Автореферат и диссертация по медицине (14.00.03) на тему:Хромосомы 2 и 5 - локусы предрасположенности к сахарному диабету типа I и синдрому Альстрема у детей

На правах рукописи

Цитлидзе Нана Михайловна

Хромосомы 2 и 5 - локусы предрасположенности к сахарному диабету типа 1 и синдрому Альстрема у детей и подростков.

14 00 03 - Эндокринология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2008

Работа выполнена в

Научно-исследовательском институте детской эндокринологии Федерального Государственного Учреждения 4 Эндокринологического научного центра Росмедтехнологий (ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий) и лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИ генетика»)

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Кураева Тамара Леонидовна

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор Носиков Валерий Вячеславович

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Смирнова Ольга Михайловна

доктор биологический наук, профессор Фаворова Ольга Олеговна

Ведущая организация Медико-генетический научный центр

Российской Академии Медицинских Наук

Защита диссертации состоится « 28 » марта 2008 г в « 14 » часов на заседании диссертационного Совета

Д 208 126 01 в ФГУ Эндокринологического научного центра Росмедтехнологий по адресу 117036, Москва, ул Дм Ульянова, 11

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий по адресу 117036, Москва, ул Дм Ульянова, 11

Автореферат разослан «_»_2008г

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук

Семичева Т.В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Сахарный диабет (СД) типа 1 является комплексным многофакторным заболеванием, т е предрасположенность или устойчивость к болезни, а также ее проявление определяется совокупностью множества генетических и средовых факторов В этом его отличие от моногенных заболеваний, для которых выполняется правило один ген - один белок - один признак (болезнь) Причиной моногенного заболевания является мутация, приводящая к изменению структуры или концентрации белка и характерна, как правило, полная пенетрантность генотипа

Многочисленные исследования, проведенные в разных странах, показали, что причина СД типа 1 связана с наследованием определенных аллелей обычных "здоровых" генов Иногда эти аллели, которые определяют предрасположенность к СД типа 1 и сцеплены с заболеванием, называют этиологическими мутациями или вариантами Большинство этиологических вариантов широко распространено в популяциях и наличие у пациента какой-либо этиологической мутации само по себе не приводит к развитию СД типа 1 Только наличие определенной комбинации этиологических вариантов в генах, предрасполагающих к заболеванию, а также взаимодействие с еще не идентифицированными факторами окружающей среды приводит к развитию СД типа 1 При реализации генетического картирования, часто используемого в исследованиях полигенных, многофакторных наследственных заболеваний, поиск генов-кандидатов начинают не с функции, а с хромосомной локализации Для этого проводится детальное картирование участков сцепления на всех хромосомах человека с использованием групп полиморфных маркеров и семей с наличием заболевания у сибсов Затем в участках, показавших максимальное сцепление с СД типа 1, изучают функции конкретных генов и исследуют ассоциацию с заболеванием полиморфных маркеров в этих генах Установление ассоциации генов с заболеванием необходимо для понимания природы процессов, приводящих к сахарному диабету типа 1, и для оценки его индивидуального и популяционного генетического риска

Таким образом, именно выявление группы "генетических маркеров" с высокой прогностической мощностью, а также внедрение массовой профилактики СД типа 1 в группах высокого риска позволит выявлять это заболевание на ранних стадиях развития, проводить превентивную терапию и, таким образом, существенно снизить опасность развития осложнений СД типа 1 Внедрение этих подходов в медицинскую практику

позволит также минимизировать немалые средства, расходуемые на медицинскую и социальную помощь больным

Использование группы новых генетических маркеров СД типа 1 поможет выявлять лиц с высоким абсолютным риском развития заболевания задолго до проявления гормонально-метаболических нарушений Получение этих данных даст возможность начинать профилактику заболевания уже в ранней доклинической фазе диабета, что позволит значительно отсрочить его манифестацию, а также снизить частоту, скорость развития и тяжесть протекания поздних осложнений

Синдром Альстрема, в состав симптомокомплекса которого входит инсулинорезистентный сахарный диабет, мало изучен В РФ в медицинской литературе ранее не описаны клинические случаи и симптомокомплекс синдрома Альстрема В мире создается регистр таких больных, насчитывающий к настоящему времени более 350 человек Идентифицирован ген, мутации в котором приводят к развитию синдрома Альстрема, причем спектр мутаций в различных популяциях только изучается Ген синдрома Альстрема расположен на 2 хромосоме, где находятся 2 локуса предрасположенности к СД типа 1 (ЛЗ£)М7 и ЮОМ13) В последние годы широко дискутируется вопрос о значении инсулинорезистентности при СД типа 1, а при синдроме Альстрема СД протекает с инсулинорезистентностью разной степени выраженности Поэтому нам представлялось интересным объединить эти исследования в одной работе

Цель исследования1

1 Поиск полиморфных маркеров, сцепленных и ассоциированных с развитием СД типа 1 в локусах ЮВМ7 и ЮВМ13, расположенных на 2 хромосоме и ЮйМ18, расположенного на 5 хромосоме, в русской популяции

2 Изучение клинических проявлений и спектра мутаций гена АЬМБ!, расположенного на 2 хромосоме, у пациентов с синдромом Альстрема

Задачи исследования

1 Проведение анализа сцепления и ассоциации полиморфных маркеров, расположенных в локусах ЮВМ7, ЮОМ13 и ЮИМ18 с СД типа 1 с использованием семей с парами сибсов

2 Изучение особенностей клинических проявлений синдрома Альстрема

3 Проведение молекулярно-генетического исследования гена Л1АШ, определение наличия наиболее распространенных мутаций у больных в России

Научная новизна'

Впервые в России исследованы сцепление и ассоциация маркеров, расположенных в локусах ЮОМ7, ЮВМ13 и ЮОМ18 с сахарным диабетом типа 1 Впервые в России описаны клинические проявления синдрома Альстрема, исследованы мутации гена А1Ш1

Практическая значимость

Молекулярно-генетические исследования в итоге позволяют изучить весь спектр предрасполагающих к развитию СД типа 1 генов, что приведет как к пониманию механизмов формирования СД типа 1, так и к повышению прогностических данных молекулярно-генетических исследований при СД типа 1 Изучение ассоциации новых полиморфных маркеров с СД типа 1 позволит дополнить данные об оценке риска развития СД типа 1 в русской популяции Кроме того, оно позволит формировать группы с высоким риском развития СД типа 1 Описание клинических проявлений синдрома Альстрема будет способствовать своевременной диагностике этого тяжелого заболевания и назначению адекватной терапии Расширение возможностей молекулярно-генетических исследований поможет в дифференциальной диагностике синдрома Альстрема

Апробация работы-

Основные результаты исследований по материалам диссертации докладывались на

• Ежегодной всероссийской конференции молодых ученых в ГУ ЭНЦ РАМН «Актуальные проблемы эндокринологии» (г Москва, Россия, 2006г)

• Детской Научно-практической конференции НИИ Эндокринологии ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий (25 декабря 2007 г)

Публикации

По теме диссертации опубликованы 8 печатных работ, включая 3 статьи, а также тезисы докладов и сообщения на конференциях

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственного исследования и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, иллюстрирована 4 рисунками Библиография содержит 9 отечественных и 139 зарубежных источников

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

1 1 Популяционные выборки и пациенты

111 Выборка была сформирована из 35 семей с конкордантными парами сибсов и 72 семей с дискордантными парами сибсов, представляющих городское населения Москвы Каждая семья с конкордатными парами сибсов содержала как минимум двоих сибсов с СД типа 1, каждая семья с дискордантными парами сибсов - одного больного и одного здорового Возраст манифестации СД типа 1 от 5 до 18 лет

112 6 пациентов с синдромом Альстрема и члены их семей (родители и сибсы) 1 2 Молекулярно-генетическое исследование

Определение аллелей полиморфных маркеров, расположенных в локусах IDDM7, IDDM13 и IDDM18 проводилось в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ФГУП «ГосНИИ генетика» под руководством д б н , проф В В Носикова Этап 1 Выделение геномной ДНК Выделение ДНК из цельной крови человека проводилось с помощью протеиназы К и экстракции фенолом и хлороформом или с использованием хелатного полимера Chelex R-100

