Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование нимесулида и близких по структуре соединений

На правах рукописи

ГЕРАСИМОВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НИМЕСУЛИДА И БЛИЗКИХ ПО СТРУКТУРЕ СОЕДИНЕНИЙ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 / ИЮЛ 2014

Курск- 2014

005550580

005550580

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор Шорманов Владимир Камбулатович доктор биологических наук, профессор Сипливая Любовь Евгеньевна

Официальные оппоненты:

Саломатин Евгений Михайлович - доктор фармацевтических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздрава России, лаборатория судебно-химических и химико-токсикологических научных и экспертных исследований, судебный эксперт (химик) высшей квалификационной категории

Сливкин Алексей Иванович - доктор фармацевтических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет», фармацевтический факультет, заведующий кафедрой фармацевтической химии и фармацевтической технологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (РУДН)

Защита состоится «10» октября 2014 г. в 12-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, д.З).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, www.kurskmed.com/diss2/load/uploads/cbc97e8.pdf

Автореферат разослан «// » ци^МА^- 2014 г.

Ученый секретарь днссертацнонного совета

•Овод Алла Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Нимесулид (Ы-(4-нитро-2-феноксифенил)-метансульфонанилид) применяется в медицине как нестероидное противовоспалительное лекарственное средство. Близкими по структуре к нимесулиду являются 4-нитроанилин (базовая структура), М-(4-амино-2-феноксифенил)-

метансульфонанилид и М-(4-метансульфониламино-3-феноксифенил)-ацетамид (метаболиты нимесулида), 4-нитро-2-феноксианилин (фармакопейная примесь нимесулида), М-(4-гидрокси-2-феноксифенил)-метансульфонанилид (вновь синтезированное вещество).

Рассматриваемые соединения токсичны для теплокровных и человека. нимесулида для крыс при внутрижелудочном введении, например, составляет 200 мг/кг, 1ЛЭ100 4-нитроанилина - 600 мг/кг. Токсичность данной группы веществ чаще всего сопряжена с нарушением функций печени и почек.

Зарегистрированы частые случаи летального отравления человека нимесулидом и 4-нитроанилином. Отравления ими могут происходить в процессе производства веществ, при попадании их в атмосферу и сточные воды предприятий, при приёме завышенных доз или суицидальных попытках.

Широкое применение нимесулида и 4-нитроанилипа, их токсические свойства, наличие случаев отравлений с летальным исходом обуславливают необходимость изучения этих соединений в химико-токсикологическом отношении. Для более надежного доказательства отравлений нимесулидом необходимо изучение его близких структур, в том числе и его метаболитов как потенциальных объектов химико-токсикологического анализа.

Степень разработанности темы исследования. До настоящего времени недостаточно разработаны вопросы изолирования рассматриваемых веществ из биоматериала, их очистки, обнаружения, идентификации и количественного определения. Недостаточно изучены закономерности их распределения в теплокровных организмах. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемых веществ в трупном материале.

Исходя из вышеизложенного. разработка методик химико-токсикологического исследования нимесулида и близких по структуре соединений является актуальной.

Цель исследования. Целью настоящего исследования является разработка методик химико-токсикологического анализа нимесулида и близких по структуре соединений.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• провести подбор условий синтеза из нимесулида рабочих стандартных образцов 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-З-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА и определить условия их очистки;

• установить структуру и содержание основного вещества в полученных субстанциях;

• изучить особенности электронных, колебательных и ЯМР 'Н спектров объектов исследования;

• определить характер хроматографической активности исследуемых веществ в тонких слоях и колонках различных сорбентов при использовании методов ТСХ, макроколоночной хроматографии низкого давления, ВЭЖХ и ГХ-МС;

В

• изучить распределение исследуемых веществ в системах из несмешивающихся жидкостей;

• исследовать особенности изолирования объектов изучения из биологического материала настаиванием с изолирующими агентами различной химической природы и различного состава, разработать схемы очистки извлечений;

• изучить распределение исследуемых веществ в органах и биожидкостях теплокровных животных;

• определить сроки сохранения рассматриваемых веществ в гнилостно-разлагающемся трупном материале.

Научная новизна. Определены оптимальные условия синтеза из нимесулида рабочих стандартных образцов 4-Н-2-ФА, 4-МСА-З-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА и предложены схемы их очистки. Изучены особенности поглощения анализируемыми веществами УФ-, видимого и ИК-излучения. Исследованы ЯМР 'Н-спектры данных структур.

Изучены особенности масс-спектров изучаемых веществ, полученных методом электронного удара. Показана возможность селективного и высокочувствительного определения данных соединений по совокупности характеристических сигналов осколков молекулы в масс-спектре и времени удерживания в капиллярной колонке при идентификации методом ГХ-МС.

Определены оптимальные условия и рассчитаны параметры хроматографирования исследуемых веществ методами ТСХ, ВЭЖХ и макроколоночной хроматографии низкого давления в условиях применения нормальнофазовых и обращеннофазовых сорбентов.

Разработаны методики идентификации и количественного определения объектов исследования спектральными и хроматографическими методами.

Выявлены основные параметры и условия очистки нимесулида и близких по структуре соединений от соэкстрактивных веществ биоматериала методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии.

Впервые обосновано применение ацетона в качестве универсального изолирующего агента для извлечения нимесулида и близких по структуре соединений из биоматериала. На основе использования ацетона как изолирующего агента и очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в тонких слоях и колонках сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и биожидкостях, приемлемые как для исследования свежего, так и гнилостно-измененного трупного материала.

В эксперименте на животных (крысы) исследованы особенности распределения рассматриваемых веществ в организме теплокровных.

Изучена сохраняемость рассматриваемых отравляющих агентов и их трансформация в гнилостно-разлагающемся трупном материале в зависимости от температурного режима и продолжительности сохранения.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты химико-токсикологического исследования нимесулида и близких по структуре соединений позволяют расширить знания о химических и физико-химических свойствах анализируемых веществ. Полученные данные составляют основу для разработки и внедрения в практику методик химико-токсикологического анализа изучаемых веществ. 4

На основании проведенных исследований разработаны два варианта практических рекомендаций к проведению химико-токсикологических исследований при отравлении отдельными производными 4-нитроанилина и нимесулидом.

Внедрены и апробированы результаты работы:

методика идентификации нимесулида и его метаболитов (4-амино-2-феноксифенилметансульфонамида и 4-ацетиламино-2-феноксифенилметан-сульфонамида) методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета (акт внедрения № 32 от 21.09.12 г.); методика очистки нимесулида и его метаболитов (4-амино-2-феноксифенилметансульфонамида и 4-ацетиламино-2-феноксифенилметан-сульфонамида) методами жидкость-жидкостной экстракции и нормальнофазовой колоночной хроматографии внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета (акт внедрения № 31 от 21.09.12 г.); методика изолирования 4-нитроанилина и нимесулида из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрией внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии им. H.H. Бурденко (акт внедрения № 62 от 17.04.12 г.); методика изолирования 4-нитроанилина и нимесулида из крови, плазмы крови и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрией внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии им. H.H. Бурденко (акт внедрения № 63 от 17.04.12 г.); методика концентрирования и выделения в чистом виде нимесулида и 4-нитро-2-феноксианилина из растворов методом колоночной хроматографии низкого давления внедрена в учебную и научную работу кафедры биологической и химической технологии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения № 48 от 25.05.12 г.); методика концентрирования и количественного определения нимесулида и 4-нитро-2-феноксианилина методом хроматоспектрофотометрии внедрена в учебную и научную работу кафедры биологической и химической технологии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения № 49 от 25.05.12 г.); методика изолирования нимесулида, 4-нитроанилина и 4-нитро-2-феноксианилина из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрией апробирована в экспертно-криминалистическом центре УМВД по Орловской области (акт апробации № 3 от 01.06.12 г.); методика изолирования нимесулида, 4-нитроанилина и 4-нитро-2-феноксианилина из мочи и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрией апробирована в экспертно-криминалистическом центре УМВД по Орловской области (акт апробации № 4 от 01.06.12 г.).

