Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсикологическое изучение алкалоидов спорыньи

'Яр ! п Я 9.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Л\ОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи ТАДЖИЕВ Мансур Азизович

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ АЛКАЛОИДОВ СПОРЫНЬИ

15.00.02 — фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

Москва — 1992 г.

'О /

Работа выполнена в Ташкентском фармацевтическом институте

Научные консультанты:

— доктор фармацевтических наук, профессор Крамаренко В. Ф.

— кандидат фармацевтических наук, профессор Икрамов Л. Т.

Официальные оппоненты:

— доктор фармацевтических наук, профессор Попков В- А.

— доктор фармацевтических наук, профессор Евтушенко Н. С.

— доктор фармацевтических наук Дементьева Н. Н.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт судебной медицины

Защита состоится /а. п. 1992 г. в часов

на заседании Специализированного совета Д-074.05.06 при Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова (г- Москва, Б. Пироговская ул., д. 2/6).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова по адресу: г. Москва, Зубовская пл., д. 1.

''/ 'О

Автореферат разослан _' =у-. / ^ '_ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета Д-074.05.06 кандидат фармацевтических наук,

доцент Н- П. Садчикова

РОССИЙСКАЯ Згд*л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в медицинской практике широко используются препараты, содержащие алкалоиды спорыньи /эргоалкалоиды/. К числу таких препаратов относятся эрготоксин, соли аргометтана и эрготамина. Имеются отдельные лекарственные Формы, в состав которых входят эргоалкалоиды: беллоид, беллатами-нал, кофетамин. Эргоалкалоиды обладают сильным фармакологическим действием и применяются при атонии матки и связанных с ней маточных кровотечениях. В определенных условиях /длительное лечение этими препаратами, передозировка, несчастные случаи, связанные с преднамеренным применением их с целью самоубийства и т.д./ эргоалкалоиды могут быть причиной отравлений.

Клинические сиштомы, патолого-анатомическая и гистологическая картины при интоксикации человека эргоалкалоидами нехарактерны и не позволяют дифференцировать состояние отравления с интоксикациями другими средствами.

Несмотря на успехи, достигнутые в области химико-токсиколиги-ческого анализа различных т;ясико^огически валных веществ, методы химико-токсикологического анализа эргоалкалоидов почти не изучены или изучены недостаточно. Никем не подвергались систематическому изучению методы обнаружения и количественного определения эргоалкалоидов в вытяжках, полученных из объектов биологического происхождения. Отсутствуют чувствительные и специфичные способы обнаружения и количественного определения эргоалкалоидов. Некоторые методы исследования эргоалкалоидов, применяемые в фармацевтическом анализе, из-за недостаточной чувствительности и неспецифичности являются непригодными для анализа. объектов химико-токсикологического исследования.

Не изучены условия выделения эргоалкалоидов из объектов био-

логического происхождения, экстракции их из водных растворов, а также способы их очистки от соэкстрактивных веществ. Отсутст-ствуют надежные методы выделения эргоыетрина, эрготамина и эрго-' токсина из различных объектов биологического происхождения. Не изучены процессы связывания эргоалкалоидов с белковыми веществами, распределение их по органам отравленных животных и сохраняемость при гнилостном разложении биологического материала.

Учитывая широкое применение эргоалкалоидов в медицине, наличие случаев отравлений этими препаратами и недостатки или отсутствие методов химико-токсикологического анализа эргометрина, эрготамина и эрготоксина, выделенных из объектов биологического происхождения, разработка методов химико-токиикологичёскогр анализа является одной из важных и актуальных проблем.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований явилось теоретическое обоснование анализа эргоалкалоидов в различных биологических объектах ; установление условий связывания эргоалкалоидов с белковыми веществами ; изучение экстракции эргоалкалоидов из водных растворов органическими растворителями в зависимости от различных факторов ; проверка существующих методик для их изолирования из биологических объектов и при необходимости создать и рекомендовать новые методы химико-токсикологического анализа эрго-алкалоидоь на основе полученных результатов УФ-спектроскопии, экстракционной фотометрии, хроматографии в тонких слоях сорбентов, электрофореза на оумаге и высокоэффективной жидкостной хроматографии, гель-хроматографии.

Для достижения указанной цели нами поставлены следующие задачи:

I. Разработать чувствительные способы идентификации исследуемых эргоалкалоидов с помощью УФ-спектроскопии, хроматографии в

тонких слоях сорбентов, электрофореза на бумаге и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Разработать чувствительные методики количественного„определения эргоалкалоидов с помощью УФ-спектрофотометрии, экстракционной фотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3. Изучить возможность применения разработанных нами методов обнаружения и количественного определения для анализа эргометрина, эрготамина и эрготоксина, выделенных из объектов биологического происхождения.

4. Изучить влияние различных факторов на степень экстракции эргоалкалоидов из водных растворов и применить полученные результаты для разработки оптимальных условий выделения эргоалкалоидов из вытяжек, полученных из биологических объектов.

5. Изучить влияние рН среды на связывание эргоалкалоидов с белковыми веществами и условия разложения образовавшихся при этом соединений.

6. Разработать оптимальные условия выделения эргоалкалоидов из объектов биологического происхождения.

7. Изучить возможность применения метода хроматографии в тонком слое сорбента и гель-хроматографии для очистки вытяжек, полученных из объектов биологического происхождения, содержащих эрго-алкалоиды.

8. На основании изучения данных литературы, экспертшнталь-ногб и экспертного материала разработать судебно-химические критерии для судебно-медицинской оценки доказательства отравлений эргоалкалоидами.

Научная новизна. Разработаны новые методы выделения эргоалкалоидов из трупного материала и биологических жидкостей. Предложены способы обнаружения и количественного определения эргоалкало-

вдов в вытяжках из объектов биологического происхождения.

Изучены условия очистки вытяжек из биологического материала, обеспечивающие удаление соэкстрактивных веществ с наименьшими потерями исследуемых эргоалкалоидов.

Впервые предложены методики идентификации и количественного определения эргоалкалоидов с помощью УФ-спектроскопии и высокоэффективной жидкостной хроматографии для исследования трупного материала.

Разработаны екстракционно-фотометрические методв количественного определения эргоалкалоидов, основанные на взаимодействии их с кислотным красителем тропеолином 00.

Показано влияние рН среды, природы органических растворителей, присутствия электролитов в водной фазе на степень экстракции эргоалкалоидов из водных растворов и вытяжек из объектов биологического происхождения.

Изучена сохраняемость эргоалкалоидов в гнилостноразложившемся трупном материале и влияние консерванта - этанола на этот процесс.

Изучено возможное распределение эргометрина, эрготамина и эрготоксина в органах й биологических жидкостях.кроликов, отравленных этими препаратами.

