь-4 наблюдается через 6 часов после начала стимуляции, и далее уровень мРНК постепенно снижается. Соотношение мРНК т1Ь-4 / мРНК т1Ь-452 на пике индукции мРНК т1Ь-4 составляет 14:1.

3. Установлено, что ген 1Ь-6 экспрессируется в клетках мышей в виде трех форм матричных РНК: мРНК ш!Ь-6, соответствующей полноразмерному белку интерлейкина-6, и двух альтернативных сплайс-вариантов, которые не обнаруживаются у человека, мРНК т1Ь-бДЗ - с делецией экзона 3 и мРНК ш1Ь-6Д5 - с делецией участка экзона 5.

4. Во всех исследованных образцах тканей мыши, как во взрослом состоянии, так и в фетальных тканях экспрессия альтернативно сплайсированных мРНК интерлейкина-4 и интерлейкина-6 носит минорный характер.

5. Продемонстрировано, что в фетальных тканях человека экспрессия гена ин-терлейкина-4 происходит с участием альтернативного сплайсинга и имеет качественные и количественные отличия в экспрессии мРНК 11.-4 и мРНК 1Ь-452, что отражает наличие тканеспецифичной регуляции альтернативного сплайсинга этого гена.

6. Обнаружен ранее не описанный у человека вариант мРНК интерлейкина-4 со сплайсированным участком третьего экзона 1Ь-4акЗ в мононуклеарных клетках культивированных в присутствии гЫЬ-18.

7. Показано, что в мононуклеарных клетках человека экспрессируются мРНК 1Ь-6, мРНК 1Ь-652 и мРНК 1Ь-65254, ранее описанная только в клетках ткани легкого и фибробластах, причем после 6 часового культивирования мононук-леаров мРНК 1Ь-65254 не определяется.

8. Установлено, что в фетальных тканях человека экспрессия гена интерлейкина-6 происходит с участием альтернативного сплайсинга с образованием мРНК 1Ь6, мРНК 11.-652 и мРНК 1Ь-66254 и имеет качественные и количест-

венные отличия в разных тканях, что может говорить о тканеспецифической регуляции альтернативного сплайсинга этого гена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Яценко О.П., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Сенников С.В., Козлов В.А. Альтернативный сплайсинг мРНК ИЛ-4 мыши. // Цитокины и Воспаление, (Материалы международной научно-практической школы-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет»), 2002, Т.1, №2, с.21.

2. Yatsenko О.Р., Filipenko M.L., Chrapov Е.А., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Alternative splicing of mouse IL-4 mRNA. // Journal of Interferon and Cytokine Research, (Cytokines and Interferons 2002. Turin, Italy, 6-10 October 2002), 2002, V22, supplement 1, S-127-128, Abstracts. P-5-48.

3. Яценко О.П., Филипенко М.Л., Храпов E.A., Сенников С.В., Козлов В.А. Альтернативный сплайсинг мРНК ИЛ-4 и ИЛ-6 мыши. // Иммунология, иммуногенетика, иммунопатология. Материалы 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН под ред. В.И.Коненкова, Новосибирск, 2003, с. 258-261.

4. Яценко О.П., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Сенников С.В., Козлов В.А. Альтернативный сплайсинг мРНК ИЛ-4 и ИЛ-6 мыши. // Медицинская иммунология (Материалы 7 Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 23-26 июня 2003), 2003, Т.5, №3-4, с.430.

5. Yatsenko О.Р., Filipenko V.L., Chrapov Е.А., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Alternative splicing of mouse IL-4 mRNA. // Proceedings of the annual meeting 2003 of the 1SICR. Cytokines, signaling and diseases. S. 335

6. Yatsenko O.P., Filipenko M.L., Khrapov E.A., Voronina E.N., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Alternative splicing IL-4 mRNA and IL-6 mRNA in mice. //

Clinical and Investigative Medicine, (Abstract 12 International Congress of Immunology and 4 Annual Conference of FOCIS), 2004, V.27 №4, p.70B.

7. Яценко О.П., Филиппенко M.JI., Воронина E.H., Храпов E.A., Сенников C.B., Козлов В.А.. Альтернативный сплайсинг мРНК интерлейкина-4 мыши. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004 Т. 137, №2, с.202-205.

8. Яценко О.П., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Воронина E.H., Сенников C.B.,. Козлов В.А. Альтернативный сплайсинг мРНК интерлейкина-6 у мыши. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004, Т.137, № 7, с.87-90.