Методология и методы исследования. Методологической составляющей диссертационного исследования стали фармакопейные статьи предприятия, а также труды отечественных ученых [Шорманова В.К., 2004; Зайцевой A.C., 2012].

В диссертационной работе использованы химические (титриметрия), физико-химические (ядерно-магнитный резонанс 'Н, спектрофотометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография и газовая хроматография,

жидкостная колоночная хроматография низкого давления, жидкость-жидкостная экстракция).

Основные положения, выносимые на защиту:

• условия синтеза из нимесулида 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-З-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА и особенности очистки указанных соединений;

• особенности поглощения анализируемыми веществами электромагнитного излучения в УФ-, видимой, ИК-областях спектра и резонансного поглощения радиочастотной электромагнитной энергии (ЯМР 'Н);

• результаты исследования хроматографического поведения рассматриваемых соединений в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями;

• методики идентификации и количественного определения рассматриваемых веществ методами хроматографии, фотометрии и хромато-масс-спектрометрии;

• результаты исследования особенностей очистки исследуемых веществ методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии;

• методики изолирования объектов исследования из тканей органов и биожидкостей на основе настаивания с ацетоном и очистки от соэкстрактивных веществ биоматериала;

• распределение анализируемых соединений в организме теплокровных животных и сохраняемость исследуемых соединений в трупном материале.

Степень достоверности н апробация результатов. Достоверность полученных результатов обусловлена использованием современных и высокотехнологичных методов исследования. Значительный объем проведенных исследований отражен в виде таблиц, графиков и рисунков. Достоверность разработанных методик количественного определения изучаемых веществ подтверждается путем их валидации и статистической обработки по требованиям ГФ XI с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2013».

Основные положения работы представлены и доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Традиции и инновации фармацевтической науки и практики» (Курск, 2011 г.), на итоговых научных конференциях сотрудников КГМУ «Университетская наука: Взгляд в будущее» (Курск, 2011 г., 2013 г.), на IV, V и VI всероссийских научно-практических конференциях с международным участием: «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2011 г., 2012 г., 2013 г.), на IV Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2011 г.), на Всероссийской научно-практической интернет-конференции с международным участием «Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм» (Курск, 2011 г.), на XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011 г.), на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы судебно-медицинской экспертизы» (Москва, 2012 г.), на 77-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2012 г.), на V Международной научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2013 г.), на IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой (Уфа-Абзаково, 2013 г.). 6

Связь залач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 36 РАМН и научной проблеме 35.04 «Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии, токсикологической и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер госрегистрации 01201157804.

Публикации. Содержание работы отражено в 36 публикациях, 6 из них в журналах, рекомендуемых ВАК к опубликованию материалов диссертационных исследований. Имеется 1 положительное решение о выдаче патента.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2, 3, 4, 5 и 6), выводов, списка литературы, приложения, изложенного на 154 страницах. Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 17 рисунков. Библиографический список состоит из 246 источников, в том числе 151 - на иностранном языке.

В автореферате используются следующие сокращения: 4-А-2-ФФМСА -М-(4-амино-2-феноксифенил)-метансульфонанилид; 4-Г-2-ФФМСА - N-(4-гидрокси-2-феноксифенил)-метансульфонанилид; 4-НА - 4-нитроанилин; 4-Н-2-ФА - 4-нитро-2-феноксианилин; 4-МСА-З-ФФА - М-(4-метансульфониламино-3-феноксифенил)-ацетамид; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ГХ-МС - газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием; ДМСО - диметилсульфоксид; ДМФЛ - диметилформамид; ПК -инфракрасный; НД - нормативный документ; НФ-ВЭЖХ - нормальнофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; НФ-Кл - нормальнофазовая жидкостная колоночная хроматография; НФ-ТСХ - нормальнофазовая тонкослойная хроматография; ОФ-ВЭЖХ - обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; ОФ-Кл - обращеннофазовая жидкостная колоночная хроматография; ОФ-ТСХ - обращеннофазовая тонкослойная хроматография; ТСХ - тонкослойная хроматография; УФ - ультрафиолетовый; ФСП - фармакопейная статья предприятия; ЯМР - ядерно-магнитный резонанс; ЬГ)<0 - полулетальная доза вещества; 1ЛЭюо - смертельная доза вещества.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы: нимесулид (НМС), субстанция, НД N 012824/03040411, дополнительно очищенный перекристаллизацией (1Г1Л= 148-149 °С); 4-нитроанилин (4-НА) ч.д.а. ТУ-6-09-258-87; синтезированные и очищенные образцы 4-нитро-2-феноксианилина (4-Н-2-ФА); 4-амино-2-феноксифенилметансульфон-алилида (4-А-2-ФФМСА); 1^-(4-метансульфониламино-3-феноксифсиил)-ацет-амида (4-МСА-З-ФФА); Ы-(4-гидрокси-2-феноксифенил)-метансульфонанилида (4-Г-2-ФФМСА); нитразепам (НТЗ), субстанция, ФСП-0034632105 (дополнительный объект исследования). Применены методы ТСХ, макроколоночной хроматографии низкого давления, ВЭЖХ, электронной и ИК-спектрофотометрии, ГХ-МС, ЯМР 'Н. Методики определения разработаны на модельных смесях с известным содержанием определяемого вещества. Результаты обрабатывались в соответствии

с установленными требованиями с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel».

Синтез рабочих стандартных образцов. На основе нимесулида, по методикам, разработанным в нашей лаборатории, были синтезированы 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-З-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА (рисунок 1).

4-Н-2-ФА (2) получен в результате кислотного гидролиза нимесулида (1). Наиболее приемлемым оказалось использование серной кислоты как наиболее сильного гидролизующего агента. Во избежание образования побочных продуктов окисления и перегрева реакционной смеси использована серная кислота 60%, обладающая температурой кипения близкой к температуре плавления (148-149 °С) гидролизуемого нимесулида, что обуславливает малое время синтеза 4-Н-2-ФА (35 минут). Продукт очищен перекристаллизацией и колоночной хроматографией, кристаллизован из ацетона, представляет собой желто-зеленый кристаллический порошок, 1^=114-116 °С. УФ (этанол) Whm 209,8 (lg е 4,33), 262,4 (lg е 3,80), 376,1 (lg £ 4,13); ИК (KBr) »Wcm'1 1025, 1155, 1263, 1336, 1516, 1587, 3198, 3236, 3350, 3473; ЯМР 'Н (300 МГц, ДМСО-дб) 8 6,26 (с, 1Н), 6,82 (д, 1Н), 7,46 (т, 2Н), 7,52 (с, 1Н); Масс-спектр (m/z) 230 (М+, 99,9%), 77 (23,3%), 52 (22,4%), 51 (22,1%), 200 (19,4%).