Этап 2 Амплификация ДНК ДНК амплифицировали методом полимеразной цепной реакции на термоциклерах РНС-2 ("Techne", Великобритания) и Терцик («ДНК-технология», Россия) На начальной стадии ПЦР ДНК денатурировали при 94° С в течение

3 мин, на конечной - проводили синтез второй цепи при 72°С - 7 мин В промежутке между данными стадиями осуществляли 25-35 циклов ПЦР в зависимости полиморфного маркера по трехступенчатой программе, включающей денатурацию ДНК (94° С/30 сек - 1 мин), отжиг праймеров (30 - 60 сек) и синтез второй цепи (72°С/30 - 60 сек) Температура отжига праймеров и продолжительность отдельных стадий циклов зависели от амплифицируемого локуса

Этап 3 Расщепление продуктов ПЦР рестриктазами Полиморфизм генов исследовали, обрабатывая соответствующими рестриктазами продукты ПЦР, содержащие полиморфный участок

Этап 4 Электрофоретическое разделение продуктов расщепления амплифицированого фрагмента ДНК Фрагменты ДНК после амплификации и/или расщепления рестриктазами разделяли в агарозном или полиакриламидном (ПААГ) гелях Электрофоретическое разделение в 1,5%-ных и 2%-ных агарозных гелях проводили в горизонтальной камере По окончании электрофореза гели окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг/мл) и просматривали в ультрафиолетовом свете Разделение ДНК в ПААГ осуществляли в вертикальной камере с использованием в качестве электродного буфера lxTBE при

4

напряженнии 350 В Для идентификации аллелей динуклеотидных микросателлитных маркеров использовали аллельные "лестницы" ПААГ окрашивали нитратом серебра 1 3 Статистическая обработка результатов

1 3 1 Для анализа сцепления генетического маркера с заболеванием в семьях с конкордатными парами сибсов, то есть с двумя и более пораженными заболеванием сибсами, применяется тест IBD (identity by descent) Этот тест основан на предположении, что при отсутствии сцепления генетического маркера с заболеванием наследование маркера 2, 1 и 0 сибсами будет соответствовать расщеплению 0,25 0,5 0,25 Достоверность отклонения наблюдаемых частот передачи аллеля от ожидаемых оценивается с помощью величины Lod, которая представляет десятичный логарифм отношения вероятностей подтверждения и опровержения гипотезы о сцеплении генетического маркера с заболеванием Величина Lod рассчитывается для каждого аллеля отдельно Максимальное значение Lod для конкретного маркера составляет величину MLS (maximum Lod score) Исходя из MLS, можно найти достоверность р по таблице Z' -распределения Если р < 0,05, мы можем говорить о сцеплении генетического маркера с заболеванием Для анализа ассоциации генетического маркера с заболеванием в семьях с дискордантными парами сибсов, то есть в семьях, где болен только один из сибсов (пробанд), использовали объединенный тест TDT (Transmission Disequilibrium Test) и S-TDT (Sib Tiansmission Disequilibrium Test) Расчет проводился с помощью компьютерной программы S-TDT Основой теста TDT является предположение, что в отсутствии ассоциации вероятности передачи аллеля от родителя каждому сибсу равны S-TDT тест представляет собой модификацию TDT теста и применяется для анализа ассоциации в семьях с дискордантными парами сибсов, для которых отсутствует информация о генотипах родителей Сравнение частот передачи аллелей больным и здоровым сибсам проводили двумя способами Во-первых, разделяли больных и здоровых сибсов на две отдельные группы и анализировали достоверность различий в частотах аллелей между ними с помощью х2"РаспРеДеления Во-вторых, при известных генотипах родителей анализировали передачу аллелей в каждой конкретной семье Величина Z', которая является аналогом Lod, дает нам оценку степени ассоциации маркера с заболеванием По таблицам х2 или распределения Z' - рассчитывали уровень значимости р Величина р < 0,05 показывает сцепление исследуемого маркера с заболеванием

1 3 2 Проверка на подчинение равновесию Харди-Вайнберга и неравновесие по сцеплению

1 3 3 Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов, точный критерий Фишера, поправка Бонферрони

1 4 Определение нуклеотидной последовательности исследуемого фрагмента ДНК 1 5 Общеклиническое обследование проводилось в отделении сахарного диабета (руководитель - проф Кураева Т Л) Института детской эндокринологии (руководитель -проф Петеркова В А) ФГУ Эндокринологического научного центра Росмедтехнологий (руководитель - проф Мельниченко Г А) и включало в себя сбор анамнеза жизни и анамнеза заболевания, результаты обследований, клинический осмотр по стандартной методике Лабораторные методы исследования включали в себя биохимические исследования (глюкоза, липиды, трансаминазы, гликированный гемоглобин, микроальбуминурия), которые проводились в биохимической лаборатории ФГУ ЭНЦ (руководитель - Ильин А В )

Результаты исследования и обсуждение:

Как свидетельствуют литературные данные, даже среди различных групп европеоидов гетерогенность локусов изученных в нашей работе, достаточно велика Поэтому проведенное нами исследование должно дать ответ о степени влияния данных локусов на предрасположенность к СД типа 1 в семьях из русской популяции

1 ЛокусЯЮМ7.

Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области 2q31-q33 (ЮЬМ7) с СД типа 1

К генам-кандидатам, картированным в области данного локуса, относят гены ЫемгоО/ВЕТА2, ЮЯР и ОАЬИТЗ Данные гены экспрессируются в клетках поджелудочной железы, продукты генов участвуют в разных этапах продукции Р-клетками инсулина Область максимального сцепления с СД типа 1 была обнаружена в третьем полном геномном поиске на британских семьях, внутри нее находится полиморфный динуклеотидный маркер £>2,5752 Впоследствии было проведено еще несколько исследований с использованием семей из этнических групп Европы, Северной Америки и Азии Их выводы о наличии сцепления или ассоциации с СД типа 1 области, содержащей полиморфный микросателлитный маркер £>25752, были как положительными, так и отрицательными

В настоящем исследовании, помимо маркера 028152, был выбран еще один полиморфный маркер - £>25/775, находящийся на расстоянии 1,5 мпн от первого (табл 1)

Таблица 1

Характеристика полиморфных маркеров, локализованных в хромосомной области 2q31-q33

Маркер Расстояние от q-конца хр 2, м п н Тип полиморфизма Число аллелей

D2S152 188,00 Динукл 9

D2S1775 189,50 Тетранукл 6

Частоты аллелей полиморфных микросателлитных маркеров Д25752 и й281775 оценивались суммарно для всех неродственных индивидов, т е для родителей в каждой

семье (табл 2)

Таблица 2

Частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров D2S152 и D2S1775

D2S152

Аллель (п н ) 269 271 273 275 277

Частота 0,007 0,010 0,100 0,235 0,066

Аллель (п н ) 279 281 283 285

Частота 0,390 0,134 0,055 0,003

D2S1775

Аллель (п н ) 115 119 123 127 131 135

Частота 0,007 0,087 0,123 0,453 0,235 0,095

Изучение сцепления полиморфных маркеров в области 2q31-q33 с СД типа 1

Оценка сцепления полиморфных маркеров проводилась на семьях с конкордантными и дискордантными парами сибсов Для каждого аллеля вычислялся LOD-балл, характеризующий вероятность совместного наследования или отсутствия наследования этого аллеля обоими сибсами одновременно Максимальный LOD-балл, или MLS, выбирался из всех значений по всем аллелям Эта величина отражает корреляцию между идентичными по происхождению сибсами Наличие корреляции свидетельствует о сцеплении полиморфного маркера с заболеванием

Результаты исследования приводятся в табл 3 В настоящем исследовании максимальный LOD-балл был получен для полиморфного маркера D2S152 (MLS =2 41) Это немного выше порога предположительного сцепления (MLS > 2 20) Для микросателлитного полиморфного маркера D2S1775 не было обнаружено сцепление с СД типа 1 у русских (MLS= 1,14), (табл 3)

Таблица 3

Результаты анализа сцепления для микросателлитов, расположенных в хромосомной области 2qЗ 1^33 с СД типа 1

Маркер МЬ8 Рс

028152 2,41 0,064

0281775 1,14 N8

Таким образом, микросателлитный маркер 028152, расположенный в хромосомной области 2qЗ 1^33, слабо сцеплен с СД типа 1 у русских

Изучение ассоциации аллелей полиморфных маркеров в области 2q31-q33 с СД типа 1.