Практическое значение работы. На основании разработанных нами методов выделения эргоалкалоидов из объектов биологического происхождения, биологических субстратов, а также предложенных методов их обнаружения и количественного определения изданы 3 методические рекомендации: "Определение эргометрина при судебно-хими-ческих исследованиях биологических объектов". - Ташкент, 1991 г. ; "Судебно-хиыическое исследование метилэргометрина в биологическом объекте" /на узб.яз./ - Ташкент, 1391 г. ; "Изолирование, обнаружение и определение эрготамина в биологических объектах". - Ташкент,

1992 г.

Разработанные нами методы изолирования, обнаружения и определения эргоалкалоидов при исследовании трупного материала и биосубстратов включены в указанные методические рекомендации и внедрены в практику судебно-химических лабораторий бюро судебно-медицинской экспертизы Республики Узбекистан, бюро судебно-медицинской экспертизы всех областей Республики Узбекистан.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены: .

- на конференциях циклов специализации экспертов-химиков на кафедре токсикологической химии Ташкентского фармацевтического института в 1984-1991 гг. ; на Всесоюзной научной конференции "Современные аспекты создания и оценки лекарственных форм" /Баку, 1984/ ; Всесоюзном симпозиуме по химико-токсикологическому исследованию лекарственных средств ДоскЕа, 1984/ ; Научной конференции третьего гьезда фармацевтов Узбекистана /Ташкент, 1987/ ; третьем Всесоюзном, гьезде судебных медиков /Одесса,. 1988/ | конференции Научного Центра по хроматографии АН УзССР /Ташкент, 1989/ ; заседании Проблемной «миссии "Фармация" научного Совета № 10 "Фармакогнозия и фармация" № СССР /Москва, 1990/ ; Третьей научной конференции молодых ученых [ специалистов /Ташкент, 1990/ ; научно-практической конференции МЗ 'зССР и Республиканского производственного объединения "Фармация" Ургенч, 1990/ ; научно-практической конференции НИИ судебной экс-[ертизы /Ташкент, 1990/ ; I съезде молодых ученых-медиков и врачей збекистана /Андижан, 1990/ ¡научно-практической конференции рес-убликанского бюро судебно-медицинской экспертизы /1937-1990/ ; овместном заседании кафедры фармацевтической и токсикологической юлии Ташкентского фармацевтического, института /1992/.

Публикация. По ,теме диссертационного'исследования опубликовано

в открытой печати 3 методических рекомендации и 29 статей.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 288 страницах машинописного текста, содержит 68 таблиц, 26 рисунков. Работа состоит из введения, шести, глав, выводов, списка литературы, включающего 419 источников, из низ 166 на иностранных языках и приложения.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертация выполнена в соответствии с планом научных исследований Ташкентского фармацевтического института /№ государственной регистрации 01827022869/ и связана с решением союзной проблемы 10.06 'Фармация" научного Совета № 10 "Фармакология и фармация" АМН СССР, которая включена в план АН Республики Узбекистан.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. На защиту диссертации выносятся следующие результаты экспериментальных ис следований и их теоретическое обоснование: .

- теоретическое обоснование методов выделения эргометрина, эрготамина и эрготоксина из органов трупов и биологических жидкостей и способы их идентификации и количественного определения в химико-токсикологическом анализе ; методики очистки этих алкалоидов от сопутствующих веществ, условия экстракции и разделения эргоалка лоидов, находящихся в водных растворах и вытяжках из объектов биологического происхождения ; изучение связывания эргоалкалоидов с биологическим материалом и влияние рН среды на устойчивость образовавшихся при этом соединений ; изучение ориентировочного распределения эргоалкалоидов в органах животных, отравленных этими пре-

/

паратами, и их сохраняемость при гнилостном разложении биологического объекта.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность избранной теш, определены цели и задачи экспериментального исследования, показана научная новизна и практическая значимость работы для деятельности судебно-химических и химико-токсикологических лабораторий.

Обзор литературы включает общие сведения о главных алкалоидах спорыньи. Здесь же дается информация о медицинском применении эргометрина малеата, эрготамина тартрата, эрготоксина и их токсикологическом значении.

В части качественного и количественного определения эргоалкалоидов, нашедших широкое применение в медицине, приведены основные методы их анализа, используемые на практике контрольно-аналитических лабораторий, и им даны критические оценки с точки зрения химико-токсикологического исследования.

Экспериментальная часть

I. Идентификация эргоалкалоидов /эргометрина малеата, эрготамина тартрата и эрготоксина/

В литературе приводится ограниченное число цветных реакций и реакций осаждения эргоалкалоидов применительно к фармацевтическому анализу. Большинство из них являются общими. Из-за низкой чувствительности они не пригодны для целей химико-токсикологического анализа изучаемых эргоалкалоидов. Отсутствует сравнительная оценка методик обнаружения эргоалкалоидов с помощью метода хроматографии в тонком слое сорбента. Приведенные в литературе методики идентификации некоторых эргоалкалоидов методом УФ-спектроско-пии не унифицированы, указана возможность их применения для целей химико-токсикологического анализа.

В связи с этим мы изучали возможность применения высокочув-

ствительных физических и физино-хииических методов анализа для обнаружения зргоалкалоидов, выделенных из объектов биологического происхождения. К числу таких методов относятся: хроматография в тонком слое сорбента, УФ-спектроскопия, высокоэффективная жидкостная хроматография, электрофорез и др.

Метод хроматографии в тонких слоях сорбентов. Для идентификации зргоалкалоидов с помощью метода хроматографии в тонком слое сорбента мы применяли пластинки, понрытые силикагелем ЛС 5/40 /из расчета на I см^ пластинки сорбента 0,021 г силикагеля, 0,001 г гипса и 0,6 мл воды/ и пластинки "Силуйол".

Для проявления пятен зргоалкалоидов на хроматограммаХ были применены различные химические реагенты. С этой целью производились опыты непосредственно на хроматографической пластинке нанесением на нее спиртовых растворов эргоалкалоида в количестве от 0,5 до 20 мкг и после высушивания пластинки просматривали при облучении ультрафиолетовыми лучами. При этом пятна зргоалкалоидов приобретали фиолетовую окраску.

В других сериях опытов обнаружение пятен эргоалкалоидов производили опрыскиванием некоторыми реактивами: 10% раствором нитрата серебра /коричневое окрашивание/, I% раствором перманганата калия /оранжевое пятно/, раствором бихроматй калия в 20% серной кислоте /синее окрашивание/ и реактивом 0,5% раствора п-диметил-аминобензальдегида в 65%-ном растворе серной кислоты /синее окрашивание/., Для указанных проявителей определяли чувствительность способа по отношению к эргоалкалоидам.

Лолученные результаты показали, что в потоке облучения ультрафиолетовыми лучами чувствительность способа обнаружения одинакова по отношению к эргоалкалоидам. Наиболее чувствительным реактивом для проявления зргоалкалоидов в тонком слое сорбента из тэе-

активов, дающие окрашенное пятно, оказался реактив п-диметилами-нобензальдегид в 6?$-ном растворе серной кислоты /реактив Оллпор-та/.

