Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Характеристика IgE-продуцирующих клеток в IgE-ответе у больных поллинозом

министерство здравоохранения россии российский государственный медицйбскии университет

удк 616-022.8 54.2-056.3-092:616.155.32-008.939.624-0 97

БАРАЕВА Людмила Викторовна

характеристика 1дЕ-пр0дуцирущих клеток в 1дЕ-0твете У больных поллинозом

(i4.oo.36 - Аллергология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукописи

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор ПОЛЬНЕР А.А.

Москва - 1^93

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и Институте иммунологии МЗ РФ

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор

A.A. Польнер

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.И. Пыцкий доктор медицинских наук, профессор Б.В. Линегин

Ведущее учреждение: НИИ вакцин и сывороток им- И.И. Мечникова

Защита состоится " "___ 1993 года

в " " часов на заседании Специализированного Совета д 084.14.06 в Российском Государственном Медицинском Университете (117869, Москва, ул. Островитянова, 1). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Государственного Медицинского Университета.

Автореферат разослан " "____iq93 г-

Ученый секретарь Специализированного совета доцент

Т.Е. Кузнецова

I Ят-:л I

WEOSi

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Патогенетическая роль антител класса гдЕ в развитии аллергических заболеваний человека является общеизвестной. Достаточно хорошо разработаны иммунологические и патофизиологические механизмы igE-опосредован-ной аллергической реакции (Адо А.Д., 1978, Гущин И.С., 1976). в последние годы исследования синтеза igE у человека проводились в основном в модельных системах in vitro и имели целью изучение молекулярных механизмов активации Т. и В лимфоцитов и их взаимодействия, ведущего к индукции синтеза igE, а также выяснение роли различных цитокинов на этапах активации, пролиферации и дифференцировки лимфоцитов и в реализации эффекторной стадии иммунного ответа (Arai к. et. al, 1992, Kips J.С. et al, 1992, Romagtiani ñ., 1990).

Однако, несмотря на значительны! прогресс в понимании молекулярных и клеточных механизмов индукции синтеза igE, очевидно, что полноценное представление об иммунном ответе невозможно без его изучения на уровне целостного организма. Это предполагает, в частности, исследование заболеваний человека, сопровождающихся повышенной выработкой тдн, и использование методов, позволяющих оценивать активность различных лимфоидных популяций, участвующих в реализации иммунного ответа in vivo. Определение igE-продуцирующей активности мононуклеарных клеток периферической крови (МПК) больных атопическими заболеваниями позволяет приблизиться к решению этой задачи. Однако, до сих пор данный метод использовался в основном для изучения механизмов регуляции синтеза TgE как такового (Romagnani S. et al, 1982, Saxon ^. et al, 1980, Yanagihara y. et al, 1981). Только некоторые исследователи пытались установить соответствие данных, получаемых in vitro, IgE ответу, идущему ill vivo у больных поллинозом (Turner К.Л. et al, 1988).

.■OÜVftVb-'SSH^

Вместе с тем, изучение различных заболеваний человека, сопровождающихся гиперпродукцией igE, требует нового подхода, дифференцирующего IgE ответ как форму гуморального иммунного ответа к антигенам окружающей среды (в , частности, аллергенам), и гиперпродукцию igE под влиянием других активирующих стимулов, возможно, антиген-неспецифических. Это может быть существенным для понимания патогенеза этих заболеваний и разработки методов ик лечения.

Актуальность работы определяется вышеизложенными теоретическими и прикладными аспектами изучения IgE ответа у человека .

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы было изучение IgE ответа к разным группам пыльцевых аллергенов у больных поллинозом в зависимости от.путей контакта с аллергенами в условиях in vivo, и в сравнительном аспекте - гиперпродукции IgE при некоторых иммунодефицитных состояниях (НДС).

В соответствии с этой целью были определены следующие задачи исследования:

1. Изучить спонтанную продукцию IgE МПК больных поллинозом в периоды различной активности выработки IgE - при отсутствии или наличии контакта с причинно-значимыми (релевантными) аллергенами in vivo.

2. Охарактеризовать субпопуляции клеток, которые обеспечивают спонтанную продукцию IgE в культуре МПК в периоды различной активности выработки ГдЕ в организме.

3. Установить, какие характеристики тдЕ ответа, идущего in vivo, находят свое отражение в изменении показателей спонтанной продукции IgE МПК in vitro.

4. у больных поллиноэом изучить особенности igE ответа к разным группам пыльцевых аллергенов и в зависимости от путей их поступления в организм: парентерального при проведении иммунотерапии (ИТ) или через слизистые оболочки дыхательных путей при естественном контакте.