Для проверки приведенных результатов о наличии сцепления с сахарным диабетом типа 1 в хромосомной области 2q31-q33 провели альтернативное исследование неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сибсам, показывающее наличие или отсутствие ассоциации с заболеванием Тест проводился на всех типах семей с использованием компьютерной программы Б-ТЭТ для каждого из 5 полиморфных маркеров Статистически значимая ассоциация не была показана ни для одного из исследуемых микросателлитов, хотя в некоторых случаях существовала слабая тенденция к неравновесной передаче аллелей Таким образом, тест ТБТ не подтвердил данные теста на сцепление о том, что локус 2q31-q33 сцеплен с СД типа 1 в семьях русского происхождения

2. Локус ЮОМ13.

Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области 2q35 (1Т>Т)М13) с СД типа 1

К генам-кандидатам локуса ЮОМ13 относят гены 1А-2, ЯЛАМР! и ЮРВР5 Данные гены участвуют в аутоиммунных процессах Кокс и соавт в одном из геномных поисков обнаружили для этой хромосомной области предположительное сцепление с СД типа 1, что в дальнейшем было подтверждено рядом других исследований Наиболее значимые результаты ассоциации данной области с СД типа 1, были получены Мораханом и соавт для полиморфных микросателлитных маркеров 028164, 028301 и028137

В настоящем исследовании были выбраны пять полиморфных маркеров, четыре из которых суммарно перекрывают область длиной около 4 м п н (табл 4)

Характеристика полиморфных маркеров, локализованных в хромосомной области 2q35

Маркер Расстояние от q-конца хр 2, м п н Тип полиморфизма Число аллелей

D2S157 211,03 Динукл 10

D2S143 216,21 Динукл 7

D2S137 216,64 Динукл 9

D2S301 217,71 Динукл 6

D2S164 220,83 Динукл 8

Частоты аллелей полиморфных микросателлитных маркеров оценивались суммарно для всех неродственных индивидов, т е для родителей в каждой семье (табл 5)

Таблица 5

Частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров хромосомной области 2q35

D2S157

Аллель (п н) 103 105 107 109 111

Частота 0,112 0,007 0,015 0,335 0,241

Аллель (п н) 113 115 117 119 121

Частота 0,040 0,056 0,121 0,052 0,021

D2S143

Аллель (п н ) 109 111 113 115 117 119 121

Частота 0,123 0,341 0,154 0,127 0,155 0,040 0,060

D2S137

Аллель (п н ) 142 144 146 148 150

Частота 0,011 0,007 0,058 0,043 0,334

Аллель (п н ) 152 154 156 158

Частота 0,420 0,105 0,010 0,012

D2S301

Аллель (п н ) 224 226 228 230 232 234

Частота 0,103 0,122 0,121 0,224 0,151 0,279

D2S164

Аллель (п н) 265 267 269 271

Частота 0,015 0,158 0,031 0,080

Аллель (п н) 273 275 277 279

Частота 0,345 0,243 0,111 0,017

Изучение сцепления полиморфных маркеров в области 2q35 с СД типа 1

В настоящем исследовании максимальный LOD-балл был получен для полиморфного маркера D2S137 (MLS = 3 18) Это немного ниже порога значимого сцепления (MLS > 3 50) Остальные исследованные маркеры не показали сцепления Таким образом, только один из изученных микросателлитов (D2S137), расположенных в хромосомной области 2q35, сцеплен с СД типа 1

Изучение ассоциации аллелей полиморфных маркеров в области 2q35 с СД типа 1.

Для проверки приведенных результатов о наличии сцепления с сахарным диабетом типа 1 в хромосомной области 2q35 провели альтернативное исследование неравновесной передачи аллелей от родителей к больным сибсам, показывающее наличие или отсутствие ассоциации с заболеванием Приведены результаты как собственно теста ТБТ, так и объединенного теста Э-ТВТ + ТВТ и рассчитана достоверность наличия ассоциации (табл 6)

Таблица 6

Передача больным сибсам аллелей полиморфных микросателлитных маркеров локуса

2q35 в семьях с СД типа 1, а также результаты объединенного теста TDT+S-TDT

Аллель (число повторов) TDT-тест Объединенный тест

Передается | Не передается | X1 \ рс Z' 1 Рс

D2S137

142 (26) 6 12

344 (27)

146 (28) 16 25

148 (29) 25 19

150 (30) 31 33

152 (31) 46 19 11,21 0,006 3,225 0,0048

Статистически значимая ассоциация была получена только для микросателлита D2S137 (X2 = 11 215, а = 0 006, Z' = 3 225, рс = 0 0048) Для этого же полиморфного микросателлитного маркера было показано и предположительное сцепление (MLS= 3,18) Таким образом, полиморфный микросателлитный маркер D2S137 локуса 2q35 сцеплен с СД типа 1 в семьях с русским происхождением

3 Лсжус ID DM 18

Изучение сцепления полиморфных маркеров в хромосомной области 5q31 l-q33 1 (IDDM18) с СД типа 1.

Локус IDDM18, расположенный в хромосомной области 5q31 l-q33 1, был обнаружен сравнительно недавно в работах с использованием NOD-линии мышей Расположенный внутри него ген IL12B кодирует субъединицу р40 белка IL-12, который является одним из ключевых цитокинов в развитии клеток Th-1 Подтверждение того, что полиморфный маркер С1159А в З'-нетранслируемой области гена ILI2B строго ассоциирован с СД типа 1, было получено в популяции больных Австралии и Великобритании При последующих исследованиях в популяциях Европы и Америки ассоциация обнаружена не была

В настоящем исследовании была поставлена задача изучить сцепление локуса ЮВМ18, расположенного в хромосомной области 5д31 1-цЗЗ 1, используя в анализе семьи русского происхождения Были выбраны два полиморфных маркера (табл 7), один из которых представляет собой однонуклеогидный полиморфизм в нетранслируемой области гена 1Ы2В, и является самым часто упоминаемым полиморфным маркером, связанным с локусом ЮОМ18 Второй маркер, 0582060, является микросателлитным маркером и расположен в непосредственной близости от маркера С1159А

Таблица 7

Характеристика полиморфных маркеров локализованных в хромосомной области 5qЗ 1 1ч]33 1

Маркер Расстояние от q-конца хр 2, м п н Тип полиморфизма Число аллелей

D5S2060 158,13 Динукл 11

С1159А 158,67 БИР 2

Частоты аллелей полиморфных микросателлитных маркеров оценивались суммарно для всех неродственных индивидов, т е для родителей в каждой семье (табл 8)

Таблица 8

Частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров хромосомной области 5д31 1^33 1

D5S2060

Аллель (п н) 108 110 112 114 116 118

Частота 0,125 0,060 0,054 0,030 0,100 0,044

Аллель (п н) 120 122 124 126 128

Частота 0,245 0,213 0,111 0,007 0,002

С1159А

Аллель (п н ) А С

Частота 0,454 0,546

Результаты исследования приводятся в табл 9 Как следует из табл 9, ни для одного из исследованных полиморфных маркеров не было показано сцепления с СД типа 1

Таблица 9

Результаты анализа сцепления в хромосомной области 5q31 1^33 1

Маркер MLS Pc

D5S2060 1,58 NS

С1159А 0,31 NS

Таким образом, изучение сцепления не показало значимой связи локуса ЮОМ18 с СД типа 1 в популяции больных русского происхождения

Статистически значимая ассоциация так же не была обнаружена ни для одного из исследованных маркеров

Таким образом, тест ТБТ подтвердил данные теста на сцепление о том, что локус ЮйМ18 не связан с СД типа 1 у русских

