Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:IgE и IgE - регуляторные цитокины при хроническом гломерулонефрите

4850732

На правах рукописи

Федичева Наталья Александровна

^Е И ^Е-РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЦИТОКИНЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТЕ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 3 ИЮН 2011

Ростов-на-Дону - 2011

4850732

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук профессор

Ханферян Роман Авакович.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук с.н.с.

Зотова Валентина Владимировна,

доктор медицинских наук профессор Козлов Иван Генрихович.

Ведущая организация: ФГБУ «Государственный научный центр

Институт иммунологии ФМБА России».

Защита состоится «. _ 2011 года в часов на

заседании диссертационного совета Д 208.082.02 при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицинском университете (344022, г. Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета

Автореферат разослан « О Л»_О /у_2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н. профессор

Н. Ю. Пшеничная.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. В последние годы не уменьшается количество больных с нефритом, который поражает, в основном, социально активных людей молодого и среднего возраста. Прогрессирование заболевания с неизбежностью приводит к развитию хронической болезни почек (ХБП) и её осложнению - хронической почечной недостаточности (ХПН). В общей структуре инвалидности хронические заболевания почек составляют около 1,5%, а среди лиц, впервые признанных инвалидами 1-й и 2-й групп, на их долю приходится около 60% [Алиев P.A., 2001].

Согласно данным «Регистра заместительной почечной терапии (ЗПТ) Российского диализного общества» количество больных, нуждающихся в проведении ЗПТ, постоянно возрастает. В 1998 году их число составило 8 228 человек, 2005 году ЗПТ получали 16 483 человека с терминальной хронической болезнью почек, а в 2007 - 20 212 или 142,3 человека на миллион населения [Гендлин Г.Е., Борисовская C.B., Эттингер O.A., и др., 2007; Бибиков Б.Т., Томилина H.A., 2009].

В настоящее время в связи с увеличением аппаратной базы диализных центров и совершенствования альтернативного метода заместительной почечной терапии - перитониального диализа - стало возможным в более ранние сроки начинать у таких больных ЗПТ [Гендлин Г.Е., Борисовская C.B., Эттингер O.A., и др., 2007].

Лечение гломерулонефрита включает в себя несколько компонентов, важнейшим из которых, наряду с этиотропной (антибиотики при манифестации заболевания), симптоматической (диуретики, антигипертензивные препараты), является патогенетическая терапия с применением кортикостероидов и цитостатиков. Клинически важную роль играет ответ на проводимую терапию кортикостероидами, когда заболевание может проявляться в стероидочувствительной, стероидозависимой и стероидорезистентной форме [Эрман М.В., 2010].

Ход лечения, прогноз, клинический исход во многом зависят от стероидочувствительности больного гломерулонефритом. В то же время, стероидочувствительность может изменяться в ходе проведения патогенетической терапии кортикостероидами, поэтому огромное значение придается возможности предсказать появление стероидорезистентности у больных гломерулонефритом с целью максимально ранней коррекции проводимого лечения со сменой модальности иммуносупрессивной терапии.

Условно в патогенезе гломерулонефрита выделяют две стадии: иммунную и воспалительную [Батурина Т. В., Сергеева Т. В., 2002].

Иммунная стадия включает некоторые звенья иммунного ответа на чужеродные или собственные антигены и заканчивается образованием иммунных комплексов и/или аутоантител [Ring G.H., Lakkis F.G., 1998], поэтому гломерулонефрит рассматривается как аутоиммунный патологический процесс.

В последние годы доказано участие про- и противовоспалительных цитокинов (IL-4, IFN-y и других) в патогенезе иммунокомплексных пролиферативных гломерулонефритов. По мнению ряда авторов, отрицательная динамика процесса однозначно выражается в увеличении провоспалительных и снижении активности противовоспалительных цитокинов, что свидетельствует об активности субклинического воспаления [Вилевальде C.B. и др., 2007; Гудгалис Н.И. и др., 2007; Исикова Х.В., 2008]. Преобладание тех или иных факторов межклеточной регуляции должны вызывать изменения в механизмах продукции иммуноглобулина Е у данных больных.

Ранее некоторыми авторами было установлено, что в развернутой клинической фазе лимфопролиферативных заболеваний (острый лимфобластный лейкоз, лимфогранулематоз и неходжкинские лимфомы), а также при гиперплазии эритроидного ростка кроветворения (хроническая эритремия и эритробластный лейкоз) концентрация общего IgE в крови

больных значительно выше уровня IgE у здоровых людей [Ригер и др., 1995, 1999; Khanferyan et al, 1995,1997].

Недавно в работах исследователей из Санкт-Петербурга было отмечено значительное повышение уровня IgE в крови детей, страдающих нефротическим синдромом с минимальными изменениями. Причем это повышение было более значительным, чем у детей с атопическим дерматитом, являющимся классическим заболеванием аллергического генеза [Тур И.И., Савенкова Н.Д., Назаров П.Г. и др., 2007; Савенкова Н.Д., Батракова И.В., Тур И.И., 2008].

Ряд авторов при волчаночном нефрите показал увеличение концентрации IgE, что позволило предположить возможную роль этого иммуноглобулина в патогенезе данного заболевания [Elkayam О, et al, 1995; Shahar Е., Lorber М., 1997; Atta А.М. et al, 2004]. Кроме того, о взаимосвязи волчаночного нефрита с аллергией говорит повышение концентрации в том и в другом случае некоторых цитокинов, таких как IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10, вызывающих сдвиг дифференцировки наивных ThO в направлении Th2 [Morton S„ et al., 1998].

Таким образом, значимость IgE не ограничивается участием лишь в клинически проявляющейся симптоматике аллергии. Среди разных синдромов и болезней, протекающих с изменением уровня IgE, участие последнего более или менее понятно в патогенезе паразитарных инвазий, при которых IgE обеспечивает противопаразитарный иммунитет. Роль IgE в возникновении всех других патологий остается совершенно неизученной [Гущин, 2001].

Вместе с тем, изучение уровня IgE при хронических заболеваниях почек, практически осталось за рамками внимания исследователей. В доступной литературе нами не обнаружено сведений об изучении этого показателя у больных с хроническим гломерулонефритом. Учитывая высокую социальную значимость данной патологии, тяжелые формы которой требуют проведения заместительной почечной терапии, особый

интерес представляет раннее прогнозирование динамики данного заболевания.

Цель исследования: На основании изучения показателей иммунной системы установить патогенетическую роль 1§р и ^Е-регуляторных цитокинов (1Ь-4 и П^-у) в развитии ХГН и оценить прогностическое значение указанных факторов в течении заболевания и эффективности проводимой терапии.

Задачи исследования:

1. провести анализ состояния Т-клеточного звена иммунитета у больных хроническим гломерулонефритом на фоне патогенетической терапии кортикостероидами;

2. провести сравнительный анализ отличий в концентрации 1§Е и 1{»Е-регуляторных цитокинов (1Ь-4 и 1Ш-у) в крови больных ХГН и практически здоровых лиц;

3. охарактеризовать динамику концентрации 1§Е и ^Е-регуляторных цитокинов на разных этапах патогенетической терпии у больных ХГН в зависимости от эффективности проводимого лечения;

4. провести сравнительный анализ синтеза ^Е и ^-регуляторных цитокинов в культуре мононуклеаров периферической крови у больных ХГН;

5. оценить динамику синтеза ^Е и 1§Е-регуляторных цитокинов на разных этапах патогенетической терапии у больных ХГН в зависимости от эффективности проводимого лечения;

6. предложить феноменологическую схему прогноза эффективности проводимой стандартной терапии, основывающуюся на учете лабораторных оценок некоторых клинико-биохимических показателей, 1{»Е и цитокинового баланса.

Научная новизна исследования, в результате проведенных исследований впервые:

1. изучена концентрация 1§Е и некоторых ^Е-регуляторных цитокинов в крови у больных ХГН;

2. изучена концентрация 1§Е и некоторых ^Е-регуляторных цитокинов в клеточной культуре мононуклеаров периферической крови у больных ХГН;

3. охарактеризована динамика концентрации 1|»Е и некоторых 1§Е-регуляторных цитокинов на разных этапах патогенетической терпии у больных ХГН в зависимости от её эффективности^

4. предложена и реализована методика прогнозирования эффективности ответа на проведение стандартной терапии, в основе которой лежит изучение концентрации некоторых клинико-биохимических показателей, в том числе 1{£Е и ^Е-регуляторных цитокинов в крови больных.

Теоретическая значимость исследования. В ходе работы впервые изучена концентрация ¡¿Е и некоторых IgE-peгyлятopныx цитокинов в крови и в клеточной культуре мононуклеаров периферической крови у больных хроническим гломерулонефритом.