9. Яценко О.П., Силков А.Н., Филиппенко М.Л.. Храпов Е.А., Воронина E.H., Козлов В.А., Сенников C.B. Альтернативный сплайсинг мРНК ИЛ-4 и ИЛ-6 в клетках разных фетальных тканей мыши и человека. /7 Медицинская иммунология, (Материалы VIII Всероссийского научного фо-. рума с международным участием имени В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге), 2004, Т. 6, №3-5, с. 264.

10. Yatsenko O.P., Filipenko M.L., Khrapov Е.А., Voronina E.N., Kozlov V.A., Sennikov S.V. Alternative splicing of mRNA of mouse interleukin-4 and in-terIeukin-6. // Cytokine, 2004, V. 28, №4-5 p. 190-196.

11. Яценко О.П., Филипенко М.Л., Самарин Д.М., Селедцов В.И., Сенников C.B., Козлов В.А. Особенности экспрессии изоформ мРНК интерлейки-на-4 и интерлейкина-6 в эмбриональных тканях человека. // Цитокины и воспаление, (Материалы Всероссийского научного симпозиума «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет»), 2005, Т.4, №2, с.82.

12. Яценко О.П., Силков А.Н., Храпов Е.А., Воронина E.H., Филипенко М.Л., Селедцова Г.В., Козлов В.А., Сенников С.В.Экспрессия слайс-вариантов мРНК генов ИЛ-4 и ИЛ-6 в различных тканях человека. // Цитокины и воспаление, (Материалы Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетичекие основы функционирования цитокиновой сети

в норме и при патологии» Новосибирск 15-17 сентября 2010г.), 2010, Т.9, №3. с. 58-59.

13. Яценко О.П., Силков А.Н., Храттов Е.А., Филиппенко М.Л., Сенников C.B. Тканеспецифичность сплайсинга мРНК генов ИЛ-4 и ИЛ-6 человека. // «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике». Под ред. В.А.Козлова и С.В.Сенникова, Новосибирск. 2011, с.57-59.

14. Яценко О.П., Силков А.Н., Храпов Е.А., Филиппенко М.Л., Козлов В.А., Сенников C.B. Тканеспецифическая экспрессия сплайс-вариантов мРНК генов ИЛ-4 и ИЛ-6 человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2011, Т. 152, № 9, с. 298-302.

Подписано в печать 26.09.2011г. Формат 60x84 Ш6

Усл. печ. л. 1,75 Тираж 100 экз Заказ № 173_

Отпечатано Омега Принт

630090, г. Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева,6 етаП: omegap@yandex.vu

Актуальность исследования.

Общее количество генов, обнаруженное в геноме человека, в процессе выполнения проектов по секвенированию всего генома по разным подсчётам не превышает 30-40 тысяч, в то же время база экспрессирующихся последовательностей человека на порядок больше. Причины этого многообразия кроются в посттранскрипционных событиях. Одним из наиболее значимых посттранскрипционных событий является альтернативный сплайсинг. Альтернативный сплайсинг пре-мРНК, благодаря комбинированию порядка и количества экзонов, наряду с альтернативным полиаденилированием позволяют продуцировать' различные зрелые транскрипты от одного единственного гена без изменения его геномной организации. Белки, образующиеся вследствие трансляции альтернативно сплайсированных мРНК, могут выполнять как сходные, так и различные функции. Сплайсинг транскриптов некоторых генов может происходить по-разному в зависимости от типа ткани, стадии развития организма, пола [147]. Опубликовано много работ подтверждающих, что альтернативный сплайсинг представляет собой явление характерное именно для транскриптов генов цитокинов. Так, было продемонстрировано, что альтернативный сплайсинг вовлечен в процессинг пре-мРНК генов IL-lp, IL-la, IL-IRa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, M-CSF, G-CSF, TGF-a, c-kit, LIF, SCF, FasL, онкостатина M, IL-2R, IL-4R, IL-5R IL-6R IL-9R GM-CSF эритропоэтина, некоторых хемокинов (VCAM) и т.д., приводя к образованию тканеспецифических изоформ различной локализации (мембрансвязанных, секреторных, внутриклеточных) и функции [143].

