Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование клофелина

1 .«■ г 1;

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР Ленинградский химико-фармацевтический институт

На правах рукописи

САЕБ'АМАД СЛВЙМАН ШЛЖО-ТОКСККОЛОШБСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛО<ШИНА

15.00.02 - фармацевтическая хамя и фармакогнозия

■ АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой огепени кандидата фармацевтических наук

ЛЕНИНГРАД 1991

Работа выполнена на кафедре фармацевтической химии Ленинградского химико-фармацевтического института ».

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент БУГОВ Е.С.

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор М01ДАВЕР Б.Л.

доктор медицинских наук, доцент БАБАХАНЯН Р.Б.

Ведущая организация: Каунасская медицинская академия

Защита оостоитоя и| ноября 1991 года в (/ часов на заседании специализированного Совета К 0980201 в Ленинградском химико-фармацевтическом институте (197376, Ленинград, уд,проф.Попова, 14 ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотека ЛХФИ.

Автореферат разослан " /Г " октября ' 1991 года

Ученый секретарь /"'

Специализированного Совета, /и « . , ^ доцент _>/ Д.А.Николаева

ЦКГКПН

^ г 1,1, ¡;1Ш

м^тдциЛ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последи;, з годы одной из особенностей химико-токсикологического анализа в СССР является значительное увеличена числа случайных и преднамеренных отравлений клофеляном, который широко применяется в качества антиги-пертензивного средства и в офтальмологической практике при леченая больных глаукомой.

Случайные отравления клофелшом обусловлены пере'дгзи-ровкой, индивидуальной гиперчувствательностыо, а .такяе неосторожностью я халатным отношением к его хранению, что нередко является причиной интоксикация детей.

Преднамеренные острые отравления клофеляном имеют,главным образом, криминальный характер и совершаются с целью приведения человека в беспомощное состояние и последующего совершения преступлений над личностью, в том числе грабежей, изнасилований и т.д. "По данным Всесоюзного научного центра ле-■ чения отравлений НИИ скорой помощи им.Н.В.Склифосовского число острых отравлений клофеляном увеличилось с 0,2? от всех отравлений в 198? г. до 14,3$ в 1969 г. в основном за счет применения раствора клофелина с криминальной целью.

Таким образом, клофелян имеет химико-токсикологическое значение. Вместе.о тем до настоящего времени судебно-медицинская экспертиза смертельных и не смертельных с давлений клофеляном представляет определенные трудности, связанные как с установлением факта отравления, так и отсутствием специфических клинических признаков отравления и эффективных мзтодик определения клофелина в биологическом материале.

В литературе отсутствуют данные об оптимизации жидкость-жидкостной экстракции клофелина из водных растворов, не изучены методы выделения препарата из биологического материала я методы счистки извлечений. .

Недостаточно разработаны методы обнаружения и количественного определения клофелина, пригодные для целей химико-токсикологического анализа.

Отсутствуют данные о распределении клофелина в органах и тканях человека и животных пра приеме токсических доз,

а такяе не изучен вопрос о сохранявшем препарата в трупном материала при его гнилостном разложения.

Учизываа ш>рокое применение в медицина, наличие случаев отравления, в том числе а со смертельным исходом, а также отсутствие методических рекомендаций по исследованию биокате-раала на присутствие клофелина, следует считать, что разработка методов выделения, очистки, обнаружения а количественного определения этого лекарственного препарата в органах трусов и биологических жидкостях "вляется одной из актуальных проблем современного химико-токсяколомчаского анализа.

Цель и задачи исследования. Целка наших исследований является разработка методов выделения клофелина из объектов биологичессого происхождения, обнаруяения и количественного определения этого препарата, пригодных для хидако-токсиколо-гического анализа.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить' следующие основные задачи:

- разработать чуаствигелыше мр^одяки идентификация клофелина с помощьв различных фотометрических, хроматографачески х и химических методов;

- разработать чувствительные методики количественного определения клофелина с применением УФ-спектрофотометрии, • газояидкостяой (ИХ) г высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЗВД;

- изучать пригодность разработанных методов-обнаружения и количественного определения дяя анализа клофелина, выделенного »1 объектов биологического проиохоадения;

- определить оптимальные условия хидкосгь-шадкосгной экстракции клофелина из водных растворов; .....

- провести сравнительную оценку методов выделения клофелина из объектов биологического происховдения; ......

- изучить распределение Н3 -клофелина в органах и-ткаш-х крыс при внутривенном и пероральном введения препарата;

- изучить ооурайяемооть кдофелиьа в Трупном материале при его гниении.

