Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Иксодовые клещевые боррелиозы в сочетанных природных очагах трансмиссивных инфекций Западной Сибири

На правах рукописи

Рудакова Светлана Анатольевна

ИКСОДОВЫЕ КЛЕЩЕВЫЕ БОРРЕЛИОЗЫ В СОЧЕТАННЫХ ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ ТРАНСМИССИВНЫХ ИНФЕКЦИИ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ

14 00 30 —эпидемиология 03 00 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

003065561

Омск-2007

003065561

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

доктор биологических наук, заслуженный деятель науки

Российской Федерации, профессор Коренберг Эдуард Исаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Злобнн Владимир Игоревич Кузяев Рафаэль Зиафутдинович Богданов Игорь Иванович

Ведущая организация: ГУ Научный центр медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН, г. Иркутск

Защита состоится « о?3 » Р/Мги&С^О^ 200^ года в часов на заседании диссертационного совета Д 208 065 03. при Омской государственной медицинской академии (644099, г.Омск, ул Ленина, 12)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омской государственной медицинской академии

Автореферат разослан » ¿З&УУУ&^^Ь^ 200

года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент __ Готвальд Р Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. С иксодовыми клещами связано существование и передача человеку возбудителей ряда заболеваний вирусной, рик-кетсиозной, бактериальной и протозойной этиологии Однако только в последние годы получен ряд новых данных, свидетельствующих о закономерном существовании и реальном эпидемиологическом значении со-четанных природных очагов трансмиссивных инфекций Возможность существования сочетанных природных очагов различных инфекций, в том числе передаваемых иксодовыми клещами, обсуждается достаточно давно (НецкийГИ идр, 1961, НецкийГИ ,ШайманМ С , 1963,1964, Пчел-кинаАА., 1971,ЖмаеваЗ М., ПчелкинаА А , 1972идр) Однако,только выявление в последние годы ряда новых клещевых патогенов (борре-лии комплекса клещевых иксодовых боррелиозов, новые патогенные рик-кетсии, анаплазмы, эрлихии, бабезии и др ) приоткрыло значимость проблемы сочетанности природных очагов трансмиссивных инфекций и инвазий, а микстзараженность ими иксодовых клещей — нормальное и широко распространенное явление (КоренбергЭ И , 1999). По выражению А Н.Алексеева(1993), наличие сочетанных природных очагов-это «скорее правило, нежели исключение из правила», однако по методологическим и гносеологическим причинам до настоящего времени изучаются преимущественно отдельные природно-очаговые инфекции, отсутствует комплексный синэкологический подход к познанию процессов, происходящих в очаговых экосистемах

Иксодовые клещевые боррелиозы - группа наиболее распространенных природно-очаговых трансмиссивных инфекций в России По данным официальной регистрации среднемноголетний показатель заболеваемости ИКБ в Российской Федерации с 1992 по 2004г составил 4,40 на 100 тыс населения, в Сибирском Федеральном округе этот показатель в два раза выше -10,08. В последние годы накоплен значительный объем информации по эпидемиологии природно-очаговых инфекций и изучению их возбудителей Наиболее распространенными среди них являются клещевой энцефалит (КЭ) и иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ) Основными переносчиками боррелий являются те же виды клещей, что и при КЭ В ряде случаев клещи могут быть инфицированы тем и другим патогенами что может привести к возникновению у человека микст-инфекций Сегодня наиболее хорошо изучены клещевые боррелиозы, ареал которых совпав дает и даже шире ареала КЭ В настоящее время в России обнаружена циркуляция различных геновидов боррелий В Ъъа^Лофп, В gar¡nll, В а/геШ / Ретроспективный анализ показал, что значительная часть заболеваний (до 1 30%), которые были диагностированы в 60-80-е гг как КЭ, на самом деле являлась клещевым боррелиозом (Коренберг Э И, 2003)

Показана широкая циркуляция в России Я ЫНса, Я в1оуаса, Я НеИоп&шщет1$, а также обнаружен ряд новых риккетсий из группы клещевой пятнистой лихорадки (КГТЛ) с неустановленной патогенностью (Рудаков Н.В. и др., 2002). Недавно на территории РФ в пределах нозоа-реала КЭ обнаружены очаги и выявлены больные гранулоцитарным и моноцитарным эрлихиозами человека (КоренбергЭ.И идр, 1999, Шпы-нов С.Н. и др., 2002). В литературе последних лет есть сведения о выявлении природных очагов бабезиоза (Семенов В.А., 2003). Возрастанию интереса к группе трансмиссивных инфекций способствовал рост заболеваемости КЭ, ИКБ, КР и появление «новых» для России «клещевых» инфекций. Вместе с тем, несмотря на растущий объем информации о трансмиссивных инфекциях на территории России, сегодня нет четких представлений о нозоареалах, структуре природных очагов, географическом распространении различных вариантов возбудителей и микст-инфекций Верифицируется лишь часть «клещевых» инфекций, этиология ряда из них остается нерасшифрованной.

Цель работы. Установить эколого-эпидемиологические закономерности существования природных очашв иксодовых клещевых боррелио-зов в Западной Сибири, изучить их этиологическую структуру, особенности сочетания паразитарных систем с паразитарными системами других трансмиссивных инфекций и разработать комплексную программу эпидемиологического надзора и профилактики «клещевых» инфекций на эндемичных территориях Задачи исследования

1. Провести анализ многолетней заболеваемости ИКБ и КЭ на различных территориях Западной Сибири, выявить основные закономерности эпидемического процесса, дать сравнительную эпидемиологическую характеристику этих инфекций в Омской области

2. Определить геновидовой состав боррелий, циркулирующих в природных очагах, и сопоставить с геновидовым спектром возбудителей у больных ИКБ на отдельных территориях Западной Сибири.

3. Изучить эколого-эпидемиологические аспекты сочетанности природных очагов трансмиссивных инфекций, провести анализ микст-ин-фицированности иксодовых клещей и геновидового состава выявляемых в них патогенов.

4. Выяснить роль клещей рода ВегтасеЫог в инфицировании населения возбудителями клещевых инфекций и охарактеризовать эюлого-эпи-демиологические особенности природных очагов различных типов

5. Усовершенствовать алгоритмы дифференциальной лабораторной диагностики инфекций, передающихся иксодовыми клещами (КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ), основанной на применении комплексов современных иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования.

6 Разработать комплексную программу эпидемиологического надзора и профилактики трансмиссивных инфекций на эндемичных территориях Западной Сибири. Научная новизна

В результате комплексного эпидемиологического анализа получены новые данные о современном состоянии и тенденциях развития эпидемического процесса ИКБ на территории Западно-Сибирского региона.

Получены новые данные о геновидовом спектре возбудителей ИКБ и генетическом разнообразии боррелий, циркулирующих в природных очагах Западной Сибири

Определены и депонированы в Международный компьютерный банк данных вепБапк 12 нуклеотидных последовательностей ДНК боррелий и бабезий (0(^016663, 0(3016662, 0(3016661, АУ649326, АУ603350, АУ603349, АУ603351, АУ583358, АУ583238, АУ583237, АУ540052, АУ540051)

Верифицированы случаи ГАЧ и МЭЧ, установлены современные эпидемиологические закономерности ИКБ, КЭ и других инфекций, в соче-танных очагах на примере Западной Сибири

Результаты настоящей работы позволили впервые оценить различия в структуре и функционировании природных очагов инфекций, вызванных патогенами вирусной и бактериальной природы в зависимости от ландшафтно-географических условий и роль различных видов переносчиков в эпидемическом процессе

Установлено участие клещей рода ВегтасеМог в эпизоотическом и эпидемическом процессах ИКБ, экспериментально доказана возможность передачи боррелий клещами геИсиЫш

Практическая значимость результатов исследований. В результате проведенных исследований получены новые данные об этиологии и степени распространения природных очагов и эпидемиологических особенностях ИКБ в Западной Сибири, которые имеют важное практическое значение для здравоохранения при организации диагностической и лечебной помощи больным, а также при организации профилактических мероприятий, в том числе в условиях сочетанности природных очагов Разработаны новые алгоритмы лабораторной диагностики ИКБ, основанные на применении комплекса иммунологических и моле-кулярно-биологических методов с целью проведения ранней дифференциальной диагностики инфекций, передающихся иксодовыми клещами, и адекватных профилактических и лечебных мероприятий Внедрение в практику новых методов лабораторной диагностики (ИФА, ПЦР) позволило организовать активное выявление случаев заболеваний, улучшить их регистрацию, повысить эффективность лечебных и профилактических мероприятий в очагах, снизить социально-экономический ущерб от

трансмиссивных инфекций, распространенных на территории Западной Сибири.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В Западной Сибири широко распространены природные очаги иксо-довых клещевых боррелиозов, сочетанные с очагами других трансмиссивных инфекций - клещевого энцефалита, гранулоцитарного анаплазмоза, моноцитарного эрлихиоза и клещевого риккетсиоза.

2. Динамика заболеваемости ИКБ в Сибирском ФО за изучаемый период характеризуется четкими пиками подъема (1995, 1998 и 2001) и снижения (1997, 2000 и 2003). В период с 1999 по 2004гг. уровень заболеваемости стабилизировался и даже имеет тенденцию к снижению. Основные особенности эпидемического проявления природных очагов иксодовых клещевых боррелиозов в современный период характеризуются существенным ростом заболеваемости городских жителей, изменениями в возрастной структуре заболеваемости: увеличение доли детей дошкольного возраста и пожилых людей.

3. В этиологической структуре заболеваемости инфекциями, передающимися иксодовыми клещами, основная роль принадлежит возбудителям КЭ и ИКБ. Заболеваемость ИКБ в Западной Сибири связана с двумя основными геновидами боррелий - В garirm и В а/геШ.

4 Основная роль в заражении населения возбудителями КЭ, ИКБ, ГАЧ и МЭЧ принадлежит клещам/ регзи1саШ Клещи рода ОегтасеЫог имеют значение в инфицировании населения возбудителями риккет-сиозов и редко - боррелиозов

5. В очагах с монодоминантным типом населения переносчика I регйикаШ преобладает геновид В ясагти, в очагах с бидоминант-ным типом населения переносчиков I регэикаШ и В геисиШш существенно превалирует геновид В а/геШ.

6. Новые алгоритмы лабораторной диагностики клещевых инфекций позволили оценить реальный риск заражения населения возбудителями различных инфекций и усовершенствовать тактику проведения экстренных профилактических и лечебных мероприятий.