В этом отношении представляют интерес два иммунорегуляторных медиатора IL-4 и IL-6. Эти медиаторы имеют важное значение для регуляции многих клеточных процессов, в том числе гемопоэза и иммунопоэза на рйзных этапах онтогенетического развития [24, 95, 12, 27, 28, 102], и для этих медиаторов показано, что их экспрессия происходит с участием альтернативного сплайсинга [3, 61, 14]. Так, например, показано, что ген 1Ь-4 у человека экспрессируется в виде двух форм мРНК: полноразмерной формы, содержащей все 4 экзона и альтернативно сплайсированной, не содержащей экзона 2 мРНК, названной 1Ь-482 [3, 41, 109]. Установлено, что мРНК 1Ь-452 детектируется в различных типах иммунокомпетентных клеток [63]. Образование изоформ мРНК 1Ь-4 у взрослого человека имеет тканеспецифический характер: обычно мРНК 1Ь-452 обнаруживается в МНК ПК человека в минорных количествах [3], однако в ряде случаев в МНК ПК [3, 7], а также в клетках тимуса и бронхо-альвеолярного лаважа [7], клеточных линиях В95/8 и НЬ60 [63] обнаруживается преобладание мРНК 1Ь-452 над полноразмерной формой. Рекомбинантный человеческий белок 1Ь-452 (гЫЬ-452) способен связываться с рецептором 1Ь-4 и ингибировать действие гЫЬ-4 на иммунекомпетентные клетки [5, 7]. В то же время, в отношении фибробластов легких и кожи человека гЫЬ-482 выступает как агонист 1Ь-4 [8] Установлено, что при ряде патологических состояний изменяется соотношение полноразмерной - 1Ь-4 и альтернативной - 1Ь-482 форм мРНК [41, 104, 110, 109] что, по мнению авторов, может играть существенную роль в патогенезе этих заболеваний. Для гена 1Ь-6 показано существование у человека пяти сплайс-вариантов мРНК 1Ь-6: ЫЬ-6 мРНК, ЫЬ-баН мРНК, ЫЬ-6А2 мРНК, ЫЬ-6А2,4 мРНК и ЫЬ-6Д4 мРНК [14, 60]. Данных об их экспрессии мало, а сведения по биологической активности противоречивы. Только в двух альтернативных сплайс-вариантах мРНК -ЫЬ-6ак и ЫЬ-6Д4, как было показано, сохраняется рамка считывания. Остаётся невыясненным имеет ли сплайсинг мРНК генов 1Ь-4 и 1Ь-6 особенности в различных тканях на разных этапах онтогенеза и как их экспрессия может меняться под действием других регуляторных молекул.

В то же время систематизированные данные по тканеспецифической экспрессии сплайс-вариантов мРНК могут прояснить физиологическую роль альтернативных вариантов этих цитокинов.

При отсутствии антител способных специфически связывать изоформы или метода анализа мРНК in situ, который тоже может быть использован для оценки уровней экспрессии, оптимальным считается широко применяемый метод ОТ-ПЦР. Учитывая трудности получения образцов тканей от человека, представляется возможным в ряде экспериментов исследовать особенности экспрессии генов на животных. Исследование на животных моделях, является одним из эффективных подходов для понимания функциональной роли альтернативного сплайсинга генов в силу ряда преимуществ, поскольку позволяет исключить использование тканей человека и трудности связанные с их получением, сводит к минимуму внутривидовые вариации (при использовании инбредных линий животных), позволяет быстро получить выборку особых состояний и стандартизовать условия исследований. Оптимальной моделью для исследований в иммунологии является мышь, поскольку имеет значительное сходство с человеком в геномной организации иммунной системы. Использование мышиной модели допустимо для изучения спектра сплайс-вариантов мРНК, поскольку имеющиеся в литературе данные о механизмах сплайсинга, говорят о том, что он происходит однотипно у человека и мыши в случае некоторых мРНК интерлейкинов [124, 115]. В частности в работе Sorek R. and Ast G. было показано, что последовательности интронов, фланкирующих экзоны, предназначенные для регулирования сплайсинга, аналогичны у ¡мыши и человека [115]. Thanaraj ТА с соавт. показали, что более половины альтернативных сплайс-вариантов человека обнаружены и у мыши. Это говорит о высокой гомологии процесса альтернативного сплайсинга у человека и мыши. Следовательно, сравнительный анализ транскрибируемых последовательностей генов человека и мыши может быть полезен для изучения альтернативного сплайсинга [124]. Изучение тканеспецифического распределения различных сплайс-вариантов мРНК цитокинов в онтогенезе может во многом поменять наши взгляды на регуляцию иммунных и дифференцировочных процессов.

