Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Экспериментальное обоснование новых подходов к патогенетической профилактике и терапии метастазов злокачественных опухолей

ъ ^ •

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР им. Н.Н.БЛОХИНА

КОЗЛОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ НОВЫХ ПОДХОДОВ К ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКЕ И ТЕРАПИИ МЕТАСТАЗОВ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ.

14.00.14- Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1997 г.

Работа выполнена в Онкологическом научном центре им.Н.Н.Блохина Российской Академии медицинских наук

Научный консультант:

доктор медицинских наук Г.К.Герасимова

Официальные оппоненты: академик РАЕН, профессор А.Ы.Гарин доктор медицинских наук В.М.Бухман доктор биологических наук Л.А.Островская

Ведущее учреждение:

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена МЗ и МП РФ.

Защита диссертации состоится " " 1397 г.

в " /О " часов на заседании Специализированного совета Д.001.17.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Онкологическом научном центре им.Н.Н.Блохина РАМН (Москва, 115478, Каширское шоссе.24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического научного центра РАМН

Автореферат разослан

Учений секретарь Специализированного совета, кандидат медицинских наук

Ю.В.Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Раннее метастазировачие - одна из ключевых причин нерадиальности всех современных способов терапии наиболее распростра-енных злокачественных опухолей. Несмотря на очевидный прогресс в х лечении, основанный на совершенствовании хирургического, луче-ого и химиотерапевтического методов воздействия и создании более Ффективных схем их сочетанного применения, до настоящего времени клинике отсутствуют высокоэффективные лекарственные средства, пособные ингибировать метастатический процесс. Отсутствуют также ациональные, унифицированные и корректные способы поиска таких репаратов в эксперименте.

За последнее десятилетие фундаментальней медико-биологической аукой получены результаты, конкретизирующие и расширяющие пред-тавление об онкопатогенезе, в том числе механизмах инвазии и ме-астазирования злокачественных опухолей. Выявлены и охарактеризо-аны, в частности, роль и механизмы локального протеолиза в реа-изации опухолевой инвазии, адгезивных молекул, их соответствую-их рецепторов в осуществлении межклеточных коммуникаций в зоне пухолевого роста, циркуляции диссеминирукших клеток в процессе этастазирования с клетками крови, эндотелием и базальными мем-ранами кровеносных сосудов, компонентами экстрацеллюлярного мат-икса. Выявлена роль микроокружения в Формировании признаков зло-ачественного Фенотипа.

На основании этих данных интенсивно формируется новый способ эрапии метастазов злокачественных опухолей, основанный на ис-зльзовании селективных регуляторов биологических процессов, ле-ащих в основе механизма метастазирования. Более того, отдельные репараты, показавшие в эксперименте антиметастатическую актив-ость,- ингибиторы протеиназ, способные блокировать инвазивную хтивность опухолевых клеток, ингибиторы агрегации тромбоцитов и ?теротипической адгезии опухолевых клеток и т.д.. находятся на азных этапах клинического изучения.

3 тоже время, полученные результаты часто противоречивы. Это Зусловлено отсутствием унифицированных "синнипое :: критериев ценки антиметастатической активности, попытками сформулировать Эобщаювде общетеоретические выводы на основании лишь частных эф-эктов, в отрыве от системного анализа сложной совокупности мно-очисленных биологических эффектов метастатического процесса.

Остаются невыясненными реальные терапевтические возможности многих изученных агентов с предполагаемой антиметастатической активностью, неясны роль и место таких соединений в арсенале современных средств профилактики и терапии метастазов злокачественны} опухолей, не разработаны принципы сочетанного применения цитоста-тиков, хирургического вмешательства и потенциальных ингибиторо! метастазирования.

Эти обстоятельства обосновывают необходимость совершенствована подходов к поиску, изучению и практическому применению антиметастатических агентов с патогенетической направленностью действия.

Диссертация выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО ОНЦ РАМН (тема 255,шифр программ* 18.06, N госрегистрации 01.9.30.009897; тема 154, шифр программ! 18.06, N госрегистрации 01.9.20.005226 и тема 169, шифр программ 18.10, N госрегистрации 01.9.20.005311).

Цель исследования:

Разработать методологические подходы к созданию лекарственны: средств, воздействующих на патогенетические механизмы процесс; метастазирования, дать теоретическое и экспериментальное обоснование новых способов профилактики и терапии метастазов злокачественных опухолей с использованием этих средств.

Задачи исследования:

1.Разработать методические и методологические принципы поиск; и доклинического изучения средств, способных ингибировать процес< метастазирования злокачественных опухолей. Упорядочить и стандартизовать схемы исследований, унифицировать критерии оценки специфической активности.

2.Охарактеризовать потенциальные мишени воздействия антиме тастатических средств с патогенетической направленностью дейс твия.

3.Изучить влияние на метастазирование перевиваемых опухоле известных фармакологических средств и новых химических соедине ний. способных воздействовать на биологические реакции, лежащие основе механизма метастазирования.

4.Разработать рациональные режимы применения антиметастати ческих средств с патогенетической направленностью леиствия.

5. Разработать схемы сочетанного применения традиционных спо собов противоопухолевой терапии и антиметастатических средств с патогенетической направленностью действия.

6.Определить перспективы поиска антиметастатических средств с татогенетической направленностью действия, а также подходы к совершенствованию дизайна известных противоопухолевых препаратов с делью повышения их антиметастатической активности.

Научная новизна:

Разработаны и внедрены в научную практику методические рекомендации по доклиническому изучению средств, способных ингибиро-зать процесс метастазирования злокачественных опухолей.

Разработаны новые модели для проведения экспериментов по экс-1ериментальной химиотерапии: модель метастазирования колоректаль-юго рака в печень, модель для тестирования активности препаратов з режиме адъювантной терапии, модель для оценки активности ингибиторов неоангиогенеза.

Дано теоретическое и экспериментальное обоснование новых под-содов к терапии и профилактике метастазов злокачественных опухо-1ей на основе использования средств, способных ингибировать био-югические процессы, лежащие в основе механизма метастазирования.

Показана принципиальная возможность ингибирования процесса (етастазирования опухолей с помощью ингибиторов протеиназ, адге-¡ивных межклеточных взаимодействий, неоангиогенеза. Разработаны финципы сочетанного применения таких агентов и методов традици-)нной терапии опухолей.

Впервые показана возможность повышения антиметастатической 1Ктивности таких средств путем иммобилизации их на полимерных но-¡ителях, обладающих собственной биологической активностью.

Получены новые данные о воздействии на процесс метастазирова-[ия нсвых химических соединений и известных фармакологических средств, в частности ингибиторов протеиназ, блокаторов кальциевых :аналов, ингибиторов агрегации тромбоцитов и др.

Получены новые данные, расширяющие представления о механизме [етастазирования.

Выявлены существенные различия содержания и состава гликос-¡инголипидов плазматических мембран клеток опухолей, различающих-я по способности к метастазированию, а также метастазов одной и ■ой же опухоли в различные органы.

Показана возможность воздействия экзогенных ганглиозидов на етаетазирование экспериментальных опухолей, усиления эффекта при .спользовании последних в виде механической смеси с сополимером ивинилового эфира и малеинового ангидрида (ШУЕМА), обладающим дъювантными свойствами на фоне хирургического удаления первичной

опухоли.

Выявлена цитотокеическая активность церамидов, выделенных и; нормальных тканей и снижение цитотокеичности церамидов , полученных из опухолей соответствующего гистогенеза.

Эти данные открывают возможность разработки принципиально нового метода противоопухолевой терапии, основанной на применена средств, модулирующих биосинтез клеточных церамидов.

Получены новые, данные о способности оригинальных химически: соединений и известных фармакологических средств, в частности ингибиторов протеиназ, блокаторов кальциевых каналов, ингибиторо] агрегации тромбоцитов и др. воздействовать на процесс метастази-рования. У ряда применяющихся в практике фармакологически: средств, в том числе£-аминокапроновой кислоты, индометацина, ве-рапамила, тамоксифена, супрастина выявлена антиметастатическаа активность.

Показана возможность повышения противоопухолевой и антиметастатической активности цитостатиков при сочетанном применении ( индометацином, верапамилом.

Показана возможность стимуляции роста и метастазирования опухолей при воздействии модификаторов биологических реакций: фактора активации тромбоцитов (ФАТ), G-CSF и ОЛ-CSF и др.

Впервые показано, что ФАТ обладает способностью резко стимулировать продукцию опухолевыми клетками активатора плазминоген: типа урокиназы (у-АП), участвующего в реализации их метастатического фенотипа.

Показана способность лектинов. обладающих повышенной троп ностью к мембранам опухолевых клеток, повышать цитотоксическу] активность цитостатиков. включенных в виде липидных производных мембрану липосом.

Научно-практическая значимость результатов:

Разработаны и Енедрены в практику "Методические рекомендаци по доклиническому изучению средств, обладающих способностью инги бировать процесс метастазирования и повышать эффективность цитос татической терапии злокачественных опухолей" (Утверждении МЗ ССС в 1991 г.).

Усовершенствованы методические и методологические принципы от бора и углубленного изучения антиметастатических средств, разра ботаны критерии корректной оценки их активности.

На основе глубокого системного анализа биологических процес сов, лежащих в основе механизма метастазирования, охарактеризова

- б -

ы мишени воздействия потенциальных антиметастатических средств с атогенетической направленностью действия,что создает рациональ-ые основы для экспериментальной разработки новых способов тера-ии метастазов.

Намечены принципиально новые подходы к воздействию на процесс етастазирования с помощью средств, модифицирующих биосинтез ли-идов клеточных мембран.

Обоснованы принципы рационального построения схем сочетанного рименения агентов,способных ингибировать процесс метастазирова-ия и традиционных методов противоопухолевой терапии (химиотера-ия, хирургия).

Разработана серия конъюгатов рубомицина fRb) и цисплатина CP) с полимерным носителем DIVEMA, обладающих меньшей токсич-остью и более высокой противоопухолевой и антиметастатической ктивностью по сравнению со свободными штос т атаками. Спеиифичес-ая активность конъюгата DIVEMA-Rb изучена в объеме, достаточном ля представления материалов в ФК.

Данные по синтезу и биологической активности двух новых конъ-гатов CP с новым полимерным носителем на основе 1,4-диизопропок-ибутена-2 (DIPB-2) защищены патентами РФ.

На рациональной основе, как потенциальные антиметастатические генты. созданы конъюгаты Rb и CP с DIVEMA, дополнительно модифи-ированные ингибитором протеиназ е-аминокапроновой кислотой (АКК). оказана высокая противоопухолевая и антиметаетатическая актив-ость этих оригинальных по строению новых соединений.

Впервые продемонстрирована возможность повышения активности нтиметастатических средств с патогенетической направленностью =йствия путем иммобилизации их на полимерном носителе.

На основании полученных данных о гиперпродукции опухолевыми летками с высоким метастатическим потенциалом у-АЛ. создан конъ-гат Rb, связанного с полимерным носителем с помощью пептидного тейсера, чувствительного к воздействию у-АЛ. Данное макромолеку-арное соединение представляет собой "про-лекарство", способное <тивироваться опухолевыми клетками, имплантирующимися в тка-я-мишени. Данное соединение может быть средством профилактики гтастазирования.

Изучено влияние на процесс метастазировакия ряда регуляторов грегации тромбоцитов, в частности ингибитора 11Ы11а интегрина Joene, индометацина, блокаторов кальциевых каналов, ФАТ и его эоизводных.

Показана способность ингибировать процесс метастазирования

ингибиторами адгезивных клеточных взаимодействий.

Разработаны схемы сочетанного применения потенциальных ингибиторов ыетастазирования, цитостатиков и хирургического воздействия, заслуживающие апробирования в клинической практике.

Методические подходы к оценке антиметастатической активност] соединений, разработанные автором, применяются в других научны: учреждениях, о чем имеются акты внедрения.

Результаты исследования полностью отражены в опубликовании: работах. По теме диссертации опубликовано 33 работы (6 из них - i зарубежных изданиях). Основные положения диссертации обсуждены н< 4 Республиканских и Всесоюзных и о Международных конференциях.