4-А-2-ФФМСА (3) получен в результате восстановления ароматической нитрогруппы нимесулида (1). Оптимальным восстановителем явилось металлическое олово в среде хлороводородной кислоты, концентрированной с добавлением этанола. Восстановление нимесулида возможно в указанных условиях при кипении реакционной смеси в течение 2-2,5 часов. Продукт очищен перекристаллизацией и колоночной хроматографией, кристаллизован из ацетона, представляет собой бесцветные игольчатые кристаллы или белый с сероватым оттенком кристаллический порошок. Возможно окисление на свету. tnjl=164-166 °С. УФ (этанол) Whm 219,5 (lg £ 4,53), 249,7 (lg е 4,14), 298,4 (lg е 3,48); ИК (KBr) Wcm"' 985, 1105, 1463, 1583, 3037, 3329, 3398; ЯМР 'Н (300 МГц, ДМСО-^) 5 2,78 (с, ЗН), 4,88 (с, 2Н), 6,29 (д, J 7,2 Гц, 1Н), 6,95-7,12 (м, 1Н+ЗН), 8,48 (с, 1Н); Масс-спектр (m/z) 199 (99,9%), 171 (69,8%), 77 (19,7%), 51 (16,8%), 278 (М+, 14,5%).

4-МСА-З-ФФА (4) получен ацетилированием ароматической аминогруппы 4-А-2-ФФМСА (3). Оптимальные условия синтеза целевого продукта достигаются при использовании избытка ацетилирующего агента - ангидрида уксусной кислоты и температуры 20-25 °С. Процесс ацетилирования завершается после полного растворения 4-А-2-ФФМСА в ацетилирующем агенте и отгоне последнего в токе воздуха при комнатной температуре. Продукт очищен колоночной хроматографией, кристаллизован из ацетона, представляет собой белый или белый с телесным оттенком кристаллический порошок, trol=104-106 °С. УФ (этанол) Хшах/нм 220,8 (lg е 4,48), 254,3 (lg 6 4,27), 287,6 (lg е 3,53); ИК (KBr) ктах/см-1 1024, 1147, 1209, 1589, 1672, 3072, 3269, 3354, 3574; ЯМР 1Н (300 МГц, ДМСО-<16) 6 1,96 (с, ЗН), 2,85 (с, ЗН), 7,03 (д, J 7,2 Гц, 2Н), 7,20-7,42 (м, 2Н+ЗН), 8,90 (уш. с, Ш), 9,76 (с, 1Н); Масс-спектр (m/z) 199 (99,9%), 43 (89,8%), 171 (68,9%), 241 (64,7%), 320 (М+, 24,2%).

4-Г-2-ФФМСА (56) получен разложением сернокислой соли диазония 4-А-2-ФФМСА (5а) из предварительно диазотированного 4-А-2-ФФМСА (3). Синтез проходит в две стадии. На первой стадии синтеза диазотирование 4-А-2-ФФМСА

(3) проводят натрия нитритом в сернокислой среде при оптимальной температуре 0-5°С. Ввиду последующего нагрева, а также с целью стабилизации образующегося диазосоединения выбран анион сильной кислоты (сульфат-анион). Для снижения мешающего влияния нитрозирующей частицы ЫСР и снижения числа побочных продуктов реакции при разложении диазосоединения (5а) использован избыток карбамида. Также для снижения количества побочных продуктов и облегчения нуклеофильной атаки (8М1) диазосоединения (5а) гидроксил-ионами воды был применен катализатор состава Си804*5Н20 (39%)+Си20. На второй стадии синтеза после удаления нитрозирующей частицы избытком карбамида диазосоединение (5а) в присутствии указанного катализатора при 95-100°С и максимально быстром нагреве реакционной смеси разлагается с выделением азота до 4-Г-2-ФФМСА (56). Продукт реакции очищен колоночной хроматографией (в два этапа), кристаллизован из ацетона о.с.ч. и представляет собой белый с кремоватым оттенком кристаллический порошок, 1ПЛ=153-156°С. УФ (этанол) \пах/нм 219,3 (^ £ 4,45), 280,6 (^ € 3,44); ИК (КВг) г^/см"11109, 1253, 1388, 1618, 2939, 3034, 3271, 3363; ЯМР !Н (300 МГц, ДМСО-4,) 8 2,83 (с, ЗН), 6,48 (д, J 7,2 Гц, 1Н), 7,00-7,19 (м, 1Н+ЗН), 7,36 (т, 2Н), 8,65 (с, 1Н), 9,24 (с, 1Н); Масс-спектр (т/г) 201 (99,9%), 96 (42,5%), 124 (27,3%), 51 (21,0%), 77 (18,8%).

Количественное содержание основного вещества нимесулида и синтезированных соединений установлено титриметрическими методами.'

Рисунок 1 - Синтез из нимесулида (1) его метаболитов - 4-А-2-ФФМСА (3), 4-МСА-З-ФФА (4) и близких к нему по структуре соединений - 4-Н-2-ФА (2), 4-Г-2-ФФМСА (56)

1 Автор приносит отдельную благодарность Филипповой О.Э. за предоставление фармакопейного образца основного объекта исследования (нимесулида) и Безъязычной A.A. за ценные рекомендации при обработке экспериментальных результатов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В качестве спектральных методов использовали УФ-, ИК-, видимую спектрофотометрию, ЯМР 'Н.

Изучено поглощение исследуемыми соединениями электромагнитного излучения в УФ- и видимом диапазоне. Спектры регистрировались в ацетоне, ацетонитриле, бензоле, воде, н-гексане, 1,4-диоксане, диэтиловом эфире, N,14-диметилформамиде (ДМФА), хлороформе, этаноле, этилацетате, 0,1 М растворах хлороводородной кислоты и гидроксида натрия. Изучено поглощение исследуемыми соединениями электромагнитного излучения в ИК-диапазоне (4000400 см"1). Установлено присутствие достаточного количества характеристических полос колебаний различных фрагментов молекул анализируемых веществ. Показана возможность их идентификации по электронным и колебательным спектрам.

Изучены спектры ЯМР 'Н анализируемых веществ и определены величины сдвигов миллионных долей, соответствующие сигналам протонам определенных функциональных групп в молекуле. Показана возможность установления структуры исследуемых веществ по ЯМР 'Н спектрам.

По данным изучения электронных спектров разработаны методики количественного анализа исследуемых веществ по поглощению в ацетонитриле этаноле, ДМФА (табл. 1).