Научная ловизна работы. Разработаны методы выделена:-клофелина из органов трупов и биологических яидкостей (кровь, моча). Для идентификации клофелина в вытяжах аз объектов биологического происхоадения предложены методам хроматографии в тонких слоях сорбента, газо-аздкостяой и высокоэффективной жидкостной хроматография, спактрофотометряи в видимой и ультрафиолетовой областях спектра. Для количественного определения кло-фе-ляяа, выделенного из биоматзриала, разработаны спектрофотомет-ряческий, газо-хроматографическяй метода и метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Изучено вдаянво рН среды, природы органических растворителей и присутствия электролитов в водной фаза на степбнь экстракции клофелина из водных растворов и вытяхек яз объектов биологического происхождения. Впервые предложены миярокрясталлоскопяческие реакции клофелина о пикриновой и пикролоновой кислотами. С применением радлоязотспного метода изучено распределение Н3-клофелина в органах, тканях а биологических жидкостях крыс при внутривенном и пероральном введении препарата. Впервые изучена сохраняемость препарата в трупном материале при его гнилостном разложении.

Практическое значение работы. Разработанные методики выделения клофелина из биологического материала, методы его идентификации и количественного определения могут использоваться ь практика ездвбно-хамичвеких лабораторий при решении вопроса об отравлении препаратам клофелина. Прздлогешше методика изолирования, осларуяения а определения клофелина з биологических жидкостях могут быть использованы в химико-токсиколога-ческих лабораториях для диагностики острых отравлений, а тачка для выбора системы и контроля эффективности двтоксихаиясн-ной терапии.

Методики идентификация и количественного определения клофелина хроматографи тоники и фотометрически;« методами !.х-гут быть использованы в фармацевтическое анализе лекарственных форм клефелпка.

Данные по распределение клофелина з органах, тканях я биожидкостях грыо могут быть использована еудебао-мадйшшскрил экспертами для обоснованного забора биологического уаг.'разля для проведения оудабно-химячосгсях ясследованпЛ. Результаты

экспериментальных данянх до сохраняемости клофелина в трупном материале могут быть использованы судебно-медацинскдаи экспертами для определения целесообразности проведения судебно-хями ческой эксперг-йзы биологического материала на присутствие клофелина в зависимости от сроков захоронения трупа, разработанная матодика выделения, обнаружения и определения клофелина в биологическом материала внедрена в практику Ленинградской химико-токсикологической лабораторий, а также в учебный процесс ИХ®. По результатам выполняемой работы получено 2 рацпредложения.

Апробация работ. Основные результаты диссертационной работ доложены на Всесоюзной конференции "Результаты и перспективы научных исследований по биотехнологии и фармации" (Ленинград, 1989 г.), на заседании кафедры фармацевтической химии ЛИИ (1990), на научно-практической конференции "Актуальные вопросы фармацевтической науки и практика" (Ленинград! 1990 г.), на Всероссийской научно-практическо.' конференции "Резервы совершенствования лекарственного обеспечения населения РСФСР" (Владимир, 1991 г.), на совместном заседании кафедр фармацевтической химии и фармакогнозии ЛХФИ (1991. г.).

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. ' Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ЛХФИ (JS государственной регистрации 01860073351), тематикой научных исследований по Всесоюзной проблеме "фармация", научного Совета № 10 "Фармакология и фармация" АМН СССР.

Публикации. По теме.диссертационной работы опубликовано 3 научных работы и 3 работы приняты в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на/ страницах машинописного техста. Она состоит из введения, 6 глаз выводов, описка литературы, включающего 259 источников, из которых 122 работы на иностранных языках., я приложения. Работа иллюстрирована 29 таблицами и 35 рисунками.

В первой глава приведен обзор литературы по методам фармацевтического и химико-токсикологического анализа препаратов клофе дича. Показана необходимость использования для вдентифв-

кации и количественного определения вещества высокочувствительных физико-химических методов анализа, определены осговнь*. направления экспериментальной работы.

Во второй главе приведены используемые в экспериментальной работе материалы, аппаратура и методы исследований.

Третья глава посвящена методам обнаружения а количественного определения клофелана, звделенного из бяоматераала. Установлены оптимальные условия проведения химических, фотометрических и хроматографаческих методов анализа и необходимость их применения в зависимости от конкретной экспертной задачи.

В четвертой главе приведены результаты исследований по оптимизации жидкость-яидкостной экстракции клофелина из водных растворов. Проведена сравнительная оценка методов выделения вещества'из биоиатариала и разработаны методики, обеспечивающие максимальное извлечение клофелина из биотканей и биожидкостей.