Апробация диссертации:

Апробация диссертации проведена на межлабораторной конференции в ОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Материалы диссертации доложен: на IV Всесоюзном съезде онкологов,1986 г..Ленинград;IX Всесоюзно! симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения",199 г., Звенигород; Международной конференции "Контроль роста и тера пия рака", 1994 г. Будапешт; Научно-практической конференци Каз.НИИ.клинической и экспериментальной хирургии им. А.И.Сызгано ва, 1993 г., Алма-Ата; V111 и IX международных конференциях Наци опального ракового института (США) и Европейской организации изу чения и терапии рака "Новые лекарства в терапии рака", 1994 1996 гг. Амстердам, Голландия; Х111 Международном симпозиуме п медицинской химии, 1994 г., Париж, Франция; 1 Съезде онколого стран СНГ, 1996 г.,Москва; 111 Всероссийском национальном конг рессе " Человек и лекарство", 1996 г., Москва.

Структура и объем диссертации:

Работа изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, 11 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего источников отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 88 таблицами и 37 рисунками.

Материал и методы исследования:

Эксперименты по тестированию противоопухолевой и антиметаста тической активности провопили™ «я животных ;линий C57BI/6 Balb/c, СБА, SHY/Kv, A/Snell и гибридах песвого-поколения BDFf.

Все лабораторные животные содержались в условиях вивария С® РАМН и получали стандартное кормление.

В исследованиях использованы перевиваемые опухоли банка опу

.олевых штаммов ШЦ РАМН : карцинома легкого Льюис, карцинома югкого РЛ-67, меланома В-16, меланома Гардинга-Пасси, меланома ¡лаудмана. рак вейки матки РШМ-5, аденокарцинома толстого кишеч-мка АКАТОЛ, аденокарцинома молочной железы АК-755, рак молочной селезы ВМР-П, ;аркома-37, а также полученный в ходе настоящего «¡следования асцитный вариант рака легкого Льюис и др.

Противоопухолевое действие новых химических соединений и изустных фармакологических препаратов оценивали в соответствии с гуществуадими "Методическими рекомендациями по изучению специфи-юской активности противоопухолевых препаратов, предлагаемых для гспытаний в клинике" (М.1986). Антиметастатическую активность фепаратов тестировали на основе разработанных с участием автора 1астоящего исследования "Методических рекомендаций по доклиническому изучению средств, способных ингибировать процесс метастази-эования и повышать эффективность цитостатической терапии злока-1ественных опухолей" (МД992). В качестве моделей метастазирова-тя использованы карциномы легкого Льюис и РЛ-67, меланома В-16 и ювая, разработанная автором, модель метастазирования колорек-гального рака в печень (на основе ортотопической трансплантации эпухоли АКАТОЛ мышам линии Balb/c в стенку толстой кишки).

Влияние препаратов на образование "искусственных" метастазов эценивали по известной методике, основанной на внутривенной имп-нантации суспензии клеток меланомы В-16, а также асцитного варианта опухоли Льюис и асцитной саркомы -37.

Аутопсийный материал подвергали патоморфологическому изучению по общепринятой методике ( Меркулов Г.А.,1969).

Уровни АН определяли двойным антительным сендвич-методом (ELISA) с использованием диагностических наборов НПЦ МБ МЗ РФ. Активность АЛ определяли фибринолитическим методом (Astrup,1952). Тип АЛ определяли методом аппликации полиакриламидного геля на фибриновые пластины и последующего электрофореза в разделяющем геле. Активность антиплазминов оценивали по подавлению активности плазмина, используя в качестве калибровочного материала контри-кал. Время лизиса эуглобулинового сгустка определяли по методу Niewlarowski, 1960.

Влияние препаратов на процесс агрегации тромбоцитов оценивали по стандартной методике (Mahaligam M.et al.1983. Saiki !. et а!.. i989 ) с помощью агрегометра ''Tnramiite-iüüü а" с цифровой индикацией и графическим регистрирующим устройством. В качестве контрольного индуктора агрегации тромбоцитов использовали ADP в концентрации 5 Midi.

Ганглиозиды из опухолей выделяли по методу Dyatlovitskaya et.al.,1976, и идентифицировали микротонкослойной хроматографией на пластинках (6x9 см) с силикагелем КСК (5-7 мк) в системах хлороформ- метанол-2, 5 н.аммиак 60:35:8 (система А) и н - пропа-нол-вода 7:3 (система В). В качестве стандартов использовали ганглиозиды животных известного строения.

Относительное содержание компонентов в смеси ганглиозидов определяли на сканирующем денситометре "Chromoscan -200" (Джойс-Лойбл", Великобритания). Ганглиозиды разделяли препаративной ТСХ по методу Dyatlovitskaya et al.,1976. Зоны, содержащие ганглиозиды, экстрагировали смесью хлороформ-метанол-вода 50-50-15. Обработку ганглиозидов нейраминидазой из нехолерного вибриона (активность 800 уд/мл) проводили по известному методу (Дятловитская Э.В и соавт.1980). Продукты ферментолиза исследовали с помощью микротонкослойной хроматографии в системе Б. Для обнаружения ганглиозидов и асиалоганглиозидов использовали, соответственно, резорциновый (Svennerholm L.,1963) и антроновый (Morris D.L.,1948) реагенты. Идентификацию сиаловых кислот проводили микротонкослойной хроматографией на силикагеле, импрегниро-ванном одно-замещенным фосфатом натрия (Dyatlovitskaya E.V. et al, 1976). Содержание сиаловых кислот определяли при сравнительном денситометрировании с известными количествами N-ацетил и N-гликолилнейраминовой кислоты. Содержание белка определяли по методу Lowry О.Н.(1951).

Статистическую обработку полученных результатов проводили по критерию х2 при к0,05, д<0,01 и по критерию U Уилкоксона-Манна Уитни при р$0,05, р<0,01 и р$0,001.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ:

1.Методические и методологические аспекты изучения средств, способных ингибировать процесс метастазирования.

До настоящего времени создание адекватных моделей метастазирования опухолей, а также разработка корректных критериев и способов оценки антиметастатической активности остаются нерешенными задачами. В целях поиска новых более адекватных моделей нами изучены частота, интенсивность метастазирования и закономерности органного распределения метастазов всех имеющихся в банке опухолевых штаммов ОВД РАМН перевиваемых опухолей мышей. Одна из основных задач при этом состояла в отборе наиболее подходящих моделей для практического использования в работах по экспериментальной

:имиотерапии.

1.1 Частота, тип, сроки метастазирования и особенности органного распределения метастазов.

Оценена способность к метастазированию аденокарциномы молоч-юй железы мышей (АК-755), карцином легкого Льюис и РЛ-67, рака аейки матки (РИМ-5), аденокарциномы толстого кишечника (АКАТОЛ), кланом Гардинга-Пасси, Клаудмана (б-91) и В-16, рака молочной келезы ВМР-П, саркомы 37 и ряда других опухолей. Среди них только некоторые (карцинома Льюис и меланома В-16) известны широкому <ругу исследователей, как штаммы метастазирующих опухолей.

Наибольшую частоту метастазирования при подкожном способе прививки показали карциномы легкого Льюис и РЛ-67, меланома В-16, саркома 37, рак молочной железы ВМР-П. У погибших животных с кар-диномами Льюис, РЛ-67 и саркомой 37 макроскопические метастазы обнаруживались в 100Х случаев. Частота метастазирования рака молочной железы ВМР-П и меланомы В-16 близка к 10ОХ. Гораздо реже летаетазируют меланомы Клаудмана и Гардинга-Пасси. Метастазы рака лейки матки (штамм РШМ-5) обнаружены у половины животных. Адено-карцинома молочной железы АК 755 не метастазировала (Таблица 1).

Выраженные различия выявлены в отношении типа метастазирования и локализации метастазов различных опухолей. Саркома 37 при подкожном способе прививки метастазировала преимущественно по лимфогенному типу. Метастазы локализовались в подмышечных, паховых, забрюшинных, подчелюстных, паратрахеальных лимфатических узлах, а в отдельных случаях,- в надпочечниках, тимусе и легких.

Карциномы Льюис и РЛ-67, рак молочной железы ВМР-П и меланомы метастазировали по гематогенному типу. Карциномы Льюис и РЛ-67 метастазировали в легкие, ВМР-П - в печень, яичники,надпочечники, легкие. Карцинома РЛ-67, помимо легких, метастазировала в сердце, почки, надпочечники, яичники.

Аденокарцинома толстого кишечника АКАТОЛ метастазировала по смешанному типу. При создании штамма авторы отмечали метастазиро-вание опухоли лишь в регионарные лимфатические узлы. Затем, в ходе серийного пассирования, она приобрела способность метастазировать в печень, утратив ее вновь через несколько десятков пассажей.

Изучено влияние способа прививки на особенности метастазирования опухолей. В экспериментах с карциномами Льюис и РЛ-67 как при подкожной, так и внутримышечной или внутрибрюшинной имплантации клеток наблюдался один и тот же тип метастазирования - гема-

Таблица 1. Частота и тип метастазирования перевиваемых опухолей мышей.

штамм Реципи- Пол Ср.продол. мета ста зирование опухоли

енты

Тип Частота Преимуи.локализация мет-зов

саркома ЛГС/Ку о 52,0+1,2 лимфо- 100% подмышечные, паховые,подче-

37 генный люстные, эаброшинные, пара-

трахеальные лимф.узлы; надпо-

чечники, тимус, легкие.

АКАТОЛ ВАЬВ/с 0 29,0+0,8 смешан- 100% подмышечные, паховые, подче-

ный люстные лимф.узлы; печень

Карцинома о 24,0+1,1 гемато- 100% легкие

Лькис В0Р1 генный

Карцинома 36,0+4,6 гемато- 100% легкие, срдце, почки, надпо-

РЛ-67 В0Р1 о генный чечники , яичники

ВМР-П А/Бп 0 29,2+1,3 гемато- 90% печень, яичники, надпочеч-

генный ники. легкие

меланома О 27.0+0,^ "емато- 90% легкие

В-16 вог1 генный

меланома ВЭР1 О 47,3+1,9 гемато- 75% легкие

Клаудмана генный

РШМ-5 СВА О 40,1+1,1 лимфо- 55% паховые, подчелюстные, под-

генный мышечные лимф, узлы

Меланома В0Р1 О 73,1+2,1 лимфо- 35% паховые, подмышечные, подче-

Гардинга- генный -1>.стниг лимф. узлц

Пасси

АК-755 ВРР1 О 26,0+0,8 - - -

[ии клеток наблюдался один и тот же тип метастазирования - гема-'огенный и единственным местом локализации метастазов были лег-ле. Различия носили лишь количественный характер.

В опытах с саркомой 37, метастазирушей по лимфогенному типу, юлучены такие же результаты.

)ти данные свидетельствуют о существовании "тропности" метастази->ующих опухолевых клеток к определенным тканям и органам.

1.2 Интенсивность метастазирования перевиваемых опухолей мышей при подкожной прививке.

В своей работе мы отказались от часто используемого качест-¡енного обозначения интенсивности метастазирования условными сим-юлами (например от + до +++). В ходе выполнения работы апробиро-¡аны разнообразные способы количественной оценки интенсивности ¡етастазирования и разработаны критерии, отвечающие требованиям юстоверности, объективности, простоты применения. Нам представились мало удобными для практического применения в условиях се->ийных химиотерапевтических экспериментов методы гистологической ¡ерификации метастазов. Подсчет метастатических узелков и опреде-[ение их площади или объема - высоко субъективны, трудоемки, со-[ряжены с вероятностью получения ошибочных результатов.

В то же время, определение коэффициента массы органа, пора-сенного метастазами (т.е. отношение массы этого органа с метаста-)ами к массе животного без опухоли), средней массы метастазов в юраженном органе или суммарной массы метастазов в пересчете на щно животное на фоне высокой интенсивности спонтанного метаста-шрования опухолей, отобранных .<:ами в качестве моделей для химиотерапевтических экспериментов, просто, объективно и достоверно [Таблица 2).

Показано, что интенсивность метастазирования карцином Льюис и >Л-67, а также рака молочной железы ВМР-П очень велика. Суммарная «асса метастазов в пересчете на 1 мышь равна для карциномы Льюис '31,8±37 мг, для карциномы РЛ-67 - 434,5±29 мг, а для саркомы 37 ■ 1837+313,8 мг. Менее интенсивно метастазировали меланомы, в 1астности В-16. Метастазы этой опухоли в легкие представляют со-юй небольшие, слегка возвышающиеся над поверхностью легких, гзелки 2-4 мм в диаметре и почти не влияют на суммарную массу лег-дах. В этих случаях, подсчет метастатических узелков оправдан.