4 Анамнез и клинические особенности пациентов с синдром Альстрема

Синдром Альстрема впервые был описан в 1959 г группой авторов во главе со шведским генетиком Альстремом Наследование аутосомно-рецессивное Основными симптомами этого прогрессирующего расстройства являются врожденная дегенерация сетчатки, ведущая к слепоте, ожирение с первого года жизни, нейросенсорная тугоухость, сахарный диабет типа 2 (табл 10) Заболевание встречается среди различных рас и этнических групп Известны ядерные семьи (2-3 пораженных ребенка) Частота синдрома в популяции остается неизвестной Ведется международный регистр больных с синдромом Альстрема, в который к настоящему времени вошло 345 человек (Konstantinova М at all, United states, Sofia Bulgaria, 2006)

Таблица 10

Возраст манифестации и частота встречаемости клинических проявлений синдрома Альстрема (Maishal S Р, Bronson R Т, 2005, адапт )

Клинические проявления Возраст манифестации Частота встречаемости

Пигментная дегенерация сетчатки, с развитием светобоязни к 6 мес С рождения 100 %

Нейросенсорная тугоухость С 5 лет 70 - 90 %

Ожирение На 1 году 100%

Инсулинорезистентность 18 мес - 4 г 47 - 68 %

Сахарный диабет II типа 2-3 декада жизни 47 - 68 %

Нефропатия Пубертат-взрослые 100%

Артериальная гипертония 80%

Соматогенная низкорослость (конечный рост ниже 3 %о) Пубертат-взрослые 85%

Гипер- и гипогонадотропный гипогонадизм Пубертат-взрослые 67 % (муж)

Гепатолиенальный синдром К 8 годам 50-80 %

Дилатационная кардиомиопатия В любом возрасте 25 - 35 %

Возможна задержка умственного развития 25 - 30 %

Фенотипические особенности грудной и поясничный сколиоз, кифоз, лордоз, широкие ступни и кисти, короткие пальцы на руках и ногах, глубоко посаженные глаза, аномалии зубов верхней челюсти, алопеция

Нами обследовано 6 человек с синдромом Альстрема (5 мальчиков и 1 девочка), в возрасте от 9 до 19 лет (ср 15,5 лет)

Семейный анамнез Проявлений синдрома Альстрема в родословных не зарегистрировано Родители у всех больных были здоровы Общее количество сибсов 12

составило 11 человек В двух семьях первые беременности закончились рождением живых мальчиков, которые в возрасте 1 — 2,5 мес умерли от сердечной недостаточности В семье пациента № 4 первая и вторая беременность закончилась рождением живых мальчиков, которые в 6 мес и 1 мес умерли Первый - вследствие ОРВИ на фоне сердечно-легочной недостаточности, второй ребенок - от фиброэластоза* Можно предположить, что дети, умершие от сердечной недостаточности, были также больны синдром Альстрема и умерли от делатационной кардиомиопатии, которая, по литературным данным, в 25-35 % случаев наблюдается при данном синдроме Тогда частота повторных случаев синдрома Альстрема в нашей группе составила 27 %, что не противоречит аутосомно-рецессиному типу наследования

Клинические проявления (табл 11) Рост и вес у 5 пациентов при рождении был в пределах нормы, вес 6-го пациента - 4350 г Кб месяцам у всех отмечалось интенсивное нарастание массы тела К моменту обращения в ЭНЦ SDS ИМТ составлял от 1,67 до 3,5 (ИМТ от 25,85 до 36,6), т о , избыточная масса тела наблюдалась у двух, ожирение - у четырех больных

У всех пятерых пациентов, достигших 16 лет, рост был ниже 3 перцентили (SDS роста от -1,99 до -3,13) при закрытых зонах роста У пациента 9 лет рост опережал хронологический, костный возраст соответствовал 14 г Можно предположить, что опережение в росте и костном возрасте было обусловлено гиперинсулинизмом (ИРИ -151,4 мкЕд/мл, С-пептид - 10,1 нг/мл) У больных старшего возраста низкорослость, вероятно, была обусловлена ранним закрытием зон роста на фоне гиперинсулинизма У всех пациентов имелся выраженный acanthosis nigncans в области шеи, подмышечных впадин, acne vulgaris на лице и спине, папилломатоз, фолликуты

Патология органов зрения и слуха выявлена у всех пациентов Светобоязнь и нистагм отмечались у всех пациентов с 6 мес Пигментная дегенерация сетчатки была диагностирована в возрасте от одного года до 5-6 лет Острота зрения у пациентов варьировала от 0,00 до 0,04

Нейросенсорная тугоухость выявлена у всех пациентов при клиническом осмотре, а у трех пациентов подтверждена при проведении аудиограммы у двух диагностирована тугоухость II степени, у одного пациента - III степени

* Фиброэластоз - чрезмерное разрастание или нарушение роста эластических волокон соединительной ткани, в частности фиброэластоз эндокарда - это диффузное утолщение эндокарда одной или более сердечных камер, образуемое коллагеновой либо эластической тканью Поражение может быть изолированным или сочетаться с другими врожденными аномалиями сердца, являясь причиной врожденных нарушений ритма сердечных сокращений

Общая характеристика группы пациентов с синдромом Альстрема

Инициалы КК М А ПА СЕ ЮР лд

№ 1 2 3 4 5 6

Пол м м м ж м м

Возраст 19 17 9 17 16 16

Вес при рождении 3500 4350 3000 3100 3200 3000

Рост при рождении 53 53 50 49 51 52

Вес (8Б8 ИМТ, кг/м 2) на момент обследования 64,0 (1,75) 91,0 (3,3) 76,0 (3,7) 89,0 (3,5) 76,5 (2,5) 67,0 (1,67)

Рост (вБв роста) на момент обследования 153,4 (-3,13) 157,0 (-2,3) 152,0 (3,09) 150,0 (-2,03) 161,0 (-1,43) 161,0 (-1,99)

СД 2 типа НТГ с 12 лет СД в 14 лет СД в 15 лет СД в 9 лет НТГ с 13 лет СД с 17 лет СДв 16 лет СДв 12 лет

Пигментная дегенерация сетчатки С 11 мес С 6 мес С 8 мес С 5 мес + С 2 лет

Нейросенсорная тугоухость С 8 лет + С 6 лет С 10 лет + +

Дилатационная кардимиопатия - - - + - -

Артериальная гипертония 150/70 мм рт CT 140/90 мм рт CT 130/80 мм рт CT 150/90 ммрт CT 140/90 мм рт CT 150/90 мм рт CT

Нефропатия + + - + + +

Гепатомегалия, жировой гепатоз + + + + + +

Возраст установления диагноза синдром Альстрема 15 лет 17 лет 9 лет 17 лет 16 лет 17 лет

Место установления диагноза ЭНЦ ЭНЦ И-т пед* ЭНЦ Пермская ДКБ ЭНЦ

*ФГУ МНИИ педиатрии Роемедтехнологий

Сахарный диабет развился у пациентов в возрасте от 9 до 17 лет У 5 больных отмечена инсулинорезистентность разной выраженности базальный уровень ИРИ от 30 до 1128 кЕд/мл, Индекс Karo 0,01 - 0,44 Базальный уровень С-пептида от 4,4 нг/мл до 18,5 нг/мл Показатель гликированного гемоглобина колебался от 8,6% до 14,9%, в среднем составлял 11,1 (табл 12) У больного № 5 при нормальном показателе индекса Karo, отмечено незначительное повышение баз уровня С-пептида, при значительной гипергликемии натощак

Степень гиперинсулинизма и инсулинорезистентность у больных с синдромом Альстрема