В зависимости от применяемых детектирующих реагентов пределы обнаружения эргоалналоидов составляют: от 2 до ГО мкг эргометрина малеата, от I до 10 мкг эрготамина тартрата и от 2 до 16 мкг эрготоксина в нанесенной на пластинку пробе.

С целью обнаружения эргометрина в тонком слое сорбента наиболее преемлемой является система Р I, сотоящая из растворителей: н-бутанол, н-гексан и 25%-ный раствор аммиака /20:15:0,5/. Для обнаружения эрготамина целесообразно использовать систем № 2, состоящую из растворителей: ацетон, хлороформ и вода /3:1:0,5/, а для обнаружения эрготоксина - система № 4, состоящая из н-бу-танола, н-гексана и 25^-ного раствора аммиака /20:5:5/.

Подробные характеристики на использованные системы приведены в таблице № I.

Пользуясь указанными выше системами растворителей, удается легко разделить эргометрина малеат от эрготамина тартрата из их смеси.

С целью разделения смеси трех алкалоидов: эргометрина малеат, эрготамина тартрат и эрготоксина способом хроматографии в тонком слое силикагеля КСК целесообразно применять систему растворителей, состоящую из смеси ацетона, хлороформа и воды /3:1:0,5/. С помощью этой системы эргоалкалоиды разделяются друг от друга, имея различные значения Н£ . Последовательность нахождения пятен при использовании указанной системы следующая: эрготоксин / йг = 0,14*0,02/, эргометрин /0,32*0,02/, эрготамин/О,86±0„02/.

Для очистки вытяжек, полученных из биологического натериала и разделения эргоалналоидов целесообразно использовать изготовлен-

Таблица I

Зависимость значения эргоалкалоидов от применения различных хроматографических систем и их пределы обнаружения при использовании отдельных проявителей

Препарат : Система : : раство- : : рителей : Прояви т е л ь

Уй- облучение : Реактив Оллпорта

йг ¡Предел об-■ '-наружения, с мкг : Кг : Предел об: наружения, : мкг

I 0,61 30,0 0,61 10,0

2 0,32 20,0 0,32 2,0

Эргометрин 3 0,14 25,0 0,14 8,0

малеат 4 0,12 20,0 0,12 8,0

5 0,36 0,15 0,36 5,0

I 0,71 15,0 0,71 8,0

2 0,86- 10,0 ' 0,86 1,0

Эрготамин 3 0,42 18,0 0,42 6,0

тартрат 4 0,64 12,0 0,64 4,0

5 0,71 25,0 0,71 10,0

I 0,21 25,0 0,21 16,0

2 0,14 16,0 0,14 2,0

Эрготоксин 3 0,38 20,0 0,38 12,0

* 4 0,43 15,0 0,43 10,0

5 0,28 20,0 0,28 14,0

Система растворителей: I. н-бутайол-н-гексан-25% аммиак

/20:15:0,5/

' 2. Ацетон-хлороформ-вода /3:1:0,5/

3. н-бутанол-н-гексан-25% аммиак /10:15:5/

- 4.н-бутанол-н-гексан-25%ашиак / 20:5:5/

5. Ацетон-хлоро(Ьорм-259б аммиак- 1,4диоксан /15:45:2,5:4?/

ные пластинки, покрытые тонким слоем силикагеля ЛС 5/40, закрепленным гипсом. Для этой цели пластинки "Силуфол" из-за их малой емкости мало пригодны.

Разработанные нами условия идентификации /методом хроматографии в тонком слое сорбента/ были использованы для обнаружения эр-гоалкалоидов как в чистых растворах, их субстанции, лекарстьенных формах, так и в вытяжках из биологических объектов /трупный материал, моча, кровь и др./.

Наши исследования показали, что величиныэргоалкалоидов, выделенных из биологических и других; указанных выше, объектов , близки к величинам Яг чистых растворов этих препаратов, взятых в качестве "свидетелей".

Метод УФ-спектроскопии. Для идентификации изучаемых эргоалкалоидов применяли метод У$-спектроскопии. Согласно данным литературы, метод УФ-спектроскрпии применялся для идентификации эргоалкалоидов в чистом виде. Однако в некоторых источниках литературы приводятся противоречивые данные о характере УФ-спектров, положении максимумов на спектральных кривых, значениях удельных и молярных коэффициентов поглощения и т.д. Почти отсутствуют исследования, посвященные применению УФ-спектроскопии для обнаружения ис-гледуемых эргоалкалоидов, выделенных из биологического материала.

Для снятия спектральной-характеристики в УФ области поглощения нами использованы рэстЕоры эргоалкалоидов в 0,1 М растворе зерной, 0,1 И растворе хлористоводородной, 0,1 М растворе еинной шслот, в 0,1 М растворе едкого.натра и в этиловом спирте.

Исследованию также подвергались вытяжки, полученные из био-югического материала, не содержащего эргоалкалоидов. В качестве 1рибора использовали спектрофотометр СФ-46.

Установлено, что эргоалкалоиды в растворе с серной кислотой,

хлористоводородной кислотой, едким натром, винной кислотой и в этиловом спирте имеют характерное светопоглощение с максимумами абсорбции: для эргометрина при X = 311 нм, эрготамина при X = 314 нм, а эрготоксина при X = 240 и 320 йм. В ряде растворителей эргоалкалоиды имеют одинаковые или близкие максимумы поглощения.

Полученные результаты показали, что примени, имеющиеся в вытяжках из биоматериала после использования метода хроматографии в тонком слое сорбента с последующим элюированием алкалоидов, не мешают обнаружению эргоалкалоидов методом УФ-спектроскопии, так как максимумы светопоглощения оставшихся примесей после очистки отличаются от максимумов поглощения эргоалкалоидов. Поэтому метод УФ-спектроскопии пригоден для обнаружения эргоалкалоидов после очистки вытяжек методом хроматографии в тонком слое сорбента. Приемлемым также, как показали результаты исследований, для очистки эргоалкалоидов может быть метод гель-хроматографии.' Как показали проведенные опыты, очистка /и разделение/ эргоалкалоидов от пр> месей достигается на геле марки "Сефалекс G -15"с применением 0,02 М серной кислоты в качестве элюирующей жидкости.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Эргоалкалоиды, как показали наши исследования, могут быть обнаружены с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для этой цели был использован микроколоночный жидкостный хроматограф "Ми-лихром I-A" с УФ-спектрофотометрическим детектором. (Обнаружение исследуемых эргоалкалоидов проводили при длине волны X = 310 нм. Чувствительность детектора 3,2 единицы оптической плотности, колонки стальные /0,2-18 см/, заполненные сорбентом силасорб Cjg с размером частиц 10 мкм, скоростью движения диаграммной ленты 300 мм/мин. В качестве элюента использовали смесь ацетонитрила и фосфатного буферного раствора /рН 7,40/ в соотношении 1:1, скорость

потока элюирующей жидкости составляла 100 мкл/мин. Идентификацию эргоалкалоидов проводили по параметру /время удерживания/. -При соблюдении указанного вше условия зремя удерживания составляет: для эргометрина -1,9 мин, для эрготоксина - 4,0 мин-, для эрготамина - 5,9 глин.

