Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Уровень IgE и механизмы его регуляции при лимфопролиферативных заболеваниях

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

УДК 616-056.43-022.854:582.998.2-036.11:576.8.097.

РИГЕР Николай Александрович

УРОВЕНЬ ГдЕ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РЕГУЛЯЦИИ ПРИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

/14.00.36-Аллергология и иммунология/

Новосибирск-1995

Работа выполнена в Краснодарском филиале Института клинической иммунологии СО РАМН.

Научный руководитель-доктор медицинских наук, профессор Ханферян Роман Авакович. Официальные оппоненты:доктор медицинских наук,профессор H.A. Бочаров;

кандидат медицинских наук Е.Р. Черных. Ведущее учреждение-Государственный научный центр иммунологии.

Защита состоится

1995 г.

в............ часов на заседании специализированного Совета Д 001.01.01

Института Клинической Иммунологии СО РАМН

Адрес:630091, г.Новосибирск,Ядринцовская 14.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

О.Т.Кудаева.

1.АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Известно, что нарушение функций регуляции в иммунном гомеостазе неизбежно затрагивает кроветворение. В качестве такой модели нарушений взаимодействия как внутри системы иммунитета, так и во взаимосвязях с кроветворением выступают лимфолролиферативные процессы (Лозовой В.П., 1987 г.).

Лимфопролиферативные заболевания пример рассогласования функций внутри системы иммунитета, неэффективности контроля за пролиферацией лимфоидной клетки ( Петров Р.В., 1980, Ломакин М.С., 1990; Ве1роште е1 а1.,1977). Как всякий злокачественный процесс, лимфопролиферативные заболевания представляют собой финал Декомпенсации, возникающий в условиях изначально слабой, функционально ригидной иммунной системы (Шпа-рык Я.В.,1990). Иммунный дефект может 'быть связан с блоком клеточной дифференцировки, атипичной пролиферацией, снижением функциональной

V

активности, дисбалансом иммунорегуляторных клеток (Вгоие1 1984, СаЮУвку а, 1982).

При злокачественных лимфопролифератмвных процессах удалось выявить тимусзаеисимый иммунодефицит. Одним из факторов снижения иммунного ответа является тормозящее действие самой опухоли. При протрессиро-вании злокачественных процессов повышается активность Т-супрессоров, подавляющих пролиферацию и дифференцировку цитотоксических Т-лимфоци-тов (Агеенко Л.А. 1982; .¿.)оНп8оп, 1984).

При первичном обследовании в крови больных лимфомами не было выявлено значительных изменений концентраций 1дС, М, А (Выговская Я.И.,1985; Барышников А.Ю., 1985; Йегер Л.,1990.). Сведения о росте концентрации сывороточного 1дЕ при лимфопролиферативных процессах единичные и касают-

- 4-

ся больных лимфогранулематозом и lgE-продуцирующими плаэмацитомами (Симбирцева Л., 1985; Йегер n..1990;Seggev J.S., 1994.). Известно, что повышение уровней IqE необязательно свидетельствует о наличии аллергии в организме (бережная Н.М., 1983; Беклемишев Н.Д., 1986;Palma-Carlos,1994.). Значение этого феномена неясно в развитии и течении ало качественных лимфопролиферативных заболеваний. Является ли изменение уровней IgE диагностическим критерием активности злокачественного процесса или подобное изменение может иметь регуляторное значение в развитии этих заболеваний. Имеются основания полагать, что IgE участвует в противоопухолевой защите (Бережная Н.М., 1987; 1991). Невыйсчено также, как влияют межклеточные взаимодействия при злокачественных лимфопролиферативных заболеваниях до и после проведения полихимиотерапии на уровень указанного класса иммуноглобулинов. Поводом для обоснования актуальности исследования этих вопросов является и то, что введение животным ииклофосфана вызывает резкое повышение продукции IgE (Ishizaka К., 1985; Katz, 1981 ; 1984.). Повышение уровня IgE-антител обнаруживается при воздействии других факторов, подавляющих костномозговое кроветворение, супрессирующих первичный иммунный ответ ( Ханферян Р.А., 1991; Palma-Carlos, 1994), что может быть основой для развития лимфопролиферативных заболеваний.

2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ.

Целью настоящей работы явилось - установить роль и механизмы регуляции изменений уровней IgE в различные фазы течения (активность - ремиссия) и во время полихимиотерапии лимфопролиферативных заболеваний. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

а) исследование уровней IgE в сыворотке больных в различные фазы болезни: до полихимиотерапии (ПХТ), во время ПХТи после ПХТ;

б) определение различий в уровне продукции IgE лимфоцитами больных и здоровых лиц;

- 5в) установление механизмов модуляции 1дЕ-аитителообразования при лимфопролиферативных процессах;

г) анализ диагностической и прогностической значимости изменений синтеза 1дЕ при злокачественной лимфопролиферации.

3. НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые проведено исследование уровней сывороточного 1дЕ у больных лимфопролиферативными процессами в различные фазы течения злокачественного заболевания и дан сравнительный анализ уровня 1дЕ у здоровых и больных людей. Проведено определение и дан анализ способности к синтезу 1дЕ лимфоцитами больных в спонтанных и индуцированных клеточных культурах. Выявлены механизмы модуляции уровня 1дЕ в сыворотке больных .' На основании исследований показана возможность использования анализа уровней 1дЕ как диагностического критерия для дифференциации, оценки динамики злокачественного процесса и коррекции лечения при отдельных формах лимфопролиферативных заболеваний.