Показатели Норма № 1 №2 №3 №4 №5* №6

Сах кр натощак 3,3-5,5 ммоль/л 15,0 10,0 6,1 12,3 13,2 11,2

ИРИ 2,3-26,4 мЕд/мл 1128 66,2 151,4 38,2 30 **

С-пептид 1,0 - 4,4 нг/мл 18,5 10,0 10,1 10,7 4,4 9,8

Индекс Каго >0,33 0,01 0,15 0,04 0,32 0,44 -

НЬА1с до 6% 10,9 9,8 8,6 13,6 11 5 14,9

*обследование в другом медицинском учреждении

* *уровень ИРИ не исследован в связи с инсулинотерапией

Патология сердечно-сосудистой системы Делатационная кардимиопатия была выявлена у одного пациента (17 %) С 6 лет ребенок наблюдается в НИИ Педиатрии по поводу кардиомиопатии, с 14 лет получает «Дигоксин», «Аспаркам» При обследовании в возрасте 17 лет в Российском кардиологическом научно-производственном комплексе МЗРФ, диагностированы делатационная кардиомиопатия, АУ-блокада 1 степени, флотирующий тромб на верхушке ЛЖ, недостаточность кровообращения 2 А степени Проводится терапия «Дигоксин» 0,25 мг/сут, «Ренитек» 2,5 мг/сут, «Конкор» 1,25 мг/сут, «Варфарин» 2,5 мг/сут, «Диувер» 5 мг/ сут под наблюдением кардиологов Артериальная гипертензия до 130-150/70-90 мм рт ст отмечалась у всех пациентов На фоне приема гипотензивных препаратов - ингибиторов АПФ (5 чел) и «Изоптин ИЗ» (1 чел) отмечено снижение показателей АД до нормального уровня

Патология печени и почек. У всех пациентов при ультразвуковом исследовании брюшной полости выявлена гепатомегалия, жировой гепатоз Уровень триглицеридов колебался от 1,6 до 18 ммоль/л, уровень холестерина - от 4,2 до 9,5ммоль/л, печеночных трансаминаз - от 27,9 до 212 ммоль/л (табл 13)

Таблица 13

Некоторые показатели жирового обмена и печеночные пробы

Показатели Норма № 1 №2 №3 №4 №5 №6

Триглицериды 0,1-2,2 ммоль/л 17,0 5,9 1,6 5,0 5,2 18,0

Об Холестерин 3,3-5,2 ммоль/л 9,5 6,7 4,6 4,2 6,1 8,19

АЬТ 10-41 Ед/л 152 49,9 212,3 63,3 52,6 67,0

АЭТ 4-38 Ед/л 87,0 27,9 78,0 68,3 49,6 42,0

Нефропатия выявлена у всех пациентов пубертатного возраста, в стадии макропротеинруии (от 0,034 до 50 г/с) У пациента № 3 нарушение функции почек отсутствовало, что соответствует литературным данным, согласно которым протеинурия диагностируется после 16 лет Более ранние стадии и скорость ее формирования не изучены

Интеллектуальное развитие различалось в зависимости от уровня индивидуального обучения в специализированных учреждениях для детей с нарушением зрения и слуха По мнению Van den Abeele К, у больных достаточно часто отмечается нормальный интеллект

Специфического лечения синдрома Альстрема не существует Лечение симптоматическое

Инсулинорезистентность/диабет 2 типа Таблетированные сахароснижающие препараты, в некоторых случаях в комбинации с инсулином Терапия диабета достаточно сложна из-за выраженной инсулинорезистентности Представляем краткие выписки из историй болезни, касающиеся вопросов терапии сахарного диабета

Пациент №1, 19 лет В 12-летнем возрасте выявлена гипергликемия натощак 9,0 ммоль/л, через 2 часа после пищевой нагрузки -14 ммоль/л В течение 2-х лет получал лечение метформином, с последующей отменой родителями При обследовании в ЭНЦ С-пептид 18,5 нг/мл, ИРИ 1128 мЕд/мл, гликированный HbAl - 10,9%, индекс Karo - 0,01 Назначение Сиофора в дозе до 3000 мг/сут привело к компенсации углеводного обмена, однако впоследствии было отменено в связи с высоким уровнем печеночных трансаминаз (ALT - 118,9 Ед/л, AST - 60,8) Терапия «Левемиром» в дозе 25 ед/сут в сочетании с «Новонормом» 8 мг/сут не имела эффекта (гликемия 20 ммоль/л), в дальнейшем назначена комбинированаая терапия «Левемиром» 20 ед/сут, с «Сиофором» 2500 мг/сут, уровень гликемии - до 10 моль/л, без нарастания печеночных трансаминаз

Пациент №2, 17 лет В 15 лет выявлены гипергликемия натощак 8-10 ммоль/л, через 2 часа после нагрузки глюкозой - 12,9-14,9 ммоль/л Уровень ИРИ- 66,2 мЕд/л, С-пептида 6,8 нг/мл (Индекс Karo - 0,15) Лечился «Сиофором» по 500 мг 2 раз в день, нерегулярно Гликемия в течение суток снизилась до 4-8 ммоль/л, HbAl - 8,5%

Пациент №3, 9 лет В 9 лет, на фоне пневмонии, выявлена гипергликемия 6,4 ммоль/л В ЭНЦ проба с нагрузкой (глюкозой) гликемия натощак - 6,1 ммоль/л, через 2 часа - 12,3 ммоль/л, ИРИ баз 151,5 мЕд/л, через 2 часа>1000, С-пептид баз 10,1 нг/мл, через 2 часа 29,4 нг/мл (Индекс Karo - 0 04) Гликированный HbAl - 8,6% Назначен «Сиофор» по 1000 мг/сут, уровень гликемии до 6,0 ммоль/л

Пациент № 4, 17 лет При обследовании по поводу кардиомиопатии -гипергликемия 18,0 ммоль/л В ЭНЦ гипергликемия натощак 10-12 ммоль/л, через 2 часа после нагрузки (глюкозой) - 14-19 ммоль/л, гиперинсулинизм (ИРИ натощак 38,2 мЕд/мл, через час после нагрузки- 120,2 мЕд/мл, С-пептид натощак 10,7 нг/мл, через час после нагрузки 17,9 нг/мл, Индекс Karo - 0 32, НОМА - 20,88, Matsuda - 0,71) При лечение Сиофором до 1750 мг/сут уровень гликемии снизился до 5,4 - 9,1 ммоль/л, ACT - с 63,3

Ед/л до 39,5 Ед/л, AJIT - с 68,3 Ед/л до 56,9 Ед/л, триглицеридов - с 5,0 до 1,9 ммоль/л, уменьшение массы тела на 4,5 кг за 3 недели лечения Тяжесть состояния была обусловлена в этот период наличием сердечно-сосудистой патологии

Пациент № 5, 16 лет При обследовании по поводу избыточной массы тела -гипергликемия 25,0 ммоль/л, уровень ИРИ - 30 мЕд/мл, С-пептид натощак - 4,4 нг/мл (Индекс Каго - 0 44) При инсулинотерапии (25 ед/сут) в комбинации с Сиофором (1500 мг/сут) наблюдалось снижение гликемии до 8,0-10,0 ммоль/л

У пациента № 6, 16 лет, дебют сахарного диабета был отмечен в возрасте 12 лет и сопровождался нарастающим кетоацидозом, диагноз был выставлен в состоянии кето-ацидотической комы Инсулинотерапия в дозе 24 ед/сут, с компенсацией углеводного обмена при сохранении гиперхолестеринемии 6,2 ммоль/л, гипертриглицеридемии - 10,8 ммоль/л Через год после перенесенного гриппа резко возросла потребность в инсулине -за 2 года до 100 ед/сут При комбинации инсулинотерапии и препарата «Глюкобай» было достигнуто снижение дозы на 50%, но через 3 месяца после его отмены доза вновь вернулась к прежним цифрам В/в инъекции «Берлитиона» привели к нормализации уровней общего холестерина и триглицеридов При поступлении в ЭНЦ гликемия до 18 ммоль/л, гликированный HbAl - 14,9 %, о холестерин - 8,19 ммоль/л, триглицериды -18,0 ммоль/л, AST - 67,0 Ед/л, ALT - 42,0 Ед/л, С-пептид 9,8 нг/мл Доза инсулина составляла 110 ед/сут Назначение «Сиофора» 1000 мг в сутки сопровождалось снижением суточной дозы инсулина до 80 ед/сут, при гликемии 10-15 ммоль/л, в течение последующих 3 мес - до 60 ед/сут, гликемия 5-10 ммоль/л , уровень триглицеридов - 9,2 мммоль/л, о холестерина - 6,7 ммоль/л Диагноз синдрома Альстрема был поставлен нами ретроспективно, по наличию соответствующего симптомокомплекса, несмотря на проводимую инсулинотерапию, учитывая высокий уровень С-пептида