Пятая глава посвящена изучении распределения Н3-клофелина в органах тканях крыс при внутривенном и перорадьном введении меченого вещества, изучена сохраняемость клофелина в загнавшем трупном материале.

В главе шестой приведен сястематичесЕай ход исследования вещественных доказательств, направляемых на химико-криминалистический анализ при подозрения на отравление клофелином.

На защиту диссертации выносятся следующие результаты экспериментальных исследований и их теоретическое обоснование:

- методы выделения клофелина из органов трупов, крови и

мочи;

- методы идентификации и количественного определения клофелина, пригодные для химико-токсикологического анализа;

- распределение Н3-кло$елияа в органах и биологических жидкостях крыс;

- сохраняемость клофелина в трупном материала при его гнилоотном разложения;

- химико-криминалистический анализ вещественных доказательств при подозрении на отравление клофелином.

СОДВРЯЛШЗ РАБОТЫ

Клофелин (гемитон? кдонидан, катапресан, 3 Т-1Б5) в химической отношении представляет собой 2- (2,6-дахлорфениламино)-имядазолин^' гидрахлорид

В фармацевтическое анализе для идентификации клофелина . применяются осадительные'и цветите реакции. Однако из-за низкой чувствительности, неспецифичности и малой доступности пред-лояенчых реактивов она не пригодны д;;я целей химико-токсикологического анализа. .

Особенностью химико-токсикологического анализа клофелина является низкий уровень концентраций в биожидкостях, органах и тканях даже при приеме токсической дозы препарата. Это вызывает необходимость применения для обнаружения и определения клофелина в биологическом материале высокочувствительных физико-хишческих методов анализа, к числу которых относятся хроматография в тонком слое сорбента, гаэожадкостная а высокоэффективная жидкостная хроматография, У£5- и ЙК-спектроскопяя и др.

Хроматография в тонком слое сорбента

Исследована хроматографическая подвижность клофелина-основания в 16 системах растворителей. При этом использовалась как одномерная, так и двумерная варианты восходящей хроматографии на пластинках "Силуфол -11У-254", !'Армсорб ТСХ КСКГ УФ-254" и "Алуфол".

Детениию клофелана проводили в УФ свате, йодней камере, реактивом Драгендорфа или раствором нингидрина. По результа-та<л исследования подвижности клофелина-оонования в однокомпо-

М'

I. Идентификация клофелина

нентных састел. ; растворителей построены "хроматографпческпе диаграммы", позволяющие конструировать новые систеш для получения оптимальных значений препарата.

Для идентификации клофелша и других производных имидэзо-лина (нафтизин, галазолин) нам рекомендована 7 сисгем растворителей, в том числе - I. метанол-25$ раствор аммиака (100:1,5), 2.• хлороформ-ацетон (1:9), 3. хлороформ-метаиол-ацетон (7:2:1), 4. бензоа-диоксая;-2555 раствор аммиака (60:35:5). Значение клофелина в указанных системах на пластинках "Силу фол ^-254" составляло 0,60; 0,62; 0,76; 0,34 соответстзенко. Предал обнаружения клофелина в зависимости от условий хроматсгра$ароэаняя составляет от 7 до 15 гаг в пробе.

Газожядаостяая хроматография ТНХ)

Разработаны условия Г2Х клофелина на высокотемпературных жидких фазах различной поляркости, а, именно: силиконы ОУ-17, ДС-550, ХВ-60,5Е-30, эластомер 3-301 (рис. I). Условия хро-матографированяя: хроматограф марки ЛХМ-80-МД-10 ят "Цвет 530", колонки стальные (1000x4 мм) дли стекляные (1000x4 ¡ал), детектор ионизационно-пламенный, скорость газа-носателя гелия -30 мл/мин, водорода - 30 мл/мин, воздуха 300 мл/мин. Скорость ленто протяжного механизма 720 т/ч. Температура термостата колонок 150 + 250°, окорость подъема температуры 16° С/ман. Идентификация клофелина проводилась по относительным временам удерживания, используя в качестве стандарта сябазон. Б таблице I представлены £:зультаты газохроматографического анализа клофелина, а таете других производных швдаэолана -нафтизина и галазолина, являющихся объектами химикс-токсикологического анализа.