4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Расширены и углублены сведения об уровнях 1дЕ при лимфопролиферативных заболеваниях. Анализ 1дЕ-лродукции позволяет получить дополнительные сведения о патогенезе и лечении злокачественной лимфопролиферации, что можно применить в экспериментальной и клинической иммуногематоло-гии. Выяснено, что цитостатики,ингибиторы простагландинсинтетаэы и блока-торы гистаминовых рецепторов вызывают изменения синтеза 1дЕ у больных лимфопролиферативными процессами.

По основным положениям диссертации опубликованы материалы на' Европейском Iищаминоном общосгпе ( Венгрия. 19Я4 ); гисгаминоппм оГнцо:!-

ве ( Канада, 1994 ); конгрессе Европейской Академии аллергологии и клинической иммунологии (Испания, 1995); 1-м конгрессе "Реабилитация в медицине" (Сочи, 1995);в журнале "Аллергология и клиническая иммунология", N3/4,1995.

5. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 218 источников литературы. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 19 рисунками.

6. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы сыворотки и мононуклеарные лейкоциты периферической крови 213 человек, которые были разделены на 5 групп:

группа 1 - здоровые люди - 53 человек.

группа 2 - больные острым лимфолейкозом (ОЛЛ) - 50 человек;

группа 3 - больные хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) - 31 человек;

группа 4 - больные лимфогранулематозом (ЛГМ) - 46 человек;

группа 5 - больные неходжкинскими злокачественными лимфомами (лим-фосаркомы, НЗЛ) - 38 человек.

Диагнозы установлены и подтверждены на основании результатов, полученных при проведении общепринятого клинико-лабораторного обследования ( Воробьев А.И., 1986). Во всех случаях больные получали лечение по стандартным программам, включающим полихимиотерапию (определенный набор цитостатических препаратов, наиболее часто используемых в онкогематоло-гии) и дистанционную ■у-терапию ( Воробьев А.И., 1985).

Сыворотки больных и здоровых людей собирались в стерильные пластиковые пробирки и хранились в замороженном состоянии. Мононуклеары периферической крови (МПК) выделялись из гепаринизированной крови центрифу-

гированием (РС-6) в градиенте плотности фиколла-верографина ( 1077-78 ). После трехкратной отмывки в среде 19Э МПК ресуспендировали в среде RPMI 1640 (Serva) и подсчитывали количество полученных клеток. Культивирование в течение 9 суток проводилось в стерильных 96-луночных пластиковых планшетах в среде RPMI 1640 (Serva), содержащей 2 мМ глютамина , 10 мМ Hepes ( Serva ), 50 мкг/мл гентамицина, 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки ; в концентрации 3*10® клеток на лунку в обьеме 150 мкл, в атмосфере, содержащей 5% С02, при 37°С и 96% влажности (Линг Н.Р., 1971.) . Супернатанты собирали в стерильные пластиковые пробирки (1,5 мл) и хранили в замороженном состоянии. Жизнеспособность культивируемых МПК проверяли под микроскопом проходящего света в нативных препаратах с добавлением трипанооого синего (Serva). Для модуляции синтеза IgE в культурах МПК использовались фитогемагглютинин ( ФГА, Serva) - 10 мкг/мл (Линг Н. Р .,1971), индометацин - 10 мкг/мл (Pharmachim), блокаторы Н1- и Н2- гис-таминовых рецепторов тагомет и клемастин (Egyt.Reanal)B концентрациях 10" 8-Ю-5М, цитостатики: метотрексат (Spofa), uwTa3ap(Upjoin), винкристин (Gedeon Richter), циклофосфан(Россия). Для исследования модулирующего влияния МПК здоровых доноров в индуцированных культурах МПК больных ХЛЛ, клетки здоровых людей обрабатывали митомицином С (Serva) (40 мкг/мл) и после отмывания добавляли в культуры 10® клеток / лунку. Модулирующее влияние на синтез IgE МПК больных лимфопролиферативными заболеваниями исследовали, добавляя в культуры МПК здоровых людей супернатанты ФГА-стимулированных МПК больных (50 мкл/лунку) и циклофосфан в различных концентрациях. Определение, уровней IgE в сыворотках проводили с использованием стандартной иммуноферментной тест-системы для определения общего IgE человека (НПО "Аллерген", г. Ставрополь) по одностадийной иммуноферментной методике количественного определения IgE человека (Р.Г. Василов и др., 1989), в супернатантах - с использованием стандартного тест-набора (НПО "Биотехнология", г. Москва) для определения IgE человека в суб-нанограммовых диапазонах двухцентровым иммуноферментным методом в авмдин-биотиновой системе (Э.Н. Цициков и лр . 1989). Измерение оптиче-г.кой пмошосги проищодиноа, на миопжашнитм ¡шанизатпр«! ЛИФ 001

Статистическая обработка полученных результатов выполнялась на персональной ЭВМ по программе *в1а1дгарЫс$ 3.0*. Из методов пакета использовались:

1. регрессионный анализ;

2. оценка достоверности различий средних;

3. сглаживание кривых в динамике иммунологических показателей с помощью открытого кубического сплаинга;

4. однофакторный дисперсионный анализ (А.Афифи;С.Эйзен, 1992).

7. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ

ДАННЫХ.

7.1. Уровни сывороточного 1дЕ у больных лимфомами.

Нами установлено .что содержание сывороточного 1дЕ при первичном обследовании (табл .1) у больных острым лимфолейкозом , лимфогранулематозом и лимфосаркомами оказалось выше в 1,8-2,0 раза (р<0.05) чем у здоровых лиц . Различия в уровнях 1дЕ в крови больных хроническим лимфолейкозом и здоровых людей недостоверны.

- ')-

Табл. 1 .Уровни сывороточного 1дЕу больных лимфопролиферативными процессами.