Из представленных данных видно, насколько сложна терапия диабета при синдроме Альстрема Терапия бигуанидами является патогенетически обоснованной, хотя повышение уровня трансаминаз затрудняет длительное их назначение в достаточной дозе Переход на инсулинотерапию не достаточно эффективен в связи с выраженной инсулинорезистентностью, что требует в этих случаях комбинированного назначения инсулина с бигуанидами

Ожирение. Низкокалорийная диета и прием «Сиофора» привели к стабилизация в весе у 5 пациентов У пациента № 4 за 3 недели лечения в стационаре было отмечено уменьшение массы тела на 4,5 кг

Дифференциальную диагностику синдрома Альстрема следует проводить с синдромами Прадера-Вилли, Лоренса-Муна Барде-Бидла, Барде-Бидла, для которых также характерно ожирение с раннего возраста

Молекулярно-генетическое исследование гена ALMS1

В 1997 году G В Colhn, JD Marshall и с соавт показано сцепление синдрома Альстрема с локусом, расположенным на 2 хромосоме В 1999 году при проведении анализа сцепления в дополнительной группе из 12 семей ими же была подтверждена локализация гена на участке 2р13 Всего в гене ALMS1 в Европейских популяциях Великобритании, Франции, Испании и США было обнаружено более 15 мутаций, которые при гомозиготном носительстве приводят к развитию синдрома Функция гена изучена не полностью, однако известно, что белок, кодируемый данным геном, входит в состав центросом, а также обнаруживается в базальной части ресничек Фибробласты с мутантным геном ALMSI формируют нормальные микротрубочки и первичные реснички - из этого факта следует, что фенотип синдрома Альстрема обусловлен нарушением не формирования, а функционирования ресничек и микротрубочек (которые необходимы для внутриклеточного транспорта)

В нашей группе больных исследованы 6 наиболее часто встречающихся в популяции европеоидов мутаций, расположенных в 8 и 16 экзонах 2 нонсенс-мутации (С10483Т; G10992A) и 4 мутации со сдвигом рамки считывания (2141delCT, 6571delTCAC, 7132insA, 10775delC)

Проведенное исследование показало следующее В семье пациента № 2 оба родители являются гетерозиготными носителями мутации 2141 delCT, пробанд унаследовал мутантные аллели от обоих родителей и является гомозиготным носителем этой мутации

В семье пациента № 1 только у матери ребенка обнаружена мутация 2141delCT, она является гетерозиготным носителем данной мутации, будучи здоровой У пробанда исследованных мутаций не обнаружено Можно предполагать, что развитее синдрома зависело от других, более редких, мутаций, нами не исследованных, а наличие у матери обнаруженной мутации явилось случайным К настоящему времени нет данных о распространенности мутаций в гене ALMS1 в общей популяции

В семьях других пациентов мутаций не найдено, что требует дальнейшего молекулярно-генетического исследования и поиска более редких мутаций гена ALMS1 Можно предполагать, что в русской популяции наблюдается другое частотное распределение мутаций, отличное от европейских данных

Выводы

1 Изучены сцепление и ассоциация с СД типа 1 двух полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области 2q31-q33 (IDDM7) в 107-ми семьях с конкордатными и дискордантными парами сибсов Обнаружено слабое сцепление с СД типа 1 полиморфного микросателлитного маркера D2S152 Не было выявлено ассоциации этого маркера с СД типа 1

2 Изучены сцепление и ассоциация с СД типа 1 пяти полиморфных микросателлитных маркеров, расположенных в хромосомной области 2q35 (IDDMI3) в 107-ми семьях с конкордантынми и дискордантными парами сибсов Обнаружено сцепление с СД типа 1 полиморфного маркера D2S137 Показана ассоциация аллеля длиной 152 пн данного маркера с СД типа 1, что позволяет отнести его к факторам повышенного риска развития заболевания

3 Изучены сцепление и ассоциация с СД типа 1 полиморфного маркера D5S2060 и однонуклеотидного полиморфного маркера С1159А в З'-нетранслируемой области гена IL-12B, расположенных в хромосомной области 5q31 l-q33 1 (IDDM18) Сцепление и ассоциация с заболеванием в данной хромосомной области не были обнаружены

4 Наиболее характерными клиническими признаками синдрома Альстрема в группе наших пациентов являются ожирение с первого года жизни, которое наблюдалось в 100 % случаев, пигментная дегенерация сетчатки, светобоязнь, тугоухость (100 %), сахарный диабет 2 типа с инсулинорезистентностью разной выраженности (100 %), нефропатия (83 %) пациентов, дислипидемия (83 %), дилатационная кардиомиопатия (17 %) Превалируют по частоте 6 классических симптомов, что согласуется с данными исследований в других популяциях ч

5 Исследование 6 наиболее часто встречающихся в Европе мутаций в гене ALMS1 позволило выявить лишь одну из них в семьях с синдромом Альстрема русского происхождения

Практические рекомендации

Родственники 1-ой степени родства больных СД типа 1 должны быть информированы о повышенном риске развития заболевания и возможности его прогнозирования и профилактики

Обследование родственников должно строиться на комплексном генетическом, иммунологическом и гормональном исследованиях В первую очередь обследованию подлежат братья и сестры больных СД типа 1, а также дети от больных родителей

При наличии у пациента ожирения с первого года жизни, пигментной дегенерации сетчатки, светобоязни, тугоухости, сахарного диабет 2 типа с инсулинорезистентностью нефропатии, дислипидемии следует заподозрить синдром Альстрема Расширение молекулярно-генетических исследований гена АЬМБ! поможет в диагностике синдрома Альстрема Лечение при синдроме Альстрема симтптоматическое Лечение сахарного диабета при синдроме Альстрема терапия бигуанидами является патогенетически обоснованной, хотя повышение уровня трансаминаз затрудняет длительное их назначение в достаточной дозе Переход на инсулинотерапию не достаточно эффективен в связи с выраженной инсулинорезистентностью, что требует в этих случаях комбинированного назначения инсулина с бигуанидами

Список публикаций

1 «Изучение ассоциации аллелей генов НЬА-ОЯВ1, НЬА-ВОВ1 и НЬА-О0.А1 с сахарным диабетом типа 1 в Вологодской популяции» (соавт Кураева, Т Л, Кашенин, М Н , Болдырева, М Н , Алексеев, Л П , Петеркова, В А , Носиков, В В , Дедов, И И)// Материалы V Съезда Российского общества медицинских генетиков, стр 216, г Уфа, Россия (24 - 27 мая 2005) Медицинская генетика, 4(5), 216 (2005)

2 «Молекулярная генетика сахарного диабета типа 1 достижения и перспективы» (соавт Носиков, В В , Кураева, Т Л , Чернышева, А , Зильберман, Л И , Савостьянов, К В , Петеркова, В А , Дедов ИИ)// Материалы V Всероссийского конгресса эндокринологов "Высокие медицинские технологии в эндокринологии", стр 40, Москва, Россия (30 октября - 2 ноября 2006 г)

3 «Изучение распределения аллелей £>£> и ВЯ генов НЬА при СД 1 типа в различных популяциях РФ» (соавт Кураева Т Л , Петеркова В А , Прокофьев С А, Алексеев Л П , Малиевский О А , Данилова Г И , Кашенин М Н , Сунцов Ю И , Зильберман Л И , Ширяева Т Ю , Иванова О Н , Южакова Т Б , Дедов ИИ)// Материалы У-го

всероссийского конгресса _ эндокринологов "Высокие медицинские технологии в эндокринологии", стр 35 (2006 г)

4 «Comparison of polymorph alleles association of gënè'/'HLA-DRBJ, HLA-DQAl, HLA-DQB1 with DM type 1 m Moscow and Yakut populations» (соавт Danilova G I., Kuraeva T L, Titovich E V , Zilberman LI, Alexeev L P , Prokofiev S A , Peterkova V A, Emelyanov AO) //Pediatric Diabetes 2006