На основании данных о частоте и интенсивности метастазирова-шя для химиотерапевтических экспериментов рекомендованы четыре юревиваемых опухоли мышей разного гистогенеза: карциномы легкого 1ьюис и РЛ-67, меланома В-16 и саркома 37.Это опухоли разного гис-

тогенеэа, обладающие высокой частотой и интенсивностью метастази-рования, характеризующиеся разной чувствительностью к химиотера-певтическим препаратам разных классов. Рак молочной железы ВМР-Г и аденокарцинома толстого кишечника АКАТОЛ метастааировали при обычных способах прививки недостаточно стабильно и не рекомендовг ны нами для работ по экспериментальной терапии метастазов.

Выбор двух, казалось бы одинаковых моделей, опухолей Льюис у РЛ-67, объясняется принципиальным различием их реакции на удаление первичного опухолевого узла.

Кроме того, мы разработали метод определения интенсивности ме-тастазирования, основанный на хирургическом удалении первичногс опухолевого узла с последующей оценкой метастатического процессе по продолжительности жизни оперированных животных. Данный мето; мы считаем наиболее объективным и высокодостоверным, т.к. продолжительность жизни животных с радикально удаленными первичным! опухолями зависит только от наличия метастазов в жизненно важньп органах и темпов их развития.

Таблица 2.Интенсивность метастазирования некоторых перевиваемых опухолей мышей после подкожной прививки.

Штамм Реципи- Ср.продол-опу- енты житель-холи ность жиз-

ни, дни

Интенсивность метастазирования

ср.масса ср.масса ср.масса

легких метаста метаста-

подопыт- зов в зов на

ных жив. легких, одну мышь мг мг мг

Карцинома

Льюис ВОП 28,4+0,9 921,8+65,9 731,8±37,0 731,8+37,0

Карцинома

РЛ-67 ВОП 29,2+1,2 609,5+49,8 434,5+29,0 434,5+29,0

Меланома

В-16 ВОП 29,0+0,8 214,0+16,2 37,5+8,7 37,5+8,7

Саркома *

37 1НУ/Ку 47,7+2,6 212,5+4,1 - 1339,0+313,0

* - метастазы в лимфатические узлы.

1.3. Сроки метастазирования перевиваемых опухолей.

При проведении химиотерапевтических экспериментов необходимо проводить четкую грань между применением лекарственных средст] с целью предупреждения появления и развития метастазов, т.е. <

целью их профилактики, и терапии ухе сформировавшихся метастазов. Учет данных о сроках метастазирования экспериментальных опухолей, используемых в качестве моделей метастазирования, необходимое условие корректного проведения таких экспериментов.

Нами изучена динамика метастазирования карцином легкого Льюис и РЛ-67, меланомы В-16, рака молочной железы ВМР-П и саркомы 37.

Установлено, что метастазы опухолей Льюис, РЛ-67, ВМР-П и меланомы В-16 после, подкожной трансплантации 1,0 млн. клеток этих опухолей "закладываются" на 5-7 день. При удалении первичной опухоли на 7-й день после трансплантации, опухолевые клетки уже присутствовали в легких в количестве, достаточном для последующего развития метастазов. Опухоль РЛ-67 метастазирует в почки, миокард, надпочечники после 9-го дня. Саркома 37 при подкожной прививке метастазирует не ранее 14-го дня.

1.4. Интенсивность метастазирования опухолей при удалении первичного узла.

Как в клинической, так и экспериментальной онкологии известен факт стимуляции роста метастазов после удаления первичной опухоли. Этот факт оказывает существенное влияние на результат хирургического и лекарственного лечения злокачественных новообразований.

Мы изучили влияние удаления первичного узла на интенсивность метастазирования новообразований, отобранных как наиболее подходящие модели для работ по терапии и профилактике метастазов.

Показано (Таблица 3), что удаление первичного опухолевого узла оказывает стимулирующе-- ьлкяние на развитие метастазов карциномы Льюис и меланомы В-16. Более сильно зто влияние выражено при меланоме В-16.

Средняя масса метастазов в легких оперированных животных в три раза превышала массу метастазов контрольных,неоперированных. Так, при удалении первичной опухоли на 12-й день она была равна в подопытной группе 771 мг, а в контрольной - 227,5 мг.

В опытах с меланомой В-16 стимулирующее влияние операции на рост метастазов было выражено еще сильнее. У оперированных животных в большинстве случаев легкие были полностью замещены опухолевой тканью, масса которой иногда доходила ло 2,0 г. Б опытах с карциномой РЛ-67 стимулирующего влияния операции на рост метастазов отмечено не было.

Удаление первичного узла аденокарциномы АК-755 не сопровождалось стимуляцией ее метастазирования.

Таблица 3.Влияние удаления первичного опухолевого узла на интенсивность роста метастазов некоторых перевиваемых опухолей мышей.

Штамм опухоли Срок удаления опухоли (дни после прививки) Коэффициент массы легких Ср. масса опухолевой ткани в легких, мг К-во метас-тич. узлов в легких.

Карцинома Льюис Контроль не опер. 9. 12 15 3,94+0,24 4,52+0,21 3,93+0,30 2,13+0,15 656,5+51,5 771,0+42,6 672,5+61,1 227,5+30,0 36,0+5,3 46,6+7,1 59,6+8,2 67,3+6,8

Карцинома РЛ-67 Контроль не опер. 9 12 15 2,60+0,15 2,70±0,20 2,75+0,17 3,00+0,32 285,8+29,7 291,5+31,0 306,5+26,1 277,1+27,5 40,3+4,0 43,6+7,4 39,0+8,2 46,2+9,1

Меланома В-16 Контроль не опер. 9 12 6,25+0,53 5,30+0,47 0,91±0,03 1133,7+109,3 899,0±124,3 52,0+0,16 * * 5,6+0,6

АК-755 Контроль не опер. 9 12 0,70+0,33 0,75+0,04 0,73+0,02 0 0 0 0 0 0

Контроль интактный - 0,72+0,03 0 0

* - почти полное замещение легочной паренхимы опухолью.

1^5 Модель спонтанного метастазирования колоректального рака

в печень. •

Конкретизация представлений о патогенезе рака создает новые предпосылки для совершенствования экспериментальных моделей. Так, данные, свидетельствующие о важной роли микроокружения в реализации признаков злокачественного фенотипа раковых клеток, обосновывают один из таких подходов:использование ортотопической трансплантации экспериментальных опухолей, т.е. имплантацию бластных клеток в тот орган, в котором опухоль данного гистогенеза обычно возникает и развивается, - на фоне влияния факторов конкретного микрсокружения.

Используя этот подход, мы разработали модель метастазирования колоректального рака в печень. В основе ее лежит ортотопическая трансплантация фрагмента перевиваемой опухоли АКАТОЛ в стенку толстой кишки сингенных мышей линии ВА1_В/с.

При вскрытии животных, забитых на 21 день после имплантации фрагмента опухолевой ткани, визуально определяли рост первичной опухоли в стенке толстой кишки диаметром 10-15 мм и множественные иетастазы в печень и другие внутренние органы (Таблица 4). Метастазы, а также первичный опухолевый узел, растущий в просвет брюшной полости, гистологически верифицированы.

Результаты гистологической обработки тканей, пораженных метастазами, свидетельствуют о высокой степени идентичности метастатического поражения печени человека и разработанной нами новой модели.

Таблица 4.Частота и локализация метастазов опухоли АКАТОЛ при имплантации ее в стенку толстой кишки.

Локализация метастазов Частота метас-тазированияД Число метаста-зов/1мышь

Печень 85 7,3+1,3

Селезенка 43 3,7±0,9

Легкие 22 5,4+1,1

Почки 10 1,3+0,2

Полученные данные свидетельствуют возможности использования данной модели для разработки в эксперименте новых подходов к терапии и профилактике метастазов колоректального рака в печень. Наличие адекватной модели качественно повышает уровень работ по решению одной из наиболее актуальных проблем клинической онкологии - терапии метастазов рака толстой кишки в печень.

1.6.Стратегия поиска сг^лств с антиметастатической активностью.

На рис.1 отображена разработанная нами и рекомендованная для практического применения общая схема поиска и доклинического изучения средств, способных ингибировать метастазирование злокачественных опухолей. Она основана на современных представлениях об онкопатогенезе, собственных данных о механизме метастазирова-ния опухолей, результатах изучения в ходе выполнения настоящего исследования противоопухолевой и антиметастатической активности более 100 известных фармакологических средств и новых химических соединений, в том числе иитостатиков. ингибитсроЕ протеиназ, антикоагулянтов, гормонов, антиэстрогенов, модификаторов биологических реакций разных классов.

Интеллектуаль ним прескрининг потенциальных антимета-статич. агентов (ингибиторы проте-иназ, адгезии, ангиогенеза, про-теинкиназы С...)

а)

б) в)

Агенты.обладающие п/о активностью, находящиеся на углубленном исследовании

Модификаторы биологических реакции (цитокины. модуляторы экспрессии генов...)

/

антиинвазивная активность антиадгезивная активность антиангиогенная активность

in vitro

ингибирование искусственных метастазов ( в/в инокуляция опу-левых клеток)

/

Ингибирование спонтанных метастазов ( опухоли мышей LLC. В-16, S-37, РЛ-67...)

_i_

Торможение метастазирования при сохраненной первичной опухоли

Торможение метастазирования на фоне удаления первичной опухоли

'ценка антиметастатическои активности на моделях ортотопической имплантации опухолей |

Разработка схем сочетанного применения ингибиторов метастазирования и цитостатиков. хирургического воздействия и др.

Рис.1. Схема поиска и доклинического изучения средств, способных ингибировать процесс метастазирования злокачественных опухолей.

2. Ингибиторы протеиназ как потенциальные антиметастатические

агенты.

2.1 Динамика уровней активаторов плазминогена в плазме крови и опухолевой ткани в процессе роста и метастазирования карциномы легкого Льюис. В настоящем исследовании оценен характер изменений уровня и активности активаторов плазминогена типа урокиназы (у-АЛ) и тканевого типа (т-АП). в плазме крови и опухолевой ткани у животных с перевиваемыми опухолями, а также некоторых других показателей состояния фибринолитической системы (ФС) организма.

Установлено (Таблица 5), что параллельно с развитием опухолевого процесса, в плазме крови животных происходят существенные изменения уровня и активности у-АП и т-АП. Уровень у-АП возрастает максимально в 2,5 раза по сравнению с контролем к 5-му дню после прививки опухоли, а к концу второй недели снижается до исходной величины. Активность же АП остается сниженной примерно в два раза в течение всего периода наблюдения. При этом фибриноли-тическая активность плазмы крови существенно снижается, что выражается в увеличении времени лизиса эуглобулиновой фракции плазмы крови более, чем в 8 раз с максимумом на 21-й день. Активность антиплазминов возрастает максимально на 7-15 дни после прививки опухолей в 2 раза.

Таблица 5.Изменение уровня и активности компонентов ФС в плазме крови мышей в процессе развития у них карциномы легкого

Льюис.

Время, сутки

у-АП нг/мл

т-АП нг/мл

Активность АП,Ме/мл

Время Антилизиса плаз-эуглобу- мины, линов,мин АТрЕ/мл

О 0,034+0,005 0,21+0,07 0,57±0,14

3 0,074±0,017 0,25+0,05 0,46+0,10

5 0,085±0,049* 0,48±0,08 0,35±0,09*

7 0,055±0,017* 0,51+0,02* 0,32±0,12*

15 0,037±0,020 1,8410,48* 0,40+0,12*

21 0,032+0,013 0,47+0,14* 0,31+0,03*

185+54 120+6

199±12 127+13 273±32 236+37* 416+30* 230+38* 1178+120* 156+22

Примечание: представлены обобщенные результаты по трем отдельным измерениям в пулах плазмы от 10 животных каждый.

* - Р< 0,05

В целом, динамика изменений показателей ФС крови коррелирует с динамикой процесса метастазирования опухоли.

Уровни и активность АП в ткани опухоли также подвержены динамике в процессе ее роста (Таблица 6).

Показано, что содержание у-АП и т-АП в опухолевой ткани максимально в период с 7 по 15-й день и на 1,5 - 2,,0 порядка выше, чем

в плазме крови. Это свидетельствует о том, что именно гиперпродукция АП опухолевыми клетками может быть источником накопления их в плазме.