Впервые изучена взаимосвязь изученных иммунологических показателей с клиническим результатом проводимой стандартной патогенетической терапии различных форм гломерулонефрита.

Особую теоретическую значимость представляют полученные результаты, связывающие прогрессирование хронического гломерулонефрита и характер клинического ответа на проводимую терапию с поликлональной активацией гуморального звена иммунитета, что позволяет предположить возможные изменения в понимании патогенеза данного заболевания.

Итогом проведения исследований явилось обоснование применения некоторых иммунологических данных для мониторинга состояния больных с хроническим гломерулонефритом и для прогноза результатов проведения патогенетической терапии.

Практическая значимость работы. Выявленные факты гиперпродукции 1§Е у больных с хроническим гломерулонефритом и отличия в концентрации 1§Е-регуляторных цитокинов позволяют предположить наличие поликлональной активации гуморального звена

иммунитета в патогенезе данного заболевания, что может привести к разработке новых схем лечения этих больных.

Достоверные различия в уровне IgE и IgE-регуляторных цитокинов у больных с различным клиническим результатом лечения позволяет дифференцированно относиться к интенсивности проводимой терапии, даже при условии получения изолированной информации о каком-либо из исследованных показателей.

Предложенные дискриминантные модели, учитывающие концентрацию IgE и IgE-регуляторных цитокинов в крови больных, позволяют с высокой вероятностью прогнозировать отсутствие эффективного ответа на проведение стандартной терапии у больных ХГН. По результатам проведенной работы получено положительное решение по заявке на патент «Способ прогнозирования эффективности планируемой стандартной терапии гломерулонефрита».

Структура работы. Диссертация изложена на 188 страницах машинописного текста и состоит из титульного листа (1 стр.), оглавления (4 стр.), списка условных сокращений (1 стр.), введения (9 стр.), обзора литературы (24 стр.), главы с описанием объектов, материалов и методов исследования (10 стр.), трех глав с изложением полученных результатов (106 стр.), обсуждения полученных результатов (11 стр.), выводов (2 стр.), практических рекомендаций (1 стр.), списка литературы (13 стр.) и приложений (6 стр.). Библиографический указатель включает 133 литературных источников, из них 75 принадлежит русскоязычным (русский и украинский языки) и 58 англоязычным авторам. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 86 рисунками.

Материал и методы исследования Характеристика групп больных. Первичный этап исследования включал анализ анамнестических данных и результатов обследования 176 пациентов, находящихся на лечении в нефрологическом отделении Краевой клинической больницы им. C.B. Очаповского (г. Краснодар), а также

в урологическом и терапевтическом отделениях Краснодарской городской клинической больницы скорой медицинской помощи с 2005 по 2009 гг.

При формировании групп учитывались следующие критерии. Критерии включения: больные с мезангиопролиферативным ХГН, морфологически верифицированный прижизненной биопсией почки; возраст от 20 до 60 лет; проведение патогенетической терапии кортикостероидами. Критерии исключения: возраст больных, выходящий за вышеуказанные пределы; наличие атопических заболеваний, связанных с гиперпродукцией IgE; проведение заместительной почечной терапии; анамнестические данные о наличии тяжелой эндокринной патологии (сахарный диабет, заболевания щитовидной железы); наличие других проявлений аутоиммунных заболеваний.

Все пациенты давали добровольное информированное письменное согласие на проведение исследования.

В соответствии с целями и задачами исследования были выделены три группы больных.

I группа - больные с манифестацией хронического гломерулонефрита до начала проведения патогенетической терапии кортикостероидами;

II группа - больные хроническим гломерулонефритом, длительное время (4+8 лет) находящихся на патогенетической терапии;

III группа - больные хроническим гломерулонефритом, осложненным ХПН1-П Б ст.;

с целью проведения объективных сравнений была сформирована IV группа практически здоровых лиц.

Половозрастная структура исследованных групп и их численность приведена в таблице 1, величина критерия %2 при степенях свободы df=21 свидетельствует об отсутствии различий между группами.

Табл. 1. Распределение обследованных лиц по полу и возрасту.

Возраст (полных лет), пол (м/ж)

Группы 20-30 31-40 41-50 51-60 Всего

в 9 <? 9 6 9 с? 9

I 3 3 4 4 2 2 3 2 23

П 2 5 8 1 1 3 5 2 27

Ш 3 2 5 3 2 4 3 1 23

IV 2 3 5 3 2 3 4 1 20

Е 10 13 21 10 7 12 14 6 93

Примечание. х2=7,01, df= 21, р=0,998.

В ходе исследования каждая группа больных была разделена на две подгруппы, отличающихся наличием устойчивости по отношению к стандартной патогенетической терапии кортикостероидами -стероидочувствительных (СтЧ) и стероидорезистентных (СтР).

Методы исследования

Исследование общеклинических лабораторных показателей

Исследование общего анализа крови проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Micros 60 (АВХ,Франция).

Биохимические методы исследования

Биохимические параметры крови и мочи исследовали на биохимическом автоматическом анализаторе KoneLab30 (TermoFisher, Финляндия) с использованием реактивов фирмы TermoFisher (Финляндия).

Исследование молекул средней массы (МСМ) проводили по Габриэляну

Иммунологические методы исследования

В работе использованы сыворотки и мононуклеары периферической крови (МПК) больных ХГН. Сыворотки собирали и хранили в стерильных пластиковых пробирках в замороженном состоянии при температуре -20° С. МПК выделяли из гепаринизированной крови путем центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности Ficoll-Paque фирмы Pharmacia (р= 1,077 г/мл). Жизнеспособность лимфоцитов определяли по включению погибшими клетками трипанового синего («Serva», Германия). При выделении лимфоцитов количество погибших клеток составляло от 3 до 5%.

и

Дважды отмытые в среде 199 МПК ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 2 мМ L-глютамина, 10 мМ буфера HEPES, («Serva», Германия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицина в концентрации 40мкг/мл. Культивирование клеток проводили в 96-луночных круглодонных планшетах при концентрации клеточной взвеси 1х10б/мл. В каждую лунку помещали 200 тысяч клеток в объеме 150 мкл. Инкубацию проводили в С02 - инкубаторе, в атмосфере, содержащей 5% С02 при 96% влажности, температуре 37°С в течение 9 суток для исследования синтеза IgE, и 3 суток для определения цитокинов. Супернатанты собирали в стерильные пластиковые пробирки и хранили до исследования при температуре -20° С.

Определение IgE в сыворотках проводили с помощью тест-наборов для определения общего IgE человека (IgE-total, FELA), "Pharmacia" и в субнанограммовых диапазонах (IgE-ultra, FEIA), "Pharmacia" на лабораторном комплексе CAP System FELA MasterCAP AM, Software Version 2.2; MasterCAP RM, Software Version 1,0 - method CAP FEIA, "Pharmacia". Уровень цитокинов (IL-4, и IFN-y) в сыворотках больных и супернатантах МПК определяли двуцентровым иммуноферментным методом в авидин-стрептавидиновой системе с использованием стандартных тест-наборов для исследования концентраций IL-4 и IFN-y, DIACLON Cedex с измерением оптической плотности на анализаторах:"АМТ08 2010", Австрия и Юникар (Phadia, Швеция).

Всем больным при поступлении и при выписке проводили исследование иммунного статуса с определением содержания CD3+, CD4+, CD8+, С020+-лимфоцитов. Иммунорегуляторный индекс (ИРИ) определяли как отношение CD4+/CD8+. Показатели клеточного звена иммунитета исследовали с помощью моноклональных антител на проточном цитометре FaxScan. Концентрацию иммуноглобулинов A, M, G определяли иммуноферментным методом с использованием соответствующих тест-

систем фирмы Pharmacia, Швеция на приборе ANTHOS 2020 (Pharmacia, Швеция).

Статистические методы исследования.

Анализ различий признаков проводили с помощью непараметрических критериев Вилкоксона и Манна-Уитни для зависимых и независимых групп, соответственно. При проведении множественных сравнений применялась поправка Бонферрони. Данные представлены в виде Ме(р25;р75), где Me -медиана значения признака, р25 и р75- нижний и верхний квартили распределения признака, соответственно. Во всех случаях использовали двусторонний уровень значимости. Различия между группами считались достоверными при уровне значимости р<0,05; или, в случае применения поправки Бонферрони при проведении п сравнений с участием данной группы лиц при уровне значимости р<0,05/и.

Для разработки прогностической модели использовали линейный дискриминантный анализ.

Подготовку данных для статистической обработки и построение графиков проводили в «Excell 2002» (MS, США). Статистическую обработку проводили в «Statiatica 6.0 for Windows» (StatSoft, США).