Таблица 1 - Результаты определения нимесулида и близких по структуре соединений методом электронной спектрофотометрии (п=6; Р=0,95)

Анализируемое вещество Среда анализа (длина волны X, нм) Найдено, %

X" Б Эх Дх Е

4-НА ДМФА (384,9) 99,76 0,99 0,40 1,04 1,04

Ацетонитрил (366,5) 100,04 0,79 0,32 0,83 0,83

4-Н-2-ФА ДМФА (391,4) 100,06 0,79 0,32 0,82 0,82

Ацетонитрил (375,1) 100,04 0,74 0,30 0,78 0,77

Нимесулид ДМФА (439,4) 100,04 0,66 0,27 0,69 0,69

Ацетонитрил (298,8) 99,96 0,86 0,35 0,91 0,91

4-А-2-ФФМСА Этанол (249,7) 99,97 0,98 0,40 1,03 1,03

Этанол (298,4) 99,92 0,91 0,37 0,96 0,96

Ацетонитрил (302,9) 99,96 0,86 0,35 0,91 0,91

4-МСА-З-ФФА Этанол (254,3) 100,02 0,90 0,37 0,94 0,94

Этанол (287,6) 99,95 0,84 0,34 0,88 0,88

Ацетонитрил (290,5) 99,95 0,76 0,31 0,79 0,79

4-Г-2-ФФМСА Этанол (241,5) 100,02 0,81 0,33 0,85 0,85

Этанол (280,6) 100,04 0,76 0,31 0,80 0,80

Ацетонитрил (287,2) 100,08 0,88 0,36 0,92 0,92

Как свидетельствуют полученные данные, разработанные методики достаточно воспроизводимы и правильны. Относительная ошибка среднего результата не более 1,04%.

В качестве хроматографичсских методов применяли нормальнофазовую и обращеннофазовую хроматографию в тонком слое сорбента (НФ-ТСХ и ОФ-ТСХ), нормальнофазовую и обращеннофазовую высокоэффективную жидкостную

хроматографию (НФ-ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ), газовую капиллярную колоночную хроматографию с масс-селективным детектированием (ГХ-МС), нормальнофазовую и обращеннофазовую жидкостную макроколоночную хроматографию низкого давления (НФ-Кл и ОФ-Кл).

Хроматографирование методом НФ-ТСХ проводили на пластинах «Сорбфил УФ-254» (сорбент - СТХ-1ВЭ), «Silufol UV-254» (сорбент - широкопористый силикагель по Питри), ОФ-ТСХ (модель привитой алкильной фазы С14-С15 на силикагеле СТХ-1ВЭ). Использованы moho-, би- и многокомпонентные подвижные фазы. Установлены зависимости абсолютной хроматографической подвижности исследуемых веществ от диэлектрической проницаемости элюента (метод НФ-ТСХ).

Для всех подвижных фаз рассчитаны показатели хроматографической подвижности. Оптимальные условия хроматографирования методом ТСХ представлены в таблице 2. Как видно из таблицы 2. предлагаемые хроматографические системы позволяют разделить и идентифицировать анализируемые вещества.

Таблица 2 - Абсолютная хроматографическая подвижность (110 нимесулида (НМС) и близких по структуре соединений в оптимальных элюентах

Элюент (объемные доли) НТЗ 4-НЛ НМС 4-Н- 2-ФА 4-А-2- Ц-МСА- ффмса!з-ффа 4-Г-2- ФФМСА

НФ-ТСХ «Сорбфил УФ-254» (сорбент - СТХ-1ВЭ)

Толуол-адетонитрил (7:3) 0,32 0.72 0,74 0.77 0.55 0,38 0.61

Тетрахлормеган-этилацетат (5,58:4,42) 0,35 0,66 0,76 0,86 0.63 0,25 0,78

Тетрахлорметан-диэтиловый эфир (3,47:6,53) 0,22 0,72 0,74 0,88 0,60 0,13 0.78

ОФ-ТСХ (искусственно привитая алкильная фаза Cu-Cn на силикагеле СТХ-1ВЭ)

Буферный р-р с рН 8,95-метанол (7:4) 0,091 0.53 0.21 0,05 0,44 0,30 0,37

Вода-пропанол-2 (8:2) 0,221 0,45 0,58 0,06 0,18 0,54 0,49

НФ-ТСХ «Silufol UV-254» (сорбент - широкопористый силикагель по Питри)

Гексан-тетрахлорметан-диоксан-пропанол-2 (10:5:5:2) - 0,37 jo,52 0,49 0,29 0,17 0,40

Оптимальные условия хроматографирования методом НФ-ВЭЖХ (колонка 100x2 мм, сорбент «Silasorb-600») для нимесулида, 4-НА. 4-Н-2-ФА достигаются в элюенте гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7), для нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-З-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА - в элюенте гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1). Результаты представлены на рисунке 2.

Оптимальные результаты хроматографирования методом ОФ-ВЭЖХ (колонка 250x4,6 мм, сорбент «Luna С18 5 мкм 100Á Phenomenex"») для аналитов достигаются при использовании подвижной фазы состава: В,% - С,%; В - 20 мМ фосфатный буфер КН2Р04 с рН 3,05: С - ацетонитрил; градиентный режим: 0,01...12,2 мин - В 65%; 12,2...13,0 мин - В 65...55%; 13,0...22,0 мин - В 55%: 22,0...23,0 мин - В 55-65%; 23,0...25,0 мин - В 65% (рисунок 3).

Как видно из таблицы 3, разработанные методики количественного анализа исследуемых соединений методом ВЭЖХ достаточно воспроизводимы и правильны. Относительная ошибка среднего результата не более 1,41%.

330 нм М " 360 нм ¡ Щ

.........................................-Л-......3 ...........................—>1

я

Б

1. 1 11 л •II : ! ! :; б - 1\ : ! 1 •

1 р; : I Л 1.

* 1; 5 1

1 ( ]] \ " 250 нм р

1 ............:.5д 4 51_

1 . .„' ' : -

Рисунок 2 - Хроматограммы смесей аналитов 4-Н-2-ФА (1), нимесулида (2), 4-НА (3), 4-А-2-ФФМСА (4), 4-МСА-З-ФФА (5), 4-Г-2-ФФМСА(6) в элюентах гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7) (А), гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1) (Б)

Рисунок 3 - Хроматограмма смеси 4-НА (1), 4-МСА-З-ФФА (2), 4-А-2-ФФМСА (3), 4-Г-2-ФФМСА (4), НТЗ (5), нимесулида (6), 4-Н-2-ФА (7). Подвижная фаза: 20 мМ фосфатный буфер КН2Р04 с рН 3,05 - ацетонитрил (градиентный режим)

По результатам хроматографирования исследуемых соединений методами НФ-Кл в системах гексан-ацетон, толуол-ацетонитрил и ОФ-Кл в системах вода-ацетон, вода-ацетонитрил определен ряд оптимальных подвижных фаз, применимых для очистки извлечений из биологического материала. В вышеуказанных системах установлены зависимости объемов удерживания аналитов от количества слабого элюирующего компонента в составе элюента.