группы обследо- Уровни 1дЕ <1од)

ванных первично 1 месяц 3 месяца бмесяцев ремиссия рецидив

здоровые 3,00+0,34

ОЛЛ 6,П±0,60' 5,56+0,58 4,30+0,57**« 3,55+0,82 6,08+0,15 5,45+0^8««

ХЛЛ 2,41+Д51«» 1,43+0,44 2,04+0,54 1,11+0,03 1,80+0,45

ЛГМ 5,17+0,55« 5,10+0,55 5,62+0,28 6,50+0,16 4,98+0,79 332+0,58"»

НЗЛ 6,00+0,25* 4,78+0,37«« 5,18+0,60«« 4Д5+5.15«« 6,57+0,15«. 5,78+0,62

Примечание: *- Р<0,05 в сравнении с уровнями 1дЕ у здоровых лиц.

♦♦-Р<0,05 в сравнении с уровнями 1дЕ в других группах лимфопролиферативных заболеваний.

♦**-Р<0,05 8 сравнении с уровнями 1дЕ у первичных больных.

Содержание сывороточного 1дЕ (табл.1) у больных ЛГМ и ХЛЛ мало изменяется в течение первых шести месяцев полихимиотерапии (ПХТ). Достоверное снижение уровня антител этого класса (Р<0,05 в сравнении с уровнем 1дЕ до начала ПХТ) обнаружено после первого, третьего и шестого месяца терапии больных лимфосаркомой и третьего и шестого месяцев лечения больных ОЛЛ.

В период ремиссии ( Таб. 1. ) концентрация 1дЕ в крови больных ОЛЛ снижается, а у больных НЗЛ-повышается (Р<0,05) по сравнению с концентрацией 1дЕ в этих группах лимфом при первичном обследовании. Различия в уровнях 1дЕ при первичном обследовании и во время ремиссии в группе больных ЛГМ недостоверны (Р>0,05).

Обнаруженное уменьшение концентрации 1дЕ во всех исследуемых группах больных (табл.1) при рецидивирующем характере течения лимфомы и неэффективности ПХТ с наибольшей достоверностью проявляется у лиц с ОЛЛ и ЛГМ (Р<0,05) в сравнении с уровнями 1дЕ на момент установления диагноза.

- 1(1-

Достоверное повышение ( Р < 0.05 ) в 1,8-2,0 раза концентрации сывороточного 1дЕ у больных ОЛЛ, ЛГМ и НЗЛ по сравнению с уровнями антител этого класса в крови здоровых лиц можно объяснить, вероятно, через механизмы В-клеточного переключения синтеза иммуноглобулинов на фоне нарушений в эффекторных субпопуляциях Т- и В-лимфоцитов (Барышников А.Ю., 1989). При ХЛЛ в отличии от ОЛЛ, ЛГМ и НЗЛ выявлено более значительное превалирование супрессорных фракций уже в первой стадии патологического процесса ( Лозовой В.П.и др.,1987; Барышников А.Ю., 1989.). Это может приводить к отрицательной модуляции синтеза антител и снижению в 2,0-3.0 раза концентрации сывороточного 1дЕ по сравнению с уровнями этого класса иммуноглобулинов в крови больных остальных исследуемых групп лимфопролиферативных заболеваний. Интенсивная ПХТ при ОЛЛ и НЗЛ вызывает подавление всех эффекторных популяций иммунокомпетентных клеток , что проявляется в падении уровня сывороточного 1дЕ в 1,5-2,0 раза (Р<0,05) к шестому месяцу лечения в сравнении с уровнем 1дЕ на момент первичного обследования. У больных ЛГМ в этот период наблюдается преимущественный рост уровней сывороточного 1дЕ по сравнению с первично выявленными больными, что может быть следствием стимуляции синтеза 1дЕ за счет более выраженного подавления цитостатиками Ту- субпопуляций (Барышников А.Ю.,1989; ^Ыгака К., 1985.(.Отсутствие значимой динамики 1дЕ в крови больных ХЛЛ свидетельствует о незначительном влиянии стандартной химиотерапии на регуляцию синтеза 1дЕ при этом типе лимфопролиферации.

Неэффективность проводимой ПХТ, рецидивирующий характер течения лимфопролиферативного процесса отличаются еще более глубоким сдвигом хелперно/супрессорного индекса в сторону супрессорных субпопуляций ( Барышников А.Ю., 1989) следствием чего является торможение синтеза 1дЕ и преимущественное снижение уровня 1дЕ при всех исследуемых типах заболеваний.

Наблюдаемые более высокие уровни 1дЕ в крови больных НЗЛ во время ремиссии по сравнению с концентрациями этих антител при первичном обследовании могут свидетельствовать о сохраняющейся положительной модуляции синтеза 1дЕ на фоне сниженных характеристик иммунорег улигорных

ток (Барышников А.Ю., 1989). Возможно, повышение уровней IgE- один из механизмов торможения неконтролируемой лимфомдной пролиферации, т.к. имеются данные о замедлении роста модулированных опухолей в условиях гиперпродукции IgE (Бережная Н.М. , 1987 ; 1991). Данные об уровнях сывороточного IgE могут быть использованы как дополнительный дифференциальный критерий между лейкозом и лимфосаркомой и как один из показателей динамики лимфопролиферации.

7.2. Синтез IgE in vitro при яимфопролифератмвных заболеваниях.

Учитывая полученные различия в уровнях сывороточного IgE у здоровых и больных людей, был исследован уровень синтеза этого класса антител in vitro. Не было получено связи между концентрациями IgE в крови и суперна-тантах спонтанных и индуцированных культур. На основании сравнения способности МПК к синтезу в спонтанных и индуцированных ФГА культурах анализировалась lgE-продукция в различные фазы течения и лечения ЛПЗ.