Таблица I

Газохроматографический анализ некоторых производных имидазолина

Неподвижная жидкая фаза я носитель Относительное время удерживания

клофелин галазолин нафтизин

I. 5% S3-30 на хроматонэ N-AW- ЖСБ (0.16-0.20 мм) 0,52(6Х)х 0,40 0,47

2. Ъ% ДС-550 на хроматона U (0,20-0,25 мм) 0,65(80) 0,45 0,52

3. Ъ% ХЗ-60 на хроматоне ti -AW- ДМС5 (0.20-0,25 мм) 0,55 (65) — -

4. 45SOV-I7 на Gas СЬиот Q. (60 - 80 меш.) 0.59(103) - -

5. Ъ% S 301 на хроматоне N -AW-ÄMCS (0,20-0,25 мм) 0,44(105) - -

х- в скобках указано абсолютное время удерживания слбазогш

в мм

Для повышения степени надежности идентификации клофелина показана необходимость проведения анализа.извлечения из биоматериала на 2-х колонках различной полярности с последующим построением двойной логарифмической зависимости относительных времен удерживания на анализируемых насадках.

Предел обнаружения клофелина-основания на исследуемых колонках составлял 0,02 - 0,04 мкг/5 мкл раствора. В связи о тем, что в кдофедине-субстанции имеется допустг -ая примесь 2,6-дихлораналина (ДХА), применяемого в качестве исходного вещества при синтезе препарата, нами разрабо""^ условия разделения смеси этих соединений методом Г|Х. Оптимальное разделение ДХА и к Целина на колонке о неподвижной жидтой фазой 0V-I7 достигалось при температуре колоши Ю0°С. Время.удерживания ДХА - 90 мм. После выхода пика "ХА газо-хромаюгре^и-ческий анализ продолла) я в режиме программироь-лвя до 250° со скоростью 25° С/мин. Вр.змя удерживания клофелина в этих условиях составляет 47 мм.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭдСХ)

Нами разработана метод ка идентификации клофелина на жидкостных хроматографах марки ",7!ялихром-2" и "Мялихром-4" с УФ-спектрофотометрическим детектором. Обнаружение препарата в элюатах проводили про длине волны 270 или 260 нм. Чувствитель ность детектора 0,1 единиц оптической плотности, колонки стальные (64 х 2 мм), заполненные сепараном С^ с размером частиц 5 мкм. Скорость движения диаграммной ленты 300 мм/час. В качестве элюирующей жидкости использовали смесь 40$' апето-нитрила на фосфатном буфере рН = 6,1 (рис.2 ) или смесь аие-тонитрил - вода (£5:15). Объем пробы 6 мкл. Скорость пропускания элюента 50 мкл/мин. Идентификацию клофелина проводили по времени удерживания. Предел обнаружения 0,02 мкг в 5 мкл раствора.

Рис.1. Хроматограмма смеси производ- Рис,2.Высокоэф1'ектиБкая

ных ямидазолина при использовании неподвижной кидкой фазы Б£-30:

1 - хлороформ (растворитель),

2 - галазолин, 3 - нафтизин,

4 - клофелия, 5 - сибазончстандарт).

жидкостная хроматография клофелина-гадрохлоридаЦ), кло^елина-осношкия (2) на колонке сепарон С^.

УФ-опектр*. ¿отоме тряя

Клофелия в вод«, и в 0,1 моль/л растворе соляной кислоты имеет два максимума поглощения при 271 и 27Ь нм, которые обу-

словлены наличием дихлорфениламянового радикала, находящегося в сопряжении с имидазолиповым циклом. Нами определены удельные показателя поглощения кдофелина при 271 и 278 нм, величина которых в воде составляет 19,6 ± 0,62 и 17,27 + 0,4 и в 0,1 моль/л растворе соляной кислоты 20,31 ± 0,27 и 17,08 ± 0,42 соответственно.

Учитывая величину А^см клофелика в этих растворителях, можно сделать заключение о невозможности его количественного определения этим методом а лекарственных формах, и тем более в извлечениях из биоматериала, г~.е концентрация клофалина может быть значительно меньше.

В то же времл в 0,1 моль/л раствора едкого натра кло$влян имеет максимум поглощения при 250 нм (А^ = 182,1 + 2,0),что объясняется, по-видимому, образованием натриевого производного клофелина и уменьшением ауксохромного эффекта аминогруппы ароматического кольца. Нами показана возможность идентификации производных ямядазолина методом УФ-спектроскоши, ¿ак как в 0,1 коль/д растворг соляной кислоты клофелик имеет поглощение при Л = 271 и 278 нм, нафтизин~2Ь0 нм,галазол^н-265 нм.