Таблица 6. Изменение уровня и активности АП в ткани опухоли Льюис в процессе ее развития.

Время, Масса Содержание Содержание Активность АП

сутки оп. ,г у-АП,нг/г т-АП,нг/г Ме/г

5 0,1±0,03 0,98+0,10 41,0+1,1 11,3+0,8

7 0,15+0,03 1,06+0,10 55,0+1-, 0 13,2+1,1

15 3,0+0,60 3,14+0,25 59,2+1,2 15,2±0,9

21 7,1+0,45 0,86+0,05 38,8+0,7 9,0+0,9

Примечание: представлены обобщенные результаты по 3 отдельным измерениям в пулах тканей опухоли от 3 животных каждый.

Характер изменения уровня и активности т-АП в плазме крови животных после введения среды соответствует реакции ФС на стрес-сорные воздействия. Динамика изменения уровней АП в ткани мелано-мы Б 16 имела тот же характер. Содержание у-АП возрастало с 1,48 нг/г на 5-й день после прививки опухоли до 20,24 нг/г на 14-й день, с последующим снижением (Рис.2).

Содержание у-АП (нг/г)

20 Н

15

10 •

У

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Дни после прививки опухоли

Рис. 2. Динамика уровней у-АП в ткани меланомы В-16 в процессе ее роста.

Таким образом, нами получены данные, свидетельствующие о способности опухоли продуцировать повышенные количества АП. -:тс приводит к существенным изменениям ФС организма.

Вероятно, гиперпродукция опухолевыми клетками у-АП играет в патогенезе злокачественных новообразований по крайней мере двоякую роль: участвует в процессе деградации экстрацеллюлярного мат-

рикса и базальных мембран на начальном этапе метастазирования, и облегчает выживаемость метастазирующих опухолевых клеток в цирку-ляторном русле. В ответ на выброс в кровоток повышенных количеств у-АЛ, запускаются компенсаторные реакции активации продукции ингибиторов АП и плазмина. В результате фибринолитическая активность плазмы крови падает, повышается вероятность тромбообразова-ния в кровеносном русле, что также может способствовать процессу метастазирования. На этапе имплантации метастазирующих опухолевых клеток в ткани-мишени у-АП может облегчить процесс их экстраваза-ции.

Данные обстоятельства позволяют рассматривать гиперпродукцию опухолевыми клетками у-АП как мишень воздействия потенциальных антиметастатических средств, а также обосновывают необходимость коррекции нарушений ФС организма, как одного из компонентов комплексного лечения злокачественных новообразований.

2.2 Сравнение содержания у-АП в первичной опухоли Льюис и ее метастазах в легкие.

Двум группам животных трансплантировали подкожно по 1,0 млн клеток первичной опухоли или метастазов в легкие. Спустя 15 суток животных забивали, опухолевые узлы выделяли и подвергали анализу, как указано выше.

Содержание т

у-АП нг/г 5 -I

4 • 3 -2 • 1 О

/V / / / /

///

первичныи узел

метастазы в легкие

Рис.3. Содержание у-АП в ткани первичного опухолевого узла и метастазов в легкие карциномы Льюис. Установлено (Рис.3), что содержание у-АП в легочных метастазах более, чем в два раза выше, чем в ткани первичного узла (соответственно 5,2+1,1 и 2,1+ 0,6 нг/г ткани). Результаты свиде-

тельствуют о том, что клетки с повышенным метастатическим потенциалом обладают более выраженной способностью продуцировать у-АП и подтверждают предположение о важной роли этого фермента в механизме метастазирования опухоли.

Роль у-АП в механизме метастазирования опухоли подтверждают также полученные нами данные о возрастании содержания у-АП в легочных метастазах в ходе серийного пассирования (Рис.4).

Содержание у-АП нг/г ткани 10 -

8

6

4

1 5 10 15 номер генерация

Рис.4. Изменение содержания у-АП в ткани метастазов опухоли Льюис в легкие в ходе их серийного пассирования. При серийном пассировании легочных метастазов происходит, вероятно, селекция клеток, гиперпродуцирующих у-АП.

2.3 Изучение влияния ингибиторов ФС на продукцию АП клетками

опухоли Льюис.

Кислотная обработка сыворотки крупного рогатого скота удаляет ингибиторы системы фибринолиза. Степень удаления ингибиторов зависит как от исходного я;-: уровня в сыворотке, так и степени за-кисления. Выявление плазминовой активности является критерием удаления ингибиторов.

Используя этот метод, мы установили, что кислотная обработка сыворотки до рН 3,5 с исходным уровнем ингибиторов около 30 анти УК инт.ед/мл приводит к практически полному удалению ингибиторов СТаблица 7).

При культивировании клеток в среде, содержащей сыворотку с максимальным удаленией^ингибиторов, продукция АП начинается сразу же после посева клеток и, постепенно возрастая, достигает высоких уровней. Так, на 14 сутки культивирования, содержание АП в куль-туральной среде достигало величины 810 инт.ед/мл. Использование для культивирования клеток сыворотки с более высоким содержанием ингибиторов приводило к тому, что продукция клетками АП начиналась на более поздние сроки .

ТаОлица 7.Изменение продукции АП клетками в зависимости от уровня ингибиторов системы фибринолиза в культуральной среде.

Исх.уро- Обра-вень ин- ботка гибит. pH Анти УК/ мл АКТИВНОСТЬ АП/мл

сутки культивирования

1 3 6 14

50 3,5 120 2,5 120 3,5 30 интактная 120 интактная 1,6+0,1 0 0 0 0 56,0+2 34,0+9 0" 0 0 125,0±19 85,5±11 2,2±0,2 18,0+6,8 0 810,0±143 221,0+33 66,2+19 45,0±7,5 40,0+13

Представлены обобщенные результаты 3-7 наблюдений.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии регулятор-ной функциональной связи между ингибиторами и активаторами плаз-миногена и ее вероятной роли в механизме метастазирования злокачественных опухолей. Эти данные обосновывают принцип воздействия на систему ингибиторы-активаторы АП с целью получения анти-инвазивного и, как следствие, антиметастатического эффекта.

2.4 Поиск средств, способных воздействовать на продукцию опухолями активаторов плазминогена.

Изучена способность 5-(3,5-диметил-1-триазено)-имидазол-4-карбоксамида (DTIC), его аналога, £-аминокапроновой кислоты (АКК), тамоксифена, аминоглютетимида, ФАТ, его антипода и некоторых аналогов, воздействовать на продукцию опухолями АП.

Выявлена способность перечисленных выше соединений (за исключением ФАТ) значительно ингибировать содержание в опухоли Льюис у-АП. Ингибируклцая активность в наибольшей степени выявлена у АКК, у DTIC и его аналога - в несколько меньшей.

После внутрибрюшинного введения мышам с опухолью Льюис DTIC в дозе 100 мг/кг, содержание у-АП в опухолевой ткани снижалось максимально через 7 час до 1,5 нг/г по сравнению с 6,8 нг/г в контроле. При тестировании эффекта ФАТ, получены диаметрально противоположные результаты: внутривенное введение 0,3 мл раствора этого агента в концентрации 1х10_бМ вызывало возрастание содержания у-АП в ткани опухоли Льюис максимально через 7 час до 27,9 нг/г по сравнению с 6,8 нг/г в контроле (Рис.5). При этом, ФАТ в большом диапазоне концентраций стимулировал процессы спонтанного ме" тастазирования перевиваемых опухолей.

Результаты, свидетельствующие о способности ФАТ , мощного эндогенного модификатора биологических реакций, стимулировать про-

цеес метастазирования опухолей на фоне стимулирующего воздействия на продукцию опухолевыми клетками у-АП получены впервые. Они расширяют представления о механизме метастазирования опухолей и могут, в частности, объяснить факты стимуляции процесса метастазирования злокачественных опухолей в случае применения ряда препаратов, относящихся к классу, например, иммуномодификаторов.

Время после введения, час

Рис.5. Влияние СПС и ФАТ на содержание у-АП в карциноме

легкого Льюис.

Данные, свидетельствующие о принципиальной возможности модификации признаков метастатического фенотипа злокачественных клеток (например, резко повышать продукцию ими активных протеолитических ферментов, способных деградировать компоненты клеточного микроокружения) с помощью эндогенных регуляторов биологических реакций в организме, необходимо учктчвать при разработке схем комбинированной терапии.

2.5 Действие ингибиторов протеиназ на процесс метастазирования перевиваемых опухолей.

Изучена противоопухолевая и антиметастатическая активность известных фармакологических средств-ингибиторов протеиназ, препаратов "Гордокс", "Контрикал", АКК. Показано, что "Гордокс", не оказывая существенного влияние на рост первичного опухолевого узла, способен в значительной степени ингибировать процесс метастазирования карциномы Льюис в легкие (Таблицы 8). Увеличение частоты введения препарата (три раза в день в течение пяти последующих дней) не повышало антиметастатическую активность препарата.

Таблица 8.Влияние препарата "Гордоке" на процесс метаста-зирования карциномы легкого Льюис.

Режим применения Ср. масса легких,мг Ср. масса метает.,мг Торможение метает. ,7.

25 Ед/мышь х 1 250 Ед/мышь х 1 25 Ед/мышь х 5 263+17 276+21 220±14 93+9 106+11 50+6 23 12 58

Контроль 290+20 120+12 -

Внутрибрюшинное введение АКК в дозе 50 мг/кг мышам с подкожно имплантированной опухолью LLC в течение 10 последующих дней оказывало противоопухолевый и антиметастатический эффект (Таблица 9). Он невелик, однако заслуживает серьезного внимания, поскольку достигается при использования средства, не обладающего цитотоксической активностью.

Обнаружение противоопухолевой и антиметастатической активности явилось предпосылкой изучения АКК в комбинации с цитостатика-ми, а также использования этого препарата для модификации дизайна конъюгатов цитостатиков с высокомолекулярными полимерными носителями.

Таблица 9. Влияние АКК на процесс метастазирования карциномы

легкого Льюис.

Схема применения Торможение роста перв.оп. дни после прививки Торм.метастаз. ,7.

13 18 24

10 мг/кг х 10 12 24 20 17 19

50 мг/кг х 10 58 65 32 24 70

100 мг/кг x 10 12 36 + 7 +56 +25

3. Ингибиторы адгезивных взаимодействий клеток, как потенциальные антиметастатические агенты.

В литературе накоплены многочисленные данные, свидетельствующие о принципиальной роли адгезивного взаимодействия опухолевых клеток с клетками крови, в первую очередь тромбоцитами, и компонентами экстрацеллюлярного матрикса в процессе роста и метастазирования. Показано так же, что механизм адгезивных взаимодействий довольно часто опосредован интегринами класса 11Ь/111а.

В настоящем исследовании изучена способность ряда соединении, в том числе ингибиторов 11Ь/111а интегринов, воздействовать на

процесс агрегации тромбоцитов, а также их противопухолевая и антиметастатическая активность.

3.1 Влияние препаратов на процесс агрегации тромбоцитов.

Изучены ИЗО-пептид, (Е,2)-4,5,9-тритиододека 1,6,11-триене--9-оксид (А^оепе).полученные из МГУ им. М.В.Ломоносова, ФАТ, его аналоги лизо-ФАТ и анти-ФАТ, а также серия новых производных ФАТ, синтезированные в МИТХТ им.Д.И.Менделеева, блокаторы кальциевых каналов финоптин и нифедипин, ингибитор циклооксигеназы индомета-цин, а так же полипептид из сыворотки крупного рогатого скота "Адгезии".

ШЭ-пептид и А]оепе являются ингибиторами 11Ь/111а интегри-нов. Ингибиторы кальциевых каналов и индометацин ингибируют адгезивные клеточные взаимодействия посредством иных механизмов. ФАТ и "Адгезин" -индукторы адгезивных клеточных взаимодействий; производные ФАТ модифицированы с целью снижения их способности индуцировать агрегацию тромбоцитов на фоне сохранения других биологических эффектов.

Уровень-агрегации

тромбоцитов, %

1-

3-

ФАТ, 0,5хЮ-6М лизо-ФАТ,0,5х10_6М анти-ФАТ,0,5х10-6М

J_I I4 ' / _I__I_1_

0123 0123 01234 Время, мин

Рис.6. Индукция агрегации тромбоцитов донорской крови с помощью ФАТ и его производных.