Отмечено ( Таб . 2. ),что стимуляция МПК здоровых лиц ФГА положительно влияет на синтез IgE. Отношение уровней IgE в спонтанных к уровням в стимулированных культурах (с/и) меньше 1,0. Добавление ФГА в культуры МПК первично выявленных больных с лимфомами отрицательно влияет на синтез IgE (с/и>1,0; Р<0,05 ) в сравнении со стимулированным ФГА синтезом IgE МПК здоровых лиц).

На фоне цитостатической терапии ответ на ФГА МПК больных постепенно восстанавливается, что отчетливо видно после шести месяцев терапии (Таб. 2; с/и<1,0; Р>0.05 в сравнении с реакцией у здоровых лиц).

Во время ремиссии положительная модуляция синтеза IgE в индуцированных ФГА культурах МПК больных сохраняется (Табл. 2). Ответ на митоген МПК больных ЛГМ и НЗЛ более выражен во время ремиссии чем МПК больных ОЛЛ.

При рецидипирующем характере течения пимфом сишпз IgE о ФГА-инду-циропаниых кунмурах МПК прпимутш-гпвнно подаплиоггя (infill 2: с/и>1,0)

Табл.2. Синтез IgE in vitro при лимфопролиферативных заболеваниях.

группы за Синтез 1дЕ (1од спонтанный / индуцированный синтез)

болеваний первично з месяца 6 месяцев ремиссия рецидив

здоровые 0,92

ОЛЛ 1,32* 0,99 0,83 0.92 1,05*

ХЛЛ 1,13* 1,09* 0,96 1,08*

ЛГМ 1,07* 1.01* 0,95 0,73* 0,99*

НЗЛ 1,05* 1.00* 0,93 0,83* 1,13*

Примечание: * - Р<0,05 в сравнении со здоровыми людьми.

Торможение синтеза 1дЕ в ФГА-индуцированных культурах МПК больных в период высокой злокачественной лимфолролиферативной активности (моменты установления диагноза и рецидивов) связано с реверсией соотношения основных иммунорегуляторных клеток с относительным, либо абсолютным, преобладанием эффекторов супрессии (Барышников А.Ю,1989;Павлова И. Е. и др., 1993; Лосева М.И.и др. 1993).При неэффективности химиотерапии дополнительно развивается дефицит В-клеток и нарастает супрессорный потенциал моноцитарно - макрофагального звена (Павлова И.Е.и др., 1993;Лосева М.И.и др. 1993). Преобладающая супрессорная фракция клеток при стимуляции ФГА оказывает неспецифическое действие на эффекторное звено системы синтеза 1дЕ, вызывая уменьшение уровней этого класса антител в сравнении со спонтанными культурами.

Проводимая ПХТ частично устраняет нарушения в хелперно/супрессор-ном соотношении в крови больных лимфомами. Цитостатики в первую очередь ингибируют эффекторы супрессии или нарушают их взаимоотношение (Ка(аока Т. е! а1. 1985). Хелперные субпопуляции регенерируют значительно быстрее ( ЕИгке М.и.,1985; врегеайсо Р., 1985). Этим объясняется восстановление к шестому месяцу лечения реакции на стимуляцию ФГА МПК больных (табл. 2 ).

-'и-

Таким образом.сравнёние спонтанной и ФГА-стимулированной 1дЕ-про-дукции МПК при лимфопролифенративных процессах может быть дополнительным критерием эффективности проводимого специфического лечения.

Добавление обработанных митомицином С МПК здоровых людей положительно влияет на синтез 1дЕ в индуцированных ФГА культурах МПК (смешанные индуцированные - си) первично выявленных больных ХЛЛ и после трех и шести месяцев терапии этой формы лимфопролиферации (си/и>1,0). При рецидивирующем течении ХЛЛ синтез 1дЕ в смешанных индуцированных культурах МПК преимущественно снижается (си/и < 1,0 ). В смешанных культурах вероятно, присутствуют цитокины, блокирующие ФГА-стимуляцию су-прессорных клеток больных ХЛЛ (Китса 1988). При прогрессировали ХЛЛ сохраняется активация нарастающей супрессорной фракции (Б.Д. Брондз, 1991) и дополнительно угнетается 1дЕ-продукция.

7.3.Роль растворимых факторов МПК в регуляции синтеза 1дЕ при лим-фопролиферативных процессах.

Для выяснения механизмов цигокиновой регуляции изменений уровней 1дЕ в крови при лимфопролиферативных заболеваниях в культуры МПК здоровых людей добавлялись суточные супернатанты ФГА - стимулированных МПК больных ОЛЛ. ХЛЛ, ЛГМ и НЗЛ. Это вызывало преимущественное снижение синтеза 1дЕ ( Рис. 1. ). Наибольшим угнетающим эффектом обладали супернатанты МПК больных ХЛЛ.

- I I-

Рис.1. Влияние МПК больных на синтез lg£.

igEl 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

олл хлл лги взл

Стимулированные ФГА преобладающие супрессорные субпопуляции МПК первично выявленных больных лимфомами выделяют цитокины, которые могут оказывать неспецифическое угнетающее действие на процесс активации МПК здоровых людей. Происходит нарушение переключения В-клеток на синтез IgE. В супернатантах МПК больных лимфомами присутствует, вероятно, повышенное количество факторов, активирующих супрессорные фракции МПК здоровых лиц. Возможна непосредственная блокада В-лимфоцитов, что наиболее показательно при добавлении супернатантов больного ХЛЛ.

Большая чувствительность эффекторов супрессии к низким дозам цикло-фосфана (ЦФ) (Бронцз Б Д., 1991; Йегер Л., 1990; Ishizaka К., 1985) позволяет избирательно инактивировать эту фракцию МПК здоровых людей in vitro и выяснить механизмы торможения синтеза IgE при добавлении супернатантов стимулированных МПК больных лимфомами.