ГХ-МС исследуемых соединений проводили с использованием капиллярной колонки ЭВ-5 МЭ ЕУГОЕХ (25мх0,2мм). Характерные времена удерживания исследуемых веществ и сигналы осколков в масс-спектрах позволяют идентифицировать анализируемые вещества с высокой селективностью. 12

При исследовании аналитов методами НФ-ВЭЖХ, ОФ-ВЭЖХ, НФ-Кл, ОФ-Кл определены и рассчитаны параметры хроматографирования: объем удерживания объём удерживания неудерживаемого компонента (У0); время

удерживания ^д); время удерживания неудерживаемого компонента (10); ширина пика у основания (и); скорость истечения элюента (и); коэффициент асимметрии пика (Аз); число теоретических тарелок (N1); высота, эквивалентная теоретической тарелке (Н); приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке (Н1); абсолютный и относительный коэффициенты емкости (к') и (к'5,) (для 4-Н-2-ФА и нимесулида относительно 4-нитроанилина, для 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-З-ФФА -относительно 4-Г-2-ФФМСА); относительный фактор емкости (Рк0; относительное изменение свободной энергии при адсорбции (Д(ДС)). Дополнительно для смежных пиков в методах НФ-ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ рассчитаны степень разделения Овэжх) и разрешение пиков (Я5).

Таблица 3 - Результаты определения нимесулида и близких по структуре соединений нормальнофазовой НФ-, обращеннофазовой ОФ-ВЭЖХ (п=6; Р=0,95)

ОФ- или НФ-ВЭЖХ, состав элюента, режим элюирования Объект исследования (детекция) Найдено, %

X Э Зг Д)Г е

НФ-ВЭЖХ; гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7), изократическое 4-НА (360 нм) 99,94 1,22 0,50 1,28 1.28

4-Н-2-ФА (360 нм) 100,51 1,10 0,45 1.15 1.14

Нимесулид (330 нм) 99,97 1,15 0,47 1,20 1,20

НФ-ВЭЖХ; гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1), изократическое Нимесулид (250 нм) 100,35 1,17 0,48 1,22 1,22

4-А-2-ФФМСА (250 нм) 100,63 1,30 0,53 1.37 1,36

4-МСА-3-ФФА(250 нм) 100,68 1,06 0,43 1,12 1,1 1

4-Г-2-ФФМСА(250 нм) 99,87 1.34 0,55 1,41 1.41

ОФ-ВЭЖХ; В,% - С,%; В - 20 мМ фосфатный буфер КН2РО4 с рН 3,05; С -ацетонитрил; градиентное: 0,01...12,2 мин - В 65%; 12,2... 13,0 мин - В 65...55%; 13,0... 22,0 мин-В 55%; 22,0...23,0 мин - В 55. ..65%; 23,0...25,0 мин-В 65%. 4-НА (230 нм) 100,76 1,13 0,46 1,19 1.18

4-Н-2-ФА (230 нм) 100,46 1,16 0,47 1,22 1,21

Нимесулид (230 нм) 100,62 1.10 0,45 1,15 1,15

4-А-2-ФФМСА (230 нм) 99,88 1,19 0,49 1,25 1,25

4-МСА-3-ФФА(230 нм) 100,03 1.00 0,41 1,05 1,05

4-Г-2-ФФМСА(230 нм) 100,30 1,17 0,48 1,23 1.23

4-НА (370 нм) 100,35 1,08 0,44 1,13 1,13

4-Н-2-ФА (370 нм) 100,17 0,98 0,40 1,02 1,02

Нимесулид (370 нм) 100,03 0,79 0,32 0,83 0,83

Оптимальной при хроматографировании в колонке нормальнофазового сорбента (8Шса§е1 Ь 40/100 мкм) нимесулида. 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА является подвижная фаза гексан-ацетон (8:2), при хроматографировании 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-З-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА - подвижная фаза гексан-ацетон (6:4).

Оптимальной при хроматографировании в колонке обращеннофазового сорбента (ЗПавогЬ С18 30 мкм) 4-нитроанилина является подвижная фаза вода-ацетон (9,5:0,5), 4-Г-2-ФФМСА и 4-МСА-З-ФФА - вода-ацетон (8,5:1,5). 4-А-2-ФФМСА - вода-ацетон (8:2), 4-Н-2-ФА - вода-ацетон (5:5), нимесулида - вода-ацетон (5,5:4,5).

Рассмотрена возможность использования хроматографии в тонких слоях и макроколонках сорбентов, а также жидкость-жидкостной экстракции для очистки исследуемых веществ в извлечениях из биоматериала.

Изучены зависимости экстрагирования аналитов из водных растворов гидрофобными органическими растворителями. Определены оптимальные условия максимального извлечения аналитов из равновесных водной и органических фаз (экстрагенты - этилацетат, этилацетат, насыщенный водой, бензол; электролиты -аммония сульфат, аммония бромид, натрия бромид). Определены условия селективного экстрагирования нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-З-ФФА при совместном присутствии в анализируемой пробе. Рассчитана необходимая кратность экстрагирования заданных количеств исследуемых соединений из водных растворов.

По результатам изучения хроматографической подвижности и характера экстрагируемости аналитов предложено 7 различных вариантов схем очистки извлечений из биоматериала. Потери изучаемых веществ при моделировании очистки хроматографическими методами не превышают 0,42%. На контрольных образцах извлечений из биоматериала экспериментально установлена наилучшая эффективность очистки методами, сочетающими экстракцию и жидкостную колоночную хроматографию (нормальная или обращенная фаза).

Определен характер извлечения аналитов из биоматериала 32 изолирующими агентами различных химических групп, в т. ч. их смесями. Ряд лучших изолирующих агентов представлен на рисунке 4 (п=5; Р=0,95).

Алифатические спирты, сложные эфиры карбоновых кислот и ацетон

к, %

Мег Эт П|>-1 И)>-2 Бут-! изо-Бут МсгАц ЭтАц ПропАц БутАц Ацетон Галогеналканы, арены и смеси индивидуальных изолирующих агентов

ДХМ ТХМ ТегрХМ 1.2ДХЭ Беш Тол о-Кс СмеаЛ Смесь2 СмесьЗ Смесь4 □ 4-ннгроанилин В 4-Н-2-ФА ИНимесулид В 4-А-2-ФФМСА И 4-МСА-З-ФФА ■ 4-Г-2-ФФМСА

Обозначения: Мег - метанол, Эт - этанол, Пр-1 - пропанол-1, Пр-2 - пропанол-2, Бут-1 -бутанол-1, изо-Бут - изо-6утанол, МетАц - метилацетат, ЭтАц - этилацетат, ПропАц -пропилацетат, БутАц - бутилацетат, ДХМ - дихлорметан, ТХМ - трихлорметан, ТетрХМ - тетрахлорметан, 1,2ДХЭ - 1,2-дихлорэтан, Бенз - бензол, Тол - толуол, о-Кс - о-ксилол. Смесь 1 - 1,4-диоксан-ацетон (мае. 1:1), Смесь2 - ацетонитрил-ацетон (мае. 1:1), СмесьЗ -1,4-диоксан-ацетонитрил (мае. 1:1), Смесь4- 1,4-диоксан-ацетон-ацетонитрил (мае. 1:1:1) Рисунок 4 - Сравнительное изолирование аналитов из биоматериала

Для всех исследуемых соединений оптимальным изолирующим агентом выбран ацетон. Исследована зависимость степени извлечения аналитов из биоматериала ацетоном от объема ацетона, продолжительности и кратности настаивания. Оптимальные условия изолирования: двукратное настаивание не менее 45 минут, массовое соотношение ацетон-биоматериал -не менее 2:1. 14

Установлено, что рост концентраций аналитов от 2,0 до 50,0 мг в 100 г биоматериала изменяет степень извлечения не более чем на 3,59 %. Значения степени извлечения х~ исследуемых веществ при этом находятся в интервале 48,73-99,90%.