Активность потенциальных индукторов и ингибиторов агрегации тромбоцитов оценена в диапазоне концентраций 10~б - 10"14М. В качестве контрольного индуктора агрегации тромбоцитов использован АБР в концентрации 5мкМ.

Полученные результаты свидетельствуют о способности ФАТ индуцировать агрегацию тромбоцитов на уровне АЮР и отсутствии такой активности у его произвдных лизо-ФАТ и анти-ФАТ (Рис.6).

ИЗЛ-пептиды, А]оепе и индометацин продемонстрировали выраженный ингибирующий эффект АБР-индуцированной агрегации тромбоцитов, блокаторы кальциевых каналов - умеренный. Эффект индометацина

Время, мин

Рис.7. Влияние индометацина на процесс АОР-индуцированной агрегации тромбоцитов

Серия вновь синтезированных производных ФАТ оказалась лишенной способности индуцировать агрегацию тромбоцитов, что позволяет рассматривать их как перспективный объект изучения с целью поиска потенциальных антиметастатических средств с патогенетической направленностью действия.

3.2 Влияние индукторов клеточной адгезии на процессы искусственного и спонтанного метастазирования.

Влияние препаратов на образование искусственных метастазов оценено в экспериментах с использованием клеток меланомы В-16, асцитного варианта карциномы легкого Льюис или асцитной саркомы 37, выполненных по схеме: опухолевые клетки инкубировали при постоянном встряхивании при 37 С в чашках Петри диаметром 5 см с культуральной средой 199, содержащей испытуемые препараты в разных концентрациях в течение 15 или 30 мин.Затем,1х105 клеток опухоли Льюис и меланомы В-16 инокулировали мышам линии С57В1/6 или 2.5х104 клеток саркомы 37 мышам СВИА внутривенно, в ретроорби-тальный синус. Спустя 10-14 дней животных забивали и подсчитывали количество метастатических узелков в легких.

Установлено (Таблица 10), что преинкубация опухолевых клеток в среде, содержащей ФАТ в концентрации от 1х10~14 до 1х10_5М в тече-

ние 15 мин, ингибировала образование искусственных метастатических колоний в легких мышей ЕЮР1 после внутривенной инокуляции опухолевых клеток. При этом, с увеличением концентраци ФАТ в культуральной среде число метастатических колоний достоверно снижалось. Так. при уровне ФАТ в культуральной среде 1х1СГ14 М число метастатических колоний в легких не отличалось от показателя у контрольных животных (соответственно равно 73+12 и 66+9), а при концентрации 1х1СГ5 М снижалось в 5 раз (14+3). Эффект ФАТ на интенсивность искусственного метастазирования отчетливо прослеживается по изменению массы легких, пораженных искусственными метастазами (у контрольных животных - 689+67 мг, у животных, получавших внутривенно клетки после их преинкубации с ФАТ е концентрации 1х1СГ14 М - 596±^8 мг, а в конц-ии 1х1СГ5 М -162+17 мг).

Таблица 10.Влияние преинкубации клеток опухоли Льюис (асцит-ный вариант) с ФАТ на развитие метастатических узлов в легких после внутривенной инокуляции.

Конц-ия ФАТ, время преинкубации (мин) Масса легких (мг) Ср.число мет.в легких

Контроль 689+67 73+12

1х 10"14Ы, 15 мин 596+58 66+9

IX 10"12М, 15 мин 397+29 60+8

1х 10~1ОМ, 15 мин 208+21 39+6

IX 10_8М, 15 МИН 429+43 56+9

1х 10_бМ, 15 мин 240+23 21+5

1х 10"5М, 15 мин 162+17 14+3

Наиболее вероятным объяснением выявленного эффекта является прямое воздействие ФАТ на опухолевые клетки. При этом,представляются реальными как цитотоксический, так и цитостатический эффекты ФАТ.

Внутривенное введение животным ФАТ (в 0,01% растворе спирта первоначально за 1 час до имплантации опухолевых клеток, затем 2 раза в день в течение 7 последующих дней) сопровождалось стимуляцией как роста первичной опухоли, так и процесса метастазирования (Таблица И).

Результаты, полученные в настоящем исследовании, а также литературные данные, достаточно убедительно свидетельствуют о ФАТ, как одном из возможных патогенетических факторов гематогенного метастазирования. Ввиду многообразия известных и предполагаемых

биологических эффектов ФАТ, механизм его действия в процессе ме-тастазирования вероятно сложен и к настоящему времени не выяснен. Он может быть опосредован через иммунную систему организма, или же реализован путем модификации межклеточных адгезивных взаимо-

■л о т> О пч -о ТI ♦'' м - - ..

Таблица 11.Влияние экзогенного ФАТ на рост и метастазирование карциномы легкого Льюис (солидный вариант).

Конц-ия ФАТ Торм. роста опухоли Ср.масса легких (мг) Ср.масса метастазов (мг) Торм. метаста-зир. Д

дни после транспл.

5 14

1х10~14М +64 +20 254,2+21 84,3+11* +100

1х10_12М +93 +49 289,1+¡¿7 119,2±15* +183

1х10~1ОМ +23 + 9 294,4+19 124,6±9 * +195

1х10_8М +116 +35 224,7+16 54,3+8 +29

1хЮ_6М +165 +2 285,3+22 115,0+16* +173

1х10_5М + 30 +9 267,4+23 97,1+12* +131

Контроль - - 212,3+14 42,5+7 -

* Р<0,05

Известен феномен ■ усиления пролиферации клеток микрометастазов при контакте с активированными тромбоцитами. В основе его лежит митогенный эффект тромбоцитарного ростового фактора (Тй7). На поверхности клеток многих опухолей выявлены рецепторы к Т(ЗГ, ввиду чего возможность митогенного влияние ТИ7 на опухолевые клетки представляется реальной.

3.3 Влияние ингибиторов клеточной адгезии на процесс метаста-зирования экспериментальных опухолей.

Нами изучена антиметастатическая активность ряда ингибиторов межклеточных адгезивных взаимодействий, предварительно охарактеризованных по их способности тормозить АБР-индуцированную агрегацию тромбоцитов крови доноров и экспериментальных животных. В работе использованы агенты с различным механизмом действия. Среди них новые соединения АЗоепе и (?(30-пептид, обладающие способностью блокировать тромбоцитарные 11Ь/111а интегрины, ингибитор циклоок-сигеназы индометадин и блокаторы кальциевых каналов верапамил и нифедипин.

Получены данные, свидетельствующие о неспособности Азоепе ин-

гибировать рост подкожно имплантированной карциномы легкого Льюис. Однако, при длительном внутривенном применении, начатом до формирования легочных метастазов,этот агент значительно ингибиро-вал спонтанное метастазирование опухоли. (Таблица 12). При отсроченном начале лечения (на 7-й и последующие после прививки опухоли дни) эффект препарата практически нивелировался.

Таблица 12.Влияние препарата АЗоепе на рост и метастазирование карциномы легкого Льюис.

Схема применения Ср.масса оп. при забое, г Торм. роста оп.,% Ср. масса легких, мг Торм. метастазирования, %

25 мкм/мышь х 14 5,2+0,7 15 261,0±16 7

50 мкм/мышь х 14 7,2+0,7 +1Я 169,3±11 37

500 мкм/мышь х14 7,3+0,6 +гг 138,1+7 50

Контроль 6,1+0,5 - 276,5+10 -

Профилактическое применение АЗоепе с последующим удалением первичного опухолевого узла было наиболее эффективно. Первичную опухоль удаляли на 7-й после прививки день, АЗоепе вводили животным внутривенно на 3-9 день после прививки опухоли; эффект терапии оценивали при забое животных на 25-й день после прививки. (Таблица 13).

Таблица 13.Действие АЗоепе на процесс метастазирования карциномы легкого Льюис на фоне удаления первичного опухолевого узла.

Режим применения Частота метастазирования Ср.масса легких, мг Ср.число мет. в легких

5 мкм/мышь 25 мкм/мышь 50 мкм/мышь 500 мкм/мышь 9/10 8/12 7/14 6/14 326,3+16 245,5+17 231,7+13 210,3+9 55+9 28+7 16+5 17±4

Контроль 8/8 343,3+19 57+12

Другой ингибитор тромбоцитарных 11Ь/111а интегринов ШБ-пептид оказывал на метастазирование перевиваемых опухолей аналогичный эффект (Таблица 14).

Применение пептида в дозе 10 мг/кг на 2-7 дни после трансплантации клеток меланомы В-16 и последующее (на 8-й день) удаление первичной опухоли более чем на 502 уменьшали частоту метастазирования опухоли.

Препараты индометацин и верапамил обладали выраженной в доста-

точной степени антиметастатической активностью, а при сочетанном применении с цитостатиками, повышали их эффективность.

Таблица 14.Влияние ШЭ-пептида в комбинации с хирургическим лалением певЕИЧного опухолевого узла на процесс метастазирования

меланомы В-16.

Препарат,схема применения Частота рециди-вирования Частота метастазирования

пептид, 10 мг/кг,в/в на 2 - 7 день + хирургия + ИЗБ-пептид на 9 - 12 день 1/8 3/8

Контроль (первич. опухоль удалена на 8-й день) 4/8 6/7

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о способности индуктора адгезивных взаимодействий опухолевых клеток ФАТ при внутривенном применении стимулировать процесс спонтанного метас-тазирования перевиваемых опухолей разного гистогенеза. В то же время, ингибиторы адгезии Р?(30-пептид, А]оепе при начале введения животным до инокуляции опухолевых клеток или до формирования метастазов в тканях-мишенях оказывают профилактическое влияние на развитие метастазов. Профилактический эффект ингибиторов адгезии повышается при хирургическом удалении первичной опухоли. Применение ингибиторов адгезии на фоне растущей первичной опухоли не оказывало терапевтического действия.

В целом, результаты подтвержают роль адгезивных взаимодействий в механизме метастазирования злокачественных опухолей, а также обосновывают возможность профилактического воздействия на этот процесс с помощью ингибиторов адгезии. При этом важно именно профилактическое применение антиадгезивных агентов, направленное на предотвращение имплантации опухолевых клеток в ткани-мишени. Представляется целесообразным применение ингибиторов адгезии в комбинации с хирургическим методом лечения и цитостатической терапией.

Метод оценки агрегации тромбоцитов (модифицированный в процессе настоящего исследования) внедрен в производственную деятельность нашего подразделения. Он включен в систему направленного скрининга и углубленного изучения новых потенциальных ингибиторов процесса метастазирования. С использованием этого метода изучено более 20 производных ФАТ и других фосфолипидов. Среди них выявлены агенты, обладающие цитотоксической и противоопухолевой активностью.

4. Ингибиторы неоангиогенеза. Влияние на процесс ыетастааирова-ния экспериментальных опухолей.

Процесс неоангиогенеза является одним из критических факторов эффективности роста и метастазирования злокачественных опухолей, ¿.'¿.иду ысти. ингиоироьанис- процесса н&оангиэгсневс; б опухоли может оказывать противоопухолевый эффект. Имеется ряд примеров, свидетельствующих о способности агентов, проявляющих противоопухолевую и антиметастатическую активность, ингибировать процесс ангиогенеза.

Однако, несмотря на высокий интерес исследователей к этой проблеме, в настоящее время нет достаточно убедительных данных о четкой прямой корреляции между антиангиогенной, противоопухолевой и антиметастатической активностью препаратов. Более того, антиметастатическая активность ингибиторе^ -нгиогенеза, относящихся к разным классам химических соединений, изучена на упрощенных модельных система^:,не позволяющих оценить объективно их действительную терапевтическую полезность, потенциальное место этих агентов в схемах комплексной терапии злокачественных новообразований.

В настоящем исследовании мы попытались ответить на некоторые из этих вопросов.

4.1 Оценка антиангиогенной активности.

В ходе выполнения данного раздела работы нами разработана модельная система количественной оценки антиангиогенной активности соединений (Рис.8).

В ее основе лежит процесс образования кровеносных капилляров вокруг имплантированных внутрикожно опухолевых клеток.

Опухолевые клетки, 105 кл в 0,1 мл культуральной среды 199, инокулировали внутрикожно в четыре квадранта брюшной стенки каждой мыши. Предварительно мы оценили ангиогенную активность саркомы 37 (асцитный вариант), аденокарциномы молочной железы АК-755, карциномы легкого Льюис (асцитный вариант, получен нами), меланомы В-16.