Контрольная обработка ЦФ (5,0-40,0 мкг/мл) МПК здоровых людей in vitro приводила к преимущественной стимуляции синтеза IgE при концентрации препарата 5,0 мкг/мл. Сочетанное добавление супернатантов и ЦФ повы-

шало синтез IgE МПК здоровых по сравнению с культурами, содержащими только суперматанты больных лимфомами (Рис. 2,а-г).

1'и< 2л t.«»4fivntN4.» модулирующее* к.'мяино п» скип»;» 1/;К cywpiwrairro® ОЛЛ и цикл*« ¡шефша

Гц» :•!» » о«м тетня- »«>дулиру*мц| |и,„>тие щ .'Hinw lj:F iryni*|Mrararm>и ХЛЛ и цги.\«.*{и»сфли

\ с* 10*

и/

я- е м

I«

° ем «.п

0.S

а.м

Цмиюфосфан, шт/ня

........... культуры, содержащие кхклофосфак

- культуры, содержащие суперпатаят ОЛЛ

н циклофпсфпн А - уровень IgE в спонтанных культурах Б - урооеяь IgE t присутствии суперна та гга ОЛЛ

Циыюфосфа», wr/ил куяътуры, содержащие цжкяофосфзн

культуры, содержащие супергигант ХЛЛ я цмкяофосфак

уровень IgE » слоитэвпых культурах уровень IgE в присутствии суиерпатгмт» ХЛЛ

__ „ ... Рис. 2а Сочстемкое модулирующее влиявяе на скктеэ 1сЕ

Р»с. гг СоЧет<мто, иодирующее ,™«н«е «« с»нтм IgE супе^тгвто. ЛГМ И дакдофосфам

Супсрватайтов НЗЛ м ннхлофосфапа

I

<3 OBS

1.04 1

о

п «* О ОИ

».м

Циклофосфам, мкг/Мя

1Диклофосфам, мкг/мл

...... культуры, содержащие цикяофосфвн _.

--культуры, содержащие супернатапт ИЗЛ

и циклофосфак д

Л - УрОВРГП. О С1Ю1ГГШНМХ культур»»» ß

>'{ ypouoni. 1/;E и прш yiciOHtr cyttcpu.« t.urra ЮЛ

культуры, содержащие цккяофосфак культуры, содержащие супергигант ЛГМ и циклгх}хх:фэи

yjKUK'Hi. IgE » спонтанных культура* vp'Wm. IgE » npHi Vifcuim « yucpiuiaui'.) ЛГМ

ЦФ во всех используемых концентрациях (Рис.2,а.) способствует повышению синтеза 1дЕ в культурах, содержащих супернатант больного ОЛЛ. Максимальный эффект проявляется при использовании 5,0 и 20,0 мкг/мл препа-ратауровень 1дЕ оказался выше, чем в культурах, содержащих только МПК здоровых людей.

Контрсупрессорный эффект ЦФ ( Рис.2, б.) в присутствии супернатанта МПК больного ХЛЛ обратно пропорционален концентрации. Максимальное положительное действие наблюдается при 5,0 мкг/мл, отсутствие контрсупрессии - при 40,0 мкг/мл.

При добавлении ЦФ в концентрациях 5,0-20,0 миг/ мл ( Рис. 2,в.) в культуры, содержащие супернатант больного ЛГМ, наблюдается преимущественная стимуляция синтеза 1дЕ по сравнению с культурами без ЦФ и супернатанта. Контрсупрессорное действие ЦФ, однако более слабое.наблюдается в концентрации 40,0 мкг/мл.

Добавление ЦФ во всех концентрациях (Рис. 2,г.) тормозит супрессор-ное влияние на синтез 1дЕ МПК здоровых лиц в присутствии супернатанта ФГА - индуцированных МПК больного лимфосаркомой, 10,0 мкг/мл препарата оказывает максимальный положительный эффект.

На рис. 2, а - г видно. что торможение сулрессорной фракции МПК здоровых лиц определенными дозами ЦФ вызывает повышение синтеза 1дЕ в присутствии супернатантов МПК больных лимфопролиферативными процессами. Обнаруженное торможение синтеза 1дЕ в контроле (Рис. 1) связано, вероятно, с преобладанием в супернатантах больных цитокинов, стимулирующих супрессорные субпопуляции МПК здоровых доноров. Дополнительная преимущественная стимуляция синтеза 1дЕ а под влиянием супернатантов больных ОЛЛ и ЛГМ (Рис. 2, а и в) на фоне ЦФ свидетельствует о присутствии цитокинов, активирующих как хелперное звено, так и непосредственно 1дЕ-ан-тителопродуценты МПК здоровых лиц.

Цитокины, содержащиеся в супернатанте больного лимфосаркомой, не только активируют супрессорное звено, но и подавляют хелперные субпопуляции МПК здоровых лиц. блокпдп супрессорных клеюк ЦФ не вызывает до-

гюлнитепьного повышения синтеза IgE в присутствии супернатанта (Рис. 2,г), как это наблюдается при сочетанием влиянии цитостатика и супернатантов МПК больных ОЛЛ и ЛГМ (Рис. 2, а и в).

Незначительный положительный эффект ЦФ на синтез IgE МПК здоровых людей в присутствии супернатантов больного ХЛЛ свидетельствует о более высоком содержании при этом типе лимфопролиферации цитокинов, активирующих супрессорные фракции и угнетающих хелперные и антителопродуци-рующие субпопуляции (Рис. 2,6).