7. Совершенствование системы эпидемиологического надзора за клещевыми инфекциями возможно на основе использования более эффективных методов мониторинга возбудителей клещевых инфекций на территориях с различным уровнем заболеваемости. Апробация работы

Материалы диссертации представлены на следующих конференциях: «Актуальные проблемы обеспечения санитарно - эпидемиологического благополучия населения» научно-практической конференции, посвященной 80-летию ОГМА, Омск, 2001; межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Омского НИИПИ, Омск, 2001;

VII International Postdam symposium on tick-borne diseases, Berlin, Germany, 2003, Всероссийской конференции «Клещевые боррелиозы», г Ижевск, 2002, III Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», г.С-Петербург, 2003, IV межрегиональной конференции с международным участием, посвященной 60-летию кафедры эпидемиологии и 80-летию кафедры микробиологии Омской государственной медицинской академии Омск, 2003; Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», г Новосибирск, 2004, V межрегиональной научно-практической конференции, Омск, 2004, VIH Всероссийском акарологическом совещания, С-Петербург, 2004, 4th International Conference on Rickettsiae and Rickettsial Diseases, Logroño, Spain, 2005, 10th International conference on Lyme borreliosis and other tick-borne diseases, Vienna, Austria, 2005, Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» г Новосибирск, 2005, научно-практической конференции с международным участием «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке», Томск, 2006 Диссертационная работа апробирована на заседании Ученого совета Омского НИИ природно-очаговых инфекций при участии сотрудников кафедры эпидемиологии Омской государственной медицинской академии Внедрение результатов исследований в практику Полученные новые данные используются в учебном процессе кафедры эпидемиологии, кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, кафедры инфекционных болезней Омской государственной медицинской академии, в лечебной практике городской инфекционной клинической больницы им Д М Далматова, детской инфекционной клинической больницы №3 Результаты исследований ежегодно используются при проведении семинаров для врачей инфекционистов и невропатологов Проведено внедрение в практику здравоохранения генетической диагностики и типирования возбудителей на ранней стадии заболевания Результаты исследований использованы при составлении пособия для врачей «Ик-содовые клещевые боррелиозы в Западной Сибири (этиология, эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика)» Утверждены председателем секции по эпидемиологии УС МЗ РФ 13 01 2005, авторы: С А Рудакова, А С Оберт, В Н Дроздов, г Омск, 2005, разработаны Методические рекомендации «Лабораторная диагностика ИКБ в условиях со-четанности природных очагов»

Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 73 научные работы, в том числе 7—в международных изданиях, 14 - в журналах, рекомендованных ВАК, монография «Иксодовые клещевые боррелиозы (нозогеографические и медико-экологические аспекты), «Наука», Новосибирск, 2001, пособие для врачей «Иксодовые клещевые бор-

релиозы в Западной Сибири (этиология, эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика)», 2005.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы содержит 741 источник, в том числе 515 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 404 страницах, иллюстрирована 29 таблицами, 41 рисунком, 5 схемами, 9 фотографиями и 6 приложениями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Эпидемиологический анализ. Анализ эпидемиологической ситуации проведен на основании данных официальной регистрации заболеваемости ИКБ за 1992-2004 гг, по материалам обращаемости больных в лечебные учреждения, данных серологической диагностики и изучения иммунологической структуры населения в отношении этой инфекции Для анализа основных эпидемиологических характеристик ИКБ использованы материалы серологического обследования больных, госпитализированных с «клещевыми» нейроинфекциями в Омской, Курганской, Кемеровской, Новосибирской областях, Алтайском крае и Республике Алтай, а также «Медицинские карты стационарного больного», «Карты эпидемиологического обследования очага инфекционного заболевания», материалы статистической отчетности. Серологически исследовано 11 872 сыворотки крови от 5836 больных с подозрением на клещевые нейроинфекции, в том числе из Омской области - 7530, из Новосибирской - 260, из Курганской - 642, из Кемеровской — 410, из Алтайского края - 156, из Республики Алтай - 92 методами реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и иммунофермент-ного анализа (ИФА) для выявления иммуноглобулинов классов M и G к вирусу КЭ, боррелиям, ГАЧ и МЭЧ, реакции непрямой иммунофлуоресцен-ции (РНИФ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) На наличие антител ко всем четырем патогенам (КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ) нами исследованы сыворотки крови 719 больных Проведен ретроспективный эпидемиологический анализ случаев КЭ, ИКБ и ГАЧ, подтвержденных серологически, по территориальной приуроченности, сезонности, возрастному, половому и профессионально-социальному составу. С целью изучения распространения природных очагов ИКБ и их сочетанности с очагами КЭ проведено изучение популяционного иммунитета населения к возбудителю ИКБ и КЭ в 17 районах Омской области и г Омске. Для этого было серологически исследовано 1798 сывороток крови лиц, проживающих в 5 ландшафтно-географических зонах области

Анализ состояния природных очагов осуществлен на основании полевых наблюдений, изучения основных клещей-переносчиков и их инфицированное™ боррелиями Для изучения природных очагов ИКБ на юге Западной Сибири проведены сборы иксодовых клещей в десяти административных территориях (Омской, Курганской, Новосибирской, Томской, Тюменской, Челябинской областях, Алтайском, Красноярском и Приморском краях и Республике Алтай), расположенных в различных ландшафтно-гео-графических зонах, и их исследование с использованием энтомологических, микробиологических, иммунологических и молекулярно-генетичес-ких методов Всего исследовано более 6 ООО экземпляров иксодовых клещей шести видов, в том числе I persulcatus Schulze, D reticulatus Fabr, D marginatus Sulz, D silvarum Ol, D nuttalli Ol, H concinna На микст-инфицированность возбудителями ИКБ и КЭ индивидуально исследовано 1456 клещей, вирусами комплекса КЭ, боррелиями, эрлихиями, анаплазма-ми, риккетсиями и бабезиями—530 экз клещей

Методы исследования переносчиков. Клещей на инфицированность боррелиями исследовали следующими методами темнопольной микроскопии витальных препаратов, микроскопии с окраской фиксированных мазков по Романовскому-Гимзе, иммунофлуоресцентной микроскопии с гипериммунной сывороткой кролика и в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с наборами реактивов, используя праймеры к межгенному спейсе-ру rrfA-rrlB (Postic D et al., 1998) Для изучения инфицированности клещей вирусами комплекса КЭ применяли иммуноферментный анализ (ИФА) и ПЦР (тест-системы ЗАО «Вектор-Бест», г Новосибирск). Исследование клещей и плазмы крови людей на наличие риккетсий, эрлихий, анап-лазм и бабезий проводили с помощью ПЦР с соответствующими наборами праймеров ДНК риккетсий была исследована с праймерами Rr190 70р и Rrl90 70In, которые амплифицируют фрагмент отрА гена риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (Fournier Р-Е , 1998) Для выявления фрагмента гена 16s-rRNA эрлихий и анаплазм применяли коммерческие тест-системы НПО «Изоген», (г Москва), фрагмента гена 18s-rRNA бабезий Babesia-F (GTG-AAA-CTG-CGA-ATG-GCT-CA) и Babesia-R (CCA-TGC-TGA-AGT-ATT-CAA-GAC) (Inokuma Н, 2003).

Получение изолятов боррелий и их генотипирование. Изоляцию возбудителей ИКБ из клещей проводили путем посева суспензии индивидуальных экземпляров переносчиков на среду BSK-H (производства фирмы SIGMA, США) с добавлением комплекса антибиотиков Всего проведено 743 посева Изучено 14 штаммов боррелий Для проведения типи-рования боррелий в изолятах использовали двухрау ндовую ПЦР с последующим определением нуклеотидной последовательности или анализом полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДРФ) полученного фрагмента ПЦР

Определение нуклеотидных последовательностей вариабельных межгенных участков проводилось на базе Новосибирского НИИ биоорганической химии и фундаментальной медицины с использованием набора дидезоксинуклеотидов Big Dye™ Tenninator Kit согласно инструкции изготовителя. Нуклеотидные последовательности анализировали на приборе «ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer» (Perkin Elmer Applied Biosystems, USA). Сравнение нуклеотидных последовательностей с зарегистрированными в GenBank проведено с использованием программы CLUSTALW (http //www.ebi ac.uk/clustalw/index.html).

Молекулярно-бшмогические методы.

Выделение ДНК Для выделения ДНК из бактериальных клеток был использован метод, основанный на разрушении клеточной стенки под воздействием 4M гуанидинтиоцианата. Выделение ДНК из клещей и биологического материала людей проводили методами фенол-хлороформной экстракции с последующей очисткой.

Амплификация фрагментов ДНК (ПИР) Однораундовую ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0,67 мМ Трис-HCI pH 8,9, 0,166 мМ (NH4)gS04,2 мМ MgCI2,0,01 % (v/v) Твин 20; 0,2 мМ dNTP, 0,3 мкм праймеров, 1 единицу активности (е.а ) фермента Taq ДНК-полимера-зы Каждый цикл амплификации (всего 40) включал в себя три температурных режима: ДНК денатурировали при 94 °С в течение 60 с, отжиг праймеров осуществляли при 58 °С в течение 60 с, элонгацию праймеров - при 72°С 90 С При проведении двухраундовой ПЦР реакционная смесь д ля первого раунда содержала 0,32 мМ Трис-HCI pH 8,9,0,83 мМ (NH4)2S04, 10 мМ MgCI2,0,005% (v/v) Твин 20; 2,5% тицерин; 0,2 мМ dNTP, 2мкл смеси ДНК; 0,5 мкм праймеров, 1 (е.а.) фермента Taq ДНК-полимеразы. Второй раунд ПЦР проводили в реакционной смеси, содержащей 0,67 мМ Трис-HCI pH 8,9; 0,166 мМ (NH4)2S04,2 мМ MgCI2,0,01 % (v/v) Твин 20, 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкм праймеров, 1 е а. фермента Taq ДНК-полимеразы. В качестве матрицы была использована смесь ампликонов первого раунда (У=2мкл) В первом и втором раунде было использовано одинаковое количество циклов - 35, отжиг праймеров осуществлялся при 56 °С в течение 60 с. - в первом раунде и при 58 °С в течение 60 с - во втором раувде Амплификацию проводили в многоканальном амплификаторе «Терцик» (НПО «ДНК-Технология», Москва) Результаты ПЦР анализировали по флюоресценции бромистого этидия после электрофореза в 2% агарозном геле в 1 TBE (50мМ трис-боратный буфер, pH 8,3,1 мМ ЭДТА) буферном растворе при 25 °С и напряженности электрического поля 5-7 В/см

Статистические методы. Статистический анализ данных осуществляли с использованием параметрических и непараметрических методов обработки, адекватных цели и задачам исследования, объему и структуре анализируемых выборочных совокупностей В статистической обработке материала использованы стандартные статистические методы исследова-