Значения доверительного интервала - Ах 1,56-6,95 (п=5; Р=0,95). В результате проведенных исследований разработаны методики определения рассматриваемых веществ в ткани трупных органов, крови, плазме крови, моче на основе изолирования ацетоном и очистки полученных извлечений комбинацией методов жидкость-жидкостной экстракции и нормальнофазовой (НФ-Кл) или обращеннофазовой (ОФ-Кл) жидкостной колоночной хроматографией. Разработаны две методики экспресс-анализа образцов мочи на присутствие в них нимесулида и двух его метаболитов - 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-З-ФФА (п=5; Р=0,95). Общее время анализа каждой методикой не превышает 1,5 часа. Результаты определения минимальных концентраций разработанными методиками представлены на рисунке 5 (п=5; Р=0,95).

Изучено распределение исследуемых веществ в организме теплокровных животных. Крысам массой 150-265 г (5 групп по 5 особей в каждой) внутрижелудочно вводили летальные дозы анализируемых соединений: 800 мг/кг 4-нитроанилина, 600 мг/кг нимесулида или 4-Г-2-ФФМСА, 1000 мг/кг 4-А-2-ФФМСА, 6000 мг/кг 4-МСА-З-ФФА, 1200 мг/кг 4-Н-2-ФА (в виде водной суспензии). После гибели животных одинаковые органы и биожидкости объединяли внутри каждой группы и определяли в них анализируемые вещества. Результаты определения представлены в таблице 4.

к>% Очистка жидкость-жидкостной экстракцией и ПФ-Кл

Печень Кровь Плазма Моча Печень К^овь Плазма Моча

Спектрофотометрия Обращеннофазовая ВЭЖХ

(концентрация аналита 40-400 мкг в 100гб/м) (концентрация аналита 1,6-120 мкгв 100гб/м)

к, % Очистка жидкость-жидкостной экстракцией и ОФ-Кл

□ 4-нкгроанилин И4-Н-2-ФА И Нимесулид И4-А-2-ФФМСА И 4-М С А-З-ФФА ■ 4-Г-2-ФФМСА

Печень Кровь Плазма Моча

Нормальнофазовая ВЭЖХ

(концентрация аналита 3,2-600 мкг в 100 г б/м)

эо. го

1В.

о.

Печеяь Кровь Плазма Моча Спектрофотометрия

(концентрация аналита 40-600 мкг в 100 г б/м)

Рисунок 5 - Результаты определения минимальных концентраций анализируемых веществ в биоматериале с использованием комбинированных способов очистки

Как видно из таблицы 4, исследуемые соединения в значительных количествах присутствуют в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, а также в крови, почках с надпочечниками и легких (4-нитроанилин), в мозге и тимусе (4-Н-2-ФА), в почках с надпочечниками и легких (нимесулид), в глазах и тимусе (4-А-2-ФФМСА), в тимусе и селезенке (4-Г-2-ФФМСА), в селезенке, крови, сердце и почках с надпочечниками (4-МСА-З-ФФА как индивидуальное вещество), в глазах, селезенке, сердце и почках с надпочечниками (4-МСА-З-ФФА как метаболит 4-А-2-ФФМСА).

Таблица 4 - Результаты распределения изучаемых веществ в организме теплокровных животных (крысы) (п=5; Р=0,95)_

Вещество Орган или биожидкость Найдено, мг/100 г биоматериала

X Б Ах

4-НА (индивидуальное вещество) Желудок с содержимым 1441,55 214,55 95,95 266,74

Тонкий кишечник с содержимым 11,70 0,84 0,38 1,05

Кровь 10,35 0,88 0,39 1,10

Почки с надпочечниками 9,01 0,98 0,44 1,22

Легкие 6,83 0,49 0,22 0,61

НМС (индивидуальное вещество) Желудок с содержимым 104,94 15,19 6,79 18,89

Тонкий кишечник с содержимым 124,13 9,77 4,37 12,15

Толстый кишечник с содержимым 77,71 8,10 3,62 10,06

Почки с надпочечниками 6,63 0,72 0,32 0,90

Легкие 9,36 0,72 0,32 0,89

4-Н-2-ФА (индивидуальное вещество) Желудок с содержимым 193,85 28,23 12,62 35,09

Тонкий кишечник с содержимым 18,70 1,25 0,52 1,56

Толстый кишечник с содержимым 3,21 0,29 0,13 0,36

Мозг 1,05 0,11 0,05 0,13

Тимус 2,89 0,21 0,09 0,26

4-А-2-ФФМСА (индивидуальное вещество) Желудок с содержимым 1235,10 93,91 42,00 116,75

Тонкий кишечник с содержимым 137,56 10,94 4,89 13,61

Толстый кишечник с содержимым 316,02 37,16 16,62 46,20

Глаза 76,49 5,72 2,56 7,10

Тимус 60,88 5,17 2,31 6,43

4-МСА-З-ФФА (как метаболит 4-А-2-ФФМСА) Глаза 24,09 2,26 1,01 2,81

Тонкий кишечник с содержимым 11,06 0,67 0,30 0,84

Селезенка 8,37 0,62 0,28 0,77

Сердце 8,30 0,62 0,28 0,77

Почки с надпочечниками 8,30 0,72 0,32 0,89

4-МСА-З-ФФА (индивидуальное вещество) Желудок с содержимым 2169,26 242,81 108,59 301,87

Селезенка 37,66 2,16 0,96 2,68

Кровь 26,39 2,62 1,17 3,25

Почки с надпочечниками 18,16 1,70 0,76 2,11

Сердце 6,56 0,31 0,14 0,39

4-Г-2-ФФМСА (индивидуальное вещество) Желудок с содержимым 379,64 44,19 19,76 54,94

Тонкий кишечник с содержимым 42,72 3,77 1,68 4,68

Толстый кишечник с содержимым 23,16 2,38 1,06 2,96

Тимус 11,64 1,06 0,47 1,32

Селезенка 9,19 0,58 0,26 0,72

В соответствии с полученными данными доказано наличие процессов восстановления нимесулида в гнилостно-разлагающемся трупном материале до 4-А-2-ФФМСА и ацетилирования образовавшегося 4-А-2-ФФМСА до 4-МСА-З-ФФА. Установлено, что трансформация 4-А-2-ФФМСА в трупном материале при достаточно низких температурах возможна по двум направлениям -ацетилирование до 4-МСА-З-ФФА или окисление до нимесулида.