Пределы обнаружения для эргометрина - 5 мкг, эрготамина -0,8 мкг и 8 мкг для эрготоксина в 10 мкл раствора эргоалкалоидов.

Разработанные условия обнаружения эргометрина, эрготамина и эрготоксина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяют не только идентифицировать эргоалкалоиды, но и обеспе-вать их разделение /см.рис.1/.

Электрофорез на бумаге. Кроме хроматографических методов исследования и метода УФ-спектроскопии для обнаружения и разделения эргоалкалоидов применяли метод электрофореза на бумаге, используя аппарат ПВЭФ-1. Носителем исследуемых веществ являлась фильтровальная бумага, Средой, в которую помещали фильтровальную бумагу, служила универсальная буферная смесь с рН 8,0 /состав смеси: 100 мл 0,04 молярных борной, фосфатной, уксусной кислот и 60 мл 0,2 молярного раствора едкого натра/ ; режим электрофореза: постоянный ток с напряжением 400 вольт, время пропускания тока 1,5 часа. После проведения электрофореза фореограмма подвергалась облучению ультрафиолетовыми лучами. Обнаруженные пятна опрыскивали реактивом Оллпорта. При наличии эргоалкалоидов появлялось голубое окрашивание. На основании измерения пути, пройденного при электрофорезе эргоалкалоидами и стандартом метилового фиолетового, рассчитывали относительную электрофоретическую подвижность исследуемых эргоалкалоидов*

Нашими опытами показано, что каждый" исследуемый эргоалкалоид

л _-1-1-1-—

О] г 4 б 8 мин

Рис.1. Разделение смеси эргоалкалоидов методе;.! высокоэффективной жидкостной хроматографии: I - ацетонитрил /растворитель/ ; 2 - эргометрин ; 3 - эрготоксин ; 4 - эрготамин

характеризуйтся электрофоретической подвижностью, свойственной каждому индивидуально /таблица 2/.

Таблица 2

Относительная электрофоретическая подвижность /ОЭП/ , алкалоидов спорыньи / п = 5 /

; Путь.пройденный при электрофорезе, см

Препарат : красителем : препаратом :

Эргометрин 9,2 10,5 1,14

Зрготамин 9,2 7,6 0,82

Эрготоксин 9,2 8,5 0,92

Ееллоид 9,2 8,4 0,91

Беллатаминал 9,2 7,5 0,81

Кофетамин 9,2 7,5 0,81

Эрготал 9,2 7,6 - ' 8,5 - 10,5 0,82-0,92-1,14

Нами изучена также возможность применения метода электрофореза на бумаге для идентификации эргоалналоидов в биологическом материале. Анализ полученных данных показывает, что злектрофорети-ческая подвижность эргоалналоидов, выделенных из биологического материала, соответствует относительной электрофоретической подвижности стандартных растворов эргоалкалоидов.

2. Количественное определение эргометрина малеата. эрготамина тартрата и эрготоксина

В фармацевтическом анализе для количественного определения эргоалкалоидов применяют несколько методов, к числу которых относятся методы титрования, флуориметрии, спектрофотометрии в УФ и видимой областях и фотоколориметрии.

При химико-токсикологическом анализе на эргоалкалоиды из объектов биологического происхождения, как правило, выделяют довольно малые количества искомых веществ, что ограничивает применение методов титрования. Поэтому методы титрования находят ограниченное применение в химико-токсикологическом анализе при количественном определении алкалоидов.

Описанные в литературе фотометрические и спектрофотометри-1еские методы определения эргоалналоидов в основном используют-зя в фармацевтическом анализе и имеют крайне ограниченное применение в химико-токсикологическом анализе. Нетод высокоэффективной шдкостной хроматографии для количественного определения эргоалкалоидов, выделенных из биологических объектов, до настоящего вре-4ени не разработан.

Учитывая вышеуказанное, для количественного определения эргоалкалоидов в трупном материале и биожидкостях нами разработаны гф-спектрофотометрический и экстракционнофотометрический методы,

а также метод высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Определение эргометрина малеата, эрготамина тартрата и эрготоксина методом УФ-спектрофотометрии

Методы, основанные на измерении светопоглощения в УФ областях, ввиду их высокой чувствительности все чаще применяются в химико-токсикологическом анализе. Эти методы в ряде случаев являются специфичными и могут быть использованы для количественного определения отдельных веществ в смесях без разделения на отдельные компоненты. Для количественного определения эргометрина малеата, эрготамина тартрата и эрготоксина в растворах методы, определения их по светопоглощения в УФ области спектра описаны в литературе. Однако эти методы для количественного определения указанных эргоалкалоидов в биологическом материале до сих пор еще не применялись

В связи с этим мы поставили задачу изучить возможность применения методов УФ-спектрофотометрии для количественного определения исследуемых наш эргоалкалоидов, выделенных из биологического материала. Вначале снимали спектры поглощения анализируемых эргоалкалоидов в 0,1 М растворах хлористоводородной, серной, винной кислот, едком натре и в этиловом спирте. Оптическую плотность растворов эргоалкалоидов измеряли с помощью спектрофотометра СФ-46 в области длин волн от 220 до 400 нм.

Учитывая характер спектров поглощения эргометрина малеата, эрготамина'тартрата и эрготоксина в различных растворителях, а также интенсивность максимумов поглощения,в дальнейших наших исследованиях в качестве растворителя был использован этиловый спирт

После определения максимумов светопоглощения спиртовых растворов эргометрина малеата, эрготамина тартрата и эрготоксина бьш определены интервалы концентраций, в пределах которых светопогло-

щение эргоалкалоидов подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера. Показано, что светопоглощение спиртовых растворов эргомет-

т а/

рина малеата при 311 нм /Ej см = 217/ подчиняется закону Бугера-

Ламберта-Бера в пределах концентраций от 5 до 120 мкг в 100 мл

раствора. Светопоглощение растворов эрготамина тартрата при 314 1%

нм /Ej см = 155/ в том же растворителе подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера в пределах концентрации от 5 до 80 мкг в 100 мл раствора. При длине волны 320 нм /Ej^CM = 126/ светопоглощение спиртовых растворов эрготоксина подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера в пределах концентраций от 5 до 90 мкг в 100 мл этилового спирта.

Удельные показатели поглощения эргометрина малеата, эрготамина тартрата и эрготоксина были использованы для расчета содержания эргоалкалоидов в спиртовых растворах и вытяжках из биологического материала. Относительная ошибка количественного определения эргометрина малеата составляет - 1,62%, эрготамина тартрата - 0,9%, эрготоксина - 1,85%.