5. У больных некоторыми формами ИДС определить взаимоотношение между igE-продуцирующей активностью МПК in vit.ro и активностью выработки IgE in vivo. ,

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. РАБОТЫ. Впервые определение спонтанно« продукции ТдЕ МПК больных in vitro было использовано как критерий для оценки характера иммунного ответа (igE ответа) in vivo. Установлено, что увеличение IgE-продуцирующей активности МПК у больных поллиноэом-в периоды стимуляции релевантными аллергенами in vivo связано с транзиторной циркуляцией в русле крови пролиферируюиих В клеток-продуцентов. Обнаружение существенного синтеза IgE de novo данной субпопуляцией клеток является показателем активации IgE ответа in vivo и может быть использовано для изучения особенностей igE ответа у больных поллиноэом. ......

Впервые определение спонтанной продукции ТдЕ и аллерген-специфических IgE антител МПК было проведено у больных поллиноэом в процессе специфической ИТ и сопоставлено с наблюдениями в сезоны пыления. Это позволило выявить индивидуальные особенности реагирования больных на разные группы пыльцевых аллергенов - пыльцы деревьев (ЯД) и злаковых трав (ПЗТ), а также зависимость выраженности igE ответа от путей поступления аллергенов в организм больного.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ- Результаты проведенных исследования служат научным обоснованием использования метода определения спонтанной продукции IgE МПК in vitro для изучения ряда- вопросов, имеющих отношение к патогенезу аллергических и неаллергических заболеваний, протекающих с повышением выработки igE или развитием специфического igE ответа. При аллергических заболеваниях они могут быть основой для изучения особенностей ГдЕ ответа к аллергенам различной степени имму-ногенности и иммунологических аспектов специфической ИТ. При неаллергических заболеваниях, включая, некоторые ИДС, - для изучения патогенетической значимости IgE и установления тех стимулов, которые вызнают его повышенную выработку при отсутствии igE-опосредованной аллергии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У больных поллинозом появление пролиферирующих В клеток ^продуцентов igE в циркулирующем пуле лимфоцитов свидетельствует: об активизации igE ответа к релевантным пыльцевым аллергенам in vivo.

2. Определение igE-продуцирующей активности МПК в динамике наблюдения больных поллинозом позволяет выявить особенности igE ответа к разным группам пыльцевых аллергенов в зависимости от путей поступления их в организм.

3. У больных некоторыми формами ИДС igE-продуцирующая активность МПК отражает активность выработки igE в организме.

Настоящая работа выполнена в рамках государственной научно-технической программы 0.69.07, "Иммунология", задание 02.03, темы "Изучение субпопуляций лимфоидных клеток при формировании аллергии немедленного типа", номер гос. регистрации от. 86.о 10286?..

Работа выполнена в ИБХ РАН (лаборатория клеточных взаимодействий, руководитель - профессор И.М.Дозморов) и Институте иммунологии Минздрава РФ - совместно со ст.н.с. к-м.н. В.Ф.Савельевой (лаборатория иммунологии аллергических реакций, руководитель - профессор А.А-Польнер). Обследованные больные наблюдались а клинике Института иммунологии врачами Н.И.Ильиной (зав. поликлиническим отделением), И.В.Данилыче-вой и В.Л.Присяжнюк (отделение "Общая аллергия", зав. к-м.н. Ю.А.Порошмна), С-А-Польнером (отделение "Бронхиальная астма", зав. - к-м.н. Т.А.Червинская), и в отделении "Имму-нодефицить детей" - ведущим научным сотрудником д.м.н. М.Н.Ярцевым и зав. отделением д.м.н. Л-А.Гомес.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Москва, декабрь 1990 г.), международном патофизиологическом конгрессе (Москва, май 1991 г.), доложены и обсуждены на объединенной научной конференции отдела иммунологии ИБХ РАБ и подразделения Института иммунологии Минздрава РФ (декабрь 1492 г.).

ПУБЛИКАЦИИ. Основные результаты исследований по теме диссертации изложены в .3 научных публикациях.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Изложена на 176 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 18 таблицами. Список цитируемой литературы включает 9 о источников-

- б -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основная группа обследованных лиц - 22 больных поллиноэом (аллергический риноконъюнктивит), обследованных в процессе проведения специфической ИТ и в сезоны пыления. У 17 больных этой группы выявлена сочетанная сенсибилизация к аллергенам ПД (березы, ольхи, орешника), и ПЗТ (тимофеевки, ежи, и др.), у 5 больных - только к аллергенам ПЗТ. Для постановки кожных тестов и проведения специфической ИТ использовали стандартные аллергены производства Ставропольского НИИВС. Особенностью в лечении 17 больных с сочетанной сенсибилизацией к аллергенам ПД и ПЗТ было раздельное и последовательное проведение курсов ИТ: вначале аллергенами ПД, а затем аллергенами ПЗТ. Исследования проводились больным в следующие периоды: до начала курса ИТ (1), по достижении максимальной дозы аллергенов ПД (2), по достижении максимальной дозы аллергенов ПЗТ (3), спустя 2 недели, перед введением первых поддерживающих доз аллергенов ПД и ПЗТ (4), и в последующие сезоны пыления деревьев (5) и злаковых трав (6)..У 5 больных поллиноэом с сенсибилизацией только к аллергенам ПЗТ исследования проводили до начала ИТ (1), по достижении максимальной дозы аллергенов ПЗТ (2), спустя ?. недели, перед введением поддерживающей дозы аллергенов ПЗТ (3), и в последующий сезон пыления злаковых трав (4).