Результаты исследования

Анализ биохимических данных у больных ХГН показал наличие воспаления и интоксикации как до начала терапии (при поступлении больных), так и после окончания наблюдения (табл.2). Об этом свидетельствовало умеренное повышение С-реактивного белка, повышение содержания в крови молекул средней массы и др. показателей, особенно выраженное у больных с осложнением в виде ХПН. Из данных таблицы можно отметить, что во всех группах данные показатели достоверно отличаются от уровня здоровых лиц, а также наличие динамики всех показателей в процессе лечения, кроме С-РБ у СтЧ больных 1П группы и МСМ в обеих подгруппах Ш группы. Последнее, вероятно, может свидетельствовать об истощении выделительных способностей почек.

Табл. 2 Маркеры воспаления и интоксикации у больных ХГН

группы п/гр С-РБ Р мсм Р

ДО после до после

I СтЧ 21,4(16,3;30,8) 8,3(4,5;10,3) * 267(252;279) 224(204;252) *

СтР 29,0(21,4;31,7) 14,1(11,6;17,2) * 287(268;300) 247(211;274) *

II СтЧ 9,0(6,4;13,6) 4,3(4,0;4,9) * 445(425;455) 220(207;230) *

СтР 10,1(9,4;10,8) 6,1(5,6;6,4) * 497(474;501) 264(256;277) *

III СтЧ 19,1(17,4;20,3) 16,4(11,9^1,6) 784(757;842) 794(751;822)

СтР 23,9(19,8;30,9) 18,1(17,0;20,1) * 902(849;946) 966(895;980)

IV 3,0(2,5;3,4) 195(150;223)

Prv... все * | все * все * | все *

Исследование содержания иммунокомпетентных лимфоидных клеток показало (рис.1, 2), что количество СБЗ(+) лимфоцитов в значительно большей степени снижено в 1П группе больных и в абсолютном, и в относительном выражении. Во II группе, несмотря на нормальные относительные величины, наблюдается снижение абсолютных показателей, в основном за счет снижения относительного содержания всех лимфоцитов крови.

% □ CD3(+)

I группа II группа III группа IV группа

Рис. 1. Относительное содержание субпопуляций Т-лимфоцитов изученных групп лиц при поступлении.

Изучение иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов - CD4(+) и CD8(+) показало, что значительное снижение содержания СБ4(+)-лимфоцитов во II и Ш группах больных происходит, главным

образом, за счет снижения, как относительного содержания этих клеток, так и выраженной относительной лимфоцитопении. Данный показатель во II и Ш группах ниже, чем в IV группе практически здоровых лиц в 2 и 3 раза, соответственно. При этом, даже, несмотря на умеренное повышение общего содержания лейкоцитов во П группе на 35% относительно практически здоровых лиц, абсолютное содержание СВ4(+)-лимфоцитов во II и III группах больных при поступлении составляет 45% и 18% от уровня лиц IV группы, соответственно.

3

2,5

2

1,5

1 ЧЛг-

0,5 щ

0 J

О CD3(+) D CD4(+) В CD8(+)

группа II группа III группа IVгруппа

Рис. 2. Абсолютное содержание субпопуляций Т-лимфоцитов изученных групп лиц при поступлении.

В то же время в результате повышения на 45% CD4(+) и повышения на 55% С08(+)-лимфоцитов у больных с хроническим гломерулонефритом до начала патогенетической терапии наблюдается только незначительное уменьшение ИРИ (рыу=0,03). С учетом проведения множественных сравнений и поправки Бонферрони такой уровень значимости недостоверен. Данное наблюдение может свидетельствовать о том, что при манифестации гломерулонефрита до начала патогенетической терапии реактивность организма остается высокой, что способствует динамике заболевания.

Проведенная терапия в целом приводит к снижению абсолютного числа клеток, несущих CD3(+) маркер во всех группах, при этом самое

значимое снижение наблюдалось в I группе больных, у которых ранее не проводилась патогенетическая терапия (рис. 3). Снижение числа клеток достигало 45%, тогда как во II и Ш группах оно составило 38% и 18%, соответственно. В динамике лечения в указанной группе отмечено, снижение СБ4(+)-лимфоцитов на 9% и повышение С08(+)-лимфоцитов на 21%, что привело к выраженному уменьшению ИРИ на 20% (ры\г<0,001).

I груша

группа

III группа IV груша

Рис. 3. Абсолютное содержание субпопуляций Т-лимфоцитов изученных групп лиц при выписке.

Наиболее интересные данные были получены при анализе иммунологических показателей в зависимости от эффективности патогенетической терапии с использованием глюкокортикоидов (рис. 4, 5). При анализе данных было установлено, что во всех анализируемых группах наблюдалась сходная картина, а именно снижение числа СОЗ(+)-лимфоцитов в стероидорезистентных подгруппах. В то же время различий в содержании и соотношении иммунорегуляторных субпопуляций в зависимости от чувствительности к стероидной терапии практически не наблюдалось.

Анализ продукции 1§Е и 1|»Е-регуляторных цитокинов показал значительные изменения в их содержании в периферической крови (рис.6). В частности, можно отметить, что сывороточная концентрация во всех исследуемых группах больных значительно превышала величины указанного иммуноглобулина у практически здоровых лиц IV группы (в 4,9+6,9 раз).

Причем наиболее выраженное повышение наблюдалось у больных II и III групп, длительно находящихся на иммунодепрессивной терапии. При этом, проведение патогенетической терапии приводило к значительному повышению концентрации IgE только в III группе больных с наличием ХПН МТБ ст. (в 1,85 раза).

—♦—IV

СтЧ, до лечения СтР до лечения

(

Лейк. Лейк.

Сй4 СР4

Рис. 5. Характеристика клеточного звена иммунитета у СтЧ и СтР больных ХГН при выписке (кратность относительно здоровых).

004 С04

Рис. 4. Характеристика клеточного звена иммунитета у СтЧ и СтР больных ХГН при поступлении (кратность относительно здоровых).

СтЧ, после лечения СтР- поспе прения —С-IV

Лейк. Лейк. <""Ч>"»|

Лимф.

Лимф.

Лимф.

Можно предполагать, что повышение концентрации 1§Е у больных, вероятнее всего, обусловлено изменением штокиновой регуляции. При этом наблюдается выраженная дисрегуляция в синтезе цитокинов, что выражалось

в изменении соотношения 1Ь-4 к 1Ж-у. Во всех группах отмечено резкое снижение данного индекса. И если в 1 группе это связано напрямую с резким повышением концентрации ТЬ-4, то во II и III группах это снижение обусловлено не столько изменениями в концентрации 1Ь-4, а в большей степени зависело от резкого снижения концентрации ШЧ-у.

Рис. 6. Характеристика гуморального звена иммунитета у больных ХГН в сыворотке (логарифмический масштаб).

Учитывая, что до начала наблюдения снижение концентрации ШЫ-у. наблюдалось лишь в группах лиц, получавших стероидную терапию, нами был проведен анализ концентрации 1§Е и цитокинов в различных по стероидочувствительности подгруппах.

Установлено (рис. 7), что концентрации ГЬ-4 в стероидорезистентных группах несколько выше, чем в группах больных, чувствительных к терапии. Вместе с тем обратная картина наблюдается в отношении концентрации 1Ш-у, что особенно выражено в зависимости от длительности проведения патогенетической кортикостероидной терапии (П1 группа).

В результате проведенной терапии, отмечена зависимость между выявленным цитокиновым дисбалансом и продукцией 1{*Е. Показано, что терапия в подгруппе, резистентной к стероидам приводит к значительному повышению продукции ^Е. Можно предполагать, что это является

1дЕдо

неблагоприятным признаком проводимой патогенетической терапии. В то же время при выраженной чувствительности к терапии гормонами наблюдается снижение концентрации IgE, что может свидетельствовать о благоприятном результате проведения патогенетической терапии.

Рис. 7. Концентрация IL-4 и IFN-y в крови обследованных групп лиц при поступлении в стационар в зависимости стероидорезистентности.

Анализ уровня синтеза IgE в различных группах больных показывает, что практически у всех больных наблюдается повышенный синтез МПК in vitro IgE. Причем, длительная терапия стероидами активирует синтез IgE, который оказался наиболее выраженным в П1 группе.

Исследование механизмов изменений синтеза IgE показало, что его синтез в культуре лимфоцитов обусловлен, главным образом, снижением синтеза IFN-y и, в меньшей степени, IL-4-зависим.

Следует отметить, что между содержанием в сыворотке крови IgE, IL-4, IFN-y и их синтезом in vitro имеется прямая взаимосвязь. Их изменение

однонаправлено практически во всех группах больных. Дальнейший анализ показал, что эти данные менее информативны для оценки эффективности терапии в различных подгруппах, по сравнению с исследованием указанных цитокинов и 1§Е в сыворотке периферической крови. Высокая трудоемкость культуральных исследований, не дает возможности рекомендовать их для массового применения при оценке эффективности патогенетической терапии.