Микрокристаллические реакция

Нами предложены 2 новые микрокристаллические реакции клофе-лина с пикриновой и пвкролоновой кислотами. С пикриновой кислотой клофелин образует после нагревания и последующего охлаждения призматические кристаллы (открываемый минимум 45 мкг, предельное разбавление 1:1110), а с пикролоновой кислотой - сфероиды (откры-ваамый минимум - 30 мкг, предельное разбавление 1:1660).

Учитывая относительно низкую чувствительность, микрокристал-лоскопяческие реакции рекомендованы нами для идентификации клофалина в лекарственных формах (таблетки, глазные капли, ампулиро-ванные растворы), выступающие достаточно часто в качестве вещественных доказательств при подозрении на отравление клофеланом.

2. Количественное определенна кпофвппна

¡.дзожидкостная хроматография

Количественное определение клофалина проводили на отечественном приборе марки ЛЖ-8 МД-10 модель на колонка с неподвижной

жидкой фазой £>В-30 в условиях, которые разработаны нами для обнаружения препарата. Определение концентрации проводили мето~ дом внутреннего стандарта (0,01$ раствор сябазона в хлороформа) по калибровочному графику или расчетным способом, используя поправочный коэффициент клофелина по сабязону, величина которого определялась экспериментальным путем. Предел определения клофелина 0,1 мет в. 5 мал раствора.

Высокоэффективная кидкостная хроматография

Количественное определение клофелина методом ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе марки "Милихром-2". Условия хрома-тографического определения приведены лри описании способов идентификации препарата. Содернаняе клофелина в исследуемых пробах рассчитывали по методу абсолютной калибровки, "инейная зависимость высоты пика от концентрации препарата наблюдается а интервале 0,04 - 0,5 мкг вещества в пробе. Предел определения 0,04 мот э 6 мкл раствора.

УО-спектрофотометрия

Разработан метод количественного определения клофелина спектрофотоме трическвы методом при 250 нм в 0,1 моль/л раствора едкого натра. Расчет концентрации клофелина в объекте исследования проводили по калибровочному графику и по удельному показателю поглощения. Соблюдение основного закона светопоглощения наблюдалось в интервале 0,05 до 6,0 мкг препарата в пробе. Предел определения - 0,5 иг.

Фотоэ яектроко лориметрия

Фотометрический метод количественного определения клофелина основан на реакции с нитропрусоидом натрия в палочной среде.' Расчет содержания ^ащества в исследуемой пробе проводили по удельному показателю поглощения, величина которого нами установлена экспериментально и составляет 501,4-2,9. Подчинение закону Бугера-Ламберта-Бера наблюдается в интервале концентраций 0,2 -1,2 мг/мл, предел определения 200 мкг клофелана в пробе.

3. Оптимизация условий жидкость-жидкостной • экстракции (ИЭ) клофелина из водных растворов

Изучено влияние рН среды, природы органических растворителей а присутствие некоторых электролитов на степень экстракции клофелина из водных растворов. Необходимое значение рН раствора, из которого производилась экстракция, создавали с помощью универсальной буферной смеси Бряттона-Робинсона и контролировали потанциоматрически. В качестве экстрагентов исследовала хлороформ, гексан, диэтиловнй эфир, этилацетат, бензол. Количественное определение клофелина проводили фотометрическим методом по реакции"с нитропруссидом натрия.

На основании экспериментальных данных установлено, что клофелин экстрагируется веема растворителями (за исключением гексана) как из кислой, так и из щелочной ■ среды (табл.2). Наибольшее количество клофелина экстрагируется хлороформом при рН = II (67,2$), а наименьшее гексаном (2,4%). При рН = 7 экстрагирующая способность исследуемых растворителей по отношению к клофелину уменьшается в ряду: хлороформ>этилацетат>бензол'> диэтиловый эфир > гексан, что полностью соответствует шкале полярности растворителей по Снайдеру. Однако, при рН = II наблюдается некоторое несоответствие шкале полярности в отношении бензола и этилацетата, что, отчасти, может быть обьяснено лучшей растворимостью этилацетата в воде (более чем в 400 раз), а также -ним, чем при рн = 7 механизмом взаимодействия кдофелин-экстрагант.