Наш установлено, что на УФ-спектрофотометрическое определение эргоалкалоидов оказывают влияние примеси, сопутствующие эрго-алкалоидам в вытяжках из биоматериала. В связи с этим нами разработан способ очистки методом хроматографии в тонком слое сорбента и гель-хроматографии.

Метод гель-хроматографии позволяет эффективно отделить примеси от физиологически активных веществ. Очищенные таким образом вещества практически не содержат примесей, что позволяет применить инструментальные методы анализа для качественного и количественного определения эргоалкалоидов.

Изучение гель-хроыатографического распределения эргоалкалоидов проводили следующим образом: в колонку, содержащую гель сефо-

декса с -15, вносили I мл Спиртового раствора эргоалкалоида / в I мл 2 мг этого алкалоида/. После впитывания раствора гелем препарат элюировали 0,02 м серной кислотой со скоростью 0,6-0,7 мл в одну минуту. Элюат собирали фракциями по 10 мл и в каждой фракции устанавливали наличие эргоалкалоидое путем УФ-облучения. Наблюдали фиолетовое свечение. Количественное определение эргоал-калоидов в элюатах производили методом УФ-спектрофотометрии при соответствующих длинах волн для каждого эргоалкалоида.

Нашими исследованиями показано, что разделение эргометрина, эрготамина и эрготоксина достигается на- геле сефодекса ^ -15 с применением 0,02 М серной кислоты в качестве элюирующей жидкости. При указанной скорости элюирования 0^02 и серной кислотой основная масса эргоалкалоидов выходила из колонки и собиралась с 16 по 28 фракции.

На основании полученных данных была изучена возможность применения разработанных способов для анализа биологического материала. Результаты исследования показали, что очистка /и разделение/ эргометрина, эрготамина, эрготоксина от примесей достигается на геле сефодекса в -15 ; в качестве элюирующей жидкости необходимо применять раствор серной кислоты.

Экстракционно-фотометрический метод. Для разработки экстрак-ционно-фотометрического метода определения эргоалкалоидов на основании экспериментальных данных был выбран реагент - тропеолин 00. Исследуете эргоалкалоида, как и другие азотистые основания, с тропеолиноы 00 при рН=4,б дают окрашенный в желтый цвет соединения, которые хорошо экстрагируются хлороформом, а от прибавления 1%-ного раствора серной кислоты в метиловом спирте хлороформные * растворы приобретают красно-фиолетовую окраску. Изучив влияние ряда факторов на интенсивность окраски, были разработаны условия

фотоколориметричесного определения эргоалкалоидов.

В делительные воронки вносили по одному миллилитру стандартных растворов эргометрина малеата, эрготамина тартрата и эрготоксина /в I мл - I мг эргоалкалоидов/, в которые прибавляли по 5 мл ацетатной буферной смеси /рН 4,6/. К этим растворам прибавляли по 5 мл 0,1%-ного раствора тропеолина 00 и по 5 мл свежеперегнанного хлороформа. Содержимое делительных воронок взбалтывали в течение 5 минут и оставляли на такое же время для разделения фаз. После этого от водного слоя отделяли хлороформную фазу. К оставшейся в делительных воронках водной фазе снова прибавляли 5 мл хлороформа и взбалтывали 5 минут. Операцию повторяли 5 раз. Хлороформные вытяжки соединяли, прибавляли 2 мл 1%-ного раствора серной кислоты в метиловом спирте, доводили хлороформом до 50 мл. При этом жидкости приобретали красно-фиолетовую окраску. Оптическую плотность измеряли с помощью фотоэлектрокалориметра КФК-2 /светофильтр зеленый, кювета 5,032 мм/. Растворами сравнения служили хлороформные извлечения из смеси перечисленных выше реактивов.

На основании полученных данных были построены калибровочные графики, выражающие зависимость оптической плотности от концентрации эргометрина малеата, эрготамина тартрата и эрготоксина в 1 этиловом спирте.

Результаты проведенных исследований были обработаны методом математической статистики.

Данные'статистической обработки и результаты наших исследований показали, что при количественном определении эрготамина тартрата светопоглощение окрашенных растворов подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера в пределах концентраций от 10 до 80 мкг этого алкалоида в пробе. При определении эргометрина малеата и эрготоксина светопоглощение окрашенных растворов подчиняется закону

Бугера-Ламберта-Еера в пределах концентраций от 20 до 100 мкг соответствующего алкалоида в пробе. Чувствительность метода определения эрготаыина тартрата 5 мнг, эрготоксина 8 мкг, эргометрина малеата 10 мкг в 50 мл конечного объема.

Относительная ошибка экстракционно-фотометрического определения эргометрина малеата составляет - 1,40%, ошибка определения эр-готамина тартрата - 1,65%, а эрготоксина - 1,89%.

Метод, высокоэффективной жидкостной хроматографии. В последнее время довольно быстро развивается метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. В то же время работ, посвященных анализу эргоалкалоидов, в доступной литературе не найдено. В связи с этим мы разработали методику количественного определения эргоалкалоидов как в чистом виде, так и. выделенных из объектов биологического происхождения.

Для количественного определения эргометрина малеата, эргота-мина тартрата и эрготоксина в качестве прибора мы использовали микроколоночный жидкостный хроматограф "Милихром I-A" с УФ-спект-рофотометрическим детектором. Условия хроматографирования эргоалкалоидов указанным методом приведены на стр.13. Количество эргоалкалоидов определяли по светопоглощению в УФ-области спектра при длине волны эргометрина малеата 311 нм, эрготамина тартрата 314 нм и для эрготоксина 320 нм. Количественное содержание исследуемых препаратов в пробах рассчитывали по методу абсолютной калибровки.

Наш установлено, что линейная зависимость высоты хроматогра-фического пика от количества эргометрина малеата имеет место от 0,05 до 0',6 мкг этого препарата в пробе, эрготамина тартрата от 0,02 до 0,8 мкг и эрготоксина от 0,04 до 1,20 мкг в пробе.

Пределы определения: 0,05 мкг эргометрина малеата, 0,02 мкг

эрготамина тартрата и 0,04 мкг эрготоксина в 10 мкл раствора этих препаратов.

Анализ результатов количественного определения эргоалкалои-дов различными методами и их статистическая обработка показала, что из применяемых нами методов наиболее простым и точным количественного определения эргоалкалоидов является спектрофотометрический метод УФ-области, а наиболее чувствительным методом количественного определения эргоалкалоидов является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Условия экстракции эргоалкалоидов из водных растворов. Различные способы экстракции широко применяются в химической технологии, аналитической химии и в других областях техники. В химико-токсикологическом анализе метода экстракции используются для выделения токсикологически важных веществ из вытяжек, полученных при настаивании биологического материала с извлекающими жидкостями, для очистки вытяжек из объектов биологического происхождения от сопутствующих примесей, для разделения смесей многих веществ и концентрирования соединений, находящихся в разбавленных растворах, а также для экстракционно-фотометрических определений многих ядовитых и сильнодействующих веществ.