Полученные в результате исследования данные легли в основу разработки прогностической модели, основанной на результатах дискриминантного анализа, позволяющей с достаточно высокой диагностической чувствительностью и специфичностью прогнозировать клинический исход заболевания. В случае лечения впервые выявленного гломерулонефрита до начала проведения патогенетической терапии построенная модель позволяет прогнозировать развитие стероидорезистентности, которая обуславливает необходимость изменения модальности глюкокортикоидной терапии.

В ходе исследования разработаны три дискриминантные модели: для больных хроническим гломерулонефритом до начала патогенетической терапии - ДФ = 3,10* ^ Е + 29,91* 1Ь-4 + 21,85* ШЫ-у - 5435,63; для больных хроническим гломерулонефритом, длительное время находящихся на патогенетической терапии, -

ДФ=2,73^С-РБ+4,37хИРИ+38,11х1ёС+44,00х1§Е+3,78х1Ь-4+13,97х1™-у-8735,41; для больных хроническим гломерулонефритом, осложненным ХПН, ДФ=8,53хС03а6° + 27,14 х Е +17,29 х 1Ь-4 + 28,48 * ШК-у -3897,37.

После подстановки в соответствующие формулы численных значений лабораторных показателей и вычисления значения дискриминантной функции при её величине больше нуля можно прогнозировать дальнейшее благоприятное течение заболевания. В противном случае можно ожидать неадекватного ответа на проводимую терапию, в том числе, возникновение стероидорезистентности.

20

ВЫВОДЫ

1. Установлена дисрегуляция в составе иммунокомпетентных лимфоидных клеток, заключающаяся в снижении количества CD3(+)-, СБ4(+)-лимфоцитов и относительной лимфоцитопении, наиболее выраженная в группах длительно болеющих лиц.

2. Проведение патогенетической терапии приводит к снижению абсолютного числа СОЗ(+)-лимфоцитов во всех группах больных гломерулонефритом, наиболее выраженному у больных с манифестацией заболевания.

3. При проведении патогенетической терапии в группе больных, ранее не получавших лечения глюкокортикоидами, отмечено снижение содержания CD4(+)- и повышение СВ8(+)-лимфоцитов, что привело к выраженному уменьшению иммунорегулятоного индекса.

4. Анализ состояния иммунной системы показал снижение числа СШ(+)-лимфоцитов в стероидорезистентных подгруппах при отсутствии различий в содержании и соотношении иммунорегуляторных субпопуляций, а также отсутствие подобных изменений у стероидочувствительных больных

5. У больных хроническим гломерулонефритом в сыворотке крови обнаружено значительное повышение концентрации IgE. При этом наблюдалась дисрегуляция в синтезе цитокинов, что выражалось в изменении соотношения IFN-y и IL-4 во всех группах. Механизмы цитокиновой дисрегуляции, вероятно, различны - в группе больных до начала патогенетической терапии это связано с резким повышением концентрации IL-4, а в группах больных, находившихся на длительной стероидной терапии - с резким снижением концентрации IFN-y.

6. Уровень синтеза IgE мононуклеарами периферической крови in vitro практически у всех больных гломерулонефритом повышен, особенно на фоне длительной стероидной терапии.

7. Изменение уровня IgE in vitro обусловлено снижением синтеза IFN-y и, в меньшей степени, накоплением IL-4, что также имеет прямое отражение в

соотношении и концентрации этих веществ в сыворотке крови практически во всех группах больных.

8. Анализ зависимости уровня синтеза 1§Е-регуляторных цитокинов показал, что концентрация 1Ь-4 в стероидорезистентных группах выше, чем в стероидочувствительных. Обратная картина наблюдается в отношении концентрации ПТЧ-у, что особенно выражено в зависимости от длительности проведения патогенетической кортикостероидной терапии.

9. В ходе исследования разработаны три прогностические модели, основанные на результатах дискриминантного анализа:

а) для больных хроническим гломерулонефритом до начала патогенетической терапии;

б) для больных хроническим гломерулонефритом, длительное время находящихся на патогенетической терапии,

в) для больных хроническим гломерулонефритом, осложненным ХПН.

Данные модели позволяют с достаточно высокой диагностической чувствительностью и специфичностью прогнозировать клинический исход заболевания и возникновение стероидорезистентности, что обуславливает необходимость изменения модальности глюкокортикоидной терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Изучение уровня 1Ь-4 и П-К-у в крови у больных хроническим гломерулонефритом позволяет получить дополнительную информацию о клиническом течении заболевания, важную для прогноза его дальнейшего развития.

2. Подстановка соответствующих показателей в дискриминантную функцию ДФ = 3,10х 1ёЕ + 29,91 х 1Ь-4 + 21,85* ПТЧ-у- 5435,63 у больных хроническим гломерулонефритом до начала проведения патогенетической терапии позволяет на ранних этапах лечения прогнозировать развитие стероидорезистентности при отрицательном значении ДФ.

3. Подстановка соответствующих показателей в дискриминантную функцию ДФ=2,73хС-РБ+4,37хИРИ+38,1 Mg G+44,00xIg E+3,78xIL-4+13,97xIFN-y -8735,41 у больных хроническим гломерулонефригом, длительное время получающих лечение глюкокортикоидами, позюляет прогаозировать развитие сгероидорезистентности при отрицательном значении ДФ.

4. Подстановка соответствующих показателей в дискриминантную функцию ДФ=8,53хСБЗабс + 27,14 xIgE + 17,29 х IL-4 + 28,48 х IFN-y - 3897,37 у больных хроническим гломерулонефригом, осложненным ХПН, позволяет прогнозировать развитие сгероидорезистентности при отрицательном значении ДФ.

5. Изучение культуральных свойств мононуклеаров периферической крови вследствие значительной трудоемкости и сонаправленного характера изменений не дает значимых преимуществ в иссследовании IgE и описанных нами IgE-регуляторных цитокинов по сравнению с анализом соответствующих показателей в крови больных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федичева H.A. Особенности применения критерия х2 при доказательстве однородности половозрастной структуры больных разных групп / Горбов JI.B., Сухинин A.A., Агаева З.А., Федичева Н.А // Информатика и системы управления.- 2008-№ 2 (16).- С. 122 - 124

2. Федичева H.A. Особенности цитокиновой регуляции при обострении хронического нефрита у больных с благоприятным и неблагоприятным исходом лечения / Федичева H.A., Ханферян P.A. // Кубанский научный медицинский вестник.-2009-№ 5-С. 121 - 126.

3. Федичева H.A. Прогностическая оценка уровня IgE и цитокинового баланса при хроническом нефрите / Федичева H.A., Ханферян P.A., Агаева З.А. // Кубанский научный медицинский вестник.- 2009.- № 7- С. 151-154.

4. Федичева H.A. Особенности цитокинового баланса и концентрации иммуноглобулина Е у больных хроническим нефритом в зависимости от результатов проведенного лечения / Федичева H.A., Багдасарьян A.C., Ханферян P.A., Горбов JI.B. // Медицинская иммунология.- 2010 - Т. 12-№ 4-5.- С. 343 - 348.

5. Федичева H.A. Прогнозирование осложненного течения острого нефрита / Федичева H.A., Ханферян P.A., Шахрай Ю.И., Горбов JI.B. // Актуальные вопросы заместительной почечной терапии, гемафереза и

трансплантационной координации: Тезисы докладов. Ежегодная научно-практическая конференция Центрального федерального округа РФ- М., 2010,- С. 47.

6. Федичева H.A. Прогнозирование эффективности стандартной терапии острого нефрита / Федичева H.A., Ханферян P.A., Шахрай Ю.И., Горбов Л.В. // Труды межрегионального форума «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии - междисциплинарные проблемы» 27-30 сентября 2010 года, Санкт-Петербург. Ill Российский аллергологический журнал -2010 -№5-вып.1.-С. 311 -312.

7. Федичева H.A. Ранний прогноз некоторых осложнений у больных с хронической болезнью почек / Шахрай Ю.И., Федичева H.A., Ханферян P.A., Горбов Л.В. // Немедикаментозная оптимизация состояния человека: мат-лы Междунар. заочн. науч.-практ. конф.- Тамбов, 2010. С. 178 - 182.

8. Федичева H.A. Математическое прогнозирование неадекватного ответа на лечение у больных с манифестацией нефрита как перспективный подход к профилактике хронической болезни почек / Федичева H.A., Шахрай Ю.И., Ханферян P.A., Агаева З.А., Багдасарян A.C., Горбов Л.В. // Актуальные вопросы практического здравоохранения: мат-лы Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова. Тамбов, 2010. С.123-132.

