Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Факторы, модулирующие каскады передачи сигналов, и мониторинг спонтанного метастазирования в условиях экспериментальных моделей

На правах рукописи

МИХАЙЛОВ Андрей Дмитриевич о :

ФАКТОРЫ, МОДУЛИРУЮЩИЕ КАСКАДЫ ПЕРЕДАЧИ

/

СИГНАЛОВ, И МОНИТОРИНГ СПОНТАННОГО МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ.

14.00.14 — онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2002 г.

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им. Н Блохина Российской академии медицинских наук (директор - чл.-корр. PAiv профессор М.И.Давыдов)

Научный консультант: -

Доктор медицинских наук, профессор А.Ю. Барышников

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор З.Г. Кадагидзе Доктор медицинских наук, профессор A.B. Караулов Доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинегин

Ведущее учреяедение:

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П Герцена МЗ РФ

Защита диссертации состоится У" ¿¿/f'2002 г. на заседай диссертационного совета по защите докторских диссертаций (Д.001 017.01) п Российском онкологическом научном центре им. H.H. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское ш., 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан "У " ЯА'Мм? 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Ю.В. Шишкин

БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ктуалыюсть проблемы

татистика роста заболеваемости и смертности от злокачественных новообра-»ваний явственно показывает, что прогресс в лечении данных заболеваний по )авнениго с достижениями в других отраслях медицины относительно не ве-1К. Проблема осложняется недостаточно ранней диагностикой, и недостаточно [)фективными терапевтическими подходами, не позволяющими селективно шчтожить опухолевые клетки. Современные терапевтические подходы часто называются безуспешными, так как в них отсутствует понимание единой тео-яи микроэволгоции опухолевого процесса, ведущего к неожиданно высокой :терогенности форм опухолей. Большинство экспериментальных данных, на эторых основываются методы диагностики и терапии, базируется на материа-IX, полученных на первичных опухолях, зрелых метастазах и культурах опу-элевых клеток. Даже модели опухолей, включая ксенотрансплантанты челове-гских опухолей на иммуносупрессированных животных, отличающиеся высо-им уровнем роста злокачественной ткани, не учитывают основной характери-гики заболевания протекающего у человека - постепенной эволюции опухоле-ых клеток приводящей к направленной селекции наиболее агрессивных вари-!1тов с одной стороны и к крайней гетерогенности с другой. Причинная и циклическая регуляция специфических цепей передачи сигна-ов полностью основывается и зависит от активности белковых фосфокиназ и юсфатаз. Эти ферменты, как правило, имеют низкую субстратную специфич-ость in vitro, но призваны выполнять строго специфические функции в клетке. !реди данных групп ферментов особо отличается фосфатаза белков типа 2А ЭР2А) которая эволюционно широко распространена во всех тканях организ-:ов всех типов, начиная с дрожжей. В организмах высших животных содержа-ие её достигает 0.1-1% от всех белков клетки, и ей принадлежит львиная доля бщей клеточной фосфатазной активности в большинстве тканей и организмов, иохимические и генетические исследования показали, что РР2А - один из

з

наиболее распространённых и в то же время консервативных ферментов, примеру, аминокислотные последовательности каталитической единицы РР2, человека и пивных дрожжей идентичны на 86%. Разрушение гена РР2А летал! но как для дрожжей, так и для млекопитающих, что указывает на то, что да! ный фермент абсолютно необходим для существования одно- и многоклето1 ных форм. Имеется масса данных, показывающая значение и вовлечение РР2; в регулирование клеточного метаболизма, репликацию ДНК, транскрипции сплайсинг РНК, трансляцию, прохождение клеточного цикла, морфогенез, ра: витие и трансформацию. Хотя до сих пор точные механизмы, через которы РР2А воздействует на эти процессы, во многих случаях до конца не определе ны. Классическая модель регуляции обратимого фосфорилирования белков у1 верждает, что белковая фосфатаза обращает эффект протеин киназ дефосфори лируя их субстраты. Однако всё более становится очевидным, что большинств субстратов РР2А - это именно разнообразные киназы. Импульс, передаваемы: и усиливаемый каскадами фосфорилирующими друг друга киназ должен за глушаться во времени, иначе его эффект станет неуправляемым и будет напо минать игру на фортепиано с постоянно нажатой педалью легато, когда чере короткое время уже нельзя различить мелодии за какафонией вибрирующи; струн.

Открытие того, что РР2А и другие минорные фосфатазы регулируют актив ности множественных киназных каскадов, подготовило почву для ответа, ка: единственный фермент может обладать такими всеохватывающими функция ми. Имея столь широкий спектр подконтрольных эффектов, РР2А является ла комой целью для токсинов, вирусов и внутриклеточных ингибиторов. Вирусы включая большинство онкогенных вирусов, чей геном, по определению, очен; невелик, и которые должны экономно использовать заложенную информацию часто несут в геноме ингибиторы РР2А. Одним из примеров является малы! антиген I из генома вируса БУ40, являющийся наиболее известным ингибито ром-перенаправлятелем активности РР2А

Непосредственно с балансом фосфорилирования/дефосфорилирования в клетках связана сеть промежуточных филаментов. Сборка/разборка и механическая гибкость этой подсистемы цитоскелета управляется через обратимое фосфорилирование ключевых эпитопов. Развитие опухолевого процесса требует от клеток сохранять способность к адаптации в недружественных условиях организма хозяина, в том числе способности к изменению формы, миграции, выживанию в суспензии в кровяном русле и инвазивному прикреплению к межклеточному матриксу. Нестин - онкофетальный промежуточный филамент 6 группы связывается со способностью клетки избегать терминальной дифферен-цировки и быстро менять форму без ущерба для систем роста и репликации.

Опухолевая клетка в условиях организма подвергается огромному разнообразию стрессов: химически гетерогенные условия в родительской ткани, зрелой опухоли, в кровотоке и органе-мишени; физические стрессы, включая стресс потока жидкости и стрессы от радиотерапии, стрессы, вызванные иммунной системой организма, и, наконец, апоптогенные стрессы под влиянием химиотерапии. Природа создала арсенал белков и факторов, условно называемых белками теплового шока, для выживания в условиях воздействия всеми указанными шоками, если это является выигрышной стратегией для организма. Опухолевые клетки взяли на вооружение данный арсенал для обеспечения своей жизнедеятельности и защиты от организма. Фактор белков теплового шока Н5Р1 является примером раннего и массированного ответа клеток ответственным за их выживание и приспособление к условиям среды. Как было показано ранее, данный фактор не только регулируется через обратимое фосфорилирова-ние/дефосфорилирование, но и сам может ассоциироваться с регуляторными субъединицами фосфатазы белков 2А, перенаправляя её субстратную специфичность.

Взятые вместе: баланс фосфорилирования, динамика промежуточных филаментов и модуляция стрессового ответа являются ключевыми факторами выживания опухолевых клеток и объектами нашего исследования.

Цель работы

Создание адекватных моделей опухолевого процесса на лабораторных жи

вотных с врождёнными иммунодефицитами и изучение факторов, влияющих н

выживание опухолевых клеток в условиях метастазирования.

Задачи исследования

1. Провести характеристику и отбор опухолевых штаммов и линий животных пригодных для моделирования опухолевого роста со спонтанной диссемина цией опухолевых клеток.

2. Разработать методы количественной оценки диссеминации опухолевых кле ток в кровотоке иммунодефицитных животных, методы картирования по верхностных антигенов опухолевых клеток и методы получения антител ] детерминантам маркерных белков, включая посттрансляционные модифика ции.

3. Подробно изучить роль фосфатаз белков и баланса фосфорилирова ния/дефосфорилирования во избежании опухолевыми клетками апоптоза вызываемого противоопухолевыми цитокинами. Разработать систему опре деления сайтов фосфорилирования регуляторных белков in vivo и in vitro.

4. Изучить специфическую значимость факторов теплового шока для выжива ния опухолевых клеток в условиях терапии и стрессорных воздействий орга низма хозяина.

5. Создать технологию повторного экспресс-анализа диссеминирующих клето! в кровотоке без применения меток и красителей

6. Разработать методы визуализации поведения промежуточных филаментов i опухолевых и дифференцирующихся клетках. Выяснить какие киназы i фосфатазы ответственны за поддержание структурного баланса онкофеталь ных промежуточных филаментов в опухолевых клетках

7. Оценить сочетанную значимость изученных факторов при избежании опухолевыми клетками систем иммунологического надзора организма.