Несмотря на' широкое применение методов экстракции в химико-токсикологическом анализе, влияние различных факторов на степень извлечения эргоалкалоидов /эргометрина малеата, эрготамина тартрата, эрготоксина/ не изучено. В связи с этим нами было изучено влияние рН среды, природы органических растворителей и присутствия некоторых электролитов на степень экстракции эргоалкалоидов из водных растворов.

С целью экстракции изучаемых эргоалкалоидов мы применяли

свежеперегнанные органические растворители: хлороформ /темп.кип. 61°/, диэтиловый эфир /теш.кип.35°, бензол /темп.кип.80°/, толуол /темп.кип.110°/,н-гексан /темп.кип.68°/. рН среда создавали с помощью универсальной буферной смеси Бриттона-Робинсона, Количественное содержание экстрагированных эргоалкалоидоВ определяли спек-трофотометрическим методом в УФ-области спектра.

Результаты проведенных опытов отражены в таблице 3.

Таблица 3

Зависимость экстракции эргоалкалоидов органическими растворителями от рН среды

Препарат ! рН растворов ; Экстрагировано эргоалкалоидов /в% / органи-"! ческими растворителями

: хлоро-• форм | бензол '.диэтило-'вый эфир '.н-гексан; толуол

I : 2 : 3 : 4 : 5 : 6 : 7

Эргометрин 2,0 3,1 4,0 4,9 9,3 - - - -

5,8 40,5 - - - -

6,9 71,0 12,4 13,5 15,5 10,9

8,1 87,5 17,5 31,5 30,0 23,5

8,9 95,5 21,5 40,8 53,0 35,5

10,0 93,0 16,5 21,5 30,5 21,5

11,3 75,5. 14,8 15,5 9,8

Эрготамин 2,0 3,1 4,0 - — -

4,9 32,5 - 9,5 - -

5,8 51,3 9,8 22,5 19,4 12,5

6,9 75,0 16,2 39,7 31,0 23,7

8,1 81,5 23,5 64,5 51,3 38,5

8,9 91,5 31,2 75,0 62,5 30,0

' 10,0 87,5 27,5 71,2 67,5 40,5

11,3 77,4 16,6 57,2 52,0 23,7

Продолжение таблицы 3 I : 2:3 : 4 :■ 5 : 6 : 7

Эрготоксин 2,0 3,1 4,0

4,9 9,3 - - - -

5,8 30,5 - 14,0 21,5 7,5

6,9 75,0 12,5 41,5 32,0 15,5

8,1 90,5 32,0 55,0 62,0 20,0

8,9 96,0 24,5 68,1 75,5 33,5

10,0 97,0 16,5 51,0 62,5 23,0

11,3 '69,5 7,5 38,0 41,5 16,0

Из данных таблицы видно, что степень экстракции эргоалкалои-дов зависит как от рН среды, так и от природы органических растворителей. Эти алкалоиды экстрагируются всеми, применяемыми нами, растворителями. Наибольшее количество эргоалкалоидов экстрагируется органическими растворителями в основном из щелочной среды. Только незначительное количество экстрагируется из кислой среды. Максимальное количество эргометрина экстрагируется при {Н 9,0 хлороформом /94,0-96,1$/ и н-гексаном /52,0-54,0% /. При рН 9,0 эрготамин экстрагируется хлороформом /39,9-92,0$ /, н-гексаном /60,0-52,6^ /. Эрготоксин при рН 9,0 максимально экстрагируется хлороформом /96,0-97,6?$ /, н-гексаном /61,0-62,55« /.

Согласно данным литературы, степень экстракции многих веществ органическими растворителями Зависит от присутствия в растворах электролитов. Б связи с этим мы изучили влияние некоторых электролитов на степень экстракции эргоалкалоидов из водных растворов. Выбор этих электролитов объясняется тем, что они применяются при некоторых методах судебно-химического анализа для разрушения эмульсий или для осаждения примесей белковых веществ, перешедших в вы-

. тяжки из объектов биологического происхождения.

Проведенные нами исследования показали, что присутствие хлорида натрия и сульфата аммония в водных растворах не оказывает существенного влияния на степень экстракции эргоалкалоидов органическими растворителями.

Б связи с широким применением экстракции в химико-токсиколо-гическрм анализе в ряде случаев возникает необходимость производить расчеты количеств экстрагированного вещества или вещества, рставшегося в водной фазе после однократной или многократной экстракции. 0сутце£т8ить эти расчеты можно только на основании количественных характеристик процессов экстракции. При расчете этих характеристик мы рользовались формулами, приведенными ^.М.Корен-маном. Для расчёта экстрагированного вещества органическими растворителями согласно принятым формулам необходимо знать константу распределения /Р0/, которую трудно определить экспериментально. Нами была рассчитана константа распределения после однократной экстракции по величине степени экстракции:

т-я

где: Я - степень экстракции, у£ ;

2 - отношение объема водной фазы к объему фазы органического растворителя

Уо

где: У(5 - объем водной фазы, мл ..;

Уд - объем органического растворителя, мл.

■Для пользования этими формулами в эксперименте основной необходимой величиной является константа распределения экстрагируемых веществ того или иного органического растворителя.

Найденные нами величины /Р0/ для эргоалкалоидов при оптимальных условиях экстрагирования приведены в таблице 4.

Таблица 4

Значения константы распределения эргоалкалоидов при использовании различных органических растворителей для их экстракции из водных растворов

Препарат ; Органические : растворители ; Оптимальное: Экстрагиру.-: ; значение : ется в % : : рН среды : : Ро

I : 2 : 3 : 4 : 5

хлорофррл 9 93,5 24,64

Эргометрин бензол 9 21,5 0,27

диэтиловый эфир д 41,5 0,70

н-гексан 9 54,0 1,17

толуол 9 35,5 0,55

хлороформ 9 92,0 11,50

Эрготамин бензол диэтиловый эфир 9 9 30,0 75,0 0,42 3,00

н-гексан О 62,5 1,66

толуол 9 30,2 0,43

Эрготоксин хлороформ бензол д 9 96,5 24,5 24,0 0,32

диэтиловый эфир 9 68,1 2,13

н-гексан 9 75,5 3,08

толуол 9 33,0 0,49

Полученные данные имеют не только теоретическое, но и большое практическое значение, так как позволяют прогнозировать количества экстрагируемого вещества на каждой ступени экстракции и в сумме с использованием разных объемов растворителей.

Выделение эргометрина, эрготамина и эрготоксина из объектов

судебно-химического исследования

В химико-токсикологическом анализе одной из важнейших операций, предшествующих качественному и количественному определению эргоалкалоидов, является выделение их "из биологического материала.