9. Fedicheva N. Levels of IgE in Acute Nephritis Patients as Related to the Efficacy of Treatment / Khanferyan R., Fedicheva N., Shakhrai J., Gorbov L., DuBuske L.M. // Supplement to The journal of Allergy and Clinical Immunology-v. 127.-№ З.-Mach 2011.-P. AB23

10. Федичева H.A. Концентрация IgE и цитокиновый баланс в динамике развития гломерулонефрита / Горбов Л.В., Федичева H.A., Ханферян P.A. // Кубанский научный медицинский вестник - 2011 — № 3 - С. 62 - 66.

Подписано в печать 11.05.2011г.

Формат 60x84 V16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,63. Тираж 100 экз. Заказ № 132 от 11.05.11 г. Напечатано в типографии «АДАС» ИП Сафронович Игорь Александрович ОГРН 310231020000039 с оригинал-макета заказчика. 350000, г. Краснодар, ул. Гоголя, 55. Тел.:(861)275-02-30

В настоящее время гломерулонефрит рассматривается как основное заболевание, приводящее к развитию хронической болезни почек (ХБП) [Алиев P.A. 2001; Сергеева Т.В., Маткеримов Д.А., Туманова Д.А., 2003; Борисова Т.П. и др, 2005, 2007]. Лечение больных с ХБП требует проведения заместительной почечной терапии, что подразумевает необходимость использования одного из трех основных методов заместительной почечной терапии (ЗПТ) - программного гемодиализа, перитонеального диализа, либо трансплантации почки. Часто среди больных ХБП превалируют лица молодого социально и экономически активного возраста [Алиев P.A., 2001]. В последние годы наблюдается устойчивый рост числа больных, требующих проведения ЗПТ, что ложится тяжелой ношей на современное здравоохранение, учитывая высокий уровень затрат, необходимый на проведение каждой процедуры гемодиализа.

Согласно данным Регистра ЗПТ количество больных, нуждающихся в проведении ЗПТ, постоянно возрастает. В 1998 году их число составило 8 228 человек, а в 2007 - 20 212 или 142,3 человека на миллион населения [Бибиков Б.Т., Томилина H.A., 2009]. В то же время следует отметить, что эта величина далека от реально существующей потребности, так как только в 2000 году более 300 000 человек страдали ХБП и нуждались в ЗПТ [Arnold W.P., 2000].

Патогенез гломерулонефрита условно может быть разделен на две стадии: иммунную и воспалительную [Вашурина Т. В., Сергеева Т. В., 2002].

Иммунная стадия включает различные звенья иммунного ответа на чужеродные или собственные антигены и заканчивается образованием иммунных комплексов и/или аутоантител [Ring G.H., Lakkis F.G., 1998], поэтому независимо от стадии развития, морфологической и клинической формы заболевания гломерулонефрит рассматривается как аутоиммунный патологический процесс. Основное внимание исследователей при анализе данного заболевания обычно привлечено к тем или иным аспектам формирования иммунных комплексов, их адгезии к базальной мембране клеток почечной паренхимы, тогда как другие механизмы иммунной регуляции в значительной степени оказываются нераскрытыми. Только в последние годы доказано участие про- и противовоспалительных цитокинов в патогенезе иммунокомплексных пролиферативных гломерулонефритов. К числу факторов, участие которых в повреждении почечных тубулоинтерстициальных структур достоверно доказано, относится у-интерферон и другие цитокины. По мнению ряда авторов ухудшение функционального состояния почек однозначно выражается в увеличении провоспалительных и снижении активности противовоспалительных цитокинов как параметров субклинического воспаления [Вилевальде C.B. и др., 2007; Гудгалис Н.И. и др., 2007; Исикова Х.В., 2008].

Вторая стадия заболевания подразумевает возникновение и прогрессирование почечного иммунного воспалительного процесса, который запускается и пролонгируется данными иммунными агентами. Она включает активацию собственно почечных клеток, миграцию моноцитов, лимфоцитов, нейтрофилов в гломерулу и интерстиций, а также высвобождение медиаторов тканевого повреждения [Couser W.G., 1998; Ring G.H., Lakkis F.G., 1998; Segerer S., Nelson P.J., Schlondorff P., 2000].

В конце 80-х годов прошлого века было экспериментально показано, что клеточно-опосредованный иммунитет при гломерулонефрите может проявлять себя посредством нескольких механизмов. К их числу относятся: антителонезависимая цитотоксичность, обусловленная Т-киллерами; антителозависимая цитотоксической активность киллеров, в том числе естественных; гиперчувствительность замедленного типа при взаимодействии Т-хелперов с мононуклеарными фагоцитами, и, наконец, активность натуральных киллеров [Matsumo К. et al., 1986; McCluskey R.T., Bhan A.K., 1986].

Лечение гломерулонефрита включает в себя несколько компонентов, важнейшим из которых, наряду с этиотропной (антибиотики при манифестации заболевания), симптоматической (диуретики, антигипертензивные препараты), является патогенетическая терапия с применением кортикостероидов (и цитостатиков). Клинически важную роль играет ответ на проводимую терапию кортикостероидами, когда заболевание может проявляться в стероидочувствительной, стероидозависимой и стероидорезистентной форме [Эрман М.В., 2010].

Ход лечения, прогноз, клинический исход во многом зависят от стероидочувствительности больного гломерулонефритом.

Недавно в работах исследователей из Санкт-Петербурга было отмечено значительное повышение уровня IgE в крови детей, страдающих нефротическим синдромом с минимальными изменениями. Причем это повышение было более значительным, чем у детей с атопическим дерматитом, являющимся классическим заболеванием аллергического генеза [Тур И.И., Савенкова Н.Д., Назаров П.Г. и др., 2007; Савенкова Н.Д., Батракова И.В., Тур И.И., 2008].

Ряд авторов при волчаночном нефрите показал увеличение концентрации IgE, что позволило предположить возможную роль этого иммуноглобулина в патогенезе данного заболевания [Elkayam О, et al, 1995; Shahar Е., Lorber М., 1997; Atta A.M. et al, 2004]. Кроме того, о взаимосвязи волчаночного нефрита с аллергией говорит повышение концентрации в том и в другом случае некоторых цитокинов, таких как IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10, вызывающих сдвиг дифференцировки наивных Th0 в направлении Th2 [Morton S., et al., 1998].

Вместе с тем, изучение уровня такого классического маркера аллергического воспаления, как IgE, практически осталось за рамками внимания исследователей. В доступной литературе нами не обнаружено сведений об изучении этого показателя у больных с различными стадиями нефрита, а также попыток трактовки развития нефрита с позиций параллелизма его патогенеза с патогенезом аллергии.

Учитывая социальную значимость нефрита, терминальные стадии которого приводят пациента к ХБП, требующей проведения программированного гемодиализа, особый интерес представляет раннее прогнозирование динамики данного заболевания на протяжении всего морбидного периода.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Установить патогенетическую роль и ^Е-регуляторных цитокинов (1Ь-4 и 1Р1чГ-у) в развитии хронического гломерулонефрита и оценить прогностическое значение указанных факторов в течении заболевания и эффективности проводимой терапии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Анализ состояния Т-клеточного звена иммунитета у больных хроническим гломерулонефритом на фоне патогенетической терапии кортикостероидами.

2. Провести сравнительный анализ отличий в концентрации 1§Е и ^Е-регуляторных цитокинов (1Ь-4 и ШЫ-у) в крови больных хроническим гломерулонефритом и практически здоровых лиц.

3. Охарактеризовать динамику концентрации І^Е и ^Е-регуляторных цитокинов на разных этапах патогенетической терпии у больных хроническим гломерулонефритом в зависимости от эффективности проводимого лечения.

4. Провести сравнительный анализ синтеза І^Е и ^Е-регуляторных цитокинов в культуре мононуклеаров периферической крови у больных хроническим гломерулонефритом.

5. Оценить динамику синтеза І^Е и ^Е-регуляторных цитокинов на разных этапах патогенетической терапии у больных хроническим гломерулонефритом в зависимости от эффективности проводимого лечения.