Группа больных ИДС включала зо детей, находившихся на лечении в отделении "Иммунодефициты детей"■ В этой группе

. - 7 -

было 12 детей без иммунной недостаточности: у 11 диагностирован атопический дерматит (АД) и у одной больной - поллиноз (АД в анамнезе); 11 детей с селективной недостаточностью igA (CHigA): у 4 больных диагностирован АД, у 3 - хронический бронхит и у 4 - неинфекционноаллергическая бронхиальная аст-ма_ (НАБА, сенсибилизация к бытовым аллергенам); 4 ребенка с синдромом гипер-igE (ГИГЕ) и з ребенка с комбинированной иммунной недостаточностью - синдромом Вискотта-Олдрича (СВО). При всех этих нозологических формах постоянным или часто встречающимся признаком является гиперпродукция igE. В группе больных НДС преобладающими по частоте были.хронические инфекционные поражения ' (кожи, подкожной клетчатки, внутренних органов) - у 26 больных, и поражения кожи в виде АД или экземы - у 21 больного.

Основным методом исследования было определение спонтанной продукции IgE in vitro МПК больных в динамике наблюдения. МПК выделяли общепринятым методом в градиенте плотности фиколяа-верографина и культивировали в полно! 'среде rpmi-16 40, содёржавшей fcs, 2 тм глютамина, ю шм hepes и 40 мкг/мл гентамицина (все - Flow Lab. ик), в течение 7 суток при 37°С при концентрации клеток 2x1$ в 1мл. По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием, отбирали надосадочную жидкость (НЖ) для определения igE, а клеточный осадок обрабатывали кислотой с целью экстракции igE, который остается связанным с клетками в конце-культивирования, по методу Kmitt.i-Muiier J.м. et al (1986). Для учета преформированного IgE (содержащегося в клетках перед началом культивирования) аналогичным образом проводили обра-

ботку части свежевыделенных МПК, взятых в такой же концентрации, как для культивирования. Суммарное количество IgE в НК культуры МПК и связанного с клетками в конце культивирования обозначали как общую продукцию IgE in vitro. Для определения синтеза IgE de novo в культуре^иэ этой величины вычитали количество преформированного igE. Все показатели выражали в пг IgE в расчете на lxio® МПК. Синтез IgE de novo в культуре МПК считали существенным, если он превышал 200 пг.

Для разделения Т и В лимфоцитов использовали метод ро-зеткообразования с эритроцитами барана, обработанными нейра-минидазой (Гаротта Д., Бери Т., 1983). С целью подавления пролиферации клетки облучали в дозе 2000 рад перед культивированием или добавляли в культуру форсколин (ФК,

-S -7

Calbiochem-Behring Corp.) в концентрациях 10 - 10 'М. Для подавления синтеза белка клетками добавляли в культуру цик-логексимид (ЦГ, Sigma) в концентрациях от 10 до юо мкг/мл.

Уровни общего IgE и TgE антител 'igE-AT) к аллергенам пыльцы березы, тимофеевки и ежи в сыворотках крови обследованных ЛИЦ определяли методами Phadehas IgE PRIST И PIiiidebas IgE клят (Pharmacia), соответственно. Уровни общего TgF выражали в КЕ/л, специфических igE-AT - в классах msT и в процентах от общей активности анти-ТдЕ реагента <»т).

Специфические igF-AT к названным аллергенам в образцах культур МПК определяли модифицировании методом fast: был удлинен срок инкубации образцов на дисках, покрытых аллергеном, до б часов при комнатной температуре. Уровни igr-AT

Í2S

оценивали по интенсивности связывания т анти-TtjF-антител и выражали в имп/мин.

Для определения общего igE в образцах культур МПК были использованы две ¡тест-системы. Первая - иммуноферментная система с чувствительностью юо пг/мл IgE, разработанная в отделе медицинских диагностикумов ВНИИ биотехнологии (Цыци-ков Э-Н- и соавт., 1988) и любезно предоставленная зав. отделом д.б.н. Р.Г.Василовым. Вторая - модифицированный метод Phadebas TgE prist: был удлинен срок инкубации образцов на дисках, покрытых анти-igE,- до 18 часов при комнатной температуре; чувствительность метода - 150 пг/мл IgE. В качестве стандарта в обеих системах использовали препарат человеческого IgE из .набора Phadebas IgE PRIST, у каждого отдельного больного количество IgE в образцах культур МПК, полученных в разные сроки исследования, определяли одним и тем же методом.