Наибольшей ангиогенной активностью обладали клетки карциномы легкого Льюис и меланомы В-16, т.е. опухолей, характеризующихся высоким метастатическим потенциалом .Наименьшей активностью - не-метастазирующая аденокарцинома молочной железы мышей АК-755 и саркома 37, метастазирующая по лимфогенному типу.(Таблица 15).

Следует также отметить, что трансплантация суспензии клеток солидного варианта опухоли Льюис сопровождалась более высокой ан-

Внутрикожная имплантация оп.кл.

(1х105 кл в 0,1мл культ, среды) 3-37,И-С (асц.вариант)

У= — & г' 4

{

ч

уЧ

Подсчет капилляров, соприкасающихся с периметром опухоли

Рис.8. Схема эксперимента по тестированию антиангиогенной

активности

гиогенной активностью. Объяснением этому может, вероятно, служить факт одновременной имплантации опухолевых клеток и измельченных фрагментов стромы, также обладающих ангиогенной активностью, а также более выраженной реакцией клеточных элементов микроокружения.

Таблица 15.Ангиогенная активность некоторых перевиваемых опухолей мышей.

Штамм опухоли Асцитный/ солидный Число капилляров на 1 узел Тип метастазирования

АК 755 солидный 5,3+1,9 не метастазир

Саркома 37 асцитный 7,1+2,4 лимфогенный

ШЗ асцитный 11,4+3,1 * гематогенный

ЬЬС солидный 13,7+4,6 * гематогенный

Мел. В-16 солидный 15,3+4,5 * гематогенный

*- различие с АК-755 достоверно (Р<0,05)

Исходя из полученных данных в экспериментах по тестированию потенциальных ингибиторов неоангиогенеза мы использовали клетки солидной опухоли Льюис, обладающие стабильной и наиболее выраженной ангиогенной активностью.

В течение 5-ти следующих за трансплантацией опухолевых клеток дней, животным, сформированным в группы по 3-5 особей, вводили тестируемые препараты. На следующий после окончания терапии день животных забивали и, как показано на рис.8, в каждой зоне инокуляции опухолевых клеток подсчитывали число новообразованных кровеносных капилляров, сопоикасающихся с поверхностью опухолевого узла. Для удобства подсчета капилляров пользовались бинокулярной лупой 12-ти кратного увеличения.

Затем, вычисляли суммарное число новообразованных капилляров в каждой группе и среднее число капилляров в пересчете на один опухолевый узел. Полученные величины подвергали статистическому анализу.

Характер и выраженность воздействия тестируемых соединений на процесс неоангиогенеза определяли,вычисляя процентное соотношение числа кровеносных капилляров на один опухолевый узел у животных каждой из групп, получавших препараты и контрольной группы.

Установлено (Таблица 16), что ряд известных фармакологических средств (индометацин, гидрокартизон и преднизолон) ингибирует процесс неоангиогенеза, индуцируемого растущей опухолью.

Таблица 16.Воздействие известных фармакологических средств и новых химических соединений на процесс опухолевого неоангиогенеза.

Препарат Доза, схема применения Ср.число капилляров на 1 узел Торможение неоангиогенеза,%

Индометацин Юмг/кг х 5 7.4+2,3 42

Еерапамил Юмг/кг х 5 7,9+2.2 38

Гепарин 5ед/мышьх5 8,2+2,7 35

Преднизолон 10мг/кг х 5 8,5+1,8 33

Гидрокортизон Юмг/кг х5 7,9+2,0 38

Гепарин+ гидрокортизон 5ед/мышь х 5 + Юмг/кг х 5 4,6+1,1 64

Моно(циклопента-диенил)цирконий диацетилацетонат (хлорид) 20мг/кг х 5 2мг/кг х 5 6,3+1,7 7,6+2,5 50 40

Бис(циаопента-диенил)цирконий дихлорид 20мг/кг х 5 2мг/кг х 5 5,1+1,4 6,9+1,7 60 46

Контроль - 12,7+3,3 -

Таблица 17. Влияние моно(циклопентадиенил) цирконий диацетил-ацетонат (хлорида) (1) и бис(циклопентадиенил) цирконий дихлори-да (11) на рост перевиваемых опухолей мышей.

Соединение Схема Торможение роста перевиваемых опухолей, 7.

и у им с нения L1210 АК-755 LLL В-16 РШМ-5 АКАТОЛ

1 20-25 X 5 - 82 - 93 82 64

11 15-25 X 5 18 95 82 88 73 71

Выявлен эффект потенцирования антиангиогенной активности гидрокортизона фибринолитиком гепарином. Механизм усиления активности этих двух агентов при сочетанном применении не ясен. Однако, отмеченный эффект заслуживает серьезного внимания ввиду возможного использования комбинации этих двух агентов в схеме комплексного терапевтического воздействия на процесс метастазирования злокачественных опухолей.

Нами впервые получены результаты, свидетельствующие с выраженном антиангиогенном эффекте циклопентадиенильных комплексов циркония, обладающих также достаточно высокой противоопухолевой активностью (Таблица 17). Обнаружение антиангиогенной активности у

комплексных соединений циркония позволяет рекомендовать их для углубленного предклинического изучения с целью выявления антиметастатической активности.

5.Коиъмгахы цкгостатиков с полимерными носителями, как потенциальные антиыетастатические средства.

Иммобилизация известных противоопухолевых препаратов на высокомолекулярных носителях - один из рациональных способов повышения избирательности их биологического действия. Такие конъюгаты могут сочетать в себе специфические свойства макромолекул (характерное тканевое распределение, замедленное выведение из организма, свойственные для макромолекул пути проникновения в клетку и т.д.) с цитотоксической активностью лекарственного препарата. При правильном -ыборе носителя и типа связи между носителем и лекарственным препаратом такое сочетание может привести к снижению токсичности, пролангированию специфического действия и повышению противоопухолевой активности исходного препарата.

Возможность модуляции с помощью специфических носителей тканевого распределения, биодоетупности и других биологических параметров противоопухолевых препаратов обосновывает возможность повышения эффективности терапии новообразований и метастазов конкретных локализаций.

В качестве носителей природного происхождения в литературе описаны белки плазмы крови, полисахариды, ДНК, антитела и т.д.

Многими авторами выявлены преимущества конъюгатов по сравнению с интактными лекарственными препаратами в эффективности инги-бирования роста опухолей при более низкой токсичности.

Эффективность конъюгатов цитостатиков с макромолекулярными носителями в отношении м°тастазов злокачественных опухолей практически не изучена.

Недостатками использованных носителей является их невысокая стабильность, а применение в качестве носителей антител - сложность получения, низкая емкость и снижение иммунологической специфичности при конъюгации с лекарственным препаратом.

Вместе с тем, использование доступных синтетических полимеров в качестве носителей противоопухолевых препаратов представляет практически неограниченные возможности в плане выбора и изменения химической структуры, введения различных функциональных групп, варьирования молекулярных масс в широких пределах.

Особый интерес, с нашей точки зрения, представляет использование в качестве носителей полимеров, обладающих собственной био-

логической активностью, в первую очередь, малотоксичных полимеров полианионного "типа, проявляющих интерферониндуцируюшую и иммуно-модулирующую активность.

В ИНХС АН РФ синтезированы сополимеры 01УЕМА, СИЛА, а так же новый сополимер 01РВ-2 с определенным гидрофильно-липофильным балансом в полимерной цепи и на их основе макромолекулярные терапевтические средства (МТС), содержащие противоопухолевые препараты рубомицин (Из) и цисплатин (СР).

Полученные МТС охарактеризованы методами ИК-.УФ и ПМР-спект-роскопии, элементного анализа, ТСХ и ВЭЖХ.

Результаты анализа водных растворов конгюгатов флюоресцентными методами свидетельствуют об устойчивом химическом связывании полимера с цитостатиками и о поведении коныогата в растворах как единой макромолекулярной системы.

Методом ВЭЖХ обнаружено, что при рН 7,2 и 37 С в течение 5 дней от полимера отщепляется не более 10 % № (Рис.9).

Показано, что скорость выделения НЬ более энергично идет в кислой среде (до 217. мае. при рН 6,2).

Увеличение липофильности полимерной цепи путем введения боковых алифатических радикалов разной длины (бутил-, гексил-, де-цил-) уменьшает скорость высвобождения антибиотика.

Высвободившийся ГОэ, % масс.

20 Н 15 10

5

_I_1_I_I_I_I_I_>

О 2 4 6 8 10 12 14 16 Время, дни

Рис 9. Динамика высвобождения Иэ из ШУЕМА-Иэ в растворе при рН 7,2 и Ь 37 С. Проведена сравнительная оценка внутриклеточного транспорта ИЬ

и 01УЕМА-йэ, который оценивали по степени тушения флюоресценции РЬ при инкубации с клетками '"'яОу " ° 000

Обнаружено, что при инкубации ШУЕМА-1?Ь с клетками его флюоресценция снижается существенно меньше, чем свободного ИЬ (на 10-20% по сравнению с 45-55%). По абсолютному значению ( судя по снижению флюоресценции) внутриклеточное включение антибиотика при

*

*

инкубации клеток с DIVEMA-Rb, более, чем на порядок ниже, чем при инкубации клеток со свободным Rb (Рис.10).

175 -I *

I L-1 V

Флюоресценция Rb, 150 Н *s _ Rb

условные единицы | "

125 Н 1

1 1 loo Н -1 "" -- *

I

I

75 ^ I

50 j _ DIVEMA-Rb

I о.

\ 7 I т

25 -i 1 ^ i------о--------о

I_I . I_' ' '_' I_I_I_I_I_L>

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Бремя, мин

Рис.10. Уменьшение флюоресценции Rb и DIVEMA-Rb при инкубации с клетками монослойной культуры CaOv.

Изучена противоопухолевая активность большой серии конъюгатов (более 100 образцов), различающихся по молекулярной массе полимерной матрицы, степени модификации ее цитостатиками, особенностям гидрофильно-липофильного балланса и другим физико-химическими свойствам. В итоге, отобрано МТС, содержащее Rb, с мол.массой около 10000, степенью модификации полимерной матрицы антибиотиком 12-15% мае., обладающее противоопухолевой активностью, превосходящей при ряде опухолей активность Rb (Таблица 18). Коньюгат DIVEMA-Rb более сильно ингибирует метастазирование опухоли LLC в легкие и опухоли ВМР-П при ортотопической трансплантации в печень, селезенку, легкие и почки (Таблица 19). DIVEMA-Rb менее токсичен , чем свободный Rb. LD 50 при однократном внутрибрюшин-ном введении мышам BDF1, расчитанная по Lltchflld and Wllcoxon ттЛЯ КОНЬЮГЧТЧ 10 ОТ^ПвНЬЮ модификации "ЯВНЯ WR-PPQ чг 'LT

a Rb- 5,1 мг/кг. DIVEMA-Rb имеет большую широту терапевтического действия (от 100 до 250 мг/кг).

Специфическая активность конъюгата DIVEMA-Rb изучена в объеме, достаточном для представления материалов в ФК РФ.

Таблица 18.Влияние ШУЕМА-ИЬ на рост некоторых солидных экспериментальных опухолей.

Соединение Доза(мг/кг), режим Макс, торможение роста в %

АК-755 LLC В 16 ВМР-П

Divema-Rb 125 X 1 150 X 1 175 X 1 88 98 96 63 70 83 50 81 76 79 96 97

Rb 3,5 X 1 57 53 70 70

Таблица 19.Влияние Rb и DIVEMA-Rb на метастазирование опухоли АКАТОЛ после ортотопической трансплантации .

Препарат Доза (мг/кг), режим Торможение частоты метастазирования

Печень Селезенка Легкие Почки

DIVEMA-Rb 50/96X2 83 70 77 31

Rb 3,5/96X2 36 31 29 16

б. Модафжация антиметастатического эффекта средств с патогенетической направленность)« действия путей иммобилизации их на высокомолекулярном полимерном носителе.

Как было показано выше, иммобилизация цитостатиков на полимерных носителях приводит к значительному возрастанию их противоопухолевой и антиметастатической активности.

Представлялось интересным оценить возможность аналогичным способом повысить эффективность агентов, обладающих антиметастатической активностью с патогенетической направленностью действия.

В качестве объекта исследования использовали ингибитор проте-иназ АКК и антиэстроген тамоксифен,показавший в наших экспериментах способность ингибировать рост и метастазирование опухолей, не относящихся по общепринятым представлениям к гормонозависимым. АКК является ингибитором протеиназ, в частности у-АП, играющего важную роль в механизме инвазии и метастазирования опухолей.