6. Предложить феноменологическую схему прогноза эффективности проводимой стандартной терапии, основывающуюся на учете лабораторных оценок некоторых клинико-биохимических показателей, 1§Е и цитокинового баланса.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

В результате проведенных исследований впервые:

1. изучена концентрация ^Е и некоторых ^Е-регуляторных цитокинов в крови у больных хроническим гломерулонефритом;

2. изучена концентрация ^Е и некоторых ^Е-регуляторных цитокинов в клеточной культуре мононуклеаров периферической крови у больных хроническим гломерулонефритом;

3. охарактеризована динамика концентрации 1§Е и некоторых 1§Е-регуляторных цитокинов на разных этапах патогенетической терпии у больных хроническим гломерулонефритом в зависимости от её эффективности^

4. предложена и реализована методика прогнозирования эффективности ответа на проведение стандартной терапии, в основе которой лежит изучение концентрации некоторых клинико-биохимических показателей, ^Е и 1§Е-регуляторных цитокинов в крови больных.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

В результате проведенной работы на защиту диссертации выносятся следующие положения:

1. у больных хроническим гломерулонефритом в крови и культуральной жидкости мононуклеаров периферической крови наблюдается достоверное увеличение концентрации по отношению к уровню практически здоровых лиц;

2. прогрессирование гломерулонефрита и его стероидорезистентность при патогенетической терапии сопровождается ростом концентрации ^Е в крови больных;

3. исходно высокий уровень І£Е в крови до начала проведения патогенетической терапии является маркером стероидорезистентности у больных с хроническим гломерулонефритом;

4. высокий уровень ^Е в крови у больных хроническим гломерулонефритом, осложненным хронической почечной недостаточностью, является неблагоприятным фактором течения заболевания;

5. у больных с хроническим гломерулонефритом концентрация 1Ь-4 достоверно превышает уровень здоровых лиц, как до начала патогенетического лечения, так и при длительном его проведении;

6. в крови больных хроническим гломерулонефритом, резистентных к патогенетической терапии глюкокортикоидами уровень 1Ь-4 достоверно выше по сравнению с группой стероидочувствительных больных;

7. в крови больных хроническим гломерулонефритом, резистентных к патогенетической терапии глюкокортикоидами уровень ШЧ-у достоверно снижен по сравнению с группой стероидочувствительных больных;

8. применение многомерного статистического анализа полученных иммунологических данных позволяет получить дискриминантные модели, позволяющие с высокой вероятностью предсказывать характер клинического исхода заболевания.

НАУЧНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

В ходе работы впервые изучена концентрация 1§Е и некоторых 1§Е-регуляторных цитокинов в крови и в клеточной культуре мононуклеаров периферической крови у больных с хроническим гломерулонефритом.

Впервые изучена взаимосвязь изученных иммунологических показателей с клиническим результатом проводимой стандартной патогенетической терапии различных форм гломерулонефрита.

Особую теоретическую значимость представляют полученные результаты, связывающие прогрессирование хронического гломерулонефрита и характер клинического ответа на проводимую терапию с поликлональной активацией гуморального звена иммунитета, что позволяет предположить возможные изменения в понимании патогенеза данного заболевания.

Итогом проведения исследований явилось обоснование применения некоторых иммунологических данных для мониторинга состояния больных с хроническим гломерулонефритом и для прогноза результатов проведения патогенетической терапии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Выявленные факты гиперпродукции 1§Е у больных с хроническим гломерулонефритом и отличия в концентрации І^Е-регулирующих цитокинов позволяют предположить наличие поликлональной активации гуморального звена иммунитета в патогенезе данного заболевания, что может привести к разработке новых схем лечения этих больных.

Достоверные различия в уровне ^Е и ^Е-регулирующих цитокинов у больных с различным клиническим результатом лечения позволяет дифференцированно относиться к интенсивности проводимой терапии, даже при условии получения изолированной информации о каком-либо из исследованных показателей.

Предложенные дискриминантные модели, учитывающие концентрацию І^Е и ^Е-регуляторных цитокинов в крови больных, позволяют с высокой вероятностью прогнозировать отсутствие эффективного ответа на проведение стандартной терапии у больных при различных стадиях гломерулонефрита.

СВЕДЕНИЯ О ВНЕДРЕНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на кафедре клинической иммунологии и лабораторной диагностики Кубанского государственного медицинского университета и кафедре клинической иммунологии ФПК и ППС Ростовского государственного медицинского университета.

Полученные результаты внедрены в практику работы терапевтического отделения №2 МУЗ «Краснодарская городская клиническая больница скорой медицинской помощи»; центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет»; кафедры общей и клинической патологической физиологии ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет».

По результатам исследования оформлена заявка на патент «Способ прогнозирования эффективности планируемой стандартной терапии острого нефрита», на которую получено положительное решение.

Основные положения диссертационной работы представлялись на ежегодной научно-практической конференции Центрального федерального округа РФ «Актуальные вопросы заместительной почечной терапии, гемафереза и трансплантационной координации» (Москва, 2010); научных конференциях «Актуальные ■ вопросы аллергологии и иммунологии -междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010),

Немедикаментозная оптимизация состояния человека» (Тамбов, 2010); «Актуальные вопросы практического здравоохранения» (Тамбов, 2010), международной конференции «4th Drug Hypersensitivity Meeting» (Рим, 2010).

Основное содержание диссертационной работы изложено в 7 статьях в журналах, входящих в перечень, рекомендованный ВАК для публикации результатов работ соискателей ученой степени кандидатов и докторов наук и 5 тезисах региональных и межрегиональных конференций.

В заключение, хочу выразить бесконечную признательность своему научному руководителю, доктору медицинских наук профессору, заведующему кафедрой клинической иммунологии и лабораторной диагностики Кубанского государственного медицинского университета Роману Аваковичу Ханферяну за всемерную помощь и поддержку в написании этой работы.

ВЫВОДЫ

1. Установлена дизрегуляция в составе иммунокомпетентных лимфоидных клеток, заключающаяся в снижении количества CD3(+)-, С04(+)-лимфоцитов и относительной лимфоцитопении, наиболее выраженная в группах длительно болеющих лиц.

2. Проведение патогенетической терапии приводит к снижению абсолютного числа СОЗ(+)-лимфоцитов во всех группах больных гломерулонефритом, наиболее выраженному у больных' с манифестацией^ заболевания.

3. При проведении патогенетической терапии в группе больных, ранее не получавших лечения • глюкокортикоидами, отмечено снижение содержания CD4(+)- и повышение С08(+)-лимфоцитов, что привело к выраженному уменьшению иммунорегулятоного индекса.

4. Анализ- состояния иммунной системы показал снижение числа СОЗ(+)-лимфоцитов в стероидорезистентных подгруппах при отсутствии различий в содержании и соотношении иммунорегуляторных субпопуляций, а также отсутствие подобных изменений у стероидочувствительных больных

5. Значительное повышение концентрации IgE вероятнее всего обусловлено изменением цитокиновой регуляции, что выражалось в резком снижении соотношения IFN-y к IL-4 во всех группах. Механизмы дисрегуляции, вероятно, различны - в группе больных до начала патогенетической терапии' это связано с резким повышением концентрации IL-4, а в группах больных, находившихся на длительной стероидной терапии - с резким снижением концентрации IFN-y.

6. Уровень синтеза IgE мононуклеарами периферической крови in vitro практически у всех больных гломерулонефритом повышен, особенно на фоне длительной стероидной терапии.

7. Изменение уровня IgE in vitro обусловлено снижением синтеза IFN-y и, в меньшей степени, возрастанием концентрации IL-4, что также имеет прямое отражение в соотношении и концентрации этих веществ в сыворотке крови практически во всех группах больных.

8. Анализ зависимости уровня синтеза ^Е-регуляторных цитокинов показал, что концентрация ІЬ-4 в стероидорезистентных группах выше, чем в стероидочувствительных. Обратная картина наблюдается в отношении концентрации ШЧ-у, что особенно выражено в зависимости от длительности проведения патогенетической кортикостероидной терапии.

9. В ходе исследования разработаны три прогностические модели, основанные на результатах дискриминантного анализа: а) для больных хроническим гломерулонефритом до начала патогенетической терапии; б) для больных хроническим гломерулонефритом, длительное время находящихся на патогенетической терапии, в) для больных хроническим гломерулонефритом, осложненным ХПН.

Данные модели позволяют с достаточно высокой диагностической чувствительностью и специфичностью прогнозировать клинический исход заболевания и возникновение стероидорезистентности, что обуславливает необходимость изменения модальности глюкокортикоидной терапии.

ГЛАВА VI ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследованиями последних лет убедительно доказано, что в патогенезе гломерулонефрита важную роль играет иммунное воспаление [Батурина Т. В., Сергеева Т. В., 2002]. Иммунное воспаление имеет различные механизмы и включает практически все звенья иммунного ответа и заканчивается образованием иммунных комплексов и/или аутоантител [Ring G.H., Lakkis F.G., 1998]. В связи с этим гломерулонефрит рассматривается как аутоиммунный патологический процесс. В течение последних лет было доказано участие про- и противовоспалительных цитокинов в патогенезе иммунокомплексных пролиферативных гломерулонефритов. Среди важнейших факторов, приводящих к повреждению почечных тубулоинтерстициальных структур, необходимо отметить такие, как IFN-y, IL-6 и другие цитокины.