Количество общего ige в образцах культур МПК определяли в иммуноферментной системе, разработанной ст-н-с. В.Ф.Савельевой (Институт, иммунологии), с использованием в качестве стандарта igG человека, выделенного из пула сывороток здоровых доноров (чувствительность тест-системы - 1 нг/мл IgG).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistical Grafios System (statgrae) на компьютере ibm-at 386. Достоверность различий определяли по t-критершо Стьюдента.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Характеристика клеток, спонтанно прдуцирующих IgE в культуре МПК больных поллинозом в периоды различной активности выработки IgE in vivo

Активность спонтанной продукции igE и igE-AT в культуре МПК больных поллинозом зависит от периода исследования. В

среднем наиболее высокие уровни общей продукции igE in vitro .определяются в период проведения больным ИТ аллергенами ПЗТ - 1896x382 пг (р=о.002, здесь и ниже по сравнению с уровнем до ИТ) и в сезон пыления злаковых трав - Ю49±200 пг (р=0.07), самые низкие - перед началом ИТ (625-124 пг) и в сезон пыления деревьев (550^84 пг). Увеличение продукции МПК igE-AT к аллергену тимофеевки наблюдается при проведении ИТ аллергенами ПЗТ - 1053^223 имп/мин и в сезон пыления злаковых трав - 600+120 имп/мин (в обоих случаях pco.ooi по сравнению с уровнем до ИТ, равным 128+29 имп/мин). Увеличение продукции igE-AT к аллергену березы наблюдается при проведении ИТ аллергенами ПД - 1?з±70 ■ имп/мин (уровень до ИТ -44+15 имп/мин, р=о.05). Увеличение общей продукции IgE in vitro зависит от появления существенного синтеза IgE de novo в культуре МПК, а уровни преформированного IgE изменяются незначительно в разные периоды исследования. При проведении больным ИТ аллергенами ПЗТ существенный синтез igi ^е novo .обнаруживался наиболее постоянно и •"-ч наибольшим в среднем по группе - и43¿382 пг (р=о. 004). Напротив, до ИТ существенный синтез IgE de novo в культуре ИПК, как правило, отсутствовал, а у 15 больных были обнаружены отрицательные значения этого показателя, свидетельствующие о преобладании деградации IgE in vitro (этот феномен был обнаружен также turner k.J., 1985, 19R7). в среднем по группе показатель синтеза IgE- de novo при исследовании до ИТ составил -24-а 1 я пг. Активность спонтанной продукции ig с, МПК больных поллинс-зом изменялась незначительно в разные периоды наблюдение (данные не представлены).

- 11 -

Спонтанная продукция igE в культуре МПК больных с гиперпродукцией igE обеспечивается пролиферирующими и непроли-ферирующими клетками- Существенный синтез IgE de novo зависит от активности пролиферирующих igE-лродуценгов и происходит в культуре в основном с з по 7 сутки - именно этот "поздний" синтез igE подавляется облучением МПК (рис-iA, кривые i и 2). Напротив, секреция igE в первые з суток практически одинакова в культурах необлученных и облученных МПК и по величине примерно соответствует убыли igE из клеток за тот же период времени (рис.1А, кривые з и -1) , т.е. зависит от высвобождения преформированного in vivo igE. Очевидно, что при отсутствии существенного синтеза igE rie novo спонтанная продукция igE в культуре МПК практически полностью определяется высвобождением преформированного igE непролиферирующими клетками-продуцентами (рис.ЗВ).

Лролиферирующие продуценты igE представляют собой активированные in vivo в клетки: в течение первых з суток культивирования происходит их'пролиферация и далее дифференци-ровка в активные igE-продуценты (Romagnani г.., 1980). Исследование обогащенных популяций В клеток показало, что синтез igE de novo определяется только в культуре необлученных В клеток (рис.2). Добавление аутологнчных Т клеток несколько увеличивало, а добавление полуаллогенных Т клеток (матери больного) - существенно подавляло синтез igE пролиферирующими В клетками. Данные, полученные у двух других больных, подтвердили, что чувствительными к регуляторному влиянию Т

Рис. 1. Динамика прироста IgE в НЖ и убыли из клеток в культуре необлученных и облученных МПК. А - при наличии, В - при отсутствии существенного синтеза IgE de novo. Кривые 1 и 2 -прирост IgE в БЖ культуры необлученных и облученных МПК, соответственно; 3 и 4 - убыль IgE из клеток, необлученных и облученных, соответственно.- По оси абсцисс - дни культивирования.

IgE pg/2 х 105 В-клеток 2000 4000 6000

В В

В + Т аутологичные

В + Т полу-

аллогенные

В* В*

7777*

3

О

Рис. 2. Продукция TgE в культуре необлученных (В) и облученных (В*) в-лимфоцитов. Т - т-лимфоциты. Заштрихованные столбики - преформированный тдЕ, светлые - общая продукция TgE in vit го.