В связи с вышеизложенным актуальным представляется изучение роли альтернативного сплайсинга в экспрессии генов интерлейкина-4 и интерлейкина-6 как ключевых цитокинов в регуляции иммунных процессов. Цель и задачи исследования Цель работы

Поиск новых сплайс-вариантов мРНК IL-4 и IL-6 и изучение особенностей их экспрессии в разных тканях и на разных этапах онтогенеза у мыши и человека

Задачи исследования

1. Изучить экспрессию в клетках мышей сплайс-вариантов мРНК IL-4 и влияние митогенной стимуляции на уровень их транскрипции.

2. Исследовать тканеспецифичность в экспрессии сплайс-вариантов мРНК IL-4 на разных этапах онтогенеза мышей.

3. Выявить в клетках мышей сплайс-варианты мРНК IL-6 и изучить особенности их экспрессии в разных тканях и на разных этапах онтогенеза.

4. Изучить спектр сплайс-вариантов мРНК интерлейкина-4 в фетальных тканях человека и оценить уровень их экспрессии в тимусе, печени и селезёнке.

5. Исследовать влияние цитокинов in vitro на спектр экспрессируемых мРНК IL-4 в МНК периферической крови здоровых людей.

6. Изучить спектр сплайс-вариантов мРНК IL-6 в различных тканях человека.

Научная новизна работы

Впервые продемонстрировано наличие специфических мРНК IL-452, IL-653 и IL-685 в клетках мыши и выполнено систематизированное исследование экспрессии сплайс-вариантов мРНК IL-4 и IL-6 в различных тканях мыши. Установлено, что кинетика экспрессии сплайс-вариантов IL-4 при митогенной стимуляции аналогична в клетках мыши и человека. Впервые продемонстрирована экспрессия мРНК IL-4alt3 и мРНК IL-65284 в мононуклерных клетках человека. Доказан тканеспецифический характер экспрессии мРНК 1Ь-4 и 1Ь-6 в фетальных тканях человека. Теоретическая и практическая значимость работы.

В работе продемонстрировано, что экспрессия генов 1Ь-4 и 1Ь-6 в клетках человека и мышей происходит с участием альтернативного сплайсинга. При этом у мышей альтерантивно сплайсированные варианты мРНК этих генов экспрессируются как минорные варианты, а у человека наблюдается тканеспецифическая экспрессия сплайс-вариантов, которая имеет качественные и количественные различия. Полученные результаты расширяют представление об экспрессии генов цитокинов клетками различных органов и тканей, позволяют глубже понять взаимосвязи внутри цитокиновой сети и их взаиморегуляцию. В частности в период фетального развития человека экспрессия альтернативных сплайс-вариантов мРНК 1Ь-4 и 1Ь-6 может быть доминантной, что отражает особенности тканеспецифической регуляции гистогенеза. Представленные в работе факты экспрессии генов цитокинов в виде нескольких форм существенно дополняют представления о структуре и функционировании цитокиновой сети. Эти данные позволяют иначе взглянуть на организацию цитокин-опосредованных взаимодействий, поскольку механизм альтернативного сплайсинга также активно используется генами рецепторов 1Ь-4 и 1Ь-6. Из полученных данных можно сделать вывод о возможности непосредственного участия изоформ цитокинов в иммунорегуляции. Выяснение спектра экспрессии генов цитокинов в различных тканях также может быть полезным для определения роли изоформ в норме и патологии. Положения, выносимые на защиту:

1. Экспрессия генов 1Ь-4 и 1Ь-6 в клетках человека и мышей происходит с участием альтернативного сплайсинга, причем характер экспрессирующих последовательностей имеет как качественные, так и количественные различия.

2. Экспрессия мРНК IL-4 и IL-6 в клетках человека имеет тканеспецифический характер. Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Новосибирск, 2002г.), 2) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003г.), 3) 7-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003г.), 4) 8-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004г.), 5) Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетичекие основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010г.), 6) Семинаре экспериментального отдела НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН (Новосибирск, 2011г.). По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в журналах рекомендованных ВАК для кандидатских диссертаций. Самостоятельность выполненной работы

Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории молекулярной иммунологии ГУ НИИ КИ СО РАМН и группы фармакогеномики ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск (руководитель к.б.н. М.Л. Филипенко).

Секвенирование неизвестных последовательностей полученных фрагментов ДНК было осуществлено сотрудниками группы фармакогеномики ИХБФМ СО РАН.