ний. вычисление средних геометрических титров антител, вычисление средней ошибки интенсивных показателей. Определяли такие статистические величины, как показатели частоты и структуры изучаемых явлений, тенденция (тренд) динамики явлений Для оценки статистической значимости различий показателей использовался t-критерий Стъюдента, х2 (хи-квад-рат) Направление и сила связи между явлениями определяли с помощью коэффициента ранговой корреляции Для статистической обработки и графического оформления материалов использованы программные продукты Microsoft STATISTICA (StatSoft, USA), системы электронных таблиц Microsoft Excel 2000 (Константинов В M, 1975, Лакин ГФ, 1980, Беляков В Д и др , 1981, Платонов А Е, 2000, Реброва О.Ю , 2006)

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам областных центров санитарно-эпидемиологического надзора Рязанцевой Г А (Тюменская область), Хазовой Т Г (Красноярский край), Смирновой H H (Курганская область), Щучиновой Л Д, Рыбину А А. (Республика Алтай), а также д м н , профессору Г H Леоновой (НИИЭМ СО РАМН, г Владивосток), д м н , профессору Т В Попонниковой (г Кемерово), д м н , профессору А.С Оберту (г Барнаул, Алтайский край) за содействие в сборе материалов Автор выражает благодарность д м н, профессору Токаревичу H К (НИИЭМ им Пастера, г Санкт-Петербург), директору НПФ «Омникс» Андрейчуку Ю В (г.Санкт-Петербург), д. б н Морозовой О В и сотрудникам Фоменко Н.В и Pap В А (НИИБОХ, г.Новосибирск) за содействие в выполнении молекулярно-генетических исследований Автор выражает особую благодарность научному консультанту д б н, профессору Э И Ко-ренбергу за оказанную помошь при написании работы

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Современное состояние природных очагов ИКБ в Сибири

Изучение природных очагов ИКБ в различных ландшафтных зонах является предпосылкой для эпидемиологического районирования на ландшафтной основе, ибо в свете теории природной очаговости болезней (Е H Павловский, 1944) к важнейшим компонентам географической среды, определяющим эпидемиологические черты и особенности территориального распространения инфекций, относится прежде всего географический ландшафт. Именно с ним связано существование природных очагов инфекционных болезней человека

Территории Омской, Новосибирской областей и Алтайского края расположены в подзонах южной тайги, осиново-березовых лесов, северной и южной лесостепи и степи Республика Алтай расположена в Западном звене горных поднятий юга Сибири - Алтайских горах, состоящих из ряда

хребтов и горных цепей, между которыми расположены остепненные котловины. Ландшафты группируются здесь в 4 вертикальные зоны: степную, лесную, альпийскую и нивальную Лесная зона Западно-Сибирской равнины подразделяется на подзоны северной, средней, южной тайги и осиново-березовых лесов

С целью изучения структуры и распространения природных очагов, определения степени эпидемической опасности территорий важное значение имеет определение численности, видового состава и зараженности иксодовых клещей боррелиями (табл 1)

Таблица 1

Уровни инфицированности клещей I регяи1саШ боррелиями в различных ландшафно-географических зонах

Ландшафтные зоны Зауралье Западная Сибирь Алтай

Южная тайга 48,1+6,9 47,4+2,6 -

Ленточные боры 32,4+2,6 - 41,6+9,9

Приобские боры - 35,2+2,2 -

Горная тайга - - -

Осиново-березовые леса 40,2+2,6 34,0+2,1 -

Северная лесостепь 27,8+1,8 21,4+3,1 -

Лесные участки южной лесостепи 11,9+2,0

Предгорная лесостепь - - 22,8+3,0

Южная лесостепь 1.7+1,2 - -

Типы населения иксодовых клещей и показатели их численности и инфицированности на различных в ландшафтном отношении территориях отличались. В регионах Зауралья и Западной Сибири наиболее высокие уровни инфицированности основного переносчика ИКБ отмечались в зоне южно-таежных лесов (48,1+6,9%), ще природно-климатические условия оптимальны для этого вида переносчиков и численность I регяи1саШ здесь наивысшая. Высокая частота выявления боррелий отмечена также в подзонах осиново-березовых лесов (40,2+2,6%) и северной лесостепи (27,8+1,8%). При анализе данных инфицированности клещей статистически значимых различий между южно-таежными стациями и зоной широколиственных лесов не установлено (1=1,48, р>0,05) Значительно ним® показатели зараженности иксодид оказались в северной и южной лесостепи, установлены статистически значимые различия (1=3,37, р<0,01) с зонами южной тайги и осиново-березовых лесов Наибольшая частота выявления инфицированных клещей боррелиями определялась на участках наблюдений с монодоминантным типом населения переносчика «персулькагус» (до 52,8±6,0%, р<0,05) по сравнению с бидоминантным типом населения пере-

носчика «персулькатус-ретикулятус» (до 32,6+4,3%, р<0,05), также ниже и численность клещей I регвикаШ на этих участках, чем в очагах с монодо-минангным типом населения переносчика «персулькагус»

При идентификации возбудителя на изучаемых территориях Зауралья, Сибири и Дальнего Востока установлена циркуляция в природных очагах ИКБ боррелий В а/геШ и В garlml, а также обоих геновидов одновременно (табл 2).

Таблица 2

Инфицированность клещей I регт1са1ия боррелиями (по данным ПЦР) на различных административных территориях

Административная территория (ландшафтная зона) Всего полож. (%+ш) Идентифицировано

В. afzelii (%+ш) В. garinii (%+m) Оба генотипа (%±ш)

Омская область (осиново-березовые леса) 32,5+2,6 22,2+2,3 6,5+1,4 2,8+0,8

Челябинская область (осиново-березовые леса) 48,1+6,9 32,7+6,5 9,6+4,1 5,8+3,2

Тюменская область (осиново-березовые леса) 37,3+5,9 31,3+5,7 10,4+3,7 4,5+2,5

Новосибирская область (южная тайга) 26,4+2,6 29,7+2,7 47,3+2,9 4,1+1,2

Томская область (южная тайга) 52,9+6,0 41,2+6,0 61,8+5,9 4,4+2,5

Красноярский край (лесостепь) 23,7+4,0 17,5+3,6 7,9+2,5 1,7±1,2

Алтайский край (ленточные боры) 45,0+5,0 34,0+4,7 16,0+3,7 5,0+2,2

Приморский край (тайга) 36,4+7,2 4,5+3,1 11,3+4,8 2,3+2,2

Характеристика сочетанности природных очагов ИКБ с очагами других трансмиссивных инфекций и риска заражения населения

На территории юга Западной Сибири отмечается практически повсеместная сочетанность природных очагов ИКБ и КЭ Имеются очаговые территории, характеризующиеся сочетанностью трех и более трансмиссивных инфекций (ИКБ, КЭ, КР, ГАЧ и МЭЧ) (табл 3)

Таблица 3

Спонтанная зараженность иксодовых клещей возбудителями ИКБ, КЭ, КР, ГАЧи МЭЧ

в Западной и Восточной Сибири

Ландшафтно-географические зоны Виды иксодовых клещей

Ьрегсика^и О.геСкикШв Б.таг^па^в Б.вИуагит О.пийаШ Н.сопсшпа

Лесная зона ЗападноСибирской низменности КЭ*, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ

Лесостепная зона Западно-Сибирской низменности КЭ*, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ КЭ, ИКБ

Степная зона Западно-Сибирской низменности КР*,КЭ КР,КЭ, Л^оуаса

Предгорная лесостепь (Алтайский край) КЭ*, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ КР КР КР КРДСЭ, ИКБ

Приобские боры предгорий Салаира КЭ, ИКБ, КР, ГАЧ, МЭЧ КЭ, ИКБ, КР

Участки горной тайги Алтая КЭ, ИКБ, КР, ГАЧ, МЭЧ

Участки горной степи Алтая КР, ИКБ, КЭ

Южная тайга Восточносибирской равнины КЭ*, ИКБ

Минусинская степная котловина (Красноярский край) КЭ*, ИКБ КР, ИКБ, КЭ*

* - данные по КЭ (Бусыгин Ф Ф с соавт ,1988)

* - данные по КР (Рудаков Н В с соавт,1988, 1995)

* - данные по Красноярскому краю (Ястребов В К, 1998, Хазова ТГ с соавт, 2001)

Эпидемический потенциал таких очагов не одинаков в различных ландшафтах и зависит от преобладания определенного вида переносчика и уровня его зараженности возбудителями этих инфекций

Разнообразие ландшафтных условий и местной фауны переносчиков на территории Алтайского края и республики Алтай обеспечивает существование сочетанных очагов трансмиссивных инфекций, прежде всего КЭ, ИКБ и КР. Результаты обследования больных показали различную степень эпидемического проявления природных очагов различных клещевых инфекций в Алтайском крае. Наиболее часто сероконверсию выявляли к возбудителям ИКБ (29,5+4,7%, р<0,05), на втором месте по частоте обнаружения антител стоит ГАЧ (23,7+5,2%, р<0,05), серопозитив-ные к вирусу КЭ сыворотки составляли 18,9±5,6% (р<0,05) и намного реже выявляли антитела к риккетсиям (9,6+2,8%, р<0,05) Определено соотношение различных вариантов микст-инфицирования. Наиболее часто наличие антител к боррелиям сочеталось с обнаружением антител к анаплазмам (15,8+4,5%, р<0,05), значительно реже выявляли сочетание ИКБ и КЭ (9,1+2,5%, р<0,05) и практически единичные случаи составляли сочетания ИКБ и КР (4,1+1,8%, р<0,05), КЭиКР (1,4+1,3%, р<0,05), и тройного сочетания - ГАЧ, ИКБ и КЭ (5,3±2,2%, р<0,05).

В Новосибирской области наиболее часто выявляли антитела к возбудителям ИКБ (41,2+3,0%, р<0,05), на втором месте по частоте обнаружения антител стоит КЭ (23,3+2,6%, р<0,05), частота сероконверсии к анаплазмам и новым риккетсиям группы КПЛ (ЯрА14, Бп828) практически одинакова (16,7+5,3 и 18,9±5,7% соответственно, р<0,05). Только в одном случае удалось обнаружить антитела класса ^М к моноцитар-ным эрлихиям (1,7+0,8%, р<0,05) в сочетании с ГАЧ и ИКБ. Микст-инфекции выявляли в следующих вариантах: наиболее часто ИКБ сочетались с ГАЧ (13,3+4,4%, р<0,05) и с КЭ (10,0±3,8%, р<0,05) случаев, сочетания ГАЧ с КЭ, ИКБ и КЭ с новыми видами риккетсиозов встречались лишь в единичных случаях

Как и на других административных территориях юга Западной Сибири, в Омской области на первом месте в структуре верифицированных случаев клещевых инфекций находится ИКБ (48,0+3,5%, р < 0,05), далее КЭ (27,0+3,1%, р < 0,05) и микст-инфекции КЭ+ИКБ (17,0±2,6%, р < 0,05). Характерно, что структура серологической верификации отличается отданных официальной регистрации, где показатели заболеваемости КЭ выше, чем ИКБ. ГАЧ в структуре клещевых инфекций составил 8,0+1,9%, в том числе в 3,0+1,2% в виде моноинфекции, в 3,0+1,2% - микст-инфекции с ИКБ и в 2,0+1,1% - с КЭ. Результаты проведенных исследований свидетельствуют об эффективности многоцелевого скрининга больных в условиях сочетанных очагов трансмиссивных инфекций.