клеток являются пролиферирующие В клетки, синтезирующие igE de novo в культуре, а характер влияния аутологичных Т клеток может быть как хелперным, так и супрессорным, что согласуется С данными Turner K.J. et al (1985).

Непролиферирующие клетки-продуценты IgE, как полагают, подобны долгоживущик радиорезистентным В клеткам, обнаруживаемым В персистирующем IgE ответе У ЖИВОТНЫХ (Romagnani s., 1982). Однако, однозначно такая субпопуляция В клето.к у человека пока не идентифицирована. Высказывается также предположение, что моноциты могут быть клетками-депо igE, т.к. он обнаруживается в этих клетках у больных поллинозом (Turner k.j. et al, 1988). Как показано выше, содержание IgE в субпопуляции непролиферирующих клеток-продуцентов фактически отражает показатель преформированного IgE. Были обнаружены достоверные корреляции между моноцитозом крови и общей величиной преформированного igE - г=о.73 (р=о.оо4), а также его внутриклеточной фракцией - r=0.69 (р=о.ооч). Корреляций этих показателей с лимфоцитозом не было. Последнее вполне объяснимо, т.к. продуцирующие igE В клетки составляют незначительный процент в циркулирующем пуле лимфоцитов. В противоположность этому, интернализация IgE моноцитами не является, по-видимому, строго селективным процессом, предполагающим существование особой субпопуляции этих клеток. Определение количества igE во фракциях лимфоцитов (неприлипающие к пластику клетки) и моноцитов (прилипающие клетки) показало, что в первой оно составляет в среднем 84+7%, во второй - 16^7% от суммы IgE в этих фракциях после разделения. Однако, в нескольких опытах уже за период разделения глоток (1 час ин-

кубации) происходила выраженная деградация части преформиро-ванного igE - от 52 до 82% от его исходного уровня, и это не позволяло установить, в каких клетках исходно содержалось основное количество префориированного igE и с какими клетками была связана его выраженная деградация в культуре. Такой же феномен наблюдали ранее Turner k.J. et al (19Я7). По мнению авторов, деградации подвергается преформированный in vivo IgE, ассоциированный С моноцитами (Turner K.J., 1989). Таким образом, IgE обнаруживается и в лимфоцитарной, и в мо-ноцитарной фракциях свежевыделенных МПК'больных поллинозом, и секреция в культуре IgE, префориированного in vivo, может зависеть и от активности дифференцированных В клеток-продуцентов, и от высвобождения igF из моноцитов.

Как показано выше, спонтанная продукция IgE в культуре МПК складывается из синтеза igE <¡e novo пролиферирующими клетками-продуцентами и секреции преформированного in vivo igE непролиферирующими клетками-продуцентами. Это подтверждается и при определении продукции TgF-AT разной специфич ности. Например, уровень TgF-AT к аллергену тимофеевки равнялся в культуре необлученных МПК i «63^1.71 имп/мин, облученных МПК - 57 3¿c> имп/мин (преформированный - 541-12 имп/мин), а уровень тдг AT к аллергену березы не разнился в культурах необлученных и облученных МПК mill и пч_;17 имп/мин) и не превышал уровня преформированных t<jf AT i ж—! имп/мин (данные больного Л., исследование в период ИТ аллергенами ПЗТ). Следовательно, в культуре МПК может происходить сущес твенный синтез <!■• fyF AT одной специфичности пролифери-

рующими клетками продуцентами, и одновременно только сок

реция преформированных in vivo IgE- AT другой специфичности непролиферирующиии клетками-продуцентами. В последнем случае может выявляться деградация igE-AT в процессе культивирования. Так, у больного Б. (исследование в период ИТ аллергенами ПЗТ) уровень преформированных ТдЕ-АТ к аллергену березы был 543¿2 имп/иин, а их уровень в культуре необлученных и облученных МПК - 379^56 и 294^25 имп/мин. Оказалось, что деградация igE в культуре МПК (при отсутствии существенного синтеза igE de novo) частично подавляется ингибитором белкового синтеза ЦТ: при этом не изменялось количество igE, сек-ретируемого в НЖ, но сохранялся более высокий уровень igE внутри клеток в конце культивирования. Это указывает на активный характер процесса деградации igE и соответствует данным литературы (Turner K.J., 1989).