В рассмотренных условиях сроки сохранения анализируемых веществ составили: нимесулида и 4-НА - 34-590 суток, 4-А-2-ФФМСА - 270-540 суток, 4-МСА-З-ФФА - 240-540 суток, 4-Н-2-ФА и 4-Г-2-ФФМСА - как минимум 240 суток. В процессе трансформации нимесулида в трупном материале на 4-130 сутки образуется 4-А-2-ФФМСА, а на 18-130 сутки - МСА-З-ФФА, которые затем можно обнаружить в модельных смесях в течение 320-590 и 230-590 суток соответственно. В процессе трансформации 4-А-2-ФФМСА в трупном материале на 24-34 сутки образуется 4-МСА-З-ФФА, который затем обнаруживается в модельных смесях до 540 суток.

,36 °С

— Нимесулид (НМС)

^•Г-->4.Д-2-ФФМСА из НМС :

' , 4-МСА-З-ФФА из НМС !

"С 60

£

©

5 40

'я = 20

О

-12 4с , Нимесулид (НМС)

к......1............ > 4-А-2-ФФМСА из НМС :

" / 4-МСА-З-ФФА из НМС !

! : Д :

/Ъ-г-^—.........; • _ .

.............1...........у .....ц.................]

.<,--*»[—-----

17-22 °С : ».Нимесулид (НМС)

" 4-А-2-ФФМСА т НМС / '4-МСА-З-ФФА т НМС

1,5-2,0 °С - Нимесулид (НМС) ■ _ , - ' '/4-А-2-ФФМСА из НМС - " " / 4-МСА-З-ФФА из НМС

-12 °С 4-А-2-ФФМСА ^ -.-./'4-МСА-З-ФФА из 4-А-2-ФФМСА НМС из 4-А-2-ФФМСА

Рисунок 6 - Результаты изучения сохраняемости нимесулида при различных температурах (А, Б, В, Г, Д) и 4-А-2-ФФМСА при -12 °С (Е).

выводы

1. Проведен подбор условий синтеза и очистки 4-Н-2-ФА и 4-А-2-ФФМСА из нимесулида, а также 4-МСА-З-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА из 4-А-2-ФФМСА. Доказана индивидуальность синтезированных соединений методами ТСХ и ГХ-МС, установлена их химическая структура с использованием методов ЯМР 1Н и ИК-спектрофотометрии. Количественное содержание основных веществ в синтезированных и очищенных образцах определялось титриметрическими методами. Определены величины химических сдвигов протонов в ЯМР 1Н спектрах исследуемых соединений. Рассчитан ряд оптических характеристик электронных спектров анализируемых соединений. Показана возможность идентификации данных веществ по их электронным, ИК-, масс-спектрам (ГХ-МС).

2. Исследовано хроматографическое поведение анализируемых веществ в тонких слоях и колонках неподвижных фаз с гидроксилированной и привитой поверхностями с применением элюентов различной полярности. Рассчитаны параметры хроматографирования анализируемых соединений. Установлено, что оптимальной для определения нимесулида и близких по структуре соединений в тонких слоях силикагеля (пластины «Сорбфил» УФ-254) является подвижная фаза толуол-ацетонитрил (7:3). При определении в тонких слоях обращённофазового сорбента (модель привитой фазы С14 - С15) оптимальной является подвижная фаза буферный раствор с рН 8,95 - .метанол (7:4).

Показано, что оптимальной для определения нимесулида, 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА методом нормалыюфазовой ВЭЖХ является подвижная фаза гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7), для определения нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-З-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА - подвижная фаза гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1). Установлено, что для определения исследуемых соединений методом обращеннофазовой ВЭЖХ универсальным является градиентный режим элюирования с компонентами подвижной фазы ацетонитрилом и 20 мМ фосфатным буфером КН2Р04 с рН 3,05.

3. Разработаны методики количественного спектрофотометрического определения аналитов по поглощению в средах ацетонитрила, ДМФА и этанола. Относительная ошибка среднего результата (п=6; Р=0,95) методик не превышает 1,04 %. Разработаны методики количественного определения аналитов методами нормальнофазовой и обращеннофазовой ВЭЖХ. Относительная ошибка среднего результата (п=6; Р=0,95) - не более 1,41 %.

4. Установлены оптимальные условия максимального извлечения аналитов из равновесных водной и органических фаз (экстрагенты - этилацетат, этилацетат насыщенный водой, бензол; электролиты - аммония сульфат, аммония бромид, натрия бромид). Определена необходимая кратность экстрагирования для извлечения заданных количеств аналитов из водных растворов. Предложены селективные условия экстрагирования нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-З-ФФА при их возможном совместном присутствии.

5. Исследована зависимость удерживания аналитов в макроколонках нормальнофазового (Silicagel L 40/100 мкм) и обращённофазового (Silasorb С18 30 мкм) сорбентов от состава и соотношения компонентов подвижных фаз. Установлены оптимальные условия хроматографирования исследуемых соединений с использованием подвижных фаз состава: гексан-ацетон (нормальнофазовый сорбент) и вода-ацетон (обращеннофазовый сорбент).

Определён уровень потерь аналитов при хроматографировании в тонких слоях и колонках сорбентов. Показана эффективность разработанных способов очистки анализируемых соединений от соэкстрактивных веществ биоматериала жидкость-жидкостной экстракцией и хроматографией.

6. Изучено сравнительное изолирование аналитов из биоматериала 32 изолирующими агентами различной химической природы в режиме настаивания. Установлены зависимости степени изолирования анализируемых соединений от длины углеводородного радикала в ряду алифатических спиртов и сложных эфиров карбоновых кислот, от числа атомов хлора в ряду галогеналканов, от молекулярной массы аренов.

Установлено, что извлечение анализируемых веществ из биоматериала целесообразно проводить ацетоном. Оптимальные условия изолирования достигаются при двукратном настаивании в течение как минимум 45 минут при массовом соотношении «ацетон-биоматериал» - не менее 2:1.

7. Разработаны методики определения анализируемых соединений в тканях трупных органов и биожидкостях (крови, плазме крови и моче) на основе изолирования ацетоном и последующей очистки жидкость-жидкостной экстракцией и хроматографией.

Установлено, что при росте содержания аналитов от 2,0 до 50,0 мг в 100 г биоматериала изменение степени извлечения не превышает 3,59%. Значения степени извлечения при этом находятся в интервале 48,73-99,90%, а значения доверительного интервала - 1,56-6,95 (п=5; Р=0,95). Для разработанных методик установлены значения определяемого минимума исследуемых веществ.

8. Исследовано распределение рассматриваемых соединений в организме теплокровных (на примере крыс). Установлено, что в значительных количествах исследуемые соединения присутствуют в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, а также в крови, почках с надпочечниками и легких (4-нитроанилин), в мозге и тимусе (4-Н-2-ФА), почках с надпочечниками и легких (нимесулид), глазах и тимусе (4-А-2-ФФМСА), селезенке, крови, сердце, почках с надпочечниками (4-МСА-З-ФФА), тимусе и селезенке (4-Г-2-ФФМСА).

Исследованы особенности сохранения нимесулида, продуктов его трансформации и близких по структуре соединений в модельных смесях с трупным материалом в пяти температурных режимах (от -12 до 36°С). Доказана возможность трансформации в трупном материале нимесулида до 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-З-ФФА, а 4-А-2-ФФМСА до 4-МСА-З-ФФА.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации

1. Шорманов, В. К. Определение изомеров нитроанилина в тонком слое нормальнофазового сорбента / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, А. С. Шилова // Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик : сб. тр. Всерос. науч.-практ. конф. - Курск : Изд-во КГМУ, 2009.-С. 171-174.