Таблица 2

Влияние экстрагента ¡: значения рН среды на полниту извлечения клофелина из водных растворов (%)

на Экстрагент Значение рН

2 4 7 9 II

I. Хлороформ 2,4 2,4 66,4 79,2 67,2

2. Этилацетат 4,0 4,8 46,4 62,4 64,6

Гексан 1.6 1Л 2,4 2,3 2,4

4. Бензол 1.6 1.6 32,0 75,0 73,6

5. Дизтидовый эфир 0.5 3,0 12.8 30,4 24,8

При изучении влияния электролитов на степень экстракции клофелина из воднмх растворов установлено, что введение в буферный раствор с рН = II хлорида натрия и- сульфата аммония в концентрации 5$ приводят к уменьшению (всалнзанию) выхода препарата. 3 то ае время сульфат натрия (5$) почти не влияет на степень экстракции клофелина.

Таким образом, оптимальными условиями 31Э клофелина из водных растворов является извлечение хлороформом при рН = II. Эти условия были использованы при изучения сравнительной оценки методов выделения клофелина из биологического материала.

4. Выделение клофелина из биологического материала

Проведена сравнительная оценка методов выделения клофел:-на из биологического материала общими и частными методами,которые наиболее часто используются в судебко-хяшческих лабораториях при определении лекарственных веществ. На основании полученных экспериментальных данных нами установлено, что подкисленным спиртом (метод Стаса-Отто) изолируется только 0,0 -6,6$ , подкисленной водой (метод А.А.Васильевой) 13,1 - 15,8/5 и 9,2 - 9,9$ (метод В.Ф.Крамаренко). С целью увеличения выхода клофелина из биоматериала разработан метод извлечения -еще-ства подкисленным ацетонитрилом.

• Ацетонитриа является растворителем, хорош*, смешивающимся с водой*и обладающий полярностью, сопоставимой с полярностью этанола и еоды. Преимущество применения ацетог'трила в качестве экстрагента заключается в том, что он хорошо проникает в клетки тканей и не образует плох разделимых эмульо. .. Показано, что подкисленный аиетонитрил поз^ляет выделить из биоматериала до 4Ь$ препарата, что более чем в 3 раза превышает выход препарата по методу А.А.Васильевой.

Для выделения клофелина-из биологических яидкостей на® применен метод прямой экстракции хлороформом при рК = II, позволяющий изолировать из крочн 20.9$, а из мочи - 33,1$.

Нами установлено, что в извлечениях, полученных из биотканей и органов любым из перечпеленньь.методов,содержится зна-

читзльноз количество соэкстрактявкых веществ. Применение о целью очистка извлечений метода реэкотракцаи, извлечение гекса-яом при рЕ л 7 я др. ни увенчалось успехом. в то же время использование метода хроматографии в тонком слое сорбента в система Оелзсл-диоксан-25^ раствор аммиака (60:30:5) с последующим элюирсваняем клофелина с хроматогр~фической пластинки метанолом позволяло достаточно быстро и надежно очистить препарат от веществ, мвшатанах определению клофелина.

5. Изучение распределения Н3-клофелина в органах, тканях и биологических жидкостях животных

Изучение распределения Н3-клофедина, синтезированного в НПК ЛХФИ, проводили радиолзогопным методом при внутривенном и дерорадьном введения клофелина из расчета 80 мкг меченого препарата на 140 г массы крысы-самца или 20,БмкКи на 140 г массы крысы в печени, почках, селезенке, желудке, кишечнике, легких, сердце, головном мозге, мышечной ткани и крови через 15 мин. 2 час. а 6 час. после соответствующего способа введения вещест-ва.5* Содержание меченого клофелина регистрировали из расчета на I г ткани анализируемого объекта, а также рассчитывали его содержание а целом органе (рис. 3). При внутривенном пути введения через 16 мая наибольшее количество Н3-клофелина отмечено в пэчеая, почках, легких. Через 2 часа отмечено почти 2-3 кратное снижение содержания меченого препарата в печени и легких, обусловленное, по-видимому, усилением е-т метаболизма или элиминацией яз этих органов.

Содержание препарата б таких органах как почки, желудок, кяиечпик и в мышечной ткани сохраняется примерно на одном уровне в интервал,. 15 мин - 2 час. и в значительной степени снижается через 6 часов после введения изотопа. В крови на всех сроках исследования отмечен сравнительно низкий уровень препарата. В моче высокий уровень радиоактивности отмечен уже через 20 мин.

* - Изучение распределения н3-кпофелина в органах и тканях крыс производилось на кафедра биохимии ШИ (зав. кафедр ей - профессор В.П.Комов ) при нашем участии.