Установлено наличие антител к нескольким патогенам одновременно у больных «клещевыми» инфекциями (микст-инфицирование). Антитела к возбудителям трех инфекций (ГАЧ, ИКБ, КЭ) одновременно в сыворотках крови больных выявляли в 2,8+1,2% (р<0,05) случаев из числа обследованных. Наиболее часто встречается микст-инфицирование возбудителями КЭ и ИКБ (21,1+5,1%, р<0,05) (табл.4)

Таблица 4

Частота микст-инфицирования больных различными видами возбудителей

Административная территория Обнаруж возб: ены антитела к нескольким ^дителям одновременно

ИКБ и КЭ ИКБ и ГАЧ КЭ и ГАЧ

Новосибирская область 10,0+3,8% 13,3+4,4% 1,7+1,6%

Алтайский край и Республика Алтай 19,6+5,8% 10,9+3,8% 2,2+1,5%

Омская область 25,3+5,7% 4,5+1,5% 2,8+1,2%

Всего 21,1+5,1% 7,4+3,2% 2,5+1,4%

Характерно, что в 56,8+1,9% случаев положительная сероконверсия к анаплазмам сочеталась с обнаружением антител к боррелиям и в 32,4+1,8% - к вирусу КЭ. Обнаружение антител к возбудителю ГАЧ в виде моноинфекции установлено только у 10,8±1,2% больных Отмечено, что микст-инфицирование ГАЧ + ИКБ встречается чаще, чем ГАЧ + КЭ.

На основании полученных данных можно сделать вывод о распространении различных возбудителей «клещевых» инфекций на юге Западной Сибири Анализ данных по всем изучаемым территориям юга Западной Сибири позволил установить широкое распространение возбудителей ИКБ и КЭ, частота выявления суммарных антител к боррелиям составляла 46%, к вирусам комплекса КЭ - 26% Частота выявления микст-инфицирования обоими возбудителями одновременно составляла 15%. Установлен высокий уровень микст-инфицирования возбудителями гранулоцитарного анаплазмоза и боррелиями и относительно низкая встречаемость ГАЧ как самостоятельного заболевания Контакт с моноцитарными эрлихиями по серологическим данным отмечается у больных крайне редко

Экспериментальное изучение возможного участия клещей

2>. геЛсиШш в циркуляции боррелий в природных очагах

Циркуляция боррелий в природных очагах ИКБ осуществляется клещами и мелкими млекопитающими Способность ктрансовариальной и трансфазовой передаче боррелий клещами I регзЫсаШя ранее изучали

(Балашов, 1998, Нефедова, 2005), что касается клещей В гейсиШш, данные о возможной передаче боррелий в цикле метаморфоза этого вида клещей в литературе не приводятся

Задачей экспериментальной работы явилось изучение возможной трансовариальной и трансфазовой передачи боррелий клещами В гейсиШш. С этой целью проведено три эксперимента с применением моделирования естественного цикла метаморфоза переносчиков.

Изучение вертикальной и горизонтальной передачи у спонтанно инфицированных клещей В гейси1аШ$ Исследование потомства спонтанно инфицированных В ггйсиЫт позволяет отметить следующее (табл 5)

Таблица 5

Эффективность трансовариальной и трансфазовой передачи боррелий у спонтанно инфицированных клещей В гейсиШш (методом РНИФ)

Фаза развития клещей Голодные Напитавшиеся Всего

Иссл Полож. %+т Иссл Полож %+т Иссл Полож. %+т

Личинки 220 7 3,2+1,2 180 20 11,0+2,3 400 27 6,8+1,3

Нимфы 72 2 2,8+1,9 78 4 5,1±2,6 150 6 4,0+1,6

Боррелии были обнаружены у всех фаз развития клещей У голодных личинок отмечен значительный разброс носительства боррелий. У напитавшихся личинок эта величина составляла от 10,5 до 13,3% и была достаточно однородной. Боррелий у сытых нимф регистрировали в 2 раза реже, чем у сытых личинок (в пределах одних и тех линий). Регистрируемая средняя частота выявления боррелий в имаго (без разделения по полу) примерно соответствовала уровню зараженности сытых нимф. По данным ПЦР в личинках В геПсиШШя обнаружена ДНК боррелий

Изучение возможности передачи боррелий от клещей I регвикаш клещам В гейсиШш при совместном питании. После совместного питания на одном животном В геПсиШт (самки и самца), в гемолимфе которых не было обнаружено боррелий, и инфицированной самки / регяиЬаШ, в потомстве обоих видов клещей обнаружены боррелии. Уровень пораженное™ боррелиями напитавшихся личинок (при пуловом кормлении) / регяи1саЫ5 и В геПсиШш был фактически идентичен и составлял 8,3% и 9,2% соответственно (табл.6).

Таким образом, боррелий обнаруживали как у голодных, так и у напитавшихся личинок и нимф. Низкий уровень выявления боррелий при исследовании голодных особей и повышение инфицированности после кормления может быть связано как с так называемым механизмом реактивации, так и с обменом между преимагинальными фазами развития (ли-

Таблица 6

Эффективность трансовариальной и трансфазовой передачи боррелийу клещей О гейси1аШ& инфицированных при совместном питании с имаго I регзи1саШя

Фаза Голодные Напитавшиеся Всего

развитии Иссл Полож %+ш Иссл Полож %+т Иссл Полож %+ш

клещей

D. reticulatus

Личинки 36 0 0 108 10 9,3+2,8 108 10 9,3+2,8

Нимфы 36 1 2,8+1,9 18 3 16,7±8,4 18 3 16,7+8,4

Имаго 61 6 9,8+3,8 - - - 61 6 9,8+3,8

I. persulcatus

Личинки 36 о о 36 3 8,3+4,6 72 3 4,2+2,4

чинки или нимфы) при пудовом кормлении. Отмечено некоторое снижение частоты обнаружения боррелий в процессе метаморфоза от личинок к нимфам. Показана принципиальная возможность вертикальной передачи боррелий этим видом клещей от имаго до имаго.

В результате проведенных исследований показана принципиальная возможность трансовариальной и трансфазовой передачи боррелий клещами D reticulatus, как у спонтанно инфицированных клещей этого вида, так и в случае их экспериментального заражения штаммом боррелий. Вероятно, боррелии в организме клещей D reticulatus сохраняются, но интенсивность накопления низка В пользу этого предположения говорит и то, что интенсивность инфицирования боррелиями на всех этапах исследования D reticulatus имаго родительских поколений, личинки и нимфы (голодные и напитавшиеся), имаго дочернего поколения характеризуется низкими показателями - во всех случаях в РНИФ регистрировали единичные боррелии в нескольких полях зрения. В результате идентификации с определением нуклеотидных последовательностей установлено наличие в клещах D reticulatus ДНК боррелий комплекса Borreha burgdorferi sensu lato Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что клещи D reticulatus могут вовлекаться в процесс циркуляции боррелий в природных очагах ИКБ, но не имеют существенного значения для его поддержания.

В Западной Сибири в лесостепных ландшафтах, характеризующихся совместным обитанием клещей I persulcatus и D reticulatus, в осенние месяцы ежегодно выявляют случаи трансмиссивных заболеваний, среди которых нами подтверждены и случаи ИКБ, которые, очевидно, могут быть связаны с клещами рода Dermacentor. При изучении инфицированное™ боррелиями клещей, снятых с пациентов, методом ПЦР установлена зараженность этого вида клещей в 23,1%, однако в биологическом материале от людей боррелии обнаружены только в 3,6% У заболевших

в дальнейшем развилась характерная для ИКБ клиника с появлением эритемы, выявлено нарастание титров антител в РНИФ до 1/80, получены положительные результаты в ПЦР, генотипирован вид возбудителя - тот же геновид был детектирован и в клещах

Молекулярно-генетические методы в изучении ИКБ в Сибири

В последние годы молекулярно-генетические методы находят все большее применение в изучении природных очагов инфекций и диагностике инфекционных заболеваний Задачей исследований являлось изучение инфицированности боррелиями иксодовых клещей иммунологическими и молекулярно-биологическими методами, а также молекулярно-генетическая характеристика штаммов боррелий, изолированных из клещей в природных очагах Западной Сибири.

Геновидовая характеристика боррелий, циркулирующих в природных очагах ИКБ. Иксодовые клещевые боррелиозы вызывают бор-релии комплекса Borreha burgdorferi sensu lato. В России основное эпидемиологическое значение имеют В afzelii и В garinii, которые широко распространены в пределах лесной зоны. С применением комплекса мо-лекулярно-биологических методов нами проведено изучение геновидо-вого состава боррелий в индивидуальных экземплярах клещей I persulcatus, D reticulatus, Н concinna, собранных в различных ланд-шафтно-географических зонах отдельных административных территорий Западной, Восточной Сибири и Дальнего Востока.

С наибольшей частотой ДНК боррелий выявляли в клещах I persulcatus (27,4+2,5%, р<0,05), инфицированность других видов была существенно ниже По результатам исследований В burgdorferi sensu stricto не выявлены, в клещах I persulcatus обнаружены боррелии гено-видов В afzelu (14,6+1,8%, р<0,05) и В garinn (3,6±1,2%, р<0,05). В клещах родаHaemaphysalis обнаружены только В afzelii (7,4+3,2%), рода Dermacentor В afzelii (7,5±3,1%, р<0,05) и В garinn (0,7±0,7%, р>0,05)

Выявлены особенности распространения геновидов боррелий в различных типах природных очагов Западной Сибири В очагах с бидоми-нантным типом населения переносчиков «I persulcatus, D reticulatus» доля В. garinn существенно ниже (14,4+2,2%) в сравнении с монодоминантным типом населения переносчика«/ persulcatus» (42,4+3,8%) Доля В afzelii в обоих типах очагов существенно не отличается (31,4+4,3 и 36,9+4,5% соответственно) (рис. 1). Данное соотношение, вероятно, должно отражаться на этиологической структуре заболеваний ИКБ в различных ландшафтно-географических зонах регионов Сибири.