У больных поллинозом вклад пролиферирующих и непролифе-рирующих клеток в спонтанную продукцию ГдЕ in vitro оказывается различным в зависимости от периода исследования. Активность прс"'гферирующей субпопуляции igE-продуцентов закономерно обнаруживается в периоды аллергенной стимуляции in vivo (рис. 3, периоду , !, 6) - существенный синтез igE de novo в культуре МПК полноr-vo подавляется либо облучением клеток (рис. ЗА), либо добавлением б культуру ФК (рис. зВ). Напротив, при отсутствии аллергенной стимуляции in vivo (период i) синтез igE (■]<■- novo не обнаруживается ¡выявляется деградация TgE), а секреция igE в культуре обеспечивается непролиферирующиии клетками, нечувствительными к облучения и действию ФК. У данного больного не наблюдалось увеличения тgf-продуцирующей активности МПК при проведении КТ аллерге-

2500 1

2000 -

СП 1500 •

ш 1000 -

SP

500 -

0 -

■5000 ■

4000 ■

сг>

о. 3000 ■

Ш-

2000 -

1000 -

А

Рисунок 3. Зависимость обнаружения активности пролиферирую-щих и непролиферирующих клеток-продуцентов igE от периода исследования (данные больного А., 1-Я (А) и 2-й (Б) годы наблюдения). По оси абсцисс периоды исследования: 1 - до ИТ, 2 - ИТ аллергенами ПД, з - ИТ аллергенами ПЗТ, 4 - через 2 недели после 3; 5 и б - сезоны пыления деревьев и злаковых трав, соответственно- Черные столбики - преформированный IgE; светлые - общая продукция IgE in vitro в контроле (не-облученные, без форсколина), заштрихованные,- то же в культуре облученньк МПК (А) или культивированных в присутствии форсколина (10-ом) (В).

О

нами ПД и в сезон пыления деревьев (периоды 2 и 5) - т.е. обнаруживаются индивидуальные особенности реагирования больных поллинозом на разные группы релевантных пыльцевых аллергенов .

Таким образом, существенный синтез igE de novo в культуре МПК обнаруживается'у больных поллинозом в сезоны пыления и при проведении ИТ релевантными аллергенами и отчетливо зависит от активности пролиферирующей субпопуляции клеток-продуцентов тдЕ, которые представляют собой активированные in vivo В клетки памяти (Rornagnani S- et al., ,1980, 19S2).■ Циркуляция этих клеток в русле крови ограничена периодами аллергенной стимуляции in vivo. Напротив, непролифери-рующие клетки, способные секретировать преформированный in vivo igE, обнаруживаются в циркулирующем пуле МПК постоянно. Они могут быть представлены дифференцированными долгоживущи-МИ В клетками-продуцентами IgE (Romagnrttii S. et al., 1982) и/или моноцитами как клетками-депо TgE (Turner к.J. et al, 1988). Следовательно, обнаружение существенного синтеза IgE de novo в культуре МПК свидетельствует о появлении в циркулирующем пуле МПК активированных В лимфоцитов. Этот показатель может быть использован для изучения особенностей igF ответа у больных поллинозом.

2.2. Особенности lyr ответа на аллергены ПД и ПЗТ у больных поллинозом при проведении ИТ и в сезоны пыления

Индивидуальные различия в характере реагирования на аллергены ПД и ПЗТ были обнаружены у больных с одинаковым спектром сенсибилизации к этим, аллергенам при проведении ИТ. У 9 больных выраженное усиление продукции t<¡f. и Tgr-ДТ к ал-

лергену тимофеевки МПК наблюдалось при проведении ИТ аллер-• генами ПЗТ, но не было аналогичного ответа при проведении ИТ аллергенами ПД (подгруппа 1, та.бл.1, и данные одного из этих больных показаны на рис.3). У' з больных наблюдался противоположный характер реагирования: увеличение продукции 1дЕ и 1дЕ-дт к аллергену березы при проведении ИТ аллергенами ПД и отсутствие аналогичного ответа при проведении ИТ аллергенами ПЗТ (подгруппа 2, табл-1). У 5 из 8 больных, обследованных в течение 2 лет, примущественное реагирование на аллергены ПД или ПЗТ было обнаружено и при проведении второго курса ИТ. Только• у з больных увеличение спонтанной продукции 1дЕ и 1дЕ-АТ МПК наблюдалось при проведении ИТ аллергенами обеих групп, и у 2 больных существенных изменений продукции 1дЕ МПК в процессе ИТ не было. Между подгруппами 1 и 2 были обнаружены существенные различия в исходном уровне клинической сенсибилизации. В подгруппе 1 выявлялись в среднем более высокие уровни сывороточных 1дЕ-АТ к аллергену тимофеевки (35,8+8,7 %т) по сравнению с таковыми к аллергену березы (4,8^2,4 ?оТ). В подгруппе 2 - более высокие уровни сывороточных 1дЕ-АТ к аллергену березы (22,0^8,9 %т) по сравнению с таковыми к аллергену тимофеевки (б,5-5,-я ът). Различия в обоих показателях между подгруппами 1 и 2 достоверны (р< 0.001).