5 «Синдром Альстрема у подростков (первое описание в России)» ( соавт Щербачева, JIH, Смирнова, Г Е, Кураева, T JI, Бровкин, А Н., Никитин, А Г , Носиков, В.В ) // (2007) Сахарный диабет, (1), 50-53

6 «Ассоциация хромосомной области 5q31 l-q33 1 (IDDM18) с сахарным диабетом типа 1 среди русских, проживающих в г Москве» (соавт Чернышева, А, Зильберман, JIИ, Савостьянов, К В , Кураева, Т Л., Петеркова, В А., Дедов И И , Носиков, В В ) (2007) Сахарный диабет, (2), 6-8

7 « Genetic analysis of putative loci located m regions lq42, 2q34-q35, 16q22-q24 and 5q33 l-q341 in Russian families with Type 1 diabetes» (соавт Nosikpv, V V, Chernyshova, A , Zilberman, LI, Kuraeva, T L, Peterkova, V A , Dedov, II)// Abstracts, of the 43th Annual Meeting of European Association for the Study of Diabetes, p S134 (Abstract 0305), Amsterdam, The Netherlands (September 17 - 21, 2007) Diab.etologia, 50[Suppl 1], p S134

8 «Ассоциация хромосомной области 2q35 с сахарным диабетом типа 1 среди русских, проживающих в г Москве» (соавт Чернышева, А, Савостьянов, К В , Зильберман, Л И , Кураева, Т Л, Петеркова, В А , Дедов И И , Носиков, В В ) // Генетика, 44(2), 232-235 (2008 г)

Заказ № 161/02/08 Подписано в печать 04 12 2007 Тираж 100 экз Уел п л 1,25

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www cfr ru, e-mail info@cfr ru

Развитие генетических методов исследования делает возможным изучение этиологических факторов не только моногенных заболеваний, но и сложных комплексных, к которым относится, в частности, и сахарный диабет. Как известно, средовые факторы провоцируют развитие диабета у индивидуумов, генетически предрасположенных к данному заболеванию.

Сегодня медицина движется по пути открытия все новых и новых генетических факторов, влияющих на риск развития сахарного диабета.

Какая цель преследуется при этом? Во-первых, изучение генетических локусов предрасположенности к диабету, выделение в пределах этих локусов конкретных генов и определение их функции, может помочь выявить тонкие молекулярные механизмы патогенеза заболевания. Вслед за этим, появится возможность разработки медицинских препаратов для лечения диабета, модифицирующих те или иные биохимические процессы, вовлеченные в патогенез болезни. Во-вторых, от индивидуальных особенностей генотипа может зависеть, например, то, какой именно из средовых факторов риска способен послужить «спусковым крючком» для развития болезни. Так, подавляющее большинство лиц с ожирением имеют ту или иную степень резистентности к инсулину, но лишь у 5-10 % из них развивается диабет. Таким образом, сведения, получаемые генетическими методами, могут способствовать лучшему пониманию роли различных средовых факторов, могущих спровоцировать развитие диабета. Отсюда следует, что обнаружение новых генетических факторов риска может помочь в формировании групп пациентов с тем или иным риском развития диабета и его осложнений, а также принять адекватные превентивные меры в таких группах (например, исключить или ослабить действие определенных средовых факторов). Сахарный диабет (СД) типа 1 является комплексным многофакторным заболеванием, т.е. предрасположенность или устойчивость к болезни, а также ее проявление определяется совокупностью множества генетических и средовых факторов. В этом его отличие от моногенных заболеваний, выполняется правило: один ген -один белок - один признак (болезнь). Причиной моногенного заболевания является мутация, приводящая к изменению структуры или концентрации белка и характерна, как правило, полная пенетрантность генотипа.

При реализации генетического картирования, часто используемого в исследованиях полигенных, многофакторных наследственных заболеваний, поиск генов-кандидатов начинают не с функции, а с хромосоной локализации. Для этого проводится детальное картирование участков сцепления на всех хромосомах человека с использованием групп полиморфных маркеров и семей с наличием заболевания у сибсов. Затем в участках показавших максимальное сцепление с СД типа 1, изучают функции конкретных генов и исследуют ассоциацию с заболеванием полиморфных маркеров в этих генах. Установление ассоциации генов с заболеванием необходимо для понимания природы процессов, приводящих к сахарному диабету типа 1, и для оценки его индивидуального и популяционного генетического риска.

Таким образом, именно выявление группы "генетических маркеров" с высокой прогностической мощностью, а также внедрение массовой профилактики СД типа 1 в группах высокого риска позволит выявлять это заболевание на ранних стадиях развития, проводить превентивную терапию и, таким образом, существенно снизить опасность развития осложнений СД типа 1. Внедрение этих подходов в медицинскую практику позволит также минимизировать немалые средства, расходуемые на медицинскую и социальную помощь больным.

Синдром Альстрема, в состав симптомокомплекса которого входит инсулинорезистентный сахарный диабет, мало изучен. В мире создается регистр таких больных, насчитывающий к настоящему времени более 350 человек. Выделен ген Синдрома Альстрема, а мутации в различных популяциях только изучаются.

Учитывая локализацию гена синдрома Альстрема на 2 хромосоме, где находятся 2 локуса предрасположенности к СД типа 1 (ЮОМ7 и ЮОМ13), нам представлялось интересным объединить эти исследования в одной работе. Тем более что в последние годы широко дискутируется вопрос о возможной роли инсулинорезистентности в развитии клинической манифестации СД типа 1, а при синдроме Альстрема СД типа 2 сопровождается инсулинорезистентностью разной степени выраженности.

Цель исследования:

1. Поиск полиморфных маркеров, сцепленных и ассоциированных с развитием СД типа 1 в локусах ЮЭМ7 и ЮОМ]3, расположенных на 2 хромосоме и ЮВМ18, расположенного на 5 хромосоме, в русской популяции.

2. Изучение клинических проявлений и спектра мутаций гена АЬМ81, расположенного на 2 хромосоме, у пациентов с синдромом Альстрема.

Задачи исследования:

1. Проведение анализа сцепления и ассоциации полиморфных маркеров, расположенных в локусах ЮОМ7, ЮБМ13 и ЮБМ18 с СД типа 1 с использованием семей с парами сибсов.

2. Изучение особенностей клинических проявлений синдрома Альстрема.

3. Проведение молекулярно-генетического исследования гена АЬМ81, определение наличия наиболее распространенных мутаций у больных в России.

Научная новизна:

Впервые в России исследованы сцепление и ассоциация маркеров, расположенных в локусах ЮБМ7, ЮВМ13 и ЮИМ]8 с сахарным диабетом типа 1. Впервые в России описаны клинические проявления синдрома Альстрема, исследованы мутации гена АЬМБ1.

Практическая значимость:

Молекулярно-генетические исследования в итоге позволяют изучить весь спектр предрасполагающих к развитию СД типа 1 генов, что приведет как к пониманию механизмов формирования СД типа 1, так и к повышению прогностических данных молекулярно-генетических исследований при СД типа 1. Изучение ассоциации новых полиморфных маркеров с СД типа 1 позволит дополнить данные об оценке риска развития СД типа 1 в русской популяции. Кроме того, оно позволит формировать группы с высоким риском развития СД типа 1. Описание клинических проявлений синдрома Альстрема будет способствовать своевременной диагностике этого тяжелого заболевания и назначению адекватной терапии. Расширение возможностей молекулярно-генетических исследований поможет в дифференциальной диагностике синдрома Альстрема.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Изучены сцепление и ассоциация с СД типа 1 двух полиморфных маркеров, расположенных в хромосомной области 2д31^33 {ЮБМ7) в 107-ми семьях с конкордантными и дискордантными парами сибсов. Обнаружено слабое сцепление с СД типа 1 полиморфного микросателлитного маркера 028152. Не было выявлено ассоциации этого маркера с СД типа 1.

2. Изучены сцепление и ассоциация с СД типа 1 пяти полиморфных микросателлитных маркеров, ■ расположенных в хромосомной области 2q35 {ЮБМ13) в 107-ми семьях с конкордантынми и дискордантными парами сибсов. Обнаружено сцепление с СД типа 1 полиморфного маркера 028137. Показана ассоциация аллеля длиной 152 п.н. данного маркера с СД типа 1, что позволяет отнести его к факторам повышенного риска развития заболевания.