Представляют существенный интерес полученные данные об обнаружении ДНК боррелий в клещах D reticulatus на юге Западной Сибири

монодоминантный тип "парсулькатус"

бидомнкаягный тип 1 пе рсу л ька ту с-р е ти куля туе"

Elgirlnll 42,40% j

Rafztlil

31/40%

об« ГвНОТИПЯ

4,00%

Ш7

а 4,60%

оба

Рис. J. Сравнительная структура геноцидов боррелий в различных типах очагов

и Н. concinna на юге Красноярского края, поскольку (тещи рода Haemaphysalis широко распространены па Дальнем Востоке России, а Dermacentor на территориях юга Восточной и Западной Сибири. Обращает на себя внимание, ч то зараженные экземпляры клещей этих видов обнаружены, как правило, в очагах с совместным обитанием клещей /. persulcatus. Заражение боррелиями клещей различных видов возможно при совместном питании на мелких млекопитающих - про кормителях различных фаз развития клещей. Зараженность различных видов клещей, не являющихся основными для той или иной инфекции, во много раз ниже, тем не менее, есть вероятность передачи возбудителя человеку при присасывании.

Нуклеотидные последовательности пяти исследуемых проб ДНК из клещей D. reticulatus, собранных в Омском, Новосибирском и Су зу не ком районах (лесостепная зона Западной Сибири) относятся к комплексу Borrelia burgdorferi Sensu lata и имеют высокую степень генетического сходства по межгенному спейееру 5S-23S с пробами ДНК, выделенными от клещей I. ricinus в Восточной Европе и на Украине (Derdakova, 2003; Nefedova, 2004) (рис.2). ДНК боррелий с подобной структурой меж ген-но по спейсера 5S-23S была детектирована в изоляте из кожного биот ага пациента с эр и те мной формой ИКБ (Wang, 1999).

Нуклеотидные последовательности двух исследуемых проб ДНК из клещей D. reticulatus, собранных в Сузунском районе Новосибирской области (лесостепная зона) относятся к комплексу Borrelia garinii NT29. Выявление ДНК этих боррелий методом ПЦР позволяет предположить, что клещи D. reticulatus способны воспринимать боррелий этой группы, а возможность сохранения и векторной передачи боррелий данным видом иксодид требует дополнительного изучения.

Bonefe sp.Dr-22* (AY540051)

_Bxefiasp. 1-77 «(«97994)

Bonebaspi lr-S215(W573193)

-B3Tefcasp.A14S(U7S616)

Ва£азй\®161 (4*032913)

Рис 2 Дендрограмма сходства Западно-сибирских изолятов (*)

с зарегистрированными в GenBank, основанная на анализе нуклеотидных последовательностей межгенного спейсера 5S-23S ДНК В burgdorferi s I В скобках приведены номера, под которыми последовательности зарегистрированы в GenBank

Результаты изучения изолятов боррелий. Первые изоляты борре-лий были выделены в 1991г. на базе НИИЭМ им Н.Ф Гамалеи РАМН в лаборатории переносчиков инфекций совместно с сотрудником лабора-

Таблица 7

Геновидовая характеристика выделенных изолятов борелий

Административная территория, населенный пункт Источник Автор, год Геноввд боррелий

Курганская область, Шадринский р-н, д Малая Погорелка I persulcatus I persulcatus I persulcatus Горелова Н Б, Рудакова С.А 1991 В afielii В garinii NT29 В garinii NT29

Новосибирская обл, Тогучинский р-н, д.Верхний Карасук I persulcatus I persulcatus Горелова Н Б, Рудакова С.А. 1991 В garinu NT29 В garinii NT29

Омская область, Омский район, с Подгородка I persulcatus I persulcatus I persulcatus I persulcatus Рудакова С А 2002 Рудакова С.А 2004 В garinii NT29 В garinii NT29 В garinii NT29 В garinu NT29

Омская область, Тюкалинский район оз Тенис / persulcatus Рудакова С А 2002 В garinii NT29

Томская область, Томский район д Холдеево I persulcatus Рудакова С.А. 2003 В garinii NT29

Новосибирская область, Усть-Таркский район / persulcatus I persulcatus Рудакова С.А 2004 В garinii NT29 В garinii NT29

—Bgannü (AY429015) Bgannrt Dr-28* 0<ШШ5О) Bgannii NT29 (L30130)

-Вдэпгй 200047 (L30119)

тории 11.Б.Гореловой. В 2002-2004гт. в Омском НИИПИ из клещей 1. persulcatus получено 8 штаммов боррелий: Р2, РЗ1, РЗЗ, Р35- Омская область, Омский район (южная лесостепь), Р12 — Омская область, Тюка-лииский район (северная лесотепь), Т6 - Томская область, Томский район (южная тайга), У 8, У10 — Новосибирская область, Усть-Таркский район (северная лесостепь) (табл. 7). Изолировать боррелий из клещей D. reliculatus путем посева на среду BSK-H не удалось.

Для проведения типиронания боррелий в изолятах использовали двух-раундовую П ЦР с праймерами, соответствующими консервативным участкам генов 5S и 23S РНК с последующим определением нуклеотидной последовательности или анализом полиморфизма длин фрагментов рее-

1 2 3 4 5 6 7

Фото, 1. Электрофореграмма продуктов рестрикции ампликонов межгенного участка 5S-23S рРНКДНК В. burgdorferi в 10% ПААГ; 1 - маркер pBR 322/ BsuRI «СибЭнзим» (г. Новосибирск); 2-В-31;

3 — исходный амплишн;

4 —молекулярный маркер Hi-Lo™ ДНК «Minnesota Molecular Inc.» (США), размеры фрагментов 50, 100,200;

5 - В. garinii NT 29 (изолят Р2);

6 - изолят Р12;

7-Я afzelii(изолят 1552, Э.И.Корснберг: Москва);

трикции (ПДРФ) полученного фрагмента ПЦР (фото 1). Для проведения анализа ПДРФ продукты амплификации гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Tru91 (Postic, 1994) Разделение фрагментов ДНК осуществляли в 12% полиакриламидном геле (ПААГ). Для определения размеров фрагментов рестрикции использованы молекулярные маркеры Hi-Lo™ ДНК (Minnesota Molecular Inc , США) и pBR322/BsuRI (СибЭнзим, Новосибирск)

Геноеидовая характеристика возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов. В последние годы все большее значение в диагностике инфекционных заболеваний придается ПЦР, позволяющей выявлять в крови больных ДНК (РНК) возбудителя Трудности культивирования борре-лий и низкая концентрация возбудителя в клиническом материале определяют потенциальные преимущества ПЦР в качестве метода экспресс-диагностики боррелиозов. В этой связи использование ПЦР в диагностике ИКБ помогает существенно расширить возможности исследований. Задачей настоящего раздела явилась верификация диагнозов и изучение геновидового спектра боррелий у больных ИКБ на отдельных территориях юга Западной Сибири (Омской, Новосибирской областей и Республики Алтай) с использованием молекулярно-генетических методов

Из числа проб крови больных, положительных в ПЦР, В garinu идентифицированы в 29,4+7,8% образцов, В afzelu - 20,6+6,9%, оба генотипа одновременно - в 23,5+7,3% случаев и не идентифицировано до вида 26,5-7.5% Следовательно, у больных ИКБ в Западной Сибири установлено наличие двух геновидов боррелий и их микст-форм У лабораторно верифицированных диагнозов ИКБ в 11,7+3,2% случаев получены положительные результаты только в ПЦР, в 37,3+4,8% - в ПЦР и РНИФ, в 51,0+5,0% - только в РНИФ (обследованные преимущественно в отдаленные сроки) У части больных, серонегативных в РНИФ, применение ПЦР в ранней стадии болезни (первая неделя) позволило диагностировать заболевание. У больных ИКБ с положительными результатами исследования крови в ПЦР в 63,2+4,8% выявляли положительные результаты в РНИФ в титрах 1:80 и выше, у больных с отрицательными результатами ПЦР в 61,5±4,8% титры антител в РНИФ составляли 1 40 и ниже.

Полученные результаты подтверждают, что основным переносчиком боррелий в природных очагах Сибирского региона являются клещи I persulcatus, а геновидами боррелий - В afzelu (27,4%) и В garinu (14,6%). Впервые выявлены различия в доминировании тех или иных геновидов боррелий в различных типах природных очагов В очагах с монодоминантным типом населения переносчика / persulcatus, преобладает геновид В garinu, в очагах с бидоминантным типом населения переносчиков I persulcatus и D reticulatus существенно превалирует геновид

В. afzelii. Впервые методом ПЦР выявлена инфицированность боррелия-ми клещей D. reticularis и Н. concinna и установлена их геновидовая принадлежность. Установлены существенные различия в инфицированнос-ти переносчиков возбудителями клещевых инфекции, потенциально опасных для здоровья людей: вирусами комплекса клещевого энцефалита, бор-релиями комплекса Borrelia burgdorferi sensu Into, эрлихнями и анаплаз-мами, риккетсиями группы КИЛ. Проведена оценка чувствительности и специфичности метода ПЦР в диагностике ИКБ. Установлено распространение двух геновидов боррелий (В. garinii и В. afzelii) и их М икст-форм у больных ИКБ в Западной Сибири.

Анализ многолетней заболеваемости ИКБ на территории Сибирского Федерального округа

За весь период с начала регистрации заболеваемость ИКБ но Сибирскому ФО более чем в два раза превышает показатели по РФ (10,08 и 4,40 соответственно, р<0,05). В целом за анализируемый период отмечается общая тенденция повышения заболеваемости ИКБ, обусловленная не только природными, но и социальными факторами. При этом наблюдалось несколько пиков заболеваемости боррелиозом в России (рис.З). Резко, почти в 2 раза по сравнению с предшествующими годами, выросла заболеваемость в 1996г. За! 994-1995гп показатель заболеваемости на 100 тысяч населения составляли 2,72 и 2,78, а в 1996г. - 5,49 (Тпр.+21,1 %, р<0,01). После снижения заболеваемости в 1997г. наблюдался рост в 1998 и 1999гг. (показатели заболеваемости 5,9 и 5,78 соответственно) (Тпр.+ 13,5%, р<0,01). Следующий подъем заболеваемости наблюдался в 2003п, показатель заболеваемости 6,06 (Trip.+9,6%, р<0,01). Первый

1992 1993 1994 1995 1996 1997 199В 1 S99 2000 2001 2002 2003 2004

Рис. 3. Заболеваемость ИКБ в Российской Федерации в 1992- 2004 гг.

подъем заболеваемости можно объяснить улучшением лабораторной диагностики. Второй и третий подъемы, возможно, связаны с циклическими процессами в природных очагах.