после введения препарата. К 40 мин. содержание препарата з моче снижается в 2,5 раза и достигает максимальных значений по уровню радиоактивности я 4 час., а через 7 час. скитается в 9 - 1С раз

При пероральаом введении препарата распределение Н3-злофеия-на в органах крыс резко отличается от распределения изотопа при внутривенном введении. Через 15 мин посла введения препарата максимальный пик радиоактивности отмечая в желудке и кишечнике. Для печени, почек, селезенки, мышца легких, сердца максимально е накопление препарата отмечено к 2 чао. полна введения, в крози при данном пути введения препарата довольно высокий уровень радиоактивности сохраняется в интервале 2-4 час., а в моче в течение 24 - 26 час.

Таким образом, при пероральном пути введения клофелина на химическое исследование необходимо направлять кровь, мочу, желудок, кишечник,-печень, почки и легкие, а при внутривенном пути введения - кровь, мочу, головной мозг, печень, почки, легкие.

При изучении элиминации Н3-клофелина с мочой установлено, что при внутривенном введении препарата, где основная масса клофелина выводится с мочой в течение 7 час., при пероральноа введении довольно высокий уровень радиоактивности з моче сохраняется в течение 24 - 2о час:

При изучения метаболизма клофелина, меченого по фениявному и идидазолиновому циклам с применением ВЭЕС и ТСУ установлено, что. в интервале 3-6 час. после внутривенного введения препарата последний выеодится с мочой в нематаболиздрованиой форме.

6. Сохраняемость клофелана в загнавшем трупном материале

Выделение клофелина из гнилостно измененного бномзтеряа-ла проводили по методике, основанной на изолировании его аце-тонитрилом-, подкисленным серной кислотой. Установлено, что через 2 недели хранения печени концентрация клофелина уменьшается на 29,4$ от определяемого количества препарата в не загнившем биоматериалв, через 2 месяца на 69,2$, через 4 месяца хра-

ЛКгМО-5

да-ю-5

15 <1

1.

ю ! 1:;".;

I

1 >• '

1 .1-

-1 'А

I г -ь ?•• I

} Н_

г-!" I {• ! .

| К'-, г . л & -А I

I М--»--"-" ¡-чЧ»-,

[тг; та

I шт Ыа.

(а)

->М '•» 4—

¿1.

1

К-*-.

15

п -0,25 час.

ы 1

-2 час.

-ь час.

_3 '4 5 ё 7

Рис.3 Распределение Н^-клоФелина в органам и тканях крыс через 0,25, внутривенном (а) и пероральном (б) введении

I-печень, 2-почки, 3-селезенка, 4-желудок, 5-легкое, 6-сердце, 7-голэвной мозг

6 7 и 6 чясов при

ОрГйЯЫ

нанял печена определяется Есаго 2,4$ клофелина. Таким образом, через 4 месяца после захоронония трупа проведение судебко-химического исследования с целью определения клофелина нецелесообразно, ввиду почти полного его разложения.

7. Хиьако-криминалйсмческий анализ вещественных доказательств пря подозрении на отравление клофелином

Судебно-следственные органы при Еозбуздения уголовного дела в связи о преднамеренным отравлением нередко направляют а криминалистические и судебко-хвмячесяие лаборатории в качестве вещественных доказательств твбик-яапельнвцы из-под глазных капель, ампулы, таблетки, остатки жидкостей, напитков и др. для определения в .последних клофелина.

Эти де объекты исследования вместо о биояидкостямл достаточно часто направляются в рамках скорой помощи на химическое исследование в хшико-токсйкологячвские в наркологические лаборатории при поступлении в клинику больных о предположительным диагнозом - отравление клофелином.

Анализ вещественных доказательств в таких случаях необходимо провести в кратчайшие срока для того, чтобы установись причину отравления, провести эффективную антидотную терапию больному, снять подозрение о обвиняемого и, наоборот, подтвердить версию следствия об использовании препаратов клофелина в качестве отравляющего вещества.

Объектами исследования явились глазные капли клофелина (0,125$, 0,25$, 0,5$), инъекционный раствор (0,1$), 0,1$ раствор нафтизина, с,1$ раствор галазолина, 1$ раствор пилокарпина гидрохлорида,-3$ раствор эфедрина гидрохяорада. Для доказательства лекарственных веществ в этих вещественных доказательствах нами использовались физико-химические методы, обладающие высокой чувствительностью, экспрвссностью, достоверностью, такие как рефрактометрия, УФ- и ИК-саектроскопид, газо-нядкостная и тонкослойная хроматография, цветные и микрокристаллические реакции.