Полученные результаты влияния ФГА-индуцированных МПК больных лим-фопролиферативнымими процессами на синтез IgE МПК здоровых людей свидетельствуют о присутствии в крови этих больных цитокинов, как супрес-сируюидих, так и стимулирующих синтез IgE. Несоответствие между высоким уровнем сывороточного IgE при ОЛЛ, ЛГМ и НЗЛ и синтезом этих антител in vitro объясняется относительным превалированием супрессоров и низким уровнем IgE- продуцентов в составе МПК ( Барышников А.Ю., 1989; Йегер Л., 1990.). Низкие концентрации IgE в сыворотке больных ХЛЛ обусловлены резким преобладанием клеточных фракций, проявляющих значительно большую супрессорную и очень слабую хелперную активность в отношении синтеза антител по сравнению с регуляторными субпопуляциями при других исследуемых типах лимфопролиферативных заболеваний (Барышников АЮ.. 1989; KunicaJ., 1988.).

7.4. Влияние цитостатикоа на синтез IgE in vitro.

Синтез IgE в ФГА-индуцированных культурах МПК больных лимфомами в период опухолевой активности преимущественно угнетается. Обработка перед стимуляцией ФГА МПК больных лимфомами метотрексатом в концентрации 0,05-5,0 мкг/мл частично или полностью отменяет супрессию синтеза IgE-аитигел в ФГА-индуциронэнных культурах Наиболее выраженный контрсу-щкчсорпый зффокг котпрении прении,)с? 0.5 мкг/мп, когдп Н.|(1пкVl.HMCq

- IS-

преимущественное повышение синтеза IgE при стимуляции ФГА МПК больных лимфомами в период активности опухолевого процесса. Неодинаковое влияние метотрексата на синтез IgE в ФГА-индуцированных культурах МПК больных и здоровых людей вероятно, связано с различной чувствительностью су-прессорных и хелперных субпопуляций к цитостатикам, изменением ТцДу-ин-декса и регуляции lgE-продукции у здоровых и страдающих лимфопролифера-тивными заболеваниями людей ( Шабалин В.Н., 1988; Барышников А.Ю., 1989).

Исследование модулирующей способности цитостатиков ( циклофосфан 0,1-10,0 мкг/мл;цитозар 0,05-5,0 мкг/мл;метотрексат 0,05-5,0 мкг/мл;винкри-стин 0,001-0,1 мкг/мл ) на синтез IgE в культурах МПК больных ХЛЛ в период активности процесса показало, что исследуемые концентрации циклофосфана оказывают преимущественно стимулирующее действие на синтез IgE по сравнению со спонтанными культурами. Положительное влияние цитозара ( антиметаболит ) на синтез IgE проявляется в концентрациях препарата от 0,5 до 5,0 мкг/мл. Влияние метотрексата (антиметаболит) в концентрациях от 0,05 до 5,0 мкг/мл на синтез IgE стимулирующее. Максимальный положительный эффект цитостатика проявляется в концентрации 0,05 мкг/мл, минимальный -0,5 мкг/мл. 0,001 и 0,1 мкг/мл винкристина ( природный алкалоид ) стимулируют синтез IgE в культурах МПК больных ХЛЛ; 0,01 мкг/мл не оказывает сколько-нибудь значительного эффекта на синтез этих антител.

Полученные результаты свидетельствуют, что низкие уровни сывороточного IgE у больных ХЛЛ, по-видимому, обусловлены резким преобладанием супрессорных субпопуляций, оказывающих неспецифическое угнетающее действие на продукцию IgE . Применение цитостатических препаратов в оптимальных дсзировках у больных ХЛЛ может оказать тормозящее влияние на супрессию иммунологических процессов, частично нормализовать хелперно/су-прессорный индекс, стимулировать выработку антител ( в частности IgE ) и повлиять на противоопухолевый иммунитет.

7.Ь. Влияние простагла!щинов на синтез IgE in vitro

I'l-

B регуляции синтеза IgE и реакциях, обусловленных lgE-антителами кроме цитокинов, принимают участи липидные клеточные медиаторы - проста-гландины (PG), лейкотриены (LT) и другие ( Йегер Л., 1990; Медуницин Н.В., 1993). В ряде работ было показано, что ингибирование простагландин-синтетазы (PGS) индометацином практически не влияло на уровень пролиферации лимфоцитов здоровых лиц (Ширинский B.C., 1992; 1993). В связи с эти нами исследована lgE-продукция МПК больных лимфопролиферативными процессами в присутствии индометацина.

Установлено, что ингибирование PGS индометацином (10,0 мкг/мл) не оказывает значительного действия на синтез IgE МПК здоровых лиц. Блокада PGS оказывала слабый угнетающий эффект на синтез IgE МПК больных ХЛЛ и НЗЛ. В группах больных ОЛЛ и ЛГМ обнаружено положительное влияние индометацина на синтез этого класса антител in vitro (повышение lgE-продукции в 1.2 раза; Р<0,05).

Можно предполагать, что при лимфопролиферативных заболеваниях (особенно ЛГМ и ОЛЛ) простагландин Е2 (PGE2) не только принимает участие в регуляции процессов, опосредованных 1дЕ,но и оказывает влияние на синтез этого класса антител.

Слабый ингибирующий эффект индометацина в культурах МПК больных ХЛЛ и НЗЛ объясняется,по-видимому, непосредственным влиянием на анти-телопродуценты, так как известно, что PGE2 не оказывает ингибирующего влияния на пролиферацию B-лимфоцитов, активированных in vivo ( Simkin N.J., 1987).