Нами проведен сравнительный анализ заболеваемости ИКБ в различных регионах Российской Федерации с целью установления рангового положения Сибирского ФО по уровню заболеваемости данной инфекций (рис.4). Установлено, что из семи федеральных округов РФ, учитываемых в информационном бюллетене инфекционной заболеваемости, Сибирский ФО занимает третье место среди регионов России, уступая только Уральскому и Северо-Западному ФО.

Рис, 4. Среднемноголетние показатели заболеваемости ИКБ па 100 тысяч населения по федеральным округам за ¡992-2004гг.

В Сибирском ФО с 1992 по 2004 год зарегистрировано 15 тысяч случаев заболеваний ИКБ со средними показателями заболеваемости 10,08 на 100 тысяч населения. Динамика заболеваемости ИКБ в Сибирском ФО в целом за период наблюдения характеризуется четкими пиками подъема (1995, 1998 и 2001) и снижения ([ 997,2000 и 2003). За период с 1992 по 1998г. заболеваемость имеет четкую тенденцию к повышению (с 7,6 до 15,8 на 100 тысяч населения (Тпр.-Н2,2%, р<0,01), с наибольшим уровнем заболеваемости в 1995 году (22,8 на 100тысяч населения), чтосвя-за! ю, в первую очередь, с улучшением качества лабораторной диагностики и увеличением количества обследованных на ЙКБ. В периоде ! 999 по 2004гг. уровень заболеваемости стабилизировался и даже имеет тенденцию к снижению (с 10,01 до 7,7 на 100 тысяч населения (Тсн.-4,5%, р<(),01).

В Сибирском регионе за анализируемый период наиболее высокие среднемноголетние показатели заболеваемости отмечены в Томской области (48,8 на 100 тысяч населения) и Красноярском крае (10,1), затем следует Кемеровская (6,5), Иркутская (6,6), Новосибирская области (5,6) и Республика Алтай (5,4), и наиболее низкие показатели имеют место в Омской области (1,04) и Алтайском крае (0,7 на 100 тысяч населения). Различия в уровнях заболеваемости по отдельным территориям могут объясняться как разной активностью природных очагов в различных кли-мато-географических условиях сравниваемых территорий, так и различным уровнем регистрации. Так, Томская область расположена в зоне южнотаежных лесов, тогда как большая часть территории Омской области находится в лесостепной и степной зонах. В Красноярском крае и Иркутской области также имеют место территориальные особенности распространения очагов - случаи заболеваний регистрируются в основном в южных районах, расположенных в лесных ландшафтах.

Характерной чертой эпидемиологии ИКБ является большая доля городских жителей и детей в структуре заболеваемости. На долю горожан приходится 82,5-85% заболевших ИКБ в РФ. В Сибирском регионе соотношение городского и сельского населения среди заболевших в различных областях отличается Преобладание в структуре заболевших городских или сельских жителей объясняется как природными, так и социальными факторами. Ряд крупных городов Сибири и Урала расположены непосредственно на очаговых территориях с высоким риском заражения ИКБ и более интенсивным контактом горожан с клещами вследствие освоения садово-огородных участков и посещения леса с целью отдыха, что и обусловливает большую долю горожан при этой инфекции. Возрастная структура заболеваемости ИКБ характеризуется преобладанием случаев заболеваний среди взрослого трудоспособного населения (20 - 59 лет), на долю которого приходится 48,1% Сравнительно большую группу больных составляют дети (до 30%), повысилась доля лиц пожилого возраста (до 12%) Указанное возрастное распределение определяется более частыми контактами этих лиц с природными очагами инфекции Среди профессиональных групп наибольший процент серологически верифицированных случаев ИКБ приходится на рабочих и служащих (34,8+3,2%), учащихся школ и ПТУ (21,3±2,5%), пенсионеров и людей, занятых домашним хозяйством (18,1+1,9%, р<0,05) и дошкольников (15,5+1,4%), тогда как на лиц, профессионально связанных с лесом, приходится лишь 1,9+0,8%. Заражение населения происходит при присасывании клещей преимущественно при посещении леса по бытовым причинам.

Эпидемиологические особенности инфекции, передающихся иксодовымн клещами

В Сибирском ФО среднегодовые показатели заболеваемости КЭ (16,1 на 100 тысяч населения) почти в два раза превышают показатели заболеваемости ИКВ (8,2 на 100 тысяч населения) р<0,01. В 1999-2004гг. доля Сибири в общей заболеваемости КЭ составляло 56,3%. Ежегодно в этот период в Сибири показатели заболеваемости КЭ на 100 тысяч населения варьировали от: 10 до 18,2, тогда как среднероссийские находились в пределах от 3,2 до 6,7, т.е. показатели заболеваемости КЭ в Сибири были в 1,4 - 4,0 раза выше средкефедеральных(р<0,01). Как в целом по России, так и в Западной Сибири максимальные показатели заболеваемости КЭ приходятся на период с 1990 по 2004гг. В 1991 -1994гг. отмечалось возрастание эпидемиологического значения Западной Сибири и снижение доли Уральского региона. В период 1999-2004гт. возрастает эпидемиологическое значение Восточной Сибири с ростом показателей заболеваемости на 100 тысяч населения с 6,3 до 31,8 (в 5 раз), что превышает уровень заболеваемости в Западной Сибири и соответствует показателям Уральского ФО. Соотношение заболеваемости КЭ и ИКБ на отдельных административных территориях Сибирскою Федерального округа отличается (рис.5).

Томская область

Омская область С™)4.28 Р О Я7

11: си6и{-;:;область Кемеровская область иркутская область Красноярский край

Алтайский «рай д д ^д Республика Алтай

Рис.5. Среднемпоголетние показатели заболеваемости КЭи ИКБ на 100 тыс. населения на территориях Сибирского ФОв 1992-2004гг.

Наиболее высокие показатели заболеваемости КЭ и ИКБ отмечены в Томской, Иркутской областях, Красноярском крае и Новосибирской области. Заболеваемость КЭ в различной степени преобладает на веехтер-

риториях Сибирского ФО, за исключением Томской области, где выше заболеваемость ИКБ

На юге Западной Сибири имеются территории с сочетанными очагами трех трансмиссивных инфекций ИКБ, КЭ и КР Клещевой риккетсиоз в последние десятилетия можно по праву отнести к «re-emerging» инфекциям, поскольку, начиная с 1979 года, отмечается беспрецедентный рост заболеваемости более чем в 10 раз Наиболее существенный рост в 80-е и 90-е годы отмечен в Западной Сибири (Алтайский край, Республика Алтай) и на Дальнем Востоке (Rudakov N V et al, 1996, 1999), в последние годы сохраняется стабильно высокий уровень заболеваемости Наиболее высокие показатели заболеваемости в Западной Сибири отмечены в Алтайском крае и Республике Алтай (более 50 на 100 тысяч населения), в Восточной Сибири — в Хакасии, Тыве, Усть-Ордынском АО Бурятии (2155 на 100 тысяч населения), на Дальнем Востоке России - в Хабаровском и Приморском краях (более 10) Более 80% случаев КР приходилось на два региона - Алтайский и Красноярский края, в том числе на Алтайский край - более 50% случаев этой инфекции в Российской Федерации Две территории Западной Сибири характеризуются самыми высокими показателями заболеваемости КР: Республика Алтай - 54,2-90,9 на 100 тысяч населения и Алтайский край - 24,3-65,3 Стабильно высокие показатели заболеваемости КР в республике Алтай связаны с высоким лоймопотенциалом горностепных: природных очагов с переносчиком D nuttalh

Анаплазмы геногруппы гранулоцитарного анаплазмоза человека (ГАЧ) впервые были выявлены в клещах I persulcatus в Балтийском регионе России (Дубинина Е В , 1999, Alekseev A N., 2001) и граничащих с Российским Дальним Востоком северо-восточных провинциях Китая (Сао W, 2000), в дальнейшем - в Алтайском, Приморском (Шпынов С Н, 2002) и Хабаровском (Медянников О.Ю , 2001) краях, Пермской и Новосибирской областях (Telford S et al, 2002, Morozova О , 2002) Случаи ГАЧ у людей были выявлены нами ретроспективно в Алтайском крае в 1999г., в Новосибирской области в 2002г (Рудаков Н В и др , 2001,2002) На территории Алтайского края на фоне роста заболеваемости КР часть случаев серонегативного КР была верифицирована с использованием реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) как ГАЧ (Рудаков Н В , 2001) Можно считать достаточно вероятным распространение возбудителя ГАЧ в России в пределах всего ареала клещей I persulcatus Несомненна необходимость дифференциации случаев ГАЧ от других распространенных клещевых инфекций - прежде всего с КЭ, ИКБ и риккетсиозами Одной из задач наших исследований являлось усовершенствование алгоритмов дифференциальной лабораторной диагностики клещевых инфекций (КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ) в условиях сочетанности природных очагов на различных территориях юга Западной Сибири

В период с 2002 по 2005гг. проведено изучение иммунного ответа к данным патогенам у заболевших, имевших в анамнезе контакт с клещами. В Новосибирской области из 260 обследованных антитела к вирусу КЭ обнаружены у 23,3+2,6% (р<0,05) лиц, антитела к боррелиям - у 45,0+3,0% (р<0,05), к ГАЧ - у 16,7+2,3% (р<0,05), к МЭЧ-у 1.7+0,8% (р<0.05). В Алтайском крас из 271 обследованных антитела к вирусу КЭ обнаружены у 32,6+2,8% заболевших, антитела к боррелиям-у 47,8+3,0% (р<0,05), кГАЧ—у 15,2+2,2% (р<0,05). В Омской области из 1255 обследованных антитела к боррелиям обнаружены у 32,7+1,3% (р<0,05) больных, к вирусу КЭ антитела обнаружены у 28.0+1,3% (р<0,05) обследованных больных, к ГАЧ - у 8,5+0,8% (р<0,05) (рис.6).

При анализе случаев заболеваний у лиц, серопозитивных к различным патогенам, установлены отличия в возрастной структуре заболевших КЭ и ИКБ по сравнению с ГАЧ: антитела к ИКБ и КЭ выявляются у больных во всех возрастных группах (от 1 года до 80 лет), в то время как антитела к ГАЧ обнаружены только у больных в возрасте 20 лет и старше.