[аучная новизна

В работе впервые в мировой практике показано, что спонтанно диссемини-ующие клетки опухолей человека могут быть регистрированы и прослежены в ровотоке модельных животных пропорционально степени иммунной супрес-ии организма хозяина, а также в ряде случаев, пропорционально сроками раз-ития опухолей. Усиление способности к метастазированшо сопровождается еорганизацией антигенного профиля, причём в наибольшей степени это каса-тся антигенов участвующих в иммунологическом распознавании. В работе первые продемонстрировано, что реорганизация эмбрионально-[ифференцировочного промежуточного филамента нестина в процессе митоза вязана с возрастающим фосфорилированием нестина по остатку треонина-316; с1с2-киназа играет основную роль в зависимой от фосфорилирования модифи-гации нестина в опухолевых клетках; кроме того, нестин фосфорилирован и его 1кспрессия регулируется в согласованности с активностью другой фосфокина-¡ы - cdk5. Выявлен ранее неизвестный факт подавления TNF-a , Fas и TRAIL->посредованного апоптоза, вызываемого ингибированием фосфатаз белков эк-югенными токсинами и внутриклеточным ингибитором РР2А - 12РР2А, и что это юдавление реализуется через стимулирование каскада передачи сигнала мито-~ен активируемой киназы (Erk), и происходит на ранних этапах исполнения, до жтивации каспаз первой ступени. Также впервые было доказано, что фосфори-шрование фактора белков теплового шока HSF-1 по серину 230 усиливает грансактивационную активность HSF1 в клетках опухолей и приводит к усиленной экспрессии HSF-70, защищающих клетки от апоптоза.

Практическая значимость

В результате проведенных исследований разработаны новые подходы к созданию экспериментальных моделей спонтанного метастазирования опухолей человека на модельных животных. Были созданы (а) новые линии высокомета-стазирующих опухолей, включая аутофлуоресцентные опухоли, наследственно меченные зелёным флуоресцентным белком, (б) методы визуализации и анти-

генного картирования диссеминирующих опухолевых клеток, (в) концепи вовлечённости фосфатаз белков и их ингибиторов в поддержание баланса ф< форилирования в клетке, регулирующего системы передачи сигнала, апопт стрессорный ответ и динамику цитоскелета клетки опухоли.

Эти данные будут использованы при создании новых диагностических и л ниторинговых подходов к биотерапии опухолей.

Данные, полученные в результате исследований по значению фосфорилщ вания в регулировании поведения опухолевых клеток, послужат основой д разработки новых модуляторов активности фосфатаз белков для терапии ог холевого процесса, методов индивидуального моделирования опухолевого пр цесса больных для экспресс тестирования лекарственной чувствительности.

Апробация работы

Апробация работы состоялась 17 октября 2001 г. на совместной научн конференции с участием лабораторий экспериментальной диагностики и би терапии опухолей, клинической иммунологи, фармакологии и токсикологи отдела экспериментальной химиотерапии, отделения трансплантации костно мозга, интенсивной химиотерапии и реанимации, отделения изучения hobi противоопухолевых лекарств РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Основные положения диссертации представлены на конференции "AID Cancer & Related Problems", Санкт-Петербург. Май 6, 1995, 35 Annual Meetii of the American Society for Cell Biology, Вашингтон, США, декабрь 9-13, 199 International Conference Comparative Physiology and Biochemistry. Национальнь парк имени Крюгера, ЮАР 31 август - 5 сентября 1997,2nd International Symp sium on the Green-Fluorescent Protein, Сан-Динго, США, Май 1999, 19th Conve tion of Physiological Society of Japan, Каназава, Япония, Апрель 1998, The 8й1, i и 10th Annual BioCity Symposium, Турку, Финляндия 1999, 2000, 2001, Molec lar Chaperones & the Heat Shock Response. Колд Спринг Харбор, США, Май 32000, Life in the Cold lllh International Hibernation Symposium, Юнгольц, Авс

рия, Август 13-18, 2000, NorFA conference on Stress and Apoptosis, Копенгаген, Дания, Сентябрь 2001, 2nd International Symposium on Signal Transduction, Люксембург, Январь 2002; Workshop on FRET microscopy, Шарлотсвиль, США, Март 2002.

Публикации

Материалы, изложенные в диссертации, оформлены в виде 27 публикаций, в том числе одного патента на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 249 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, и тематических глав с отдельными обзорами литературы, результатами собственных исследований и их обсуждениями, а также общих заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 13 таблицами, 49 рисунками. Список литературы включает 386 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линейные мыши с врожденными иммунодефицитами пи/пи и beige/nu разведения лаборатории экспериментальных моделей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Линейные мыши с комбинированным иммунодефицитом - seid - разведения питомника BioClear (Yokohama, Japan). Клеточная линия меланомы человека (МЕЛ-7) полученная в лаборатории экспериментальных моделей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН из штамма Вго к моменту начала экспериментов прошедшая 27 перевивок (метастазы в легкие - при подкожном введении) на beige/nude мышах. Высокометастазирующий вариант Mel7h был получен на beige/nude мышах в результате серийного подкожного пассирования клеток, взятых из лёгочных метастазов. Клеточные культуры опухолей человека из коллекции лаборатории - меланомы (BRO, Mel-7h, Mel-71, GREMMA), нейроб-ластомы (Neu), рака молочной железы (МаТи, РМЖ-4), гепатомы (H4-TG, Alex, Рпеч-1, Рпеч-2, Рпеч-3), плоскоклеточного рака лёгкого (РЛ-4) и рака тела мат-

ки (РТМ) - культивировали на среде DMEM с добавлением 10% эмбрионал ной сыворотки крупного рогатого скота. Клеточные линии HeLa, ST15/ С2С12, ЮТУ2, ЗТЗ, COS-7 (получены из АТСС) и клетки J3 (гибрид крысинс гепатомы H4TG и гепатоцитов бурундука) культивировались на среде DMEM 10% ЭТС и 2% L-глютамина. Клетки U937, JURKAT, К562 и гибридомы кул] тивировались на среде RPMI1640. Клетки были трансфецированы при помои электропорации плотностью разряда 750 вольт на см; для трансфекции в обы ме 400 мкл использовали 10-40 мкг ДНК.

Антитела против микроцистина, нодуларина, меланома-ассоциированног антигена, ассоциированного антигена рака лёгкого, фосфорилированных эш топов виментина, нестина и фактора HSF1 получены в лаборатории экспер! ментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ РАМН их получение подробно описано в диссертационной работе. Остальные антите ла. были производства Sigma, Pierce, Santa Cruz, Pharmigen, Amersham МедБиоСпектр.

Иммунохимическое тестирование проводили методом Westrn блоттинга н мембраны из PVDF, методом иммуногистохимического флуоресцентного о* рашивания клеток с последующей конфокальной микроскопией, иммунофер ментным анализом. Степень апоптоза измерялась цитофлуориметрически пр двойном окрашивании анексином-5 и йодидом пропидия, а также цитохимиче ски при окрашивании ядер DAPI.

Иммуноаффинная хроматография и иммунопреципитация проводились пр помощи антител иммобилизованных на крос-связанной эпоксиактивированно агарозе. Остальные хроматографические процедуры проводились на аппарат FPLC Pharmacia. Пептиды, соответствующие антигенным эпитопам, были сип тезированы на аппарате Applied Biosystems по твердофазной технологи] FMOC; антигены для иммунизаций и тестирования были приготовлены путё( химической конъюгации пептидов и токсинов к белкам-носителям или поли лизину. Анализ активности фосфатаз проводился при помощи наборов Gib

coBRL, а активность фосфокиназ измерялась по включению радиоактивного фосфора в иммунопреципитированные субстраты. Фосфопептидное картирование было проведено в двух направлениях на пластинах микрокристаллической целлюлозы для тонкослойной хроматографии с последующей афторадиографи-ей. Секвенирование пептидов после трипсиновой деградации белков проводилось масс-спектрометрические при помощи метода MALDI-TOF.

Математическую обработку результатов, полученных в ходе работы, проводили с использованием компьютерной статистической программы GraphPad Prism 3.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Метастазнрование и мониторинг днссеминацин опухолевых клеток в условиях экспериментальных моделей.

Показано, что после окраски конъюгатом моноклональных антител против меланома-ассоциированного антигена с ФИТЦ средняя интенсивность флуоресценции образцов циркулирующих в крови клеток была достоверно выше контрольной как у nude так и у beige/nude мышей несущих опухоль. В связи с этим мы провели тестирование широкой панели антител против опухоле-ассоциированных антигенов, лигандов и иммунопреципитинов из опухолевых клеток морских животных (Таб. 1).

На основании полученных данных были выбраны маркёры для поиска опухолевых клеток упомянутых линии человека в кровотоке иммунодефицит-ных животных:

• Mel-7 -MEI и их комбинации с OPlh и OP2h,

• Neu - оба клона на a-FP и их комбинации с OPlh и OP2h,

• РМЖ-4 - СЕА, a-FP (D10), OP 11, ОР21 и их комбинации с OP 1 h и OP2h,

• Рпеч-1 - комбинация GalT и OP2h,

• Рпеч-2 - подходящие комбинации не выявлены,

• Рпеч-3 - a-FP (Н12), СА-125 и их комбинации с OP 1 h и OP2h,

• РЛ-4 - комбинация WGA и OP2h,

• РТМ - СА-125 и его комбинация с OP 1 h.