Механизм противоопухолевого и антиметастатического действия тамоксифена может быть также опосредован ингибированием продукции опухолевыми клетками у-АП. Кроме того, тамоксифен является довольно с;Ш)НЫМ ингибитором иротеиикиназы С л кальмидулипа., а также способен угнетать продукцию инсулиноподобного фактора роста , известного митогена для клеток разных опухолей.

Показано, что дополнительная модификация конъюгата Rb и DIVE-MA с помощью АКК значительно повышает его противоопухолевую и ан-

- 39 -

тиметастатическую активность (Таблица 20).

Таблица 20. Сравнительная оценка действия № и конвогатов 01УЕМА-АКК и 01УЕМА-га>-АКК на рост и метастазирование опухоли

ШР-П в печень.

Препарат Доза,мг/кг, Торможение роста оп. % Торможе-

схема при- ние ме-

менения дни после прививки таста-

зиро-

Ь 12 21 26 31 вания,%

75 х 1 96 96 83 85 73 80

DIVEMA-Rb- 100 х 1 99 97 83 84 59 93

-АКК 150 х 1 87 71 45 56 41 61

200 X 1 88 75 57 46 41 35

25 X 5 45 53 29 24 21 19

50 X 5 58 66 40 31 14 20

100 X 1 69 79 43 54 37 36

DIVEMA-АКК 200 X 1 63 74 46 51 35 33

25 X 5 71 69 34 38 38 27

50 X 5 59 71 49 47 37 29

Rb 3,5 X 1 38 27 25 14 +7 8

Иммобилизация самой АКК на полимерном носителе также приводит к возрастанию ее антиметастатической активности. Дополнительная модификация с помощью АКК конъюгата циклоплатама (CPL) и DIVEMA (DIVEMA-CPL) также повышает его активность (Таблица 21). Использование тамоксифена в виде механической смеси с DIVEMA давало больший терапевтический эффект, чем применение свободного тамоксифена (Таблица 22). Усиление терапевтических эффектов связано, вероятно, с пролонгированием поступления препаратов в циркуляцию из своеобразных депо-форм, в качестве которых можно рассматривать конъюгаты и механическую смесь фармакологического средства и полимерного носи:еля.

Введение коъюгатов цитостатиков на полимерных носителях, дополнительно модифицированных ингибитором протеиназ АКК в зону опухолевого поражения оказывало наиболее сильное ингибирующее воздействие на рост и метастазирование экспериментальных опухолей.

Эффект конъюгата Rb, дополнительно модифицированного АКК был наибольшим, - более 90% торможения роста первичной опухоли и ме-гастазирования. Терапевтический эффект даже после однократного введения препарата сохранялся на достоверно значимом уровне в течение всего периода наблюдения, вплоть до забоя животных на 31-й день после трансплантации опухолей. Можно предположить, что прирост терапевтического эффекта конъюгата Rb с DIVEMA, дополнитель-

но модифицированного АКК, связан с ингибированием процесса инвазии в зоне роста первичного узла вследствие подавления продукции опухолевыми клетками у-АП.

Препараты ШУЕМА-К!Ь-АКК и 01УЕМА-СРЬ-АКК не имеют аналогов. Строение и активность этих соединений свидетельствуют о целесообразности завершения их предклинического изучения. Они являются примером модификации дизайна известных противоопухолевых препаратов для повышения их антиметастатической активности.

Таблица 21.Влияние СР1. и его конъюгата с ШУЕМА, дополнительно модифицированного АКК (В1УЕМА-СРЬ-АКК) на рост и метаста-зирование опухоли ВМР-П.

Препарат, схема применения Торможение роста оп.Д Торможение метастаз, в печень , %. Торможение метастаз, в яичники, %

дни после прививки

7 14 21

DIVEMA-AKK 25МГ/КГ/ х5 48час 67 60 55 31 47

CPL бОмг/кг XI 72 46 36 12 23

DIVEMA-CPL-AKK 150мг/кг XI 72 77 69 66 70

Таблица 22.Влияние тамоксифена и смеси тамоксифена с 01УЕМА на рост и метастазирование карциномы легкого Льюис.

Препарат Схема применения Торможение ооста опухолиД Торможение метастази-рованияД

Тамоксифен 2 мг/кг х 14 78 57

Смесь: Тамоксифен+ DIVEMA [ 2 МГ/КГ] X 2 [150 мг/кг] 31 79

7.Влияние колониестимулирунщих факторов на рост и метастазирование перевиваемых опухолей.

Результаты многочисленных работ убедительно свидетельствуют о высокой эффективности ЕоздейстЕия кслониестимулирукших :актор:е (КСФ) на систему кроветворения, в частности, способности быстро восстанавливать гемопоэз после проведения массивных курсов лучевой химиотерапии (Jones Т.С.,1991 Kanz L. et al.1991)).

В то же время, влияние КСФ на развитие опухолевого процесса,

в частности скорость пролиферации опухолевых клеток и способность их к метастазированию изучены в меньшей степени. Однако необходимость наличия таких сведений для оптимизации подходов к применению их в онкологической клинике очевидна. По нашему мнению, оптимистические результаты, свидетельствующие о высокой активности КСФ как средств реставрации нормального кроветворения и регуляции функций гранулоцитов и макрофагов при различных патологических состояниях, затмили реальную возможность их негативного воздействия на опухолевый процесс.

Вместе с тем, вероятность усиления роста и метастазирования опухолей на фоне применения КСФ, представляется более, чем реальной. Для избежания потенцирования злокачественного процесса и разработки рациональных способом применения КСФ у онкологических больных по тому или иному назначению детальное изучение влияния этих агентов на развитие опухолевого процесса просто необходимо.

С целью выяснения сформулированных выше вопросов, нами проведены эксперименты по изучению влияния G-CSF и &J-CSF (Baler,США) на рост и метастазирование карцином легкого Льюис и РЛ-67.

GM-CSF применяли в течение 7 последующих дней в дозе 0,5 мкг/мышь в соответствии со схемами , указанными на рис.10.

Применение Ш-CSF стимулировало рост первичной опухоли Льюис и практически полностью отменяло эффект ЦФ (Рис.11). На 7-й день после прививки (после проведения 5-ти дневного курса терапии) средний объем опухолей животных, получавших GW-CSF, и контрольных соответственно равен 3670+ 294 и 1123+ 89 ммЗ (Р<0,01).

3

V оп.мм -7000 -

6000 -

5000 -

4000 -

3000 -

2000 -

1000 -

0 7 14 21 27

Дни после прививки опухоли

Рис. 11. Влияние аьСБР, ЦФ и комбинации этих агентов на рост карциномы легкого Льюис.

х-о-

ф-

д-Q-

контроль ЦФ

GM-CSF+ ЦФ ЦФ+GM-CSF ai-CSF+nS4-GM-CSF GM-CSF+ai-CSF

Схема применения: ЦФ - 100 МГ/КГХ1 evI-CSF - 0.5 мкг/мышьх5

Применение одного ЦФ в дозе 100 мг/кг на 7-й день после прививки ингибировало рост опухолей к 14 дню на 87%,а на фоне предварительного 5-ти дневного курса Ш-CSF - только на 12%. Применение же СМ-CSF после ЦФ или до- и после ЦФ стимулировало рост первичной опухоли Льюис на 45-70%.

Наряду со стимуляцией роста первичной опухоли, имела место стимуляция процесса метастазирования. Прослеживалась зависимость эффекта от способа введения КСФ. При внутрибрюшинном применении EM-CSF стимулирующий эффект выражен в большей степени. При соче-ганном применении ЦФ и СМ-CSF средняя продолжительность жизни мы-ией с подкожно трансплантированной опухолью Льюис была в два раза ниже, чем в случае применения одного цитостатика. Схема, предполагающая применение на заключительном этапе ЦФ, снижала стимулирующий эффект Od-CSF.

Не выявлено дозовой зависимости модуляции противоопухолевой активности цитостатика под воздействием GM-CSF. Определяющее вли-эние на терапевтический эффект оказывает последовательность применения компонентов изученной комбинации: наиболее неблагоприятней эффект регистрируется в случае применения КСФ вслед за цитос-гатиком.

Т.о. полученные нами данные, свидетельствующие о возможности стимуляции роста и метастазирования перевиваемых опухолей на фоне трименения G-/(3d-CSF , а также снижения эффективности цитостати-сов при их сочетанном применении с КСФ обосновывают острую необхо-1Имость поиска рациональных схем применения этих агентов.

ВЫВОДЫ

1. Процесс метастазирования опухоли (определение феномена) -саскад селективных биологических процессов, реализующихся на мо-текулярном, клеточном, тканевом уровнях, а также уровне целостного организма, включающий специфическое взаимодействие опухолевых меток с высоким метастатическим потенциалом с клетками и композитами экстрацеллюлярного матрикса, инвазию прилежащих нормаль-шх тканей, транспортировку током лимфы и крови, высокоспецифи-шскую рецептор-опосредованную адгезию к клеточным и субклеточным :убстратам и инициацию пролиферации опухолевых клеток в тка-шх-мишенях.

2. Антиметастатическая активность (определение феномена) -¡пособность фармакологических средств, воздействуя на те или иные ¡иологические процессы, играющие существенную роль в механизме

метастазирования злокачественных опухолей, препятствовать реализации признаков метастатического фенотипа опухолевых клеток.

Необходимо четко дифференцировать антиметастатическую активность лекарственных средств от их способности воздействовать на уже существующие метастазы.

3. При изучении антиметастатической активности любых препаратов, как цитостатиков, так и селективных ингибиторов процесса метастазирования, режим адъювантной терапии, предполагающий удаление первичного опухолевого узла на фоне сформировавшихся в организме метастазов, является наиболее адекватным клинической ситуации, а оценка эффекта по увеличению средней продолжительности жизни животных - наиболее корректной и объективной.

4. Соединения, характеризуемые как обладающие антиметастатической активностью и расцениваемые как перспективные для продвижения в клинику, должны обладать способностью:

а) эффективно (не менее, чем на 50%) ингибировать процесс спонтанного метастазирования перевиваемых опухолей при подкожной или внутримышечной их трансплантации в присутствии первичного опухолевого узла.

в) в режиме адъювантной химиотерапии (на фоне удаления первичного опухолевого узла) при начале лечения через 48 час после прививки опухоли в 1,5-2,0 раза увеличивать среднюю продолжительность жизни животных (желательно излечение части животных).

с) на моделях спонтанного метастазирования потенцировать эффект цитостатиков; в режиме адъювантной терапии увеличивать продолжительность жизни животных в 1,5-2,0 раза в сравнении с животными, получавшими лишь цитостатическую терапию.

5. Наличие антиметастатической активности препарата может быть продемонстрировано на любых моделях спонтанного метастазирования, но обязательно должно быть подтверждено в экспериментах с использованием одной из общепринятых моделей метастазирования, используемых в работах по экспериментальной химиотерапии метастазоЕ (карциномы легкого Льюис и РЛ-67, меланомы В-16, саркомы 37).

6. Средства, обладающие достоверной антиметастатической активностью, могут не обладать эффектом в отношении первичной опухоли.

7. Мишенями воздействия потенциальных антиметастатическю

средств с патогенетической направленностью действия могут быть процессы инвазии опухолевых клеток, реакции рецептор-опосредованных адгезивных взаимодействий опухолевых клеток с клетками крови, эндотелиальными клетками кровеносных капилляров, компонентами ба-зальных мембран и экстрацеллюлярного матрикса и неоангиогенез.

8. Антиэстроген тамоксифен, обладает способностью ингибиро-вать процесс метастазирования экспериментальных опухолей не относящихся к разряду гормонозависимых. Данный эффект, а также его способность подавлять продукцию ростовых факторов, обосновывают целесообразность клинического апробирования этого препарата в режиме адъювантной терапии при более широком спектре опухолей, помимо опухолей молочной железы и эндометрия, в частности колорек-тальном раке, раке легкого, меланоме.

9. Модификаторы биологических реакций, такие как фактор активации тромбоцитов, колониестмулирующие факторы, иммуномодификато-ры и другие, проявляя специфические эффекты, могут стимулировать процесс метастазирования злокачественных опухолей. Ввиду этого, все новые модификаторы биологических реакций, предлагаемые для практического применения, в первую очередь не обладающие противоопухолевой активностью, на стадии доклинического изучения обязательно должны оцениваться по их эффекту на процесс метастазирования злокачественных новообразований.