До настоящего времени методы выделения эргометрина, эрготамина и эрготоксина из объектов биологического происхождения глубоко не изучены. Приведенные в литературе методики выделения эрготамина из биологического материала имеют ряд недостатков. Не учитывается соосаждение эргоалкалоидов с примесями белковых веществ и продуктами их разложения.

В результате проведенной нами сравнительной оценки выделения изучаемых эргоалкалоидов с помощью методов Стаса-Отто, A.A. Васильевой и В.Ф.Крамаренко было установлено, что эргоалкалоиды выделяются в незначительных количествах /9,10-20,60%, 26,У2-70,61%, 18,20-48,80/, соответственно/.

Вопрос о потерях различных веществ при выделении их из объектов биологического происхождения является одним из сложных вопросов химико-токсикологического анализа. Потери этих веществ, выделяемых из биологического материала, мсгут зависеть От ряда факторов: несовершенства методов выделения исс-ледуеснх эргоалкалоидоЕ, применения неподходящих извлекающих жидкостей для изолирования их из объектов биологического про- • ксхождения, неправильного выбора условий очистки от примесей,

сорбции исследуемых эргоалкалоидов осадками примесей и от связывания исследуемых эргоалкалоидов с биологическим материалом и т.д. В связи с этик! мы изучили влияние отдельных факторов на выход эргоалкалоидов из объектов биологического происхождения в химико-токсикологическом анализе.

С целью решения вопроса о связывании эргоалкалоидов с биологическим материалом применяли метод равновесного диализа. Нашими исследованиями показано, что белковые вещества, находящиеся в трупном материале, связываются с исследуемыми эргоалкалоидами при рН 7,0-9,0. Установлено, что при рН 9,0 связывается около 58% эргометрина, 53& эрготамина и 60% эрготоксина. Причем, с повышением рН среды степень связывания эргоалкалоидов с биологическим материалом увеличивается. Образовавшиеся соединения исследуемых эргоалкалоидов с биологическим материалом разлагаются при рН 2,0-4,0. При рН 4,0 связывается 20% эргометрина, 11,296 эрготамина и 8,8$ эрготоксина. Процесс разложения возрастает с понижением рН и достигает максимума при рН 2,0.

Кроме этого, мы установили, что на выход эргоалкалоидов из объектов биологического происхождения влияет анионный состав кислот, применяемых для подкисления извлекающих жидкостей, а так- ' же зависит от природы извлекающих жидкостей.

На основании изучения влияния различных факторов на степень выделения эргоалкалоидов из биологического материала, нами предложен новый метод выделения, основанный на настаивании биологического материала со смесью ацетона и воды. Предложенный метод пригоден для выделения эргоалкалоидов из органов трупов, крови и мочи.

В качестве извлекающей жидкости для изолирования эргоалкалоидов из исследуемого материала использовали смесь, состоящую

из ацетона и воды в соотношении 5:3. Настаивание биологического материала проводили 3 раза. Объединенные водно-ацетоновые вытяжки вносили в колбу аппарата для перегонки жидкостей и ацетон отгоняли при 6П°С до полного его удаления. Водную фазу, оставшуюся в колбе, подкисляли 10% раствором щавелевой кислоты до рй 2,5 и экстрагировали 3 раза по 15 мл хлороформом. Полученные хлороформные вытяжки объединяли и испаряли до сухого остатка. Затем кислые водные вытяжки подщелачивали 25/°-ным раствором аммиака до значений рН, при которых наблюдается максимальная экстракция исследуемых эргоалкалоидов /рИ 8,0-9,0/ и взбалтывали с хлороформом по 20 мл 3 раза. Содержание изучаемых эргоалкалоидов, выделенных из биологического материала, после хроматографической очистки определяли спектрофотометрическим методом.

Из данных таблицы 5 следует, что эргоалкалоиды при настаивании смесью Ацетона с водой /5:3/ извлекаются в больших количествах по сравнению с другими проверенными нами методами /56,4077,20% /.'

Нами также проведены исследования по изучению сохраняемости эргоалкалоидов в биологическом материале, который подвергается гнилостным изменениям. Проведенные опыты показали, что значительная часть эргоалкалоидов исчезает при гниении биологического материала. Консервирование биологического материала 95^ этиловым спиртом увеличивает сроки сохранения эргоалкалоидов до 45' суток.

Из известных нам литературных данных, алкалоиды.и фармацевтические препараты, поступившие в организм, неравномерно распределяются в органах и биологических жидкостях. С целью химико-токсикологического анализа необходимо брать те органы и биологические жидкости, в которых содержится сравнительно большое количество исследуемых эргоалкалоидов.

Таблица 5

Сравнительная оценка ыетодов выделения■вргоалкалоидов из биологичеокого материала

Название .О^КТЫ

Г "помдо-пгепарата ^^

Стаоа- Отто

Вндолзно аргоалкалоиза различными методами . %_

Спомошьюпред-

А.А.Ваоильевой

В.Ф.Крамаранко : л око иного нами

Эргометрин печень 9,10-10,70 кровь моча

26,92-35,64

18,20-24,70

56,40-59,60 50,20-54,40 57,85-59,72

Эрготамин печень 17,80-20,60 кровь ыоча

62,90-70,61

42,80-48,60

69,80-77,20 53,10-57,47 71,52-77,85

G3 О

Эрготокоин печень 10,80-12,90 крзвь моча

42,20-49,60

35,60-39,20

60,50-64,30 49,10-5*,27 62,78-65,46

Результаты изучения распределения эргоалкалоидов в тканях и биологических жидкостях кроликов, отравленных алкалоидами, показали, что в качестве объектов исследования для химико-токсикологического анализа следует брать желудок с содержимым, печень, толстый и тонкий кишечник, кровь и мочу, а также мышцы, изъятые в области инъекции.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Впервые научно обоснованы и предложены принципы методологического и экспериментального подхода к решению вопросов химико-токсикологического анализа эргоалкалоидов в биологических объектах в субстратах /кровь, моча/.

2. Для обнаружения эрго'метрина, эрготамина и эрготоксина в фармацевтических препаратах /лекарственных формах/ разработаны методы, основанные на УФ-спектроскопии, хроматографии в тонких слоях сорбентов, флуоресценции и электрофорезе на бумаге, обеспечивающие цели химико-токсикологического анализа.

3. Разработанные методы обнаружения эргоалкалоидов могут быть использованы для анализа вытяжек, полученных из объектов биологического происхождения после их предварительной очистки методом хроматографии в тонком слое сорбента или гель-хроматографии.

4. С помощью методов хроматографии в тонком слое сорбента, высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза на бумаге эргоалкалоиды могут быть обнаружены при их совместном присутствии.

5. Показана возможность обнаружения эргоалкалоидов /эрго-метрина, эрготамина и эрготоксина/ в сложных смесях /беллоиде, беллатаминале, кофетаыине/, в рожках спорыньи и пищевых прОдук-

тах с помощью вышеуказанных способов.