Автор выражает благодарность Самарину Д.М. (Лаб.Клеточных биотехнологий РЖИ СО РАМН) за любезно предоставленные для исследований образцы фетальных тканей человека.

Большую признательность автор выражает научному руководителю работы профессору, д.м.н. C.B. Сенникову и к.б.н. М.Л.Филипенко за конструктивные предложения по содержанию работы и подробное обсуждение полученных результатов, а также всем сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии НИИКИ СО РАМН и группы фармакогеномики ИХБФМ СО РАН за благожелательное отношение в ходе выполнения работы.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в спленоцитах и мононуклеарных клетках костного мозга мышей ген интерлейкина-4 экспрессируется в виде двух форм мРНК: полноразмерной и альтернативно сплайсированной по 2 экзону.

2. Продемонстрировано, что в культуре спленоцитов, стимулированных Конканавалином А происходит индукция как мРНК ш1Ь-4, так и мРНК ш1Ь-482, причем максимальный уровень мРНК 1Ь-482 наблюдается через 3 часа после добавления КонА с последующим резким падением уровня экспрессии, а пик индукции мРНК т1Ь-4 наблюдается через 6 часов после начала стимуляции, и далее уровень мРНК постепенно снижается. Соотношение мРНК ш1Ь-4 / мРНК т1Ь-482 на пике индукции мРНК т1Ь-4 составляет 14:1.

3. Установлено, что ген 1Ь-6 экспрессируется в клетках мышей в виде трех форм матричных РНК: мРНК т1Ь-6, соответствующей полноразмерному белку интерлейкина-6, и двух альтернативных сплайс-вариантов, которые не обнаруживаются у человека, мРНК ш1Ь-6АЗ - с делецией экзона 3 и мРНК ш1Ь-6А5 - с делецией участка экзона 5.

4. Во всех исследованных образцах тканей мыши, как во взрослом состоянии, так и в фетальных тканях экспрессия альтернативно сплайсированных мРНК интерлейкина-4 и интерлейкина-6 носит минорный характер.

5. Продемонстрировано, что в фетальных тканях человека экспрессия гена интерлейкина-4 происходит с участием альтернативного сплайсинга и имеет качественные и количественные отличия в экспрессии мРНК 1Ь-4 и мРНК 1Ь-462, что отражает наличие тканеспецифичной регуляции альтернативного сплайсинга этого гена.

6. Обнаружен ранее не описанный у человека вариант мРНК интерлейкина-4 со сплайсированным участком третьего экзона 1Ь-4акЗ в мононуклеарных клетках, культивированных в присутствии гЫЬ-18.

7. Показано, что в мононуклеарных клетках человека экспрессируются мРНК 1Ь-6, мРНК 1Ь-682 и мРНК 1Ь-65254, ранее описанная только в клетках ткани легкого и фибробластах, причем после 6 часового культивирования мононуклеаров мРНК 1Ь-68254 не определяется.