10. Предложены новые подходы к модификации дизайна известных фармакологических средств с целью повышения их антиметастатической активности:

а) иммобилизация цитостатиков (антрациклиновый антибиотик ру-бомицин, комплексные соединения платины) на полимерных носителях.

в) иммобилизация антиметастатических средств с патогенетической направленностью действия на сополимерах дивинилового эфира и малеинового ангидрида, обладающих собственной биологической активностью;

с) дополнительная модификация конъюгатов цитостатиков и полимерных носителей ингибиторами протеиназ;

с!) включение липидных производных цитостатиков в мембраны ли-посом, дополнительно модифицированных углеводородными векторами, более эффективно распознающимися опухолевыми клетками;

е) иммобилизация цитостатиков на высокомолекулярных полимерных носителях посредством пептидных спейсеров, чувствительных к

действию протеиназ (у-АП), гиперпродуцируемых опухолевыми клетками с высоким метастатическим потенциалом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Методические рекомендации по доклиническому изучению средств, обладающих способностью ингибировать процесс метастазирования и повышать эффективность цитостатической терапии злокачественных опухолей. Под редакцией академика АМН Е.Д.Гольдберга Е.Д. и профессора Сыркина A.B. М.,1992 г.Утверждены МЗ СССР 25 ноября 1991г. (соавт. Зуева Е.П., Герасимова Г.К., Амосова E.H., Разина В.Е., Гольдберг В.Е.).

2. Патент N 2034856 от 10 мая 1995г."Комплексное соединение цис-диамминоплатины(И) с сополимером Na-соли малеиновой к-ты и 1,4-диизопропоксибутена-2,обладающее противоопухолевой активностью при полном отсутствии нефротоксичности и имнунодепрес-сивного действия." (соавт.Иорданская Л.И.Стоцкая Л.Л., Улогога Ю.В., Кренцель Б.А. .Губайдулин Л.Ю. .Гурышев Н.В. и др.)

3. Патент N 2033998 от 30 апреля 1995 г."Комплексное соединение цис-диамминоплатины(И) с сополимером Na-соли малеиновой к-ты и фурана, обладающее п/о и иммуномодулирующей активностью, с широким интервалом терапевтических доз при низкой нефротоксичности" (соавт. Иорданская Л.И., Стоцкая Л.Л.Улогова Ю.В., Сербии A.B., Кренцель Б.А..Старшинова И.В. и др.).

4. Авторское свидетельство N1088345 от 22 дек. 1983г."Цис-дихло-ро-ди-0-Ы-диметилгидроксиламиноплатина(11) .проявляющая противоопухолевую активность", (соавт. Вальдман С.С., СтеценкоА.И., Шарипов X.Т.Парпиев H.A.)

5. Авторское свидетельство N 1517316 от 22 июня 1989 г. N-(2,3-эпоксипропил-!)- аскорбиген, обладающий противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью (соавт.Преображенская М.Н..Плихтяк И.Л., Хан Зу Ен (КНДР).Горюнова О.В..Ярцева И.В. и др.).

6. Метастазы перевиваемых опухолей мышей как модель для углубленного изучения противоопухолевых препаратов. Автореферат канд.дисс. М.,1979 г.

7. Влияние удаления первичного опухолевого узла на интенсивность метастазирования некоторых перевиваемых опухолей мышей и чувствительность метастазов к химиотерапии.В сб. .'Химиотерапия опухолей в СССР. ,1978, вып. 25 и 26, с.185-190 (соавт.Софьина З.П., Преснов М.А.).

3. О влиянии удаления первичного очага на метастазирование перевиваемых опухолей. Вопросы онкологии,1980,том XXVI,N 7,с.43-46 (соавт. Софьина З.П.).

Э. Частота, сроки и тип метастазирования различных перевиваемых оп«'холай мышей. е*\тл. ^ксп^г1. би'лт. V Мал. . 1 qw тпм. i wyv v 12,с.715-718 (соавт. Софьина З.П.)

10.Модель спонтанного метастазирования колоректального рака в в печень.Материалы научно-практич.конференции Каз.НИИ клинич. и эксперим. хирургии им.А.И.Сызганова. Тезисы доклада, Алма-Ата, 1993г.,с.102.(соавт.Ибрагимов С.С..Патютко Ю.И.).

11.Влияние циклофосфамида на содержание и профиль ганглиозидов в метастазирующей и неметастазируюзей карциноме молочной железы мышей. Бюлл.эксп. биол. и мед.,1985,N 7,с.76-78 (соавт. A.M. Новиков,Л.С.Бассалык).

12.Избирательное сбрасывание ганглиозидов клетками асцитной сар-комы-37 мышей. Бюлл.эксп.биол.и мед.,1986,N 8,с.229-230 (Соавт. А.М.Новиков, Л.С.Бассалык).

13.Изменение содержания и состава ганглиозидов опухолей при действии химиотерапевтических препаратов.Экспериментальная онкология, 1984,т.6, N 5, с.62-66 (Соавт.А.М.Новиков,Л.С.Бассалык, З.П.Софьина).

14.ЛСК(ганглиозиды), как показатель распространенности опухолевого процесса и эффективности химиотерапии. IV Всесоюзный съезд онкологов, Тезисы докл., Ленинград, 1986, с.285-286 (Соавт.: А.М.Новиков,Л.С.Бассалык).

15.A possible role of platelet-activating factor (PAF) in mechanism of malignant tumor metastasis. Ann.International Conference "Growth control and therapy of cancer",Budapest,21- 24 august,1994,92 (Соавт.:N.S.Saprikina,Yu.N.Bulychov).

16.Modification of antitumor and antimetastatic activity of cis-platin,vepeside and adriamycin by indometacin Ann.International Conference "Growth control and therapy of cancer".Budapest, 21-24 august,1994,91 (Соавт.Yu.N.Bulychov).

17.Antitumor amd antimetastatic activity of conjugates of rubo-mycin and copolimers of divlnyl ester and maleic angidride. 8th NCI-EORTC symposium on new drugs in cancer therapy, Amsterdam, 15-18 march, 1994,136 (Соавт.M.Yu.Gorshkova.L.L.Sto-tskay, В.A.Krentse1,Yu.N.Bulychov).

18.The intracellular transport and interaction with DNA of dau-norubicin bound with polyglutaminlc asid as compared to free drug.8th NCI-EORTC symposium on new drugs in cancer therapy,

Amsterdam, 15-18 march 1994,91 (CoaBT.T.A.Bogush.G.B.Smirno-va.E.P.Baranov, T,I.Ivanova).

19.Повышение активности сарколизина путем превращения его в ли-пидное производное у. включения в мембрану липосом, содержали) углеводный вектор. Бюлл.эксп.биол.и мед..1997. т.123.. N4,с. 439-441 (Соавт.Е.Ю.Корчагина,Е.Л.Водовозова,Н.В.Бовин,Юл.Г. Молотковский, A.B.Сыркин).

20.Some experimental approaches to the therapy of large intestine adenocarcinoma metastasis into the liver and other viscera after ortotopic transplantation. 9th NCI-EORTC symposium on new drugs in cancer therapy,Amsterdam,12-15 march,1996, 156 (Соавт.N.S.Saprykina, Y.N.Bulycho^).

21.Динамика уровней активатора плазминогена в плазме крови и опухолевой ткани в процессе роста и метастазирования карциномь легкого Льюис В сб.:"Химиотерапия опухолей,1993,вып.60 с. 57-61

22.Действие индометацина и его комбинации с цитостатиками на процесс метастазирования опухоли мышей АКАТОЛ при имплантации ее в стенку толстой кишки. В сб.-.Химиотерапия опухолей, 1993,вып.60 с.50-56.

23.Модификация биологического действия рубомицина путем иммобилизации его на полимерном носителе. В сб.: Химиотерапия опухолей, 1991, вып. 57. с.57-64.(Соавт.: М.Ю.Горшкова, Л.Л. Стоцкая, Б.А.,Кренцель.М.М.Козловский).

24.Ajoene inhibits experimental metastasis and implantation of tumor cells in mice. J.Cell.Biochem.1992,(Suppl. 16F) (Соавт.: A.V.Tatarintcev, P.V.Vrzhes'nch,A.A.Schegolev.N.S.Saprikina).

25.Модификация биологического действия рубомицина путем иммобилизации его на полимерном носителе. IX Всесоюзный симпозиум "Синтетические полимеры медицинского назначения" Звенигород, 1991,Тезисы докладов,с.79 (Соавт.М.Ю.Горшкова,Б.А.Кренцель).

26.Новые малотоксичные комплексы платины,обладающие противоопухолевой активностью. Труды 1 съезда онкологов стран СНГ,Москва, 2-6 дек.1996,т.1.отд.Эксперимент.терапия опухолей, с.160 (Соавт.Т.К.Кулабухова.Л.Л.Стоцкая).

27.Липосомы, содержащие липидное производное сарколизина, модифицированные углеводными векторами. Труды 111 Российского национального конгресса "Человек и лекарство",Москва,16-20 апреля 1996г.,с.27. (Соавт.Е.Ю.Корчагина,Е.Л.Водовозова.Н.В. Бовин, Юл.Г.Молотковский).

28.Малотоксичные п/о препараты на основе рубомицина и сополимеров

малеинового ангидрида. (Соавт.Там же, с. 50.Л.Л.Стоцкая., М.Ю.Горшкова).

29.Влияние глюкоманнана на метастазирование экспериментальных опухолей. В сб.: Химиотерапия опухолей в СССР,вып. 44, с.

18"-!?'"'. '^оавт.Р.П.Со^ьин5?. Г. А.ФИП^ОР?. Р Т'.МЯРЧР^Ч. п л '■V.-дакова).

30.Сравнительный анализ иммуномодулирующих свойств тиазолсодержа-щего производного сарколизина В сб. .-Химиотерапия опухолей в СССР,1988,вып.51, с.112-117. (Соавт.Л.А.Горелова,А.А.Пименов ,Г.П.Андроникова,Л.И.Смирнова).

31.Синтез и противоопухолевая активность конъюгатов рубомицина с полимерными носителями В сб.¡Химиотерапия опухолей в СССР, 1988,вып. 49, с.25-30 (Соавт.С.Э.1 ельперина,Л.Л.Стоцкая,Б.А. Кренцель, О.Б.Семенов).

32.Противоопухолевая активность комплексных соединений циркония. В сб.: Химиотерапия опухолей в СССР ( Материалы Всесоюзного совещания"Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей", М. ,1982,вып.37,с.127-131 (Соавт.Л.И.Стрункина.М.Х. Миначева, А.М.Брайнина).

33.Антиметастатическое действие хлорида ртути(11). В сб.:Химиоте-рапия опухолей в СССР,1986,вып.46,с.38-44 (Соавт.В.К.Бров-цин,3.П.Софьина,И.В.Кондратенко).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АП

у-АП

т-АП

ВЭЖХ

ИНД

КСФ

тех

ФАТ

ФС

ЦФ

АБР

АКК

СРМА

СР

-активатор плазминогена -активатор плазминогена типа урокиназы -активатор плазминогена тканевого типа -высокоэффективная жидкостная хроматография -индометацин

-колониестимулирующие факторы -тонкослойная хроматография -фактор активации тромбоцитов -фибринолитическая система -циклофосфамид -аденозиндифосфат -аминокапроновая кислота -сополимер малеинового ангидрида с Фураном -цисплатин

СРь -циклоплатам

01УЕМА -сополимер дивинилового эфира и малеинового ангидрида

01УЕМА-№ - конъюгат рубомицина с сополимером 01УЕМА ШУЕМА-АКК -конъюгат -аминокапроновой кислоты е сополимером 01УЕМА

БIУЕМА-СРЬ -конъюгат циклоплатама с сополимером 01УЕМА

ШРВ-2 -сополимер 1,4-диизопропоксибутена 2 с малеино-вым ангидридом

ОТ 1С -5-(3,5-диметил-1-триазено)-имидазол-4-карбокса-мид

Б-СБР -гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ЭЛ-СБР -гранулоцито-макрофагальный колониестимулирующий фактор

1?Ь -руОомицин

ТО? -тромбоцитарный ростовой фактор

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Тираж ] 00

Поди, к печати Заказ ^ 2. <}