Нами разработан систематический ход исследования перечне-

денных лекарственных форм, позволяющий без каких-либо подготови-Тсльннх операций (экстракция, концентрирование) в кратчайшие сроки получат*, достоверные результаты. 5 основу систематического хода исследования вещественных доказательств положен метод исключений. Полученные экслэршентальнне данные позволили составить настолько схе:». анализа вещ ственных доказательств на пр?.суто?в£е клофелина, о применением которых выполнено более 50 эдслэртяз, в том числе для Ленинградского областного бюро судебно-медицинской экспертизы,городской химико-токсикологиче-CKOii лаборатории, органов суда и следствия.

ОБИШ ВЫВОДЫ

1. Анализ данных литературы, материалов центров печения отравлений показывает резкое увеличение в последние годы случайных у. преднамеренных острых отравлений клофелином, что позволяет считать химико-токсикологическое исследование клофели-не весьма актуальным.-

2. Разработана комплексная методика обнаружения клофеляна, выделанного из объектов биологического происхождения, пригодная для пелей хямико-токсяк^логяческого анализа, включающая в себя УФ— в ИК-спектроскопию, хроматографию в тонких слоях сорбента, газожидксотную и высокоэффективную жидкостную хроматографии.

3. Разработана схема химико-криминалистического анализа 5ещ«стз'бнных доказательств, поступающих ча экспертизу при подозрении на отравление клофеляном.

Последовательное применение Уф-спектрофотометрии,рефрактометрии, тонкослойной я газожидкостной хроматографий, цветных и микрокристаллических реакций позволяет в течение 5-10 минут идентифицировать клофеляк, галазолин, нафтизин, эфедрина гкдрохлорзд, пилокарпина гидрохлорид/

-4. Для обнаружения клофелина в лекарственных формах (таблетки, глазные капли) впервые разработаны микрокристаллические реакции с пикриновой (предел обнаружения 45 мкг, предельное разбавление 1:1110) и пи крало новой (предел обнаружения 30 мкг, предельное разбавление 1:1660) кислотами.

5. Для количественного определения клофелина в вытяжках из биологического материала разработаны чувствительные методики газожидкостной я высокоэффективной жидкостной хроматографий. Предел определения методом ГЗХ - 0,2 ккг в 2 мкл и методом ВЭ2Х - 0,1 мкг в 6 мкл раствора.

6. Проведена оптимизация жидкость-жидкостной экстракции клофелика из водных растворов. Установлено, что при рН = II экстрагируется около 90$ вещества.

7. Разработан новый метод выделения клофелина из объектов биологического происхождения, основанный на изолировании егс подкисленным ацетонитрилом. С помощью этого метода можно ввде-лить 43,4 - 48,6 % клофелина. Для препаративной очистки клофе • лина, изолированного из биоматериала, предложена тонкослойная хроматография на пластинках "Силуфол" в системе бензол-диоксан-25$ раствор аммиака (60:35:5).

6. Изучено распределение Н3-клофелина через 0,25, 2 и 6 часов в органах и тканях крыс после внутривенного в перорально-го введения меченого препарата. Результаты исследования позволили заключить, что при целенаправленном исследовании трупного материала на наличие клофелина ь судебно-химические лаборатория следует направлять желудок , кишечник, печень, почки, легкие и мочу.

■ 9. Клофелин разлагается в биологическом материале при его гниений;'В биоматариале через 4 месяца можно обнаружить только 2,4$ клофелина.

10.Результаты исследований внедрены в практику Ленинградской химико-токсикологической лаборатории. Разработаны методические, указания по изолированию, обнаружению и определению клофелина в биологическом материала.

• ОСНОВНЫЕ ГОЛОНЙНИЯ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ

I. Саеб Ахмад Слейман, В.С.Бушуев, С.Н.Никифорова /Судабно-

химическая экспертизма вещественных доказательств на присутствие

клофелина // Результаты и 'перспективы научных исследований по

биотехнологии и фармации. Тез. докл. Всесоюзной конференции -Л.: 1969. - С.ЬО.

2. Саеб Ахмад Слейман, Е.СЛзушуев /Определение примеси 2,6-дихлоранилина в клофедине методом газокидкоотной хроматографии JJ Резервы совершенствования лекарственного обеспечения населения РСФСР. Тез.докл. научно-практической конференции - Владимир. 1991 - С.70-71. > . ;. >

3. Саеб Ахмад Слеймая» Е.С-Булуев'/О возможности применения газожидкостной хроматографии для доказательства клофелина в биологических'жидкостях // Актуальные;.проблемы, судебно-медицинской токсикологии. Л.: 15Э1,- С.89-91.• V

'fti'ib

-ШК 8.352 ?Л:йС Г.,&."Беош»*ыо.

I . ■ ' ■■ '•>/> ' » • - • • . - • ■