□ Новосибирск Я Алтай □ Омск

Рис. 6. Частота выявления антител к возбудителям клещевых инфекций у больных на территориях юга Западной Сибири

Наибольшая доля больных, серопозитивных к антигенам вирусов комплекса клещевого энцефалита и возбудителям ИКБ, приходилась на взрослое трудоспособное население (31 -50 лет), в том числе 35,7+2,7% (р<0,05) -при КЭ и 31,2+2,6%(р<0,05)- при ИКБ. При ГАЧ существенная доля

лабораторно верифицированных случаев заболеваний приходилась на возрастную группу от 51 до 60 лет(33,3+2,7%, р<0,05)

Основные направления совершенствования эпидемиологического надзора за клещевымн инфекциями в Западной Сибири

Б ЛЧеркасский (1983) выделяет в системе эпидемиологического надзора за зоонозами два структурных блока 1) оперативное слежение за заболеваемостью животных и людей, основной задачей которого является получение оперативной информации об эпизоотолого-эпидемиоло-гической обстановке в целях принятия мер по снижению интенсивности или ликвидации эпидемического и эпизоотического процессов, 2) углубленное эпидемиологическое наблюдение за эпидемическим и эпизоотическим процессами, основной задачей которого является поиск рациональных и высокоэффективных методов профилактики и борьбы с зоонозами.

Применительно к трансмиссивным природно-очаговым инфекциям, передаваемым иксодовыми клещами, информационные потоки должны быть подразделены на две основные группы: экологическую и эпидемиологическую Первая группа сведений должна характеризовать особенности природных очагов трансмиссивных инфекций (особенности экологии переносчиков, хозяев и возбудителей, типы населения основных переносчиков и хозяев, степень интенсивности эпизоотического процесса) и является по своему содержанию мониторингом природных очагов Вторая группа сведений должна характеризовать уровень заболеваемости, ее территориальное распределение, частоту контактов населения с переносчиками, определение степени риска заражения, данные об иммунологической структуре населения

Основными направлениями эпидемиологического надзора являются оперативный и ретроспективный эпидемиологический анализ, эпидемиологическое слежение (мониторинг) за очаговыми территориями, включая эпидемиологическую разведку и углубленное изучение очагов Оперативный анализ имеет своей целью динамичную оценку состояния и тенденций развития эпидемического процесса, прежде всего в «группах риска» Он складывается из эпидемиологического обследования случаев заболеваний изучаемой инфекции и анализа заболеваемости в конкретном населенном пункте, районе, области Основной задачей ретроспективного эпидемиологического анализа является оценка состояния и тенденций развития эпидемического процесса, призванная обеспечить выявление территорий риска, времени риска и факторов риска В результате ретроспективного анализа характеризуется интенсивность эпидемического процесса в очагах Оперативный и ретроспективный анализы логически

связаны между собой и являются основой для прогноза Материалы анализа используются для прогнозирования проявлений эпидемического процесса, в частности материалы оперативного анализа - для ближайшего, краткосрочного прогноза, а ретроспективного - для долгосрочного прогноза.

Целью мониторинга природных очагов является получение информации о состоянии и закономерностях развития паразитарных систем во времени и пространстве Применительно к иксодовым клещевым борре-лиозам осуществляется слежение за активностью природных очагов, включающее мониторинг переносчиков, изучение циркулирующих штаммов боррелий, сероэпидемиологические и клинические наблюдения в очагах В процессе мониторинга выясняется состояние природных очагов ИКБ на конкретной территории, динамика их изменений под влиянием различных факторов (биотических, абиотических, антропических). Социально-экологический мониторинг заключается в слежении за социальными и природными факторами, способными влиять на эпидемический или эпизоотический процессы. К специфическим для трансмиссивных инфекций факторам относят, природно-преобразовательную деятельность, наличие на территории природного очага детских оздоровительных учреждений, туристических баз, зон отдыха, развитие садово-ого-роднической деятельности, организацию и проведение вакцинации и экстренной профилактики КЭ и ИКБ, диспансеризацию и т.д. К данному мониторингу относят и сбор информации об основных природных факторах, влияющих на эпидемический и эпизоотический процессы при трансмиссивных инфекциях - метеорологических (температура воздуха, влажность) и ландшафтно-географических, определяющих приуроченность природных очагов КЭ и ИКБ к лесным массивам

Диагностическая подсистема включает в себя предэпидемическую диагностику, т.е. своевременное обнаружение предпосылок и предвестников осложнения эпидемической ситуации; прогнозирование эпидемической ситуации Сравнительная эпидемиологическая диагностика эпидемического и эпизоотического процессов в сочетанных очагах КЭ и ИКБ должна выявлять сходство и различия в характеристике паразитарных систем, условий заражения, уровне заболеваемости и смертности, а также времени, территориях и группах риска (В К.Ястребов, 1998) В ходе оперативного и ретроспективного эпидемиологического анализа дается обоснованное определение типа эпидемического процесса по условиям заражения и путям передачи Правильно организованная информационно-диагностическая деятельность обеспечивает обоснованные управленческие решения, направленные на факторы, поддерживающие эпидемический процесс в сочетанных природных очагах

Алгоритмы проведении лабораторной диагностики и обоснование

дифференцированного подхода к профилактике инфекций, передающихся иксодовыми клещами, в Западной Сибири

На территории Западной Сибири установлено наличие сочетанных природных очагов инфекций с трансмиссивным механизмом передачи, в связи с чем определен риск заражения людей одновременно несколькими возбудителями инфекций, что диктует комплексный подход к проведению лабораторной диагностики и профилактических мероприятий Для оперативного и эффективного проведения специфических профилактических и терапевтических мероприятий разработаны алгоритмы экспресс-индикации различных патогенов в снятом переносчике (в течение 3 суток от момента присасывания) С целью ранней индикации возбудителей инфекций в организме пациента может быть исследована кровь или биоптат из места присасывания клеща В случае получения положительного результата, показано проведение экстренных профилактических мероприятий (введение специфического гамма-гаобулина, антибиотикопрофилактика) Если результат исследований отрицательный, может быть проведено повторное исследование сыворотки крови с интервалом 10-14 дней

Лабораторная диагностика боррелиозной инфекции включает в себя ряд тестов, как прямых (микроскопический, культуральный и ПЦР методы), так и непрямых - серологических (иммунофлуоресцентный, имму-ноферментный, иммунный блотгинг) методов Существенное значение в лабораторной диагностике ИКБ имеет применение различных лабораторных тестов в зависимости от сроков развития инфекционного процесса В стадии инкубации и в первые дни развития заболевания наибольшая диагностическая значимость принадлежит методу ПЦР при исследовании кожного биоптата с места присасывания клеща Так как при ИКБ возбудитель в первые дни локализуется в кожных покровах в области присасывания клеща и в крови может не обнаруживаться В острой стадии инфекционного процесса, когда возбудитель попадает в кровь, имеют значение метод ПЦР (при исследовании плазмы крови, ликвораи пункгатов лимфатических узлов) и ИФА для выявления иммуноглобулинов класса М В период разгара болезни и стадии реконвалесценции диагностическую ценность приобретают серологические методы диагностики (РНИФ, ИФА-^М и ^в), позволяющие выявлять антитела, образующиеся к антигенам боррелий Достоверным лабораторным подтверждением диагноза считается не менее чем 4-х кратное нарастание титра антител при исследовании парных сывороток, полученных с интервалом не менее 3-4 недель В хронической стадии заболевания, как правило выявляются высокие титры антител класса в, и может быть положительной ПЦР как при исследовании крови, так и при исследовании биоптатов из мест возможной локализации возбудителя (внутрисуставная жидкость, кожный био-

птат) Определение антител к белкам боррелий является основным способом лабораторной диагностики боррелиозов.

Интерпретация результатов серологического исследования при отсутствии эпидемиологического анамнеза и стертой клинической картине заболевания существенно осложняется. Кроме того, жители эндемичных по ИКБ территорий нередко являются серопозитивными, поэтому частота обнаружения антител в крови пациентов может быть значительной. В этой связи необходимо проведение подтверждающих тестов для установления истинного диагноза. Основным скрининговым тестом в этой схеме может являться РНИФ или ИФА Исследуемые образцы с положительными или сомнительными результатами подлежат дополнительному исследованию методом иммунного блоттинга.

Наличие сочетанных природных очагов клещевых инфекций увеличивает риск заражения людей одновременно несколькими патогенами, усложняет их диагностику и профилактику и требует комплексного подхода Разработаны алгоритмы проведения диагностических и экстренных профилактических мероприятий в отношении комплекса клещевых инфекций (схема 1).

Схема 1

Алгоритм обследования лиц, обратившихся с присасыванием клеща

В работе используется принцип дифференциальной экспресс-индикации зараженности клеща, напавшего на человека, и рекомендации вида специфической профилактики, в зависимости от результатов исследования на антиген вируса КЭ (ИФА), боррелии (ПЦР), риккетсии (ПЦР), эр-лихии/анаплазмы (ПЦР), бабезии (ПЦР)

С целью усовершенствования тактики проведения экстренных диагностических и профилактических мероприятий в отношении лиц, обратившихся по поводу присасывания иксодовых клещей, было проведено изучение инфицированности различными патогенами клещей, снятых с людей, а также биологических материалов (кровь, южных биоптатов) этих лиц

При исследовании клещей/ регяикаШя и крови лиц, подвергшихся укусам переносчиков этого вида установлено уровни вирусофорности клещей вирусом КЭ иантигенемииулюдейсоставили38,2+2,8% и38,1+2,8% соответственно Частота выявления борреяийв клещах/регзикаШ и крови людей методом ПЦР составила 23,5+2,4% и 2,6+0,9% соответственно Полученные результаты подтверждают данные о различной локализации возбудителей в начальной стадии инфекционного процесса в организме человека Так, при КЭ вирус быстро проникает в кровь, тоща как при клещевом боррелиозе возбудитель в первые дни локализуется в кожных покровах в области присасывания клеща и в крови не обнаруживается. Это подтверждают положительные результаты исследования кожных биоптатов в ПЦР, полученных у лиц, в снятом клеще у которых обнаруживали боррелий Выявлены микст-инфицированные переносчики, зараженные вирусом КЭ и боррелиями одновременно, они составили 5,9%

При тестировании клещей / рег$и1са(ж на зараженность риккетсиями, анаплазмами/эрлихиями и бабезиями получены следующие результаты уровень инфицированности риккетсиями составил 23,5+6,2%, причем в 11,8+3,2% случаев риккетсии обнаруживали одновременно в сочетании с другими патогенами (с вирусом КЭ - в 5,8+2,5%, с боррелиями - в 8,9+2,8%, с анаплазмами и эрлихиями - в 5,9+2,5%) Анаплазмы и эрлихии выявляли в 35,3+7,0% исследованных переносчиков и в 14,7+3,3% - без сочетания с другими возбудителями Одновременно с боррелиями анаплазмы и эрлихии обнаруживали в 5,9±2,5% случаев, тогда как сочетаний с вирусом КЭ не выявить не удалось. Бабезий детектировали только в одном клеще и в сочетании с анаплазмами и эрлихиями (2,9+1,9%)

Анализ полученных результатов исследований снятых клещей / регт1саШ8 и биологических материалов людей позволяет сделать вывод о более высокой эпидемиологической значимости зараженности клещей / регьикаШз вирусом КЭ по сравнению с другими возбудителями Уровни инфицированности боррелиями снятых переносчиков также имеют существенное значение в риске заражения людей этими возбудителями Риккетсии, анаплазмы и эрлихии, бабезии, вероятно, имеют меньшее значение в инфицировании населения Омской области

При исследовании клещей D reticulatus получены следующие результаты в ИФА антиген вируса комплекса КЭ выявляли в 21,4+2,6% случаев, при этом в крови пациентов с положительными результатами исследования снятых клещей обнаруживали антиген вируса только в 10,7+3,2%. Часть проб, содержащих антиген вируса КЭ в ИФА, исследованы в дальнейшем в ОТ-ПЦР, но положительные результаты получены не во всех случаях. Специфичность ОТ-ПЦР определяется применением пары праймеров в NS3 — области вирусного генома, которые позволяют выявлять строго специфично РНК вируса КЭ различных штаммов, не выявляя РНК других флавивирусов. Методом ИФА выявляется группос-пецифичный антиген вирусов комплекса КЭ, включая вирус омской геморрагической лихорадки (ОГЛ).