Результаты определения опухолевых клеток человека линий Ме1-7, рака

молочной железы-4 и рака тела матки приведены в табл.2.

Таблица 1. Картирование поверхностных антигенов и гликоконъюгатов опухолевых клеток в сравнении с клетками донорской крови

Клеточные линии опухолей человека МКА Лектины Лиганды

MEI Loe CEA pLac a-FP DIO a-FP H12 CA-125 OP11 OPlh OP21 OP2h WGA a-LA GalT

BRO (Ме1-7) 37/ 2.11 0/ 1.32 0/ 0.93 0/ 1.21 22.7/ 1.25 0/ 0.91 0/ 0.89 0/ 1.07 91/ 5.50 0/ 1.15 91.8/ 6.66 0/ 1.19 10.9/ 1.62 0/ 1.41

Neu 35.3/ 1.20 0/ 1.03 7.32/ 1.40 0/ 1.00 37.2/ 1.77 30.7/ 1.77 27.9/ 1.57 0/ 0.90 91.6/ 5.07 0/ 0.90 71.7/ 4.90 0/ 1.01 8.8/ 1.38 0/ 1.02

MaTu (РМЖ-4) 35.1/ 1.20 0/ 0.79 33.2/ 1.56 0/ 1.18 36.9/ 1.63 9.1/ 1.39 4.9/ 1.30 11.5/ 1.35 72.8/ 6.30 13.5/ 1.40 87.1/ 5.97 21.6/ 1.25 10/ 2.09 56/ 1.14

Alex (Рпеч-1) 0/ 1.01 15.4/ 1.95 7.4/ 1.51 12.8/ 1.81 67/ 1.97 36/ 1.58 30.5/ 1.53 0/ 1.00 - 0/ 1.06 87.5/ 9.66 89.9/ 1.65 23.5/ 2.05 75.4/ 1.50

Рпеч-2 0/ 0.92 0/ 0.98 10.2/ 1.44 0/ 1.00 48.8/ 1.60 19.8/ 1.30 8.8/ 1.22 0/ 0.84 0/ 0.90 0/ 0.93 85.6/ 3.90 0/ 1.03 4.00/ 1.22 0/ 1.05

Рпеч-3 3.65/ 1.16 0/ 1.03 2.47/ 1.20 0/ 1.05 72.7/ 2.15 61.2/ 1.87 43.3/ 1.83 0/ 1.18 99.2/ 4.91 0/ 1.03 98.6/ 5.01 0/ 0.99 5.04/ 1.40 0/ 0.95

РЛ-4 0/ 0.98 5.4/ 1.21 - 3.4/ 1.30 71.3/ 1.48 32.3/ 1.06 0/ 0.95 0/ 0.89 5.03/ 1.25 0/ 0.91 46.3/ 3.25 87/ 1.54 3.3/ 1.35 0/ 1.01

РТМ 0/ 1.14 0/ 0.79 1.3/ 1.09 0/ 1.26 4/ 1.19 0/ 1.03 42/ 2.11 0/ 1.32 61.2/ 5.13 0/ 1.20 79.1 / 7.55 2.1/ 1.11 2.4/ 1.39 0/ 1.00

Кровь контрольной мыши 0/ 0.97 3.1/ 1.13 0/ 1.00 0/ 0.98 52.0/ 10.5 0/ 0.96 23.2/ 2.40 0/ 0.93 4/ 1.15 0/ 0.88 28.8/ 2.62 39.5/ 3.11 11.8/ 2.03 0/ 0.98

Кровь здорового человека 0/ 0.93 0/ 1.01 0/ 1.00 0/ 0.97 0/ 0.95 6.3/ 1.33 0/ 1.05 0/ 0.99 0/ 1.00 0/ 1.02 0/1.00 0/ 1.03 0.6/ 1.06 0/ 0.96

Примечание. МКА: MEI—к опухолеассоциированному ангагену меланомы человека, Loe—к раку лёгкого человека, CEA—к раково-эмбриональному ангагену, pLac к пролакгину, a-FP — два МКА к различным эпитопам а-фетопреггеина человека, СА-125 — к углеводному овариальному антигену. Лекганы: ОР — два онкопреципитина из морских беспозвоночных низко- (1) и высокомолекулярная (h) фракции, WGA—лекшн проростков пшеницы. Лиганды: a-LA—a-лактаяьбумин, GalT—галакиозшпрансфераза. Прочерк—недостоверные данные. В числителе - % позитивных клеток, в знаменателе - приведенный модуль флуоресценции.

аблица.2 Количество маркёр- Клетки в Мыши

эзитивных клеток на 100000 кле- кровотоке Nude beige/nude

ж периферической крови имму- животных с

э-дефицитных животных с опухолью

гсухолями. Ме1-7 324 4241

311 5320

274 5471

РМЖ-4 0 319

0 0

РТМ 12 4970

350 975

[з табл.2. Видно, что далеко не во всех случаях перевиваемых опухолей чело-ека даже у наиболее иммунологически ослабленных животных можно обна-ужить опухолевые клетки в кровотоке. Практически значимые количества пухолевых клеток в кровотоке иммунодефицитных животных с опухолями че-овека были обнаружены только в случаях меланомы у рака тела матки. Как жидалось, наибольшие количества опухолевых клеток были обнаружены у швотных с комбинированным иммунодефицитом - beige/nude, хотя свойство к [иссеминации опухолевых клеток из первичного очага проявляется у обеих ли-[ий животных с врождёнными иммунодефицитами.

Описанный подход к мониторингу диссеминации опухолевых клеток в :ровотоке иммунодефицитных животных может служить основой для разра-¡отки тестовых моделей при изучении феномена метастазирования.

Полученная в результате многолетнего пассирования высоко-1стастазирующая меланома была трансфецирована в культуре зелёным флуо->есцентным белком с усиленной эмиссией (EGFP), и прошла селекцию в тече-

ние 4 месяцев на резистентность к антибиотику G-418. Затем популяция клет< с высокой аутофлуоресценцией была отсортирована на проточном цитофлу риметре, стабильность экспрессии EGFP контролирована в течение 2 месяцев клетки перевиты под кожу мышам с различной степенью врождённых иммун дефицитов: nude, beige/nude и seid. Периферическая кровь животных с опух лями периодически проверялась на проточном цитофлуориметре на налич] аутофлуоресцентных клеток до достижения опухолями размера в 2 см в макс: мальном направлении. Пропорции роста меланомы трансфецированной EGI (названной GREMMA) не отличались значимо от таковых материнской линии Скорость роста опухолей на мышах линии seid была заметно выше в сравн нии с ростом на мышах линий nude и beige/nude. Клетки появлялись в кровот ке на 15й, 23й и 32й дни для мышей линий seid, beige/nude и nude соответстве] но (табл.2). Мы не нашли значимой корреляции между размером опухоли и ча тотой регистрации опухолевых клеток в кровотоке у животных beige/nude nude. В противоположность этому, результаты, полученные с использование мышей seid, показали высокую корреляцию между всеми регистрируемыми п раметрами (табл. 3). Наши данные наглядно показывают, что тип врождённо1 иммунодефицита, наблюдаемый у мышей seid, является более адекватным дд развития ксеногенных опухолей, нежели иммунодефицита мышей nude ил beige. Представленный подход к изучению и мониторингу диссеминации оп; холевых клеток при спонтанном метастазировании аутофлуоресцентных ксен< генных опухолей в условиях ксеногенного хозяина может быть успешно hi пользован для изучения феномена метастазирования ровно, как и служить о< новой для изучения влияния химиотерапевтических средств и генной терапи на процесс метастазирования.

Дней линия мышей Таблица.З. Частота регист-

пис1е beige/nude 5С/С/

0 0/4 0/7 0/10 рации аутофлуоресцентных

8 0/4 0/7 0/10 опухолей в периферической

15 0/4 0/7 3/10 крови животных с врождён-

23 0/4 1/7 6/9 ными иммунодефицитами.

30 7/8 Количество животных с реги-

32 1/3 4/7 стрируемыми опухолевыми

36 4/4 клетками в кровотоке к обще-

40 1/3 1/7 му количеству животных с

47 1/3 5/6 опухолями.

Эмбриональные промежуточные филаменты и их фосфорилированне в регуляции физиологии опухолевых клеток.