В конце 80-х годов прошлого века было экспериментально показано, что клеточно-опосредованный иммунитет при гломерулонефрите играет ключевую роль в развитии данной патологии [Matsumo К. et al., 1986; McCluskey R.T., Bhan A.K., 1986].

Ранее было показано, что при ряде заболеваний не аллергического генеза, в основе которых может лежать иммуно-воспалительный процесс (ревматоидный артрит, атопический дерматит, лимфопролиферативные заболевания, волчаночный нефрит наблюдается увеличение концентрации IgE, изменение продукции и синтеза важнейших IgE-регуляторных цитокинов, таких как IL-4, IFN-y и др., что позволило предположить возможную роль этого иммуноглобулина в аутоиммунных заболеваний почек [Elkayam О, et al, 1995; Shahar Е., Lorber М., 1997; Atta A.M. et al, 2004]. Кроме того, о взаимосвязи волчаночного нефрита с аллергией, как указывалось ранее, говорит повышение концентрации в том и в другом случае некоторых цитокинов, таких как IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10, вызывающих сдвиг дифференцировки наивных Th0 в направлении Th2 [Morton S., et al., 1998].

Необходимость установления патогенетической роли IgE и IgE-регуляторных цитокинов в патогенезе нефрита очевидна. Большой интерес представляет раннее прогнозирование динамики всех стадий данного заболевания (острого, хронического и терминального).Возможность использования таких маркеров иммунного процесса, как IgE и IgE-регуляторные цитокины для прогнозирования течения заболевания, эффективности проводимой терапии, также представляет значительный-« интерес. Ранее подобный подход был успешно применен при оценке эффективности терапии лимфопролиферативных заболеваний (Ригер H.A., 2005). Изучение динамики концентрации Ig Е и ряда Ig Е-регуляторных цитокинов в ходе лечения различных вариантов гломерулонефрита, сопоставленное с особенностями клинического течения почечного поражения позволит расширить представления о патогенезе данного заболевания, с большей точностью оценивать активность гломерулонефрита, максимально рано предсказывать характер его течения, возможные осложнения и развитие ХПН. Таким образом, это позволит улучшить результаты лечения больных нефритом, уменьшить количество осложнений и инвалидизации больных, получив тем самым значительный экономический и социальный эффект.

В данной работе впервые изучена не только концентрация IgE и основных IgE-регуляторных цитокинов (IL-4, IFN-y) в периферической крови, но* и в клеточной культуре МПК у больных с хроническим гломерулонефритом до начала патогенетической терапии« с применением кортикостероидов, при сроках проведения такой терапии в течение 4+8 лет и при осложнении хронического гломерулонефрита ХПН І+ІІБ ст. Исследовалось также взаимосвязь изученных иммунологических показателей с клиническим результатом проводимой стандартной терапии хронического гломерулонефрита.

Учитывая важную роль Т-лимфоцитов в продукции IgE и IgE-регуляторных цитокинов, был проведен сравнительный анализ роли всех указанных факторов в иммунопатогенезе гломерулонефрита и оценена возможность использования их как в качестве прогностических и диагностических маркеров воспаления при гломерулонефрите, так и для оценки эффективности проводимой терапии.

Анализ биохимических данных у больных хроническим гломерулонефритом (табл. 6.1) показал наличие воспаления и интоксикации до начала терапии (при поступлении больных). Об этом свидетельствовало умеренное повышение С-реактивного белка, повышение содержания в крови молекул средней массы и др. показателей, особенно выраженное у больных с осложнением в виде ХПН.

Исследование содержания иммунокомпетентных лимфоидных клеток показало, что количество CD3(+) лимфоцитов в значительно большей' степени снижено в III группе больных (и в абсолютном, и относительном выражении). Во II группе, несмотря на нормальные относительные величины, наблюдается снижение абсолютных показателей, в основном за счет снижения относительного содержания всех лимфоцитов крови.

Изучение иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов - CD4(+) и CD8(+) показало, что значительное снижение содержания С04(+)-лимфоцитов во II и III группах больных происходит, главным* образом, за счет снижения, как относительного содержания этих клеток, так и выраженной относительной лимфоцитопении. Данный показатель во II и III группах ниже, чем в IV группе практически здоровых лиц в 2 и 3 раза, соответственно. При этом, даже, несмотря на умеренное повышение общего содержания лейкоцитов во II группе на 35% относительно практически здоровых лиц, абсолютное содержание С04(+)-лимфоцитов во II и III группах больных при поступлении составляет 45 и 18% от уровня лиц IV группы, соответственно.

Табл. 6.1. Биохимические и иммунологические показатели сыворотки крови обследованных групп лиц (медиана) признак группа ^ С-РБ, нг/мл МСМ, усл.ед. Лейкоциты, хЮ9/л Лимфоциты % <10% СБЗ(+) % // <10% СБ4(+) % // <109/л СЭ8(+) % <ю% ИРИ, еД. С019(+) % <10%

IV 3,0 195 5,7 35 >,07 72,3 [,37 52,2 1,12 21,7 3,45 2,53 9,3 3,22

I ДО 23,0 247 11,3 28 3,12 66,5 2,10 50,9 22,1 3,70 2,30 14,2 /^0,40 после 10,7 196 6,6 26 1,70 68,0 [,15 47,6 1,48 27,2 ^^3,85 1,84 12,3

II до 9,5 450 9Д 17 1,40 73,9 ),98 37,8 3,50 34,2 3,50 1Д4 12,1 3,18 после 5,0 226 6,0 14 ),96 62,5 ),61 36,8 3,50 26,2 3,39 1,50 10,1 3,16

III до 20,4 860 6,6 12 ),76 39,9 ^^ 3,38 28,6 3,20 23,5 3,17 1Д9 10,2 3,07 после 17,7 847 5,5 10 ^^),58 44,6 0,31 28,4 3,24 22,6 3,16 1,29 8,8 3,07

В то же время в результате повышения на 45% СБ4(+) и повышения на 55% С08(+)-лимфоцитов у больных с хроническим гломерулонефритом до начала патогенетической терапии наблюдается только незначительное уменьшение ИРИ (рМу-0,03). С учетом проведения множественных сравнений и учета поправки Бонферрони такой уровень значимости должен быть признан недостоверным. Данное наблюдение может свидетельствовать о том,1 что при манифестации гломерулонефрита до начала патогенетической терапии реактивность организма остается высокой, что способствует динамике заболевания.

Проведенная терапия в целом приводит к снижению абсолютного числа клеток, несущих СЭЗ(+) маркер во всех группах, при этом самое значимое снижение наблюдалось в I группе больных, у которых ранее не проводилась патогенетическая терапия. Снижение числа клеток достигало 45%, тогда как во II и III группах оно составило 38% и 18%, соответственно. В динамике лечения в указанной группе отмечено, снижение СП4(+)-лимфоцитов на 9% и повышение С08(+)-лимфоцитов на 21%, что привело к выраженному уменьшению ИРИ на 20 (риу<0,001).

Наиболее интересные данные были получены при- анализе иммунологических показателей в зависимости от эффективности патогенетической терапии с использованием глюкокортикоидов. Для проведения этого анализа больные были разделены (табл. 6.2) на подгруппы стероидочувствительных (СтЧ) и стероидорезистентных лиц (СтР).

При анализе данных было - установлено, что во всех анализируемых группах наблюдалась сходная, картина, а именно снижение числа-СВЗ(+)-лимфоцитов в стероидорезистентных подгруппах. В то же время различий в содержании и соотношении иммунорегуляторных субпопуляций в зависимости от чувствительности к стероидной терапии практически не наблюдалось.