3. Изучены сцепление и ассоциация с СД типа 1 полиморфного маркера О582060 и однонуклеотидного полиморфного маркера СИ59А в З'-нетранслируемой области гена И-12В, расположенных в хромосомной области 5q31.1-q33.1 (ЮВМ18). Сцепление и ассоциация с заболеванием в данной хромосомной области не были обнаружены.

4. Наиболее характерными клиническими признаками синдрома

Альстрема в группе наших пациентов являются: ожирение с первого года жизни, которое наблюдалось в 100 % случаев; пигментная дегенерация сетчатки, светобоязнь, тугоухость (100 %); сахарный диабет 2 типа с инсулинорезистентностью разной выраженности (100 %); нефропатия (83 %) пациентов, дислипидемия (83 %), дилатационная кардиомиопатия (17 %). Превалируют по частоте 6 классических симптомов, что согласуется с данными исследований в других популяциях.

5. Исследование 6 наиболее часто встречающихся в Европе мутаций в гене АЬМ81 позволило выявить лишь одну из них в семьях с синдромом Альстрема русского происхождения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Родственники 1-ой степени родства больных СД типа 1 должны быть информированы о повышенном риске развития заболевания и возможности его прогнозирования и профилактики.

Обследование родственников должно строиться на комплексном генетическом, иммунологическом и гормональном исследованиях. В первую очередь обследованию подлежат братья и сестры больных СД типа 1, а также дети от больных родителей.

При наличии у пациента ожирения с первого года жизни, пигментной дегенерации сетчатки, светобоязни, тугоухости, сахарного диабет 2 типа с инсулинорезистентностью нефропатии, дислипидемии следует заподозрить синдром Альстрема. Расширение молекулярно-генетических исследований гена АЬМБ! поможет в диагностике синдрома Альстрема. Лечение при синдроме Альстрема симтптоматическое. Лечение сахарного диабета при синдроме Альстрема: терапия бигуанидами является патогенетически обоснованной, хотя повышение уровня трансаминаз затрудняет длительное их назначение в достаточной дозе. Переход на инсулинотерапию не достаточно эффективен в связи с выраженной инсулинорезистентностью, что требует в этих случаях комбинированного назначения инсулина с бигуанидами.

КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ И СОКРАЩЕНИЙ.

Аллель — одно из возможных структурных состояний гена. Ассоциация — (здесь) генетического маркера с заболеванием, более частая (положительная ассоциация) или более редкая (отрицательная ассоциация) встречаемость определенных аллелей или генотипов генетического маркера среди больных по сравнению с популяцией. Гаплоидный набор хромосом — набор хромосом в гаметах, который равен половине диплоидного набора соматических клеток. Гаплотип — сочетание аллелей одного локуса, расположенных* на одной хромосоме.

Ген — элементарная единица наследственности, наименьший неделимый элемент наследственного материала, который может быть передан от родителей потомству как целое и который определяет признаки, свойства или физиологическую функцию организма. На молекулярном уровне — это участок молекулы ДНК, кодирующий первичную структуру белков и РНК.

Геномный импринтинг — различия в выражении (уровне экспрессии) гена в зависимости от того, от родителя какого пола унаследован данный ген.

Генотип — сочетание аллелей нескольких локусов, расположенных на обеих хромосомах.

Гетерозиготностъ — наличие разных аллелей в соответствующих локусах в диплоидном наборе хромосом.

Гомозиготность — наличие одинаковых аллелей в соответствующих локусах в диплоидном наборе хромосом. ДНК - дезоксирибонуклеинованя кислота.

Дискордантпость — несовпадение индивидов по наличию или отсутствию заболевания или любого другого признака, включая генетические.

Интроп — фрагмент гена, разделяющий экзоны, удаляемый в процессе созревания пре-мРНК и, соответственно, отсутствующий в зрелой мРНК. Конкордантность — совпадение индивидов по наличию или отсутствию заболевания или любого другого признака, включая генетические. Локус — местоположение определенного гена (его аллелей) или генетического маркера на хромосоме. мРНК - матричная (информационная РНК).

Мутация со сдвигом рамки считывания - Делеции или вставки одного или двух нуклеотидов в кодирующей области. Мутации со сдвигом рамки считывания составляют ~ 80% от всех генных мутаций. Неравновесие по сцеплению — неслучайное сочетание аллелей разных локусов в гаметах.

Нонсенс мутация - замена функционального кодона на стоп-кодон.

Ортологичные области хромосом — в данном обзоре относится к областям хромосом человека и грызунов (мышь и крыса), имеющих сходную структурно-функциональную организацию. В этих областях гомологичные гены расположены в одинаковом или близком порядке. ПААГ - полиакриламидный гель. ПЦР - полимеразная цепная реакция.

П.н., т.п.н. и ммм. — пары нуклеотидов, тысячи пар нуклеотидов и миллионы пар нуклеотидов.

Полиморфизм — многообразие нуклеотидных последовательностей, в том числе и аллельных форм гена. Полиморфным считается ген, имеющий два и более аллелей.

Пробанд лицо, с которого начинается семейное исследование. Пепетрантностъ гена — проявляемость гена. РНК - рибонуклеиновая кислота. СД- сахарный диабет.

Сибсы — общее наименование для братьев и сестер. тРНК - транспортная РНК.

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Хромосома — составной элемент клеточного ядра, являющаяся носителем генов. В основе хромосомы лежит линейная молекула ДНК. Экспрессия гена — наличие синтеза РНК (рибосомные и транспортные РНК) или мРНК (информационная РНК), а затем и белкового продукта в определенных типах клеток организма.

Экзон — фрагмент гена, кодирующий аминокислотную последовательность и остающийся в зрелой мРНК после транскрипции и нитронов при созревании пре-мРНК.

Экспрессия гена — наличие синтеза РНК (рибосомные и транспортные РНК) или мРНК (информационная РНК), а затем и белкового продукта в определенных типах клеток организма.

Этиологическая мутация (вариант) — определенный аллель конкретного гена, сцепленного с заболеванием. Часто этот аллель широко распространен в популяции, при этом сам по себе он не приводит к развитию заболевания. Однако наличие определенной комбинации этиологических вариантов в генах, предрасполагающих к заболеванию, может приводить к физиологическим нарушениям, находящим выражение в развитии заболевания.

Ядерные семьи — полные семьи с обоими живыми родителями и двумя или более больными сибсами. ALMS1 - ген синдрома Альстрема.

S-TDT — расширенный метод TDT. Позволяет анализировать сцепление с заболеванием с помощью не только биаллельных маркеров, но и полиморфных маркеров с большим количеством аллелей. Lod — десятичный логарифм величины, показывающей соотношение шансов (правдоподобия) за и против сцепления (от английского logarithm of odds ratio).

As — уровень семейной ассоциации с СД типа 1 (от английского degree of familial clustering of type 1 DM), ^s = Ясибса \ Илопуляции (6% \ 0,04% = 15).

MLS — логарифм величины, показывающей во сколько раз выше вероятность того, что данный маркер сцеплен с заболеванием (от английского maximum lod score).

МНС - главный комплекс гистосовместимости (major hystocompatibiliti complex)

IBD — идентичный по происхождению (identical-by-descent) Ig — иммуноглобулин IL - интерлейкин INS - инсулин

TDT — метод анализа сцепления биаллельного маркера с заболеванием. Основан на неравной вероятности передачи аллелей больному ребенку от родителей, гете-розмготных по данному маркеру, в том случае когда • используемый локус и гипотетический локус, определяющий развитие заболевания, сцеплены или находятся в неравновесии по сцеплению (от англ, transmission disequilibrium test).

HLA - антигены лейкоцитов человека (human leukocyte antigens)

Tsp — метод анализа ассоциации полиморфного маркера с заболеванием при наличии сцепления в этой области.

VNTR — тандемный повтор с изменяющимся числом повторяющихся единиц, каждая из которых имеет длину равную или больше 7 н.п. YAC— искусственная хромосома дрожжей.