В течение интерфазы (М1-8-82-Ш) нестин и виментин формируют неразделимую цепь филаментов в цитоплазме опухолевых клеток. Это означает, что данные два белка промежуточных филаментов (ПФ) формируют сополимер. Данная идея была развита в гипотезу, предполагающую, что нестин может служить своего рода связующим белком, в котором длинный карбокситерминальный хвост может взаимодействовать с микротрубками и микрофиламентами, интегрируя воедино несколько частей цитоскелета. В соответствии с нашими результатами, филаменты нестина претерпевают значительные изменения, формируя околоядерные структуры в митозе или при обработке нокодазолом. Параллельно с морфологическими изменениями в цитоскелете опухолевых клеток изменяется степень фосфорилирования нестина и виментина. Нестин показывает базовое фосфорилированне в интерфазе с 3-кратным увеличением фосфорилирования в процессе митоза. В сравнении с этим изменения в фосфорилировании

виментина ещё более заметны — до 6 раз. Постоянное фосфорилирование н стнна может иметь отношение к специфическим функциям клеток и тканей, которых он экспрессирован. Фосфорилирование может изменять конфигур цию хвостового домена, влияя на белок-белковые взаимодействия, и, соотве ственно, на организацию сетей цитоскелета. Нами сделано предположение, ч сс1с2-киназа играет роль в фосфорилировании нестина и его регуляции в пр цессе митоза. Более того, был идентифицирован треонин-316 как сс1с2-кина специфический сайт фосфорилирования нестина in vitro (Рис.1).

ROD

С-ТЕРМИНАЛ

314-LQTPGR

lime (m in)

Пик на цикле

Фракция II Последовательность деградацИИ Эд„ана , 314-LQTPGR з

Рис.1. Идентификация треонина -316 как сайта фосфорилирования нести; с<1с2-киназой.

Важно, что треонин-316 находится на стыке родцомена и карбокситерминал ного хвоста; аминокислотные последовательности как род домена, так и ( терминального домена высоко консервативны. Были получены антитела прот] пептида симулирующего эпитоп фосфорилирования нестина по треонину-3 (á-PThr316) для выяснения степени фосфорилирования нестина in vivo. При i помощи удалось показать, что хотя нестин постоянно фосфорилирован по эт

му сайту, в процессе митоза степень фосфорилирования возрастает в несколько раз. В добавление к основной полосе, соответствующей полной молекуле не-стина (220КД), антитела показали активную реакцию с полосой молекулярной массы 175КД.

Киназа, ответственная за постоянное фосфорилирование нестина, была неизвестна, но ею могла быть, например, киназа cdk5, которая необходима для нормального развития и дифференциации нервной и мышечной тканей и может быть неплохим кандидатом для фосфорилирования Тре316 нестина в интерфазе. Наши данные доказали, что cdc2-KiiHa3a вовлечена в регулирование нестина в течение митоза. Пока не совсем ясно, достаточно ли одной cdc2-Knna3bi для опосредования реорганизации и структурных изменений нестина в митозе, или требуются какие-либо ещё дополнительные киназы. Суммируя, можно сказать, что интерес к динамике ПФ привёл нас к изучению ранее не характеризованной регуляции ПФ нестина в течение клеточного цикла. Мы показали, что реорганизация нестина в процессе митоза связана с возрастающим фосфорилировани-ем нестина, и что cdc2-KHHa3a играет основную роль в зависимой от фосфорилирования модификации нестина.

Экспрессия нестина ассоциирована с морфологически динамичными клетками, такими как делящиеся, злокачественные или мигрирующие. Такие клетки нуждаются с высокой гибкости их систем цитоскелета. В данном исследовании мы продемонстрировали, что нестин - специфическая цель для сёк5-киназы in vitro и in vivo и доказали важность функции cdk5-KHHa3bi в регуляции динамики нестина на примере миогенеза.

In vitro фосфорилирование препаратов ПФ демонстрирует, что нестин эффективно фосфорилируется cdk5. По сравнению с нестином, виментин плохо фосфорилируется этой киназой. Наши результаты наглядно демонстрируют, что киназа cdk5 разделяет большинство своих сайтов с cdc2-Kirna30ií. Мы идентифицировали треонин-1493 в качестве cdk5-cneni^H4ecKoro сайта фосфорилирования in vitro. Кроме того, мы показали, что ранее идентифицированный

как сайт фосфорилирования сёс2-киназы треонин-316 может также фосфорили роваться сс1к5-киназой.

Гиперэкспрессия cdk5 вместе с р35 в клетках ST15A приводит к кардинапь ной реорганизации нестина. Сеть филаментов нестина концентрируется на од ном их полюсов клетки, как правило, вокруг центросом. CdkS-киназа опосредо ванные изменения характерны для нестина, поскольку иные основные системь цитоскелета, такие как филаменты актина и микротрубки не меняют морфологии при гиперэкспрессии cdk5 вместе с р35. Суммированные результаты данной части работы показывают, что нестин фосфорилирован cdkS-киназой ir vitro и in vivo и доказывают роль cdkS-киназы в регулировании нестина в процессе раннего развития. В добавление, идентификация нестина в качестве субстрата для cdk5, принимая во внимание высокую динамичность и специфик) спектра экспрессии нестина в развивающейся и взрослой мышечной и нервной ткани, проясняет роль ПФ в целом и нестина в частности в регуляции сигнальных событий в клетках специфичных для различных стадий развития и диффе-ренцировки.

Ингибиторы фосфатаз фосфопротеинов и и* значение в модуляции апоп-тоза в клетках опухолей.

Используя метод конъюгирования микроцистина к белкам-носителям через N-метил-дегидроаланин, мы создали батарею моноклональных антител с различной степенью кроссреактивности между иммуногеном (MC-LR) и близкородственными токсинами. Чувствительность нашей тестовой иммунофермент-ной системы была достаточна для прямого определения концентрации общего микроцистина в реальных образцах, ровно, как и для количественных измерений кроссреактивности. В данном исследовании мы продемонстрировали удобство и возможности применения трёх различных, базирующихся на взаимодействии с микроцистином, методов быстрого и количественного извлечения РР2А. из цитозоля. Два из этих методов с использованием антител против микроцис-

тинов были предложены впервые. Подход к использованию иммобилизирован-ного на матриксе микроцистина был применён ранее для очистки РР1, РР5 и регуляторной субъединицы «А» РР2А из экстрактов растений и многобелковых комплексов содержащих РР2А. Однако использование этого подхода для очистки самой РР2А-С во многих работах натолкнулось на значительные трудности. В данной работе мы впервые показали: 1) фосфорилирование РР2А по остаткам серина в живых клетках, 2) временные волновые изменения в фосфори-лировании РР2А в ответ на стимуляцию эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и 3) стабильную ассоциацию ряда белков с РР2А.

Микроцистин - высокоспецифичный ингибитор РР2А и РР1 с нанномоляр-ной аффинностью. Соответственно, использование его для аффинной хроматографии является стратегически оправданным. Ингибитор связывается к открытому активному центру и, соответственно, может быть даже более удобным для афинной хроматографии, чем антитела. Антитела к РР2А, дающие хороший сигнал на иммуноблоттинге, как правило, имеют тенденцию не преципитиро-вать РР2А, предположительно, поскольку эпитопы (в противоположность денатурированному белку на блотгинге) не экспонированы, блокированы другими субъединицами, либо имеют компактную трёхмерную конформацию. Другие антитела, которые активны как на денатурированном, так и на нативном белках - обычно к терминальным последовательностям - часто зависят от отсутствия посттрансляционных модификаций РР2А как фосфорилирования, метилирования, гликозилирования и фразенилирования, что ограничивает их использование случаем экстракции рекомбинантного белка.

Начальные попытки изолировать РР1 и РР2А с использованием микроцистина иммобилизованного на матриксе, были безуспешны, поскольку микроцистин присоединяли к матриксу через карбоксильные группы токсина. Эти карбоксильные группы требуются для присоединения к фосфатазам белков с высокой аффинностью, так как эстерификация микроцистинов существенно снижает их ингибирующие свойства. Предыдущие исследования, включая связывание ,251-

меченный MC-YR, показали, что микроцистины могут образовывать ковалеш ные аддукты с РР2А, поскольку денатурирующие условия, включая кипячени в 1% додецил-сульфате натрия, не достаточны для разрыва связи. В тех произ водных N-метилдегидроаланин - немодифицирован, что позволяет ему форми ровать ковапентную связь путём нуклеофильной атаки высоко консервативног остатка цистеина в положении 273 молекулы РР2А. Сообщения о ковалентно] природе связи микроцистинов с фосфатазой белков свели на нет попытки ис пользовать токсин для аффинной очистки фермента. Однако, дериватизаци микроцистинов разрушающая ненасыщенную связь в N-метилдегидроаланине будет препятствовать образованию ковалентного соединения с фосфатазам) белков. Такой тип соединения был синтезирован, и колонка с дериватизирован ным микроцистином была использована для очистки РР1, РР5 и регуляторно) единицы РР2А. Исследование с использованием аналогично дериватизирован ного соединения микроцистин-биотин иммобилизованного на хроматографиче ском матриксе показали, что более чем 30 белков может быть со-очищено i РР1-С.