Табл. 6.2. Биохимические и иммунологические показатели сыворотки крови обследованных групп лиц (медиана) в зависимости от,результатов терапии и сроков наблюдения выше диагонали - до, ниже - после лечения) признак группа \ С-РБ, нг/мл МСМ, усл.ед. Лейкоциты, х109/л Лимфоциты %(х109/л) СБЗ(+) %(хЮ9/л) СЭ4(+) %(хЮ9/л) СБ8(+) %(хЮ9/л) ИРИ, ед. СБ19(+) %(х109/л)

IV 3,0 195 5,7 35(2,07) 72,3(1,37) 52,2(1,12) 21,7(0,45) 2,53 9,3(0,22)

I СтЧ 21,0 /" 6,0 267 /^ 180 12,9 /^ 7,4 31,0 /" 26,0 72(2,70)/ /^8(1,15; 52(2,00)/^ /^8(1,36] 21(0,83)/^ /15(0,98) 2,50 /' 1,95 15(0,95) /Щ0,54)

СтР 29,0 /" 14,0 287 198 10,6 /^ /^ 5,4 27,0 /X 25,0 65(1,90)/ /^1,04; 50(1,49)/^ /48(1,36; 25(0,72)/' /¿8(0,80; 2,00 /" /^1,68 12(0,36)/^ /0(0,29;

II СтЧ 9,0 4,0 445 220 8,7 6,8 17,0 14,0 75(0,96)/ /що,бз; 39(0,50) /<38(0,50; 34(0,47) /^ /¿3(0,33) 1,16 /^ /^ 1,65 13(0,18) /* /0(0,13)

СтР 10,0 /^ /^ 6,1 490 /" 264 10,8 /' /X 5,3 15,2 13,0 69(1,17/ /68(0,57 29(0,47) /$0(0,47) 34(0,66)/^ /¿6(0,62) 0,80 /^ /^3,86 11(0,34) /^ /П(0,29)

III СтЧ 19,0 15,0 784 /' 794 6,5 /^ /^ 6,0 15,0 /" /10,0 54(0,50)/ /$3(0,31) 29(0,27) /^ /18(0,24) 24(0,20)/' /¿3(0,20) 1,28 /^ 1,24 10(0,07)/" /^7(0,06;

СтР 24,0 /^ 18,0 900 /^ /X 966 7,2 5,0 11,5 /' /^ 9,0 44(0,34)/ /ВДЗО) 29(0,20) /¿0(0,20) 24(0,16) // /¿1(0,16) 1,13 /^ /X 1,34 10(0,09)/^ /9(0,07;

Анализ продукции 1§Е и 1§Е-регуляторных цитокинов показал значительные изменения не только в их содержании в периферической крови, но и в их синтезе мононуклеарными клетками периферической крови (табл. 6.3).

В частности, можно отметить, что сывороточная концентрация ^Е во всех исследуемых группах больных значительно превышала величины указанного иммуноглобулина у практически здоровых лиц IV группы« (в 4,9+6.9 раз). Причем наиболее выраженное повышение наблюдалось у больных 1Г и ПГ групп, длительно находящихся на иммунодепрессивной терапии. При этом, проведение патогенетической терапии приводило к значительному повышению концентрации ^Е только в III группе больных с наличием ХПН ИШ ст (в 1,85 раза).

Можно предполагать, что повышение концентрации ^Е у больных, вероятнее всего, обусловлено изменением цитокиновой регуляции. При этом наблюдается выраженная дисрегуляция в синтезе цитокинов, что выражалось в изменении соотношения 1Ь-4 к ШМ-у. Во всех группах отмечено резкое снижение данного индекса. И если в 1 группе это связано напрямую с резким повышением концентрации 1Ь-4, то во II и III группах это снижение обусловлено не столько изменениями в концентрации 1Ь-4, а в большей степени зависело от резкого снижения концентрации ШЫ-у.

Учитывая, что снижение концентрации ШЫ-у. наблюдалось лишь в группах лиц, получавших стероидную терапию, нами был проведен анализ концентрации 1§Е и цитокинов в различных по стероидочувствительности подгруппах (табл. 6.4).

Установлено, что концентрации 1Ь-4 в стероидорезистентных группах несколько выше, чем в группах больных, чувствительных к терапии. Вместе с тем обратная картина наблюдается в отношении концентрации Шч!-у, что особенно выражено в зависимости от длительности проведения патогенетической кортикостероидной терапии (III группа).

Табл. 6.3. Иммунологические показатели (медиана) в сыворотке крови и культуральной жидкости МПК признак группа ^Е сыв, ед/мл 1Ь-4 сыв, пг/мл ШМ-у сыв, пг/мл 1Ь-4 сыв, ед. ед/мл 1§Е8Ь ед/мл 1Ь-45р, пг/мл 1Ь-4* пг/мл пг/мл пг/мл

IV 12 6,9 179,0 28,3 0,02 0,03 3,3 3,9 152 169

I до 276 30 178,7 ' 4,6 0,07- 0,08 ' 3,5 5,5 ' 39 •55 после 311 0,06 0,09 с 1.

II до 307 18 99,5 6,2 0,09 0,11 6,2 9,1 33 31 после 291 0,10 0,12

III до 391 31 20,1 1,3 0,11 0,12 2,5 3,7 25 28 после 725 0,12 0,14

Табл. 6.4. Иммунологические показатели (медиана) в сыворотке крови и культуральной жидкости МПК обследованных групп лиц в зависимости от результатов терапии и сроков наблюдения (выше диагонали - до, ниже признак группа 1§Е сыв, ед/мл 1Ь-4 сыв, пг/мл ШЫ-у сыв, пг/мл 1Ь-4 сыв, ед. ед/мл ед/мл 1Ь-4<ф, пг/мл 1Ь-451, пг/мл ШМ-узр, пг/мл П^-Тя, пг/мл

IV 12 6,9 179,0 28,3 0,02 0,03 3,3 3,9 152 169

I СтЧ 272 ./ 154 Ж 197^5/ 0,05 ./ /0,06 0,06 ./ /^0,06 3,5/ ^у ^ху

СтР 280 ./ 701 уьу уухр/ ^/ 0,07 >/ /0,08 0,08 ,/ /0,09 5^7/ 62/ ./ с

II СтЧ 227 ./ >/140 шу 0,08 /0,08 0,10 ./ /0,08 ^у ^ьу ^ъу 70

СтР 307 >/ 513 жу 87,4/ ъу 0,09 /^ /одо 0,12 ./ /0,13 ^у ту гу

III СтЧ 246 >/ 211 у 0,07 /0,07 одо /' /0,12 ^у ^ъъу

СтР 650 /^ >/830 уьу \ьу 1,0/ 0,12 >/ /0,13 0,13 /^ /0,15 ^у ^у ^ту

В результате проведенной терапии, отмечена зависимость между выявленным цитокиновым дисбалансом и продукцией IgE. Показано, что терапия в подгруппе, резистентной к стероидам приводит к значительному повышению продукции IgE. Можно предполагать, что это является неблагоприятным признаком проводимой патогенетической терапии; В то же время при выраженной чувствительности к терапии гормонами наблюдается снижение концентрации IgE, что говорит о благоприятном результате проведения патогенетической!терапии;

Анализ уровня синтеза! IgE в различных группах больных показывает, что практически; у всех больных наблюдается: повышенный синтез; in vitro мононуклеарами: периферической: крови; IgE. Причем, длительная терапия стероидами, в некоторой степени; активирует синтез IgE, который оказался наиболее выраженным в III группе.

Исследование: механизмов изменений синтеза IgE показало, что: его синтез в; культуре лимфоцитов: обусловлен, главным- образом, снижением синтеза IFN-y и, в меньшей степени, IL-4-зависим.

Следует отметить, что- между содержанием в сыворотке крови IgE, IL-4, IFN-y и их синтезом in vitro имеется; прямая взаимосвязь. Их изменение однонаправлено практически во всех группах больных (табл. 6.3)

Дальнейший анализ по результатам исследования IgE, IL-4 и IFN-y in vitro показал, что- эти данные менее информативны для оценки эффективности терапии в различных подгруппах, по сравнению с исследованием указанных цитокинов и IgE в сыворотке периферической крови: (табл. 6.4). Кроме: того, высокая; трудоемкость, культуральных исследований, не дает возможности рекомендовать их для массового применения для оценки эффективности патогенетической терапии.

Полученные в результате: исследования данные легли в основу разработки прогностической модели, основанной на результатах дискриминантного анализа, позволяющей- с достаточно высокой диагностической; чувствительностью, и специфичностью прогнозировать клинический исход заболевания. В случае лечения впервые выявленного гломерулонефрита до начала проведения патогенетической терапии построенная модель позволяет прогнозировать развитие стероидорезистентности, которая обуславливает необходимость изменения модальности глюкокортикоидной терапии.

В ходе исследования разработаны три дискриминантные модели: для больных хроническим гломерулонефритом до начала патогенетической терапии- ДФ = 3,10х 1ёЕ + 29,91х 1Ь-4 + 21,85х И^-у-5435,63; для больных хроническим гломерулонефритом, длительное время находящихся на патогенетической терапии,

ДФ=2,73хС-РБ+4,37хИРИ+38,11х1ё 0+44,00*^ Е+3,78х1Ь-4+13,97х1РК-у-8735,41; для больных хроническим гломерулонефритом, осложненным ХПН, ДФ=8,53хСБЗабс + 27,14 х 1ё Е + 17,29 х 1Ь-4 + 28,48 х П^-у -3897,37.

После подстановки в соответствующие формулы численных значений биохимических и иммунологических показателей и вычисления значения дискриминантной функции при её величине больше нуля можно прогнозировать дальнейшее благоприятное течение заболевания. В противном случае можно ожидать неадекватного ответа на проводимую терапию, в том числе, возникновение стероидорезистентности.