При изучении инфицированное™ клещей боррелиями методом ПЦР установлена зараженность этого вида клещей в 23,1 +6,2%, однако в биологическом материале людей боррелии обнаружены в 3,6+1,9% Установлена инфицированность клещей!) reticulatusриккетсиями-в 6,7+1,5% случаев, при этом у пациентов в крови ДНК риккетсий была выявлена только в одном случае, несмотря на развитие у многих пациентов регионарною лимфаденита. При секвенировании нескольких положительных проб ДНК от лихорадящих пациентов и с регионарными лимфаденитами установлен геновид риккетсий RpA4. Анаплазмы и эрлихии у клещей D reticulatus обнаружить не удалось Бабезии у клещей этого вида обнаруживали в 12,8+2,0%, последующих заболеваний людей не установлено. Можно предположить, что обнаруживаемые бабезии относятся к непатогенному для человека виду В cams cams, описанному у клещей этого вида на территориях Омской и Новосибирской областей

Таким образом, результаты дифференциальной экспресс-индикации клещевых патогенов в снятых переносчиках и у обратившихся лиц и проведение дифференцированной экстренной профилактики природно-оча-говых трансмиссивных клещевых инфекций свидетельствуют об эффективности данной тактики предупреждения заболеваний.

ВЫВОДЫ

1 В Западно-Сибирском регионе установлено широкое распространение сочетанных природных очагов трансмиссивных инфекций - клещевого энцефалита, иксодовых клещевых боррелиозов, гранулоци-тарного анаплазмоза, моноцитарного эрлихиоза и клещевого риккет-сиоза, обусловленное общностью переносчика - клеща/ persulcatus. Результаты исследований впервые позволили оценить различия в структуре и функционировании природных очагов клещевых инфекций в различных ландшафтных зонах

Динамика заболеваемости ИКБ в Сибирском ФО за изучаемый период характеризуется четкими пиками подъема (1995, 1998 и 2001) и снижения (1997, 2000 и 2003). В период с 1999 по 2004гг уровень заболеваемости стабилизировался и даже имеет тенденцию к снижению (Тсн-4,5%, р<0,01) Основные особенности эпидемического проявления природных очагов иксодовых клещевых боррелиозов в современный период определяются существенным ростом заболеваемости городских жителей (до 80%), изменениями в возрастной структуре заболеваемости увеличение доли детей дошкольного возраста и пожилых людей (до 42%)

На основании комплекса современных лабораторных методов расширены представления об этиологической структуре заболеваемости «клещевыми» инфекциями в Западной Сибири. Основная роль в формировании заболеваемости принадлежит возбудителям КЭ и ИКБ Впервые верифицированы случаи ГАЧ и МЭЧ, установлена высокая частота микст-инфицирования населения возбудителями ГАЧ и ИКБ и относительно низкая встречаемость ГАЧ как самостоятельного заболевания

Получены новые данные о геновидовом спектре возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов и генетическом разнообразии борре-лий, циркулирующих в природных очагах Западной Сибири По данным идентификации боррелий у больных заболеваемость ИКБ в Западной Сибири связана с двумя основными геновидами боррелий -В сфе1и (27,4%) и В %агтп (14,6%) и их сочетаниями. Впервые выявлены особенности распространения геновидов боррелий в различных типах природных очагов Западной Сибири В очагах с бидоминантным типом населения переносчиков «I регяШсаШ, О геЬсиШт» доля В существенно ниже (14,4+2,2%) в срав-

нении с монодоминантным типом населения переносчика «/ рег$и1са1т» (42,4+3,8%) Доля В а/ге1и в обоих типах очагов существенно не отличается (31,4+4,3 и 36,9+4,5% соответственно) Установлено участие клещей рода ОегтасеШог в инфицировании населения возбудителями ИКБ, экспериментально доказана возможность трансфазовой (4,0+1,6%) и трансовариальной (6,8+1,3%) передачи боррелий у клещей Ь геПсиЫш.

Разработан двухэтапный алгоритм лабораторной диагностики иксодовых клещевых боррелиозов с применением комплекса иммунологических (ИФА, иммуноблот) и молекулярно-биологических (ПЦР) методов исследования с целью проведения ранней дифференциальной диагностики и назначения этиотропной терапии, учитывающий возможность реализации риска микст-инфицирования На основе более эффективных методов мониторинга возбудителей инфекций, передающихся иксодовыми клещами с использованием

ПЦР и ИФА технологий разработана программа эпидемиологического надзора за клещевыми инфекциями на территориях с различным уровнем заболеваемости этими инфекциями.

9 Усовершенствован дифференцированный подход к профилактике различных инфекций, передающихся иксодовыми клещами в Западной Сибири с учетом степени эпидемической опасности очаговых территорий, что позволило оптимизировать тактику экстренных предупредительных мероприятий.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Матущенко А А Предварительные результаты эколого-эпидемиоло-гического изучения болезни Лайма в Западно-Сибирском регионе / А.А.Матущенко, С А.Рудакова, Э И. Коренберг // Журнал Мед.пара-зитол ипаразитар Болезни.-1993.-№4.-С.27-29

2. Оберт А.С Распространенность возбудителей и особенности течения клещевых нейроинфекций в природных очагах Западной Сибири / А.С Оберт, Н В Рудаков, С.А Рудакова//Сибирский Консилиум.-2000.-N8(18) - С 55-58

3 Оберт А С Иксодовые клещевые боррелиозы (нозогеографические и медико-экологические аспекты) /АС Оберт, В Н Дроздов, С А.Ру-дакова//Новосибирск -Наука, 2001.-110 с.

4. Новые данные о генотипировании возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов в Азиатской части России и Казахстане / С.А Рудакова, Н В Рудаков, Н К.Токаревич и др //Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.-2002,- N4.- том 2 - С.99-101.

5. Новые и возвращающиеся природно-очаговые инфекции: теоретические и прикладные аспекты проблемы / Н В.Рудаков, А. А Матущенко, С.Н.П1пынов, С.А Рудакова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН - 2002.-N4,-том 2,- С.16-19

6. Рудакова С.А Иксодовые клещевые боррелиозы в Западной Сибири (этиология, эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика) / С.А Рудакова, А.С.Оберт, В.Н Дроздов//Пособие для врачей - Омск.- «ЦИО» - 2005- 39 с

7. Рудакова С.А. Результаты генетических исследований в природных очагах иксодовых клещевых боррелиозов в Сибири и на Дальнем Востоке / С.А.Рудакова // Омский научный вестник.- №4 (33).- 2005.-приложение.-С 113-115.

8 Генотипическая характеристика боррелий, циркулирующих в природных очагах Западной Сибири / С А Рудакова, А А Матущенко, Н.В.Фо-

менко, А.Е.Тупикин // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН - №2 - 2005 -С 233-236

9 Дифференциальная лабораторная диагностика клещевых инфекций в Западной Сибири / С А Рудакова, Е.В Матущенко, О В Бутаков, А С Оберт // ЗНИСО №7 - 2005 - С 34-37

10 Изучение возможной трансовариальной и трансфазовой передачи боррелий клещами Dermacentor reticulatus (IXODIDAE) / С.А.Рудакова, Е В.Матущенш, В В Якименюэ и др // Паразитология - №39 - т 5 -2005.-С 427-431

11 Кузьминов А М Характеристика заболеваемости икеодовыми клещевыми боррелиозами в Омской области / А М.Кузьминов, С А Рудакова, Е В Матущенко // Омский научный вестник - №4 (33) - 2005 - приложение - С.53-55

12. Эпидемиологическая характеристика клещевого энцефалита, клещевого боррелиоза и гранулоцитарного анаплазмоза на юге Западной Сибири / С. А Рудакова, А А Матущенко, О В Бутаков и др. // «Омский научный вестник».- №4 (33) - 2005 - приложение - С 115-118.

13 Кузьминов AM Оценка эффективности инсектоакарицидного средства «Акаритокс» в природных очагах клещевых инфекций / А М Кузьминов, С.А.Рудакова, И В Боровский и др // «Сибирь-Восток», июль, 2006, с. 17- 20

14 Rudakova S A Possible participation of ticks D reticulatus in the circulation of Borrelia m natural foci / S A Rudakova, A. A.Matuschenko / /Abstract book of internat. conference, Irkutsk - 1996.- p.86-87

15 The new data on genotyping of tick-borne borreliae in the Asian part of Russia / S.A Rudakova, N. V Rudakov, N К Tokarevich et al // Abstracts VII International Postdam symposium on tick-borne diseases, Berlin -2003,- p 40

16 Serological verification of several tick-borne infections in West Siberia of Russia / S A.Rudakova, E VMatuschenko, A.S.Obert et al // Book of Abstrakts 10th International conferens on Lyme borrehosis and other tickborne diseases, Vienna (Austria) - 2005 -P 93

17 Tickborne Pathogen Detection, Western Siberia, Russia / V.Rar, N Fomenko, A Dobrotvorsky et al // Emerging Infectious Diseases - vol 11 -N 11 -2005 -P 1708-1715.

На правах рукописи

Рудакова Светлана Анатольевна

ИКСОДОВЫЕ КЛЕЩЕВЫЕ БОРРЕЛИОЗЫ В СОЧЕТАННЫХ ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ ТРАНСМИССИВНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ

14.00.30 — эпидемиология 03 00 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Омск-2007

Подписано в печать 28 05.2007 Формат 60x84/16 Бумага офсетная Пл -2,0 Способ печати - оперативный Тираж 100

Издательско-полиграфический центр ОмГМА 644099, г. Омск, ул. Ленина, 12, тел 23-05-98 E-mail: ipc@omsk-osma ru