Мы использовали центрифугирование для отделения РР2А цитозольно) фракции от большинства РР1. Некоторое количество РР1, однако определяете; в промывном буфере с высоким содержанием соли, но РР1 не определяется ) последующем элюате, показывая, что фракции РР2А свободны от РР1. Наин данные свидетельствуют, что связывание РР2А с дериватизованной формо! микроцистина не было ковалентным, хотя и имело чрезвычайно высокук афинность и требовало полной денатурации фермента для разрыва связывания Анализ миграции каталитической единицы РР2А на двумерном электрофорез! свидетельствует, что фермент может быть элюирован в полном объёме и с со хранением физико-химических свойств первичной структуры.

Наши результаты экспериментов с РР2А-С, изолированной in vivo из метаболически меченных 32Р клеток, показывают, что каталитическая субъединицг

была фосфорилирована по остаткам серина, треонина и тирозина в живых клет

j

ках. Неожиданным было обнаружение фосфорилирования по серину в обеих контрольных и стимулированных ЭТС клетках ЮТ'А и IV5. Фосфорилирование РР2А по остаткам серина, которое, по всей видимости, является постоянным, не было обнаружено ранее и возможные функции такого фосфорилирования остаётся выяснить. Ранее было показано, что реакция РР2А с протеин-киназами вызывает фосфорилирование РР2А и ведёт к её инактивации. Результаты, приведённые здесь - первое свидетельство фосфорилирования треонина РР2А в ин-тактных клетках. В клетках культивировавшихся в отсутствие сыворотки фосфорилирование треонина было едва заметным, но после стимуляции ЭТС давало интенсивный, хотя и непродолжительный всплеск. Сайт(ы) фосфорилирования РР2А по треонину до сих пор не открыты и не охарактеризованы. Фосфорилирование остатка тирозина в положении 307 было продемонстрировано в опухолевых клетках в ответ на цитокины и инсулин и подтверждено в наших исследованиях. В обоих случаях фосфорилирование было временным с пиком между 5 и 15 минутами воздействия. Фосфорилирование тирозина индуцированное инсулином может быть блокировано противонаправленными инсулину гормонами, увеличивающими внутриклеточный уровень цАТФ. Также было показано, что Janus киназа 2 (JAK-2) ассоциирована с РР2А и что инсулин стимулирует JAK-2-опосредованное фосфорилирование РР2А-С. Наши результаты демонстрируют множественное фосфорилирование РР2А по различным сайтам, и поддерживают идею о регуляторной природе фосфорилирования фосфатаз белков, управляющей активностью и взаимодействием с другими соединениями. В противоположность результатам, полученным с использованием иммоби-лизированного микроцистина, ни фосфотирозин, ни фосфотреонин не были обнаружены при экстракции РР2А после её взаимодействия со свободным микро-цистином. Это может быть объяснено, по крайней мере, спекулятивно, как результат конформационных изменений в каталитической субъединице при фос-форилировании приводящем к сокрытию свободного цистеина внутри молекулы и препятствованию его взаимодействия с дегидроаланином микроцистинов.

Было показано, что аффинное взаимодействие микроцистинов с активным центром РР2А и реакция токсина с цистеином фермента, - последовательные процессы. Очистка РР2А на иммобилизированном микроцистине использует только первую часть взаимодействия, тогда как для того, чтобы быть очищенное через взаимодействие с антителами против микроцистина, процесс формирования ковалентной связи должен быть завершен.

Мы нашли, что несколько других фосфопротеинов стабильно ассоциировань с РР2А, связанной с матриксом МС-1Л-АГА-Се1®. Поскольку их связывание конкурентно нивелировалось избытком микроцистина-ЕШ и не было отмеченс связывание иных белков с микроцистинами, нежели фосфатазы белков, можне заключить, что это были белки, взаимодействующие с одной или несколькими субъединицами РР2А. Ассоциированные белки не могут быть удалены при помощи умеренных условий промывки, и, похоже, что их ассоциация с РР2Л сколь специфическая, столь и стабильная. Среди белков, ассоциированных с РР2А-С, мы обнаружили А65 и Ва55 субъединицы РР2А и киназу И-аМ. Несколько других обнаруженных белков, детектированных при авторадиографии, видимо соответствуют альтернативным некаталитическим субъединицам РР2А, формирующих альтернативный ферментный комплекс. На сегодняшний день обнаружено 15 вариантов различных «альтернативных» субъединиц, включая фактор терминации трансляции еШЧ, который может ассоциироваться с РР2А вместо субъединицы «В», придавая ферменту функции регуляции белковогс синтеза. У млекопитающих найден вариант ТАР42, известный как а4, который тоже способен прямо связываться с каталитической субъединицей РР2А. Человеческий гомолог Б1Т4 был клонирован позже и назван РР6. Очень мало известно о функции РР6 в клетках млекопитающих. Поскольку РР6 и РР2А -близкородственные представители одного семейства, вполне возможно, что РРб тоже может соочищаться на МС-1Л-АШ-Се1®, однако, маловероятно, чтобы белок, элюированный на уровне ЗбкД был смесью РР2А и РР6, так как на двумерном электрофорезе были обнаружены только три РР2А-С - специфические

изоформы. Также известно, что РР2А и РР6 мигрируют различным образом на двумерном электрофорезе. Также было показано, что РР2А была ассоциирована с JAK-2 и PI3 киназами, CaMKIV киназой, РАК1 и РАКЗ. Raf-1 киназа формирует гетеродимер с каталитической субъединицей РР2А in vivo и in vitro, и РР2А функционирует как позитивный регулятор активации Raf-1. Комплексы Raf-1 с РР2А наблюдались и в нашей работе.

Эти данные указывают на важность субъединиц РР2А в определении активности и специфики функции этой фосфатазы в клетке. Ключевой вопрос сегодняшних исследований процессов передачи сигналов состоит в том, как киназы и фосфатазы с широким спектром специфичности могут действовать на свои собственные строго определённые мишени? Современная идея состоит в том, что субъединицы или специфические «якорные» белки направляют ферменты на специфические субстраты. Часть из фосфопротеинов, специфически соочи-щающихся с РР2А, - кандидаты на регуляторы РР2А или белки регулируемые РР2А. Функциональные свойства РР2А могут также регулироваться через фос-форилированно опосредованную передачу сигнала, либо через прямое фосфо-рилирование каталитической субъединицы, либо через фосфорилирование ре-гуляторных белков. В этой связи открытие новых ассоциированных фосфо-белков соответствует второму типу регуляции - специфичности, а наблюдаемое динамическое фосфорилирование первому - активности.

Универсальный способ передачи сигнала и поддержания равновесия в каскадах передачи внутриклеточных сигналов - это обратимое фосфорилирование белков. Ранним указанием на то, что серин/треонин фосфатазы непосредственно вовлечены в контроль роста было открытие факта, что окадиаковая кислота являющаяся специфическим ингибитором РР1 и РР2А и одновременно активным опухолевым промотером. Эти данные ещё более 10 лет назад дали почву для предположения, что РР2А может функционировать в качестве природного опухолевого супрессора. Различные ингибиторы белковых фосфатаз, дефосфо-рилирующих фосфосерин и фосфотреонин, как было показано на протяжении

последующего десятилетия, способны изменять чувствительность к запрограм мированной клеточной смерти в различных типах клеток. В нашем исследова нии мы доказываем, что опухолевая промоция, вызываемая ингибиторами фос фатаз белков, протекает по типу подавления апоптоза.

Наши результаты со всей очевидностью доказывают, что ингибитор фосфа таз белков каликулин А эффективно супрессирует апоптоз вызываемый a-Fas TNF-a и TRAIL в клетках U937. Каликулин А был способен подавлять апопто до уровня в примерно 50% от контрольного (рис.2). Ранее было показано, чт> некоторые опухолевые промотеры способны реализовывать свой эффект по средством подавления апоптоза. Другой ингибитор РР2А - внутриклеточны] 12РР2А высоко экспрессирован в опухоли Вильма и на ранних стадиях эмбрио нального развития. Используя гиперэкспрессию данного белка в клетках HeL для внутриклеточного ингибирования РР2А путём временной трансфекции клс

РР2А

ток Ь , мы показали, что данные клетки становятся защищенными от Fas опосредованного апоптоза.

Рис.2. Эффект каликулина А на развитие Fas-, TNF-a- и TRAIL-опосредованного апоптоза в клетках U937 при воздействии каликулином А (справа) и после трансфекции

Контроль

TNF-a TRAII

I2PP2A (Б).