У больных ОЛЛ и ЛГМ эффект не ограничивается влиянием на В-субпо-пуляции. МПК больных с опухолями ретикулоэндотелиальной системы (например ЛГМ) секретируюг больше PGE in vitro и особенно эффективны в подавлении ответов Т-клеток. Существуют эффекторные клоны, которые обладают структурами, чувствительными к PGE2. Влияние индометацина вызывает торможение супрессорных механизмов и активацию хелперных и антителопроду-циругсщих субпопуляций ( Пол У. 1987; Моисеенко B.C., 1991 ). Сочетанное лейг.ми/м! индометамипп на Т- , В- и моноцтпрньк; фракции МПК fioni.iiux

ОЛЛ и ЛГМ ослабляет влияние PG на процесс активации супрессорных механизмов, стимулируя синтез IgE в этих группах исследуемых лимфопролифера-тивных заболеваний.

Ранее установлено (табл. 1.), что уровни сывороточного IgE у больных НЗЛ в 2,0 раза выше, чем у больных ХЛЛ и здоровых лиц, а индометацин оказывает подобное слабое отрицательное влияние на синтез IgE in vitro. У больных ОЛЛ и ЛГМ стимуляция синтеза IgE in vivo сочетается с положительным влиянием индометацина на этот процесс in vitro. По-видимому, в исследуемых группах лимфопролиферативных заболеваний простагландины по-разному влияют на регуляцию синтеза IgE.

7.6. Участие гистаминовых рецепторов в регуляции синтеза IgE.

Имеющиеся данные об изменениях уровней сывороточного гистамина при лимфопролиферативных процессах (Komahashi К. et al. 1988 ) позволяют предлологать влияние блокады гистаминовых рецепторов на механизмы IgE -продукции. Эндогенный гистамин, являясь медиатором аллергии и воспаления (Бережная Н.М., 1992 ), может быть одним из факторов, способствующих изменению уровней IgE. На иммунокомпетентных клетках обнаружены три типа гистаминовых рецепторов: Н1-, Н2- и НЗ- ( Бережная Н.М., 1992).

Блокаторы Н1- ( клемастин ) и Н2 - гистаминовых рецепторов ( тагомет ) в концентрациях 10-5-Ю-8 М оказывают преимущественно угнетающий эффект на синтез IgE у здоровых доноров in vitro. На Рис. 3 видно, что повышение концентрации Н2-блокатора приводит к увеличению супрессии синтеза IgE, а блокада Н1-рецепторов вызывает обратную реакцию МПК здоровых людей.

- 21-

Рис.З.Влияние блокады Н1 - и Н2-рецептоов на синтез 1дЕ МПК здоровых лиц.

Ю-8 10"7 10"6 10'5

Концентрация препаратов М Уровень 1дЕ по оси ординат.

Н1- и Н2-блокаторы при воздействии на МПК больных ОЛЛ ( Рис.4.а. ) в концентрациях 10*8- ю*7 м вызывали торможение синтеза 1дЕ. Особенно значительным был эффект 10-7 м клемастина. Тагомет в концентрации 10*6 М преимущественно стимулировал синтез 1дЕ ( уровни 1дЕ выше, чем в спонтанных культурах). При концентрации препарата 10-5 м уровни 1дЕ-антител были близки к контрольным.

При блокаде Н1- и Н2- гистаминовых рецепторов МПК больных ХЛЛ наблюдается преимущественная однонаправленная стимуляция синтеза 1дЕ в концентрациях препаратов 10-8, 10-6-10*5 М ( Рис.4 б). Концентрация 10-7М не оказывает влияния на уровни 1дЕ в еупернатантах.

Блокада Н2-рецепторов МПК больных ЛГМ (Рис.4 в) положительно влияет на синтез 1.дЕ. При повышении концентрации Н1-блокатора стимулирующий эффект препарата ( 10"8-Ю"7 М ) отменяется в концентрациях Ю-б-Ю-5 М.

Ркс.4*Шимнис блокады и Н.-рещчггчфов и;« су»г«.*ч IgE МПК Гямьиих ОЛЛ

РисЧб Кэмгинм- им'Киды Hj - и Mj-peneirropo« п» ctitm-.t IgE МПК {"»лиилх ХЛЛ

^ ее

I .,

10* ю-7 ft* 10-5

котцитрщи Н1< и НЗ-бдживре!, М

Н i -бломтор -блока тор

! -4

!(Н 10-7 щ-в яомцмтрация И1 • и Н2*&*омторо«, W

Ht «блока тор Н^бдокатор

Рис.*» Влияние биюжады Hj- к Н^рецеотороа «а синтез IgE МПК больных дофогравумштоао»

Рис.41* Вшам блокады Нг л Hi«peq»Bxopo& ш сиятез IgE МПК больны* лхмфосаркомахх

% М

10-» 10-7 10-е ад-5 аоицситртумЖ- и Ш-бкпаторв«, М

tO10*? Ю-« 10*5 омцакгрэчи* МТ- и Ю-флоотарм. М

Hj-C локатор Н2-6локагор

Н ^локатор Н^-б локатор

Клемастин (Н1-блокагор ) отрицательно влияет на синтез IgE в культурах МПК больных НЗЛ (Рис.4 г), что наиболее выражено в концентрациях 10-6 M препарата. При блокаде Н2-рецепторов торможение синтеза IgE (10-8 M таго-мета) сменяется стимуляцией ( концентрации 10-7-10-6 М) с преимущественным угнетением lgE-антителообразования (10-5 M препарата).