У .":,:ьных поллинозом обнаруживаются различия в выраженности 1дЕ ответа на релевантные пыльцевые аллергены в зависимости от пути их поступления в организм: парентерального при проведении ИТ или через слизистые оболочки дыхательных путей при естественном контакте. Так, у большинства больных

Таблица 1. Спонтанная продукция 1?Е (пг/10Еб МПК) и 1дЕ-АТ (имп/мин/ЮЕб МПК) у больных похлинозом с преимущественным ответом на аллергены ПЗТ (группа 1) или Щ (группа 2) при проведении ИТ

Период Обвдй 1дЕ-АТ

исследования 1еЕ ----------------------------

к аллергену к аллергену березы тимофеевки

1 381±79(9) [100-885] 13+6(9) [0-53] 76+16(9) [0-148]

2 632+121(9) [290-1187] 15+7(9) [0-66] 182±90(9) [43-627]

Группа 1 3 1793+184(9)* [528-2634] 17+8(9) [0-78] 1222+274(9) [180-2779]

4 1366+346(5) [591-2266] 3+3(5) [0-15] 709+219(5) [266-1542]

5 463±121(4) [228-779] 10+6(4) [0-26] 150+24(4) [108-219]

6" 1498+335(6) [378-2471] 80+35(5) [19-201] 730+234(6) [156-1690]

1 225±95(3) [127-415] 40+26(2) [14-66] 3+3(2) [0-6]

2 1522±70(3)* [1387-1625] 671+37(3)* [562-756] 8+8(2) [0-15]

Группа 2 3 529+71(3) [437-481] 172±60(3)* [59-262] 20+20(2) [0-40]

4 6311471(2) [160-1102] 222+171(2) [51-392] 12±2(2) [10-14]

5 431+271(2) [160-702] 140+89(2) [50-228] 16+2(2) [14-18]

6 , 680+329(3) [328-13383 87+27( 3) [54-140] 439+275(2) [164-714]

Данные представлены как М+т. В кругл: а скобках - число наблюдений, в квадратных - диапазон индивидуальных значений. Периоды исследований см. Рис. 3. * - достоверные различия (р<0,01) между соответствующими показателями при сравнении 1 и 2 групп больных. Выделены - достоверные различия (р<0,01) по сравнению с соответствующим показателем до ИТ внутри каждой гр.уппы больных.

поллиноэом с сочетанной сенсибилизацией к аллергенам ПД и ПЗТ стимуляция 1дЕ ответа к аллергенам одной из этих групп (ПД - в подгруппе 1, или ПЗТ - в подгруппе 2) наблюдалась только при исследовании в сезон пыления, но не при проведении ИТ (табл.1). Подобным же образом, у 2 из 5 больных с сенсибилизацией только к аллергенам ПЗТ отчетливый ответ на эти аллергены наблюдался в сезон пыления злаковых трав, но не-при проведении ИТ (у з других обнаруживался выраженный ответ на аллергены ПЗТ при проведении ИТ)- Слабая выраженность 1дЕ ответа при проведении специфической ИТ может быть связана с тем. что В клетки памяти локализованы преимущественно в лимфоидных тканях, ассоциированных со слизистыми оболочками дыхательного тракта. При парентеральном введении аллерген, возможно, не достигает лимфоидных образований слизистых оболочек и дренирующих их лимфоузлов. Напротив, при естественном контакте с пыльцой именно эти лимфоидные образования оказываются доступными для проникновения аллергена и являются местом развития иммунного ответа. Соответственно, сильное реагирование на парентеральное введение аллергена может быть связано с высокой степенью генерализации ТдЕ ответа 1п \-ivM - т.е. с нахождением антиген-специфических клеток памяти ке только в "местных, но и в "отдаленных" лимфоидных образованиях.

Антиген-неспецифическое усиление выработки тдЕ-АТ к аллергенам ПЗТ при проведении ИТ аллергенами ПД было обнаружено у з больных с coчeíaннcй сенсибилизацией. В двух случаях увеличение продукции 1дЕ-АТ аллергену тимофеевки было обусловлено выраженным приростом уровней преформированных ТдЕ-АТ

данной специфичности (при этом, не наблюдалось одновременного увеличения продукции IgE-AT. со специфичностью к аллергену березы). Б третьем случае на пике ИТ- аллергенами ПД наблюдался существенный синтез de novo IgE-AT к злаковым аллергенам, и одновременно - прирост продукции JgE-AT к аллергену березы. Максимальная активация синтеза IgE-AT. к злаковым аллергенам наблюдалась у всех з больных при проведении ИТ аллергенами ПЗТ. Поскольку аллергены групп ПД и ПЗТ не' имеют общих антигенных детерминант (Jung к. et al, 1987), антиген-неспецифическое усиление выработки IgE-AT может объясняться действием in vivo лимфокинов (ИЛ-4) или изотип-специ-фических регуляторных факторов, продуцируемых активированными Т клетками.