35

* 30

0 |25

1 20 п

1 15 о

5 ю

* 5-О

я

контроль Fas + CXH контроль Fas + CHX (циклогексимид)

Ингибирование в клетках фоефатазной активности каликулином А ведёт к повышению активности МАРК (Егк), но не уровня МАРК. Ранее было показано, что активация МАРК киназного каскада вполне может приводить к супрессии Раз-опосредованного апоптоза. В сериях наших экспериментов мы обнаружили высокую корреляцию между ингибированием активности фосфатаз и повышением активности МАРК. Это указывает на то, что эффект каликулина А, индуцирующий устойчивость к рецептор-апосредованному апоптозу, по крайней мере основывается на активации МАРК каскада передачи сигнала.

Стабильные трансфектанты с МКК11-А были созданы нами для дальнейшего установления вовлечённости МАРК в регулирование рецептор-опосредованного апоптоза. Наши данные подтверждают практически полное ингибирование чувствительности к апоптозу вызываемому агонистами рецепторов Fas, TNF-a и TRAIL в клетках, трансфецированных МКК1-П (рис.3).

Наши результаты доказывают, что подавление апоптоза в опухолевых клетках, вызываемое ингибированием фосфатаз белков реализуется через стимулирование каскада передачи сигнала митоген активируемой киназы (МАРК, Егк) - участника каскада ответственного за пролиферацию и выживание клеток, и это подавление происходит на ранних этапах исполнения, до активации каспаз первой ступени. Практически это открывает пути к созданию средств, модули-

5-

Рис. 3. Постоянно активная МКК1 подавляет Fas, TNF-а и TRAIL индуцируемый апоптоз в клетках U937.

контроль

Fas

TNF-a TRAIL

рующих выживание опухолевых клеток на основе активаторов фосфатаз и ингибиторов ряда митоген-активируемых киназ.

Стрессовый ответ и защита клеток от апоптоза

Наши результаты показали, что появление ядерных гранул фактора теплового шока (Н8Р-1) и фосфорилирование этого фактора по-разному происходит при ингибировании протеосом и при термальном стрессе. Данное исследование предоставляет новые свидетельства внутренней регуляции активации ШР-1 при стрессах, показывая, что множественные условия в цепи активации данного фактора могут действовать разнонаправленно в зависимости от природы стимула. Всего 15% клеток НеЬа имело ядерные гранулы НБР-1 в качестве ответа на воздействие М0132 или класто-лактацистин-р-лактоном, хотя эти структуры были найдены во всех клетках после теплового шока. Возможно, что число ШР1 гранулонесущих клеток и размер гранул отвечают интенсивности стресса, поскольку термальный шок при +43°С - +45°С приводит к более быстрому образованию большего числа ядерных гранул НБР-1 чем умеренный стресс при +42°С. Возможно, что интенсивность повреждений при стрессе индуцируемом ингибированием протеосом, может приводить к последствиям зависимым от тканевой принадлежности клеток: у суспензионных клеток К562, ответ на ин-гибирование протеосом, как измерено по формированию ядерных гранул НБР-1, был весьма подобен таковому после умеренного теплового шока; в то время как ответ и формирование гранул у клеток НеЬа был более чем умеренным. Так или иначе, воздействие М0132 усиливало ответ на тепловой шок, приводя к усилению экспрессии Н8Р-70 у обоих типов клеток.

Хотя функция гранул ШР-1 не установлена, они появляются параллельно с гиперфосфорилированием Н8Р-1, активацией ДНК-связывающей активности и транскрипционно активным состоянием клеток злокачественных опухолей. Например, было продемонстрировано, что клетка НеЬа содержит примерно 6-10 гранул после теплового шока со значительными вариациями между индивидуальными клетками. Мы обнаружили, что число НБР-1 гранул в клетках НеЬа

после воздействования ингибиторами протеосом MG132 или класто-лактацистин-р-лактоном было не таким же как у клеток после термального шока, что указывает на зависимость числа гранул от других факторов, кроме простой плоидности. В добавление к тепловому шоку как было показано воздействие иными стрессорными факторами, например ионами кадмия или аналогом аминокислоты - азетидином, может вызывать формирование ядерных гранул HSF-1, но со значительно более медленной кинетикой, нежели при тепловом шоке. Подобным образом отложенная кинетика формирования HSF-1 гранул обнаружена при ингибировании протеосом. Стоит заметить, что жизненный цикл ядерных гранул HSF-1 не коррелирует с ДНК-связывающей активностью данного фактора после ингибирования протеосом. Эти результаты позволяют предполагать, что ослабление ДНК-связывающей активности фактором HSF-1 может и не быть связано с исчезновением гранул HSF-1 в опухолевых клетках. Альтернативно, HSF-1 может оставаться связанным с HSE in vivo, хотя постоянная ДНК-связывающая активность HSF-1 может быть обнаружена in vitro в ответ на стресс, индуцированный ингибиторами протеосом.

В случае шока, вызванного повышенной температурой или кадмием HSF-1 гранулы сосуществуют в параллели с гиперфосфорилированием этого фактора. Ингибиторы протеосом, такие как синтетические пептидные альдегиды ALLN и MG132, а также природные соединения типа лактацистина, влияют на фосфо-рилирование HSF-1, как показано с помощью анализа миграции на вестерн-блоттинге. В данном исследовании мы продемонстрировали, что миграция HSF-1 при электрофорезе в полиакриламидном геле изменялась не одинаково в клетках под действием MG132 или лактацистина, по сравнению с тепловым шоком. Эффект MG132 на фосфорилирование HSF-1 был верифицирован при ш vivo мечении HSF-1. Действительно, воздействие MG132 усиливало фосфорилирование HSF-1. Подобно тепло-индуцированному гиперфосфорилированию HSF-1, мы обнаружили, что MG132 усиливает фосфорилирование остатков се-рина на факторе HSF-1; но увеличение уровня фосфорилирования было более скромным, чем при тепловом шоке. В этом плане ответ не был равноценным у обоих типов исследованных клеток. Пересчёт результатов вестерн-блоттинга и

in vivo фосфорилирования в нашем исследовании свидетельствовал о том, что у клеток HeLa мог быть достигнут только промежуточный уровень фосфорилирования HSF-1, тогда как у клеток К562 HSF-1 был действительно гиперфосфо-рилированым при длительном влиянии.

Индуцируемое фосфорилирование нередко связывалось с транскрипционно компетентным состоянием HSF-1. Мы показали, что, хотя степень фосфорилирования HSF-1 в ответ на влияние ингибиторов протеосом была и ниже, чем при тепловом шоке, оба воздействия одинаково успешно способны вызывать подъём уровня HSP-70 и его м-РНК в клетках. Увеличение уровня m-PHK HSP-70 происходит вследствие усиления транкрибционной активности гена HSF-70, поскольку наши данные демонстрируют, что воздействие MG132 индуцируют транскрипцию HSP-70. В целом наши результаты предоставляют свидетельство того, что появление ядерных гранул HSF-1 более тесно коррелирует с состоянием фосфорилирования HSF-1 чем с его HSE-связывающей активностью. Существует вероятность, что формирование ядерных гранул требуется в ходе физиологических механизмов включающих индуцируемое фосфорилирование и транскрипционную активацию HSF-1 в человеческих клетках. Однако для того чтобы иметь возможность разделить фосфорилирование HSF-1 при стрессах вызванных тепловым шоком или ингибированием протеосомного комплекса требуются дальнейшие исследования, включающие характеристику сайтов фосфорилирования HSF-1. На данный момент в литературе описаны 3 сайта постоянного фосфорилирования HSF-1, но работы по дальнейшей идентификации сайтов фосфорилирования продолжаются несколькими группами исследователей, фокусирующих своё внимание на центрах индуцируемого фосфорилирования - более важных в процессе функциональной регуляции HSF-1.

На сегодняшний день известна лишь информация о негативном влиянии на активность HSF1 сайтов постоянного (структурного) фосфорилирования, и в доступной литературе имеются только косвенные коррелятивные данные о позитивных эффектах индуцируемого фосфорилирования. Это может быть отражением состояния, при котором известны только несколько сайтов фосфорилирования этой серин-насыщенной (13%) молекулы. В данном исследовании, мы

[спользовали новый подход к изучению фосфорилирования HSF1, адресовав юпросы и подходы к их разрешению на in vivo идентификацию сайтов фосфо-шлирования человеческого HSF1 в опухолевых клетках при нормальных и :трессовых условиях. Наши результаты показали, что тепловой шок индуциру-;т фосфорилирование большинства фосфопептидов обнаруженных при расще-шении трипсином. При дальнейшем анализе in vivo 32Р-меченного HSF1 мето-юм деградации Эдмана, мы смогли идентифицировать серин-230 в качестве ювого сайта in vivo фосфорилирования HSF1. Для демонстрации того, что этот эстаток действительно фосфорилирован в клетках, мы произвели антитела специфические к фосфорилированному пептидному эпитопу, включающему сайт фосфорилирования HSF1 по серину-230. Наши антитела продемонстрировали, что фосфорилирование серина-230 однозначно увеличено при тепловом шоке, и что фосфосерин-230 обнаруживается в стресс-индуцируемых гранулах.