8. Установлено, что в фетальных тканях человека экспрессия гена интерлейкина-6 происходит с участием альтернативного сплайсинга с образованием мРНК 1Ь-6, мРНК 1Ь-652 и мРНК 1Ь-65254 и имеет качественные и количественные отличия в разных тканях, что может говорить о тканеспецифической регуляции альтернативного сплайсинга этого гена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая полученные результаты можно заключить, что экспрессия генов IL-4 и IL-6 в клетках человека и мышей происходит с участием альтернативного сплайсинга, причем характер экспрессирующих изоформ мРНК имеет как качественные, так и количественные различия. Так в стимулированных in vitro спленоцитах и мононуклеарных клетках костного мозга мышей ген интерлейкина-4 экспрессируется в виде двух форм мРНК: полноразмерной и альтернативно сплайсированной по 2 экзону, как и у человека. При изучении кинетики экспрессии изоформ этого гена в культуре спленоцитов стимулированных Конконавалином А наблюдается индукция как мРНК IL-4, так и мРНК IL-482, причем максимальный уровень мРНК IL-482 наблюдали через 3 часа после добавления КонА с последующим резким падением уровня экспрессии, а пик индукции мРНК mIL-4 наблюдался через 6 часов после начала стимуляции, и далее уровень мРНК постепенно снижался. Но на этом общие моменты в регуляции экспрессии этого гена с участием альтернативного сплайсинга заканчиваются. Экспрессия мРНК mIL-482 носит минорный характер не только в спленоцитах и клетках костного мозга, но и в различных тканях мышей, в т.ч. фетальных, что не позволяет говорить о тканеспецифической регуляции альтернативного сплайсинга этого гена. При изучении экспрессии гена IL-6 в клетках мышей показаны три формы матричных РНК, мРНК mIL-б, соответствующая полноразмерному белку интерлейкина-6, и два сплайс-варианта, аналоги которых не обнаруживаются у человека: мРНК mIL-бДЗ - с делецией экзона 3 и мРНК mIL-6A5 - с делецией участка экзона 5. Таким образом, альтернативный сплайсинг гена IL-6 у мышей происходит иначе. Также при изучении их экспрессии в разных тканях, в том числе фетальных, установлено, что экспрессия изоформ мРНК IL-6 у мышей носит минорный характер, что также не позволяет говорить о тканеспецифической регуляции альтернативного сплайсинга этого гена. Наиболее интересные данные об участии альтернативного сплайсинга в экспрессии генов 1Ь-4 и 1Ь-6 обнаружены в клетках человека, что позволяет говорить об их возможном участии в регуляции иммунных процессов. Так, в отличие от мышей, в фетальных тканях человека экспрессия гена интерлейкина-4 происходит с участием альтернативного сплайсинга и имеет тканеспецифический характер, поскольку в некоторых тканях обнаруживался только полноразмерный вариант мРНК ИЛ-4 (в образцах тканей сердечной мышцы и лёгкого), в других - только альтернативный, мРНК 1Ь-482 (в образцах тканей ребра и скелетной мышцы), в третьей группе (образцы тканей яичника и мозга) - оба сплайс-варианта матричных РНК интерлейкина-4. Кроме того, в фетальных тканях, имеющих непосредственное отношение к гемопоэзу и иммунопоэзу (тимус, печень, селезёнка) количественно охарактеризован уровень матричных РНК 1Ь-4 и 1Ь-482. Показано, что экспрессия полноразмерного варианта в тимусе в среднем на 1-2 порядка выше, чем в печени и селезёнке. Количественный анализ мРНК 1Ь-482 показал, что в печени его в среднем в 2-5 раз больше чем в селезёнке или тимусе. В то же время в тимусе у эмбрионов мРНК 1Ь-482 даже чуть больше, чем в селезёнке. Эти данные позволяют говорить о тканеспецифической регуляции альтернативного сплайсинга гена 1Ь-4 и предполагать о возможном регуляторном влиянии этих изоформ, учитывая тот факт, что их биологические эффекты на функциональную активность клеток могут носить различный характер. Также представляют определенный интерес и тот факт, что у 2 из 5 доноров в клетках, культивированных в присутствии гЫЬ-18, был обнаружен дополнительный фрагмент кДНК соответствующий не описанной ранее у человека формы матричной РНК интерлейкина-4 со сплайсированным третьим экзоном 1Ь-4акЗ (215 п.о.), что подтверждено прямым секвенированием. Эти данные говорят о том, что иммунорегуляторные молекулы (в частности 1Ь-18) могут влиять на альтернативный сплайсинг гена 1Ь-4. Для гена 1Ь-6 человека также получен ряд интересных данных, говорящих в пользу возможного участия изоформ этого цитокина в регуляции. В частности показано, что в фетальных тканях человека экспрессия гена интерлейкина-6 происходит с участием альтернативного сплайсинга с образованием мРНК 1Ь-6, мРНК 1Ь-652 и мРНК 1Ь-65284, уровень экспрессии которых имеет качественные отличия. Кроме того, в мононуклеарных клетках человека были обнаружены мРНК 1Ь-6, мРНК 1Ь-682 и мРНК 1Ь-68284, причём последняя ранее обнаруживалась только в клетках ткани легкого и фибробластах. В процессе культивирования МНК ПК человека происходит изменение спектра экспрессируемых сплайс-вариантов матричных РНК интерлейкина-6: изоформа мРНК 1Ь-68254 (373 п.о.) исчезает.

Исходя из полученных данных о том, что экспрессия генов интерлейкина-4 и интерлейкина-6 у человека в разных тканях происходит с участием альтернативного сплайсинга, качественно и количественно различается в разных тканях, можно говорить о тканеспецифической регуляции альтернативного сплайсинга и о возможных тканеспецифических эффектах продуктов этих генов, имеющих важное значение в онтогенетическом становлении иммунной системы и других систем в организме.