- б. Для количественного определения эргометрина, эрготами-на и эрготоксина при анализе объектов биологщеского происхождения разработаны УФ-спектрофотометрия и экстракционно-фотомет-рический метод, базирующийся на реакции с тропеолином 00.

7. Для количественного определения эргометрина, эрготами-на и эрготоксина при исследовании биологических объектов предложен чувствительный специфический метод высокоэффективной жидкостной' хроматографии.

8. Изучены условия экстракции эргоалкалоидов из водных растворов. Установлено, что степень экстракцщ зависит от рН среды, природы органических растворителей, природы и концентрации электролитов в водной фазе. Указанные алкалоиды экстрагируются как из кислой, так и щелочной среды. Однако большие количества этих эргоалкалоидов экстрагируются из щелочной среды. Присутствие в водной фазе электролитов не оказывает зайетного влияния на экстракцию эргоалкалоидов.

9. Предложен способ расчета экстракционных равновесий при извлечении эргометрина, эрготамина и эрготоксина в водной фазе органическими растворителями /степень экстракции и коэффициента распределения/.

10. При помощи метода равновесного диализа установлено, что связывание эргометрина, эрготамина и эрготоксина с белками происходит при рН выше изоэлрктрической точки белковых веществ, и разрушение копплекса при рН 2,0-4,0.

11. Проведена сравнительная оценка методов выделения эргоалкалоидов методами Стаса-Отто / в виде современной модификации/, А.А.Васильевой и В.Ф.Крамаренко.

12. Разработан новый метод выделения эргометрина, эрготами-

на и эрРотоксина из объектов биологического происхождения, основан ный на изолировании эргоалкалоидов скесью ацетона с водой /5:3/, который позволяет определить 58,04% эргометрина, 69,80% эрготамина и 62,0% эрготоксина.

13. Рекомендованы способы изолирования, обнаружения и определения эргоалкалоидов при анализе биологических жидкостей методом изолирования смесью ацетона с водой /5:3/. Этот метод обеспечивает выделение и определение из крови эргометрина 53,10%, эрготамина 55,39%, эрготоксина 51,88%. Из мочи позволяет выделять эргометрина 58,43*!, эрготамина 74,54% и эрготоксина 64,19%.

14. Установлено, что эргоалкалоиды сравнительно быстро разлагаются в органах трупов при их гниении, через 35 дней они в объекте не обнаруживаются. Консервирование объекта этиловым спиртом пролонгирует сохраняемость эргоалкалоидов до 45 суток.

15. Изучено распределение эргометрина, эрготаютна и эрготоксина в органах и бидлогических жидкостях кроликов, отравленных эргоалкалоидами. Для решения вопроса об отравлении эргоалка-лоидами следует направлять на химико-токсикологическое исследование следующие объекты: желудок с содержимым, толстый и тонкий кишечник с содержимым, печень, кровь и мочу, а также мышцы, изъятые в области инъекции эргоалкалоидов.

Список опубликованных работ, отражающих основное содержание диссертации

1. Таджиев М.А., Икрамов Л.Т., Сафрыгина И.И. Реакции обнаружения эрготала, эргометрина и идентификация их в тонком слое сорбента // Современные аспекты создания и оценки лекарственных форл: Тез.докл.Всесоюз.науч.конф. - Баку, 1984.- С.158-159.

2. Таджиев М.А. Обнаружение эргометрина при исследовании

биологического материала // Всесоюз.симп.по химико-токсикологическому исследованию лекарственных средств: Сб.науч.тр. - М., 1984.- С.54.

3. Таджиев М.А., Саидвалиев А.К. Экстракция алкалоида эрго-ыетрина из водных растворов в зависимости от рН среды // Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств: Сб.науч.тр. - Ташкент, 1987.- С. 39-43.

4. Таджиев М.А., Миющев А.Г. Идентификация эргометрина в тонком слое сорбента // Ш съезд фармацевтов Узбекистана: Тез.докл. -Ташкент, 1987,- С.128-129.

5. Таджиев М.А., Икрамов Л.Т. Сохраняемость эргометрина при гнилостном разложении трупного материала // Ш съезд фармацевтов Казахстана: Сб.науч.тр. - Алма-Ата, 1987.- С.62.

6. Таджиев М.А. Сохраняемость метилэргометрина в биологическом объекте //'Современные лабораторные методы исследования судебно-медицинских объектов: Сб.науч.тр. - Ташкент, 1988.- С.61-65.

7. Таджиев М.Д., Икрамов Л.Т. Сохраняемость эргометрина в биологическом объекте // Криминалистика и вопросы судебной экспертизы: Сб.науч.тр. - Ташкент, 1988.- С.54-56.

8. Таджиев М.А., Икрамов Л.Т. Изолирование эргометрина из биологических объектов // Всесоюз.съезд судебных медиков: Сб. науч.тр. - Одесса, 1988,- С.270-271.

9. Таджиев М.А., Икрамов Л.Т. Сравнительное изучение методов изолирования эргометрина в трупном материале // Суд.-мед. экспертиза. - 1989.- К» 2. - С.30-31.

10. Таджиев М.А. Экстракция эргометрина из водных растворов з зависимости от рН среды // Современные лабораторные методы исследования судебно-медицинских объектов: Сб.науч.тр. - Ташкент, [969. - С.61-65.

11. Таджиев M.A., Икрамов JI.T; Спектрофотометрическое определение алкалоида эрготамина // Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств: Сб.науч.тр. -Ташкент, 1990. - С.47-48.

12. Таджиев М.А., Мирхаитов Т. К вопросу об анализе метил-эргометрина в фармпрепаратах // Повышение качества лекарственного обеспечения населения и учреждений здравоохранения республики: Тр.науч -практ.конф. - Ургенч, 1990.- C.II5-II6.

13. Таджиев М.А. Новые методы обнаружения и определения эрготамина в фарманализе // Там же. - С.110-112.

14. Таджиев М.А. Определение эрготамина в биологических объектах // Суд.-мед.экспертиза. - 1991.- IP 4.- С.42-44.

15. Таджиев М.А, Идентификация метилэргометрина в малых количествах // Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств : Сб.науч.тр. - М., 1991.- Т.2, 4.2.- С.49-50.

16. Таджиев М.А., Икрамов Л.Т. Методические рекомендации по определению эргометрина при судебно-химических исследованиях биологических объектов. - Ташкент, 1991: МЗУзССР.- 12 с.

17. Таджиев М.А. Идентификация эргоалкалоидов высокоэффективной жидкостной хроматографией //I съезд молодых ученых-медиков и врачей Узбекистана: Тез.докл. - Андижан, 1991.- С.423-433.

18. Таджиев М.А. Химико-токсикологическое изучение алкалоидов спорыньи // Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств : Сб.науч.тр. - Ташкент, 1991.-С.26-27.

19. Таджиев М.А., Икрамов Л.Т. Сравнительная оценка методов выделения метилэргометрина из биологического материала // Там не. - С.24-25.