Серин-230 располагается в регуляторном домене HSF1, что подразумевает роль данного сайта фосфорилирования в регуляции активности HSF1. В подтверждение этой гипотезы, наше исследование показало, что замена серина-230 аланином снижает транскрибционную активность химерного белка GAL4-hHSFl. Другая мутация в том же положении на отрицательно заряженный остаток аспарагиновой кислоты, структурно и по электронной плотности во многом аналогичным фосфосерину, восстанавливает и даже усиливает транскрибционную активность фактора. Поскольку сайт фосфорилирования обычно претерпевает многократные циклические модификации фосфорилирова-ния/дефосфорилирования (и даже может быть обратимо блокирован от фосфорилирования обратимым О-гликозилированием), введение негативного постоянного заряда может необратимо сдвигать регуляторную функцию, ассоциированную с данным сайтом, в сторону неуправляемой постоянной активности. В добавление к экспериментам с химерным белком GAL4-hHSFl, другое указание на то, что сайт фосфорилирования по серину-230 имеет позитивную регуляторную функцию получено при оверэкспрессии постоянно активной СаМК II. Эта киназа ответственна за фосфорилирование эндогенного HSFI по серину-

230 и приводит к увеличению амплитуды трансактивации HSF1 под действие теплового шока.

Важность роли фосфосерина-230 в трансактивации HSF1 далее была подтве

ждена обнаружением нами того, что стресс-индуцированные гранулы содерж;

HSF1 фосфорилированный по данному сайту. Вместе с нашими данными г

фосфорилированию серина-230, литературные данные позволяют сделать bi

вод о том, что стресс-индуцируемое фосфорилирование транскрибционно а:

тивного HSF1 соответствует появлению ядерных гранул.

В добавление к идентификации нового сайта фосфорилирования HSF1 in viv

мы подтвердили, что серины 303 и 307, которые ранее были найдены при мул

ционном анализе HSF1, действительно фосфорилированы и в живых клетка:

Стоит также отметить, что фосфорилирование по так называемым «постоянш

структурным» сайтам фосфорилирования серин-303 и серин-307, показывг

дальнейшее увеличение под влиянием теплового шока, поднимает вопрос о p¡

нее предложенной роли этих сайтов в негативной регуляции HSF1.

Ранее было предложено, что несколько киназ белков могут фосфорилировать

подавлять транскрибционную активность HSF1. На данный момент не извест

но, как стимулирующие выживание каскады передачи сигналов, включая ERb

РКС, и GSK-3 киназы, а также стресс-индуцируемый JNK путь, взаимодейст

вуют при реализации их эффектов на регуляцию HSF1. В данном исследовани

мы предположили, что СаМК II киназа-опосредованные сигналы могут быт

вовлечены в позитивную регуляцию HSF1-опосредованной трансактивацш

Это предположение базируется на факте, что HSF1 - подходящий субстрат дл

СаМК II киназы как ш vitro, так и in vivo, и что гиперэкспрессия СаМК II при

водит к увеличению фосфорилирования по серину 230 и стимулируе

индуцируемую тепловым шоком транскрибционную активность HSF1

Поскольку СаМК II распространена очень широко среди клеток и тканей ;

регулируется одним кальций-калмодулин-зависимым механизмом, эта киназ

могла бы быть хорошим кандидатом, регулирующим активность HSF1 :

клетках различных типов. В добавление, СаМК II как было отмечено многим!

авторами, вовлечена в регуляцию ряда других транскрибционных факторов

таких как ЕВРР, CREB, и ATF-1, что показывает, что транскрибционны

зо

факторы часто являются субстратами для белковых фосфокиназ. Дальнейшие исследования требуются для завершения об обобщении физиологической роли фосфорилирования СаМК II киназой фактора НБР1 в клетках.

Почему НБР1 регулируется в клетках опухолей столь противоречиво, включая многостадийное фосфорилирование по нескольким сайтам, потенциально делающими возможным вовлечение нескольких путей передачи сигнала? Ответ на тепловой шок - быстро протекающий адаптивный клеточный процесс, при котором входящие сигналы от быстро и непредсказуемо изменяющихся условий окружающей среды должны быть интегрированы таким образом, чтобы обеспечить активацию Н8Р1, по длительности и силе, адекватную испытанному стрессу и обеспечивающую выживание опухоли при терапевтических воздействиях. Поскольку НБР1 активируется в ответ на множество стрессовых ситуаций, различные киназы/фосфатазы белков могут требоваться для управления ответами на эти стимулы. Необходимая осторожная и высоко управляемая транскрибционная регуляция может объяснять разное и подчас противоположное значение фосфорилирования по отдельным сайтам: индуцирующее фосфорилирование по серину-230 и вместе с тем ингибирующее фосфорилирование по серинам 303 и 307. В действительности, наличие обоих ингибирующих и стимулирующих сайтов фосфорилирования, которые постоянно и индуцируемо, регулируются киназами и фосфатазами белков, предлагает прецизионный и элегантный механизм настройки активности и функции белка, чья регуляция требует высокой интенсивности и аккуратности кинетики (рис.4). Н8Р1 может проходить стадию трансактивации, уже имея остатки фосфатов на ингибирующих сайтах. Согласно этой схеме, кажется привлекательным представить, что в течение фазы ослабления, активированные сайты будут дефосфорилированы, и эффект ингибирующего фосфорилирования становится доминантным. Такая регуляция была бы противоположностью ситуации, когда ингибирующие фосфатные остатки удаляются в процессе входа в митоз, и эффект активированных сайтов становится основным. Точная регуляция НБР1 может быть абсолютно необходимой в организме для предотвращения болезней и патологических состояний ассоциированных с НБР1. Например, недавние данные №ка1 и соавто-

ров показали, что самцы мышей экспрессирующие избыток активного HSI страдают от бесплодия в следствие апоптоза клеток Сертоли. Фосфорилирование HSF1 - динамический процесс, в котором степень фосф рилирования определяет активность фактора. Наши результаты подчёркивак важность фосфорилирования во внутриклеточной регуляции HSF опосредованной транскрибционной активности. Более утонченно, наши резул таты показывают позитивную роль фосфорилирования в его регуляции. Буд; щие исследования будут направлены на идентификацию и характеристику все сайтов фосфорилирования HSF1 in vivo и фосфокиназ/фосфатаз белков, вовл' чённых в расшифровку определяемой фосфорилированием регуляции HSF1.

левых клетках фактором HSF-1 под управлением двухстадийного фосфорили рования.

выводы

1. Единичные спонтанно диссеминирующие клетки опухолей человека могут быть регистрированы и прослежены в кровотоке модельных животных. Животные с комбинированными иммунодефицитами более пригодны для выведения и исследования высокометастазиругощих линий. Спонтанная диссеминация опухолей меченных зелёным флуоресцентным белком (вРР) наблюдается в кровотоке, начиная с 15-го дня, и слабо коррелирует с размером опухоли.

2. Усиление способности к метастазированию сопровождается исчезновением антигенов, участвующих в иммунологическом распознавании (HLA-DR, ICAM-1) и детерминант LAMP-1 и SiaLe*, необходимых для лиганд-рецепторных взаимодействий, имеющих место при активно протекающем процессе метаста-зирования.

3. Тип врождённого иммунодефицита, наблюдаемый у мышей seid, является более адекватным для развития ксеногенных моделей опухолей, нежели иммунодефицита мышей nude или beige.

4. Реорганизация эмбрионально-дифференцировочного промежуточного фила-мента нестина в процессе митоза связана с возрастающим фосфорилированием нестина по остатку треонина-316; с(1с2-киназа играет основную роль в зависимой от фосфорилирования модификации нестина в опухолевых клетках.

5. Профили экспрессии нестина, сс!к5-киназы и её активатора р35 взаимосвязаны, и морфология сети филаментов нестина зависит от данной киназы и её активаторов. Нестин фосфорилирован сс1к5-киназой in vitro и in vivo, что доказывает роль сс!к5-киназы в регулировании нестина в процессе раннего эмбрионального и опухолевого развития.

6. Фосфатаза белков типа 2А - РР2А фосфорилирована по остаткам треонина в интактных клетках. Среди белков ассоциированных с РР2А-С обнаружены А65 и Ва55 субъединицы РР2А и онкогенная киназа Raf-1.

7. Эффективное подавление TNF-a , Fas и TRAIL-опосредованного апоптоза, вызываемое ингибированием фосфатаз белков экзогенными токсинами и внутриклеточным ингибитором РР2А - 12РР2А реализуется через стимулирование каскада передачи сигнала митоген активируемой киназы (Erk), и это подавление происходит на ранних этапах исполнения, до активации каспаз первой ступени.