2.3.' Анализ клинических данных и активность спонтанной продукции igE-МПК больных группы НДС

Обследование группы больных ИДС показало, что гиперпродукция igE в подавляющем большинстве случаев не связана с респираторными аллергическими заболеваниями. Они были .диагностированы только у 7 из зо больных: у 4 больных с CH.igA (КАБА) и у 3 больных без иммунной недостаточности (полли-ноз). Преобладающими по частоте "атопическими" проявлениями были поражения кожи -ДД или экзема), и у большинства больных с кожными поражениями наблюдалось значительное повышение уровней сывороточного IgE. Однако, не удалось установить отчетливой связи между активностью кожного процесса и активностью выработки igE: только у 3 из 12 обследованных в динамике больных наблюдалось параллельно снижение уровней сывороточного igE и спонтанной продукции igE МПК и уменьшение

активности АД. Этот результат находится в соответствии с данным литературы - отчетливой корреляции между повышением выработки ТдЕ и клиническими проявлениями АД нет, и в патогенезе заболевания ведущая роль может принадлежать другим иммунным механизмам (Adkinson n.f., piatts-Miiis т.д.е., 1988, Hanifin J.M., 1984). Вместе с тем, у больных группы ИДС были обнаружены высокие корреляции между уровнями igE в сыворотке крови и показателями общей продукции IgE МПК in vitro (r=o,93, pco.ooi) -и синтеза IgE de novo (r=0,93, p<o.ooi), но не преформированного igE (r=0.06). Следовательно, igE-продуцирующая активность МПК больных отражает активность выработки IgE in vivo. Это обстоятельство может быть использовано в дальнейших исследованиях механизмов активации выработки IgE и его патогенетической значимости при некоторых формах ИДС.

ВЫВОДЫ

1. У больных поллинозом увеличение спонтанной продукции igE и igE-AT МПК in vitro соответствует периодам аллергенной стимуляции in vivo в сезоны пыления и при проведении специфической ИТ.

2. Спонтанная продукция igE в культуре МПК обеспечивается как пролиферирующими, так и непролиферирующими субпопуляциями клеток. Синтез igE de novo зависит от активности пролифе-рирующих lgE-продуцентов, а секреция в культуре IgE, преформированного in vivo, осуществляется непролиферирующими клетками.

3. Пролифериругащие igE-продуценты представляют собой активированные В клетки и обнаруживаются в популяции МПК у больных поллинозом в периоды стимуляции релевантными пыльцевыми аллергенами in vivo.

4. Непролиферирующие igE-продуценты могут быть представлены дифференцированными В клетками, осуществляющими персистирую-щую продукцию igE антител у больных поллинозом. Часть пре-Формированного in vivo igE связана с моноцитами, являющимися клетками-депо молекул igE антител.

5. Возможность использования показателей спонтанной продукции igE МПК in vitro для изучения igE ответа in vivo у больных поллинозом основывается на том, что увеличение igE-npo-дуциругацей активности МПК, связанное с синтезом IgE de novo пролиферирующими В клетками, свидетельствует об активизации IgE ответа, in vivo.

6. У больных поллинозом с сочетанной сенсибилизацией к аллергенам ПД и ПЗТ при проведении ИТ выявляется, как правило, выраженный ответ только-на одну из этих групп аллергенов -ПД или ПЗТ, и такое преимущественное реагирование совпадает у больных с более выраженной клинически сенсибилизацией к основным аллергенам этих групп: пыльцы березы либо тимофеевки, соответственно.

7. У сольных поллинозом с сочетанной сенсибилизацией к аллергенам РД и ПЗТ может происходить антиген-неспецифическое усиление выработки IgE антител к аллергенам ПЗТ под влиянием стимуляции in vivo в процессе ИТ неродственными аллергенами ПД.

8. У больных поляинозом выявляются различия в реагировании ■ на релевантные пыльцевые аллергены в зависимости от путей

поступления их в организм. Выраженная стимуляция продукции igE антител обнаруживается у отдельных больных в сезон пыле-ния при отсутствии ответа на эти аллергены в процессе специфической ИТ.

9. Выраженная гиперпродукция IgE у обследованных больных группы ИДС в большинстве случаев не связана с респираторным аллергическим заболеванием. Высокие корреляции показателей спонтанной продукции IgE МПК in vitro с уровнями IgE в сыворотке крови указывают на то, что igE-продуцирующая активность МПК при данных патологических состояниях отражает активность выработки IgE in vivo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Багаева Л.В., Савельева В.Ф., Польнер А-А., Ильина Н.И. Антиген-неспецифическое усиление выработки igE антител у 'больных ПОЛЛИНОЭОМ. - Иммунология, 1990, N4, С. 49-51.

2. Savelyeva V.F., Danilicheva I.V., Bagaeva L.V., Polner A.A. Examination of in vitro Spontaneous IgE Production in Pollinosis Patients. - In: International Symposium on Allergy and Clinical Immunology "Regulation and Clinical Significance of IgE". Moscow, 1990. Abstracts, p.61.

3. Polner A.A., Savelyeva V.F., Bagaeva L.V. Antigen-nonspecific amplification of biosynthesis of immunoglobulin E in pollen allergy. - In: Constituent Congress of International Society for Pathophysiology. Moscow, 1991. ■Abstract hook, p. 29G-297.