Известно, что при злокачественных лимфопролиферативных заболеваниях уровни сывороточного гистамина часто выше, чем у здоровых лиц ( Komahashi К. et al 1989; Belcheva A. et al. 1992). Сопоставляя полученные результаты действия Н1- (преимущественное торможение синтеза IgE) и Н2- (стимуляция в определенных концентрациях IgE - продукции ) блокаторов на МПК больных in vitro , можно сделать вывод,что эндогенный гистамин в высоких концентрациях, связываясь с гистаминовыми рецепторами (особенно с Н1-), стимулирует синтез IgE in vivo у больных ОЛЛ. ЛГМ, и НЗЛ. Установлено (Табл.1), что при ОЛЛ и лимфосаркомах наблюдаются самые высокие уровни сывороточного 1дЕ,а блокада H1-рецепторов вызывает наиболее значительное торможение IgE - продукции in vitro (Рис.4 а и г.). У больных ХЛЛ и ЛГМ in vitro наблюдается преимущественное повышение уровней IgE при блокаде Н2 - рецепторов и, вероятно, действия эндогенного гистамина на Н1-рецепторы (Рис.4 б и в). Низкие уровни сывороточного IgE у больных ХЛЛ обусловлены активацией гистамином эффекторов супрессорных реакций, т.к. применение Н2-блокаторов in vivo у этих больных стимулировало процессы антителообра-зования ( Belcheva A. et al. 1992; Nielsen H. et al. 1992).

На рис.3 видно, что y здоровых людей действие блокаторов Н1- и Н2-гистаминовых рецепторов на синтез IgE in vitro избирательно и подчиняется зависимости доза-эффект. По-видимому,у практически здоровых лиц существует определенное равновесие в соотношении гистаминовых рецепторов и их чувствительности к гистамину. При злокачественных лимфопролиферативных заболеваниях изменяется соотношение гистаминовых рецепторов на иммуно-компегеигных клетках, извращается их чувствительность к эндогенному i исга-мину ( Б(;р(зжная Н.М., 1992; Kamahashi K.et al. 1988)

- 2-1-

При оценке влияния блокады Н1- и Н2-рецеторов МПК больных людей на синтез IgE ( Рис.4 а-г ) не наблюдается четкой разнонаправленной зависимости доза-эффект, как это происходит в культурах МПК здоровых доноров. Поэтому, изменение уровней сывороточного IgE при исследуемой патологии может быть следствием не только различных концентраций эндогенного гис-тамина у больных и здоровых людей. Нарушение соотношения гистаминовых рецепторов (Н1- и Н2- в частности), изменение их чувствительности , должно приводить к извращению взаимодействия между иммунорегуляторными субпопуляциями. Одним из следствий этих сдвигов является изменение уровней IgE в крови при злокачественной лимфопролиферации по сравнению со здоровыми людьми.

ВЫВОДЫ.

t. Уровень сывороточного IgE у больных ОЛЛ, ЛГМ и НЗЛ при первичном обследовании выше, чем у здоровых людей.Концентрация IgE в крови больных ХЛЛ ниже, чем в других группах исследуемых лимфопролиферативных заболеваний и мало отличается от концентрации IgE у здоровых людей.

2. На фоне проводимого специфического лечения уровень IgE в крови больных преимущественно снижается.Во время ремиссии- концентрация сывороточного IgE уменьшается у больных ОЛЛ и ЛГМ и увеличивается у больных НЗЛ . При рецидивирующем течении злокачественного лимфолролифера-тивного процесса наблюдается снижение концентрации IgE у всех обследованных больных.

3. У больных лимфопролиферативными процессами не выявлено зависимости между уровнями сывороточного IgE и синтезом этого класса антител in vitro. Обнаружено снижение lgE-продукции в ответ на стимуляцию ФГА МПК больных с высокой активностью лимфопролиферативного процесса. Синтез IgE в ФГА-индуцированных культурах МПК больных повышается при проведении полихимиотерапии, в период ремиссии лимфопролифератиавного процесса или при добавлении в культуры инактивироеанных МПК здоровых лиц.

4.Подавление in vitro чувсгешельных к цитостагикам суг,рессорных фракций МПК больных лимфопролифератиоиыми процессами оказывает симулирующее воздействие на синтез IgE за счет изменения соотношений в хелпер-но/ супрессорных популяциях.

5.Стимулированные ФГА МПК больных лимфопролиферативными процессами выделяют растворимые факторы, как тормозящие lgE-продукцию в культурах МПК здоровых людей,так и стимулирующие синтез IgE .

6. Блокада ПГС индометацином стимулирует синтез IgE in vitro у больных ОЛЛ и ЛГМ за счет угнетения супрессорных субпопуляций и не оказывает значительного влияния на lgE-продукцию в культурах МПК больных ХЛЛ и НЗЛ. При блокаде in vitro Н1- и Н2-гистаминовых рецепторов МПК больных лимфопролиферативными процессами нарушена четкая связь между концентрацией блокатора, типом рецептора и уровнем продукции IgE.

7. Под влиянием злокачественной лимфоидной пролиферации происходит изменение чувствительности простагландиновых и гистаминовых рецепторов. нарушаются механизмы активации и цитокиновой регуляции синтеза IgE, что вызывает изменение уровней сывороточного IgE при лимфопролифе-ративных процессах.

8. Анализ изменений в lgE-продукции при лимфопролиферативных заболеваниях может иметь диагностическое и прогностическое значение.

- 26-

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1.Riger N.,Khanferyan R.A. Histamine and prostaglandines in the regulation of IgE synthesis in lymphomas.// AMEHRS XXII.-Budapest.: 1994.-1p.

2.Riger N.,Khanferyan R.A. On the role of histamine in regulation of IgE-antibody synthesis in lymphomas.//AMHRS'94.-Canada.-1994.-1p.

3.Riger N.,Khanferyan R.A. Immune disfunction in lyraphoproliferative diseases.// EAACI,95.,Spain.-1995.-1p. '

4.Ригер НА.Ханферян P.A. Модулирующее влияние цитостатиков на синтез IgE у больных лимфомами.// 1-й конгресс "Реабилитация в медицине".-Сочи.- 1995.-1 с.

Б.Ригер Н.А.,Ханферян Р.А. Лимфомы как иммунопатологический процесс.// Аллергология и клиническая иммунология.-1995.-N 3-4.-6с.