8. Ядерные гранулы фактора белков теплового шока HSF-1 появляются как в ответ на тепловой шок, так и под действием ингибиторов протеосом, что усиливает фосфорилирование HSF-1. Фосфорилирование данного фактора по се-рину 230 усиливает трансактивационную активность HSF1 в клетках опухолей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Михайлов А.Д., Малахов A.A., Ревазова Е.С.; Валякина Т.Н.. Метастазирова-ние меланомы человека на иммунодефицитных мышах. Опухолевые клетки в кровотоке // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1994. -№8. -С.188-191.

2. Осипова Т.А., Пискунова Т.В., Мартынов A.B., Чинарёва И.В., Бурова О.С., Михайлов А.Д., Барышноков А.Ю., Булатов A.A. Панель моноклональных антител к пролактину и их иммунохимическая характеризация // Биотехнология. -1994.-№ б. -С.31-36.

3. Михайлов А.Д., Малахов A.A., Ревазова Е.С., Валякина Т.И., Юдичева Т.В. Метастазирование меланомы человека на иммунодефицитных мышах. Сравне-

ие линий с различной метастатической активностью // Бюл. эксперим. биолога и медицины. -1995. -№2. -С.206-209.

. Михайлов А.Д., Малахов А.А., Ревазова Е.С., Мороз С.А., Пискунова Т.В., алякина Т.И., Юдичева Т.В. Диссеминация клеток солидных опухолей чело-ека в кровотоке иммунодефицитных животных // Бюл. эксперим. биологии и едицины. -1995. -№12. -С.615-618.

. Валякина Т.И., Малахов А.А., Комалёва P.J1., Петрова Е.Э., Михайлов А.Д., евазова Е.С., Несмеянов В.А. Дифференциальный эффект глюкозаминилму-амилдипептида на фенотип сублиний меланомы, различающихся метастатиче-ким потенциалом // Молекулярная биология. -1996. Т.ЗО. -№6. -С.1394-1401.

. Eriksson JE, Toivola DM, Sahlgren С, Mikhailov AD, Harmala-Brasken A-S. trategies to access phosphoprotein phosphatase and protein kinase-mediated regula-on of the cytoskeleton И Methods in Enzymology. -1998. -Part B: Molecular Mo-jrs and Cytoskeleton, Academic Press. -Vol.298. -P.542-569.

. Hitzfeld, В., Fischer, W., Eriksson, J., Mikhailov, A., and Dietrich, D. Immuno-hemical detection of microcystin-LR in tissues and cells of rainbow trout // Toxico-agical Sciences. -1999. -Vol. 48. (1-S). -P.33.

I. Fischer, W., Hitzfeld, В., Tencalla, F., Eriksson, J., Mikhailov, A., and Dietrich, D, /Ticrocystin-LR toxicodynamics, induced patholgy and immunohistochemical local-zation in livers of Rainbow trout //Toxicological Sciences. -1999. -Vol. 48 (1-S). -».34.

>. Mikhailov A, Harmala-Brasken A-S, Meriluoto J, Sorokina Yu, Dietrich D & iriksson JE. Production and specificity of mono- and polyclonal antibodies against

microcystins conjugated through N-methyldehydroalanine // Toxicon. -2000. -Vol. №.4. -P.477-483.

10. W. J. Fischer, B. C. Hitzfeld, F. Tencalla, J. E. Eriksson, A. Mikhailov, and D. Dietrich. Microcystin-LR Toxicodynamics, Induced Pathology, and Immunohis chemical Localization in Livers of Blue-Green Algae Exposed Rainbow Trout (( corhynchus mykiss) //Toxicological Sciences. -2000. -Vol.54. -P.365-373.

11. Holmberg CI, Illman SA, Kallio M, Mikhailov A and Sistonen L. Formation nuclear HSF1 granules varies depending on stress stimuli // Cell Stress & Chap ones. -2000. -Vol.5. -№3. -p.13-23.

12. Holmberg CI, Hietakangas V, Mikhailov A, Kallio M, Hellman J, Morrice MacKintosh C, Morimoto RI, Eriksson JE and Sistonen L. Serine 230 Is a No> Stress-Related in vivo Phosphorylation Site of Human HSF1 and a Target for Po; tive Regulation by CaMK II Signaling//EMBO J. -2001. -Vol.20. -P.3800-10.

13. Mehto P., Mikhailov A., Hinkkanen A, Ankelo A., Eriksson J., Meriluoto J. time-resolved fluoroimmunometric assay for detection of microcystins, cyanobact rial peptide hepatotoxins // Toxicon. -2001. -Vol.39 (6). -P.831-836.

14. Mikhailov A., Harmala-Brasken A. -S., Polosukhina E, Hanski A, Wahlsten > Sivonen K and Eriksson J. Production and specificity of monoclonal antibodl against nodularin conjugated through N-methyldehydrobutyrine // Toxicon. -2001. Vol.39 (10).-P.1453-1459.

15. Sahlgren C., Mikhailov A., Hellman J., Chou Y. - H., Lendahl U., Goldman R and Eriksson J. Mitotic Reorganization of the Intermediate Filament Protein Nesti

nvolves Phosphorylation by cdc2 Kinase // J Biol. Chem. -2001. -Vol.276 (19). -M6456-16463.

6. Mikhailov A.D., Harmala-Braskén A.-S., Meriluoto J. and Eriksson J.E. Identifica-ion of ATP synthase as a novel intracellular target for microcystin-LR // Chem.-3iol. Interact. -2002. -Vol.41 (II). -P.27-35.

Ipe3enmai¡uu e c6opmiKax KOiic¡)epem¡uii:

17. Mikhailov AD, Malahov AA, Revazova ES, Moroz SA, Valakina TI, Piskunova TV, Yudicheva TV. 1995. Human solid tumour cells dissemination in the blood ¡tream in immunodeficient mice // 3rd International conference: "AIDS, Cancer & delated Problems" - St.Peterburg, May 22-26, 1995. -p.70

18. Toivola DM, Mikhailov A, Goldman R & Eriksson JE. Characterization of the in /ivo phosphorylation of liver keratins 8 and 18 // 35 Annual Meeting ofthe American Society for Cell Biology. - Washington, Dec 9-13, 1995. -p.l 19, B90/2168.

19. Mikhailov AD, Mominoki K, Kondo N. Models for the Hibernation-associated Proteins (HP) Synthesis // International Conference Comparative Physiology and Biochemistry. - Skukuza Rest Camp, Kruger Natl. Park, South Africa, 31 Aug - 5 Sept, 1997. -p.25.

20. Mikhailov A, Harmala-Brasken AS, Sorokina J, Eriksson E. Immunodetection of Cyclic Peptides from Toxic Cyanobacteria // VIII Annual BioCity Symposium. -Turku, Finland, 1999. -p.54.

21. Mikhailov A, Bryzgalov I, Klimova S, Tran S, Eriksson J. Use of GFP-transfected tumor cell lines to experimental monitor metastasis // 2nd International Symposium on the Green-Fluorescent Protein. - San Diego, 1999. -p.l 13.

22. Mikhailov A., Harmala-Brasken A-S, Meriluoto J, Sorokina Yu, & Eriksson JE. Immunochemical analysis of the cellular targets of microcystins, inhibitors of ser/thr-specific protein phosphatases // The IXth Annual BioCity Symposium. - Turku, Finland, August 26-27, 1999. -p. 58.

23. Sahlgren СМ., Mikhailov A, Chou Y-H, Lendahl U, Goldman RD & Eriksson JE. Phosphorylation and assembly of the intermediate filament protein nestin during normal and regenerative processes // The IXth Annual BioCity Symposium. - Turku, Finland, August 26-27, 1999. -p. 58.

24. Holmberg CI, Heitakangas V, Mikhailov A, Morimoto RI, Eriksson JE & Sistonen L. Characterization of a novel stress-related phosphorylation site of human HSF1 // Molecular Chaperones & the Heat Shock Response. - Cold Spring Harbor May 3-7,2000.-p.120.

25. Mikhailov A, Eriksson JE and Kondo N. Establishing cell lines producing hibernation-associated proteins and studies of the role ofmitogen-activated protein kinase in regulation of the expression of these proteins // Life in the Cold 11th International Hibernation Symposium. - Jungholz, Vital Hotel Tirol, August 13-18,2000. -p. 104.

26. Andrey Mikhailov, Ann-Sofi Harmala-Brasken, Thomas Soderstrom, Tim Holmstrom, Zahi Damuni & John E. Eriksson. Supression of TNF-a-, TRAIL and Fas-receptor induced apoptosis by the protein phosphatase inhibitor calyculin-A and the PP2A inhibitor protein I2PP2A // 2nd International Symposium on Signal Transduction, Luxembourg, Jan30-Feb3, 2002. -p.l 19.

Патент:

27. Mikhailov A., Kondo N. Cell line producing hibernation proteins. Japanese patent. 1999. App.# 11-4685 (9-160258/591243103).