2. Шорманов, В. К. Изучение особенностей определения изомеров нитроанилина методом нормальнофазовой ТСХ после переведения их в соответствующие полинитропроизводные / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов,

A. С. Шилова // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов III Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию Курск, гос. мед. ун-та. - Курск : Изд-во КГМУ, 2010. - С. 323-325.

3. Возможности применения электронной спектрофотометрии для идентификации нимесулида в биологических жидкостях / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко, С. Г. Галушкин // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2011. - С. 213-215.

4. Идентификация 4-нитроанилина методом электронной спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, Л. Е. Сипливая, О. И. Гришечко // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2011. -С. 215-217.

5. Количественное определение 4-нитроанилина на основе поглощения в среде ацетонитрила / В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2011. -С. 220-223.

6. Количественное определение 4-нитроанилина на основе поглощения электромагнитного излучения в среде ДМФА / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко, С. Г. Галушкин // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2011.-С. 211-213.

7. Количественное определение нимесулида методом спектрофотометрии в УФ-области / В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов, С. Г. Галушкин // Университетская наука: Взгляд в будущее : материалы итоговой науч. конф. сотрудников КГМУ (2-3 февр. 2011 г.) : в 3 т. - Курск : Изд-во КГМУ, 2011. - Т. 2. - С. 292-294.

8. Определение нимесулида методом электронной спектрофотометрии /

B. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко // Университетская наука: Взгляд в будущее : материалы итоговой науч. конф. сотрудников КГМУ (2-3 февр. 2011 г.) : в 3 т. - Курск : Изд-во КГМУ, 2011. - Т. 2. -С. 294-297.

9. Особенности определения отдельных нитропроизводных анилина в биологический объектах в тонком слое обращеннофазового сорбента /

B. К. Шорманов, А. С. Шилова, Ю. А. Сухомлинов, Д. А. Герасимов // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2011. - Т. 11, вып. 3. -

C. 407-414.

10. Получение ацетильных производных анилина и ряда близких структур для дальнейшего химико-токсикологического анализа / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, А. С. Шилова, О. И Гришечко // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. -Курск : Изд-во КГМУ, 2011. - С. 209-211.

11. Прямофазная тонкослойная хроматография нимесулида и близких по структуре соединений в индивидуальных подвижных фазах / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, С. Г. Галушкин, О. И. Гришечко // Материалы Четвертой междунар. дистанц. науч. конф. «Инновация в медицине» - Курск : Изд-во КГМУ, 2011.-С. 132-136.

12. Фотометрическое определение нимесулида в гранулах для приготовления суспензий / В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко // Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм : материалы Всерос. науч.-практ. интернет-конф. с междунар. участием (27 апр. 2011 г.). - Курск : Изд-во КГМУ, 2011. - С. 397-399.

13. Фотометрическое определение нимесулида в моче человека /

B. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко // Материалы XVIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2011. -

C. 655.

14. Бабина, С. В. Экстракция 4-нитроанилина органическими растворителями / С. В. Бабина, Д. А. Герасимов // Молодежная наука и современность: материалы 77-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых (18-19 апр. 2012 г.): в 3 ч. - Курск : Изд-во КГМУ, 2012. - Ч. 2. - С. 294-297.

15. Идентификация метаболита № 1 нимесулида методом электронной спектрофотометрии / Д. А. Герасимов, В. К. Шорманов, Ю. О. Усова, Л. Е. Сипливая // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2012. -С. 66-69.

16. Идентификация метаболита № 2 нимесулида методом электронной спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, С. Г. Галушкин,

B. В. Чупак // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2012. -

C. 108-111.

17. Определение метаболита № 1 нимесулида на основе поглощения электромагнитного излучения в среде ацетонитрила / Д. А. Герасимов,

B. К. Шорманов, С. Г. Галушкин, Л. Е. Сипливая // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2012. - С. 69-72.

18. Определение метаболита № 2 нимесулида на основе поглощения электромагнитного излучения в ацетонитриле / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов,

C. Г. Галушкин, В. В. Чупак // Биотехнология и биомедицннская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2012.-С. 111-114.

19. Определение метаболита № 2 нимесулида на основе поглощения электромагнитного излучения в этаноле / Д. А. Герасимов, В. К. Шорманов, В. В. Чупак, С. Г. Галушкин // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб.

материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2012.-С. 63-66.

20. Определение нового соединения из группы метансульфонамидов на основе поглощения УФ-излучения в среде ацетонитрила / JI. Е. Сипливая, В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, С. Г. Галушкин // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2012. - С. 86-89.

21. Определение нового соединения из группы метансульфонамидов на основе поглощения УФ-излучения в среде этанола / Д. А. Герасимов,

B. К. Шорманов, JI. Е. Сипливая, С. Г. Галушкин // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2012. - С. 72-76.

22. Сохраняемость нимесулида и его основных метаболитов в гнилостно-разлагающемся трупном материале / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов,

C. Г. Галушкин, Л. Е. Сипливая // Актуальные проблемы судебно-медицинской экспертизы : сб. тез. науч.-практ. конф. с междунар. участием (Москва, 17-18 мая 2012 г.). -М„ 2012. - С. 271-273.

23. Спектрофотометрическое определение примеси «D» нимесулида в средах ацетонитрила и диметилформамида / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко, JI. Е. Сипливая // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2012.-С. 99-102.

24. Шорманов, В. К. Идентификация 4-нитро-2-феноксианилина методом электронной спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, Ю. О. Усова // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2012. - С. 96-99.

25. Шорманов, В. К. Идентификация нового соединения из группы замещенных метансульфонамидов методом электронной спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2012. - С. 93-96.

26. Шорманов, В. К. Изолирование нимесулида из биологического материала / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, С. Г. Галушкин // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация. - 2012. - № 22 (141), вып. 20/1. - С. 124-129.

27. Шорманов, В. К. Сохраняемость нимесулида в трупном материале / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, JI. Е. Сипливая // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2012. - № 3. - С. 102-107.

28. Идентификация некоторых соединений группы 4-нитроанилинов методом колебательной спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, Ю. В. Андреева, В. А. Омельченко // Университетская наука: Взгляд в будущее : материалы итоговой науч. конф. сотрудников КГМУ (7 февр. 2013 г.) : в 2 т. -Курск : Изд-во КГМУ, 2013. - Т. II. - С. 168-171.

29. Определение метаболита № 1 нимесулида на основе поглощения электромагнитного излучения в среде этанола / В. К. Шорманов, О. С. Дукова, О. Д. Герасимова, Д. А. Герасимов // Биотехнология и биомедицинская инженерия :

сб. материалов VI Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-воКГМУ, 2013.-С. 72-76.

30. Определение нимесулида на основе поглощения электромагнитного излучения в среде ДМФА / В. К. Шорманов, Д. Ю. Кондаурова, А. И. Янченко, Д. А. Герасимов // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов VI Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2013. -С. 76-79.

31. Определение примеси 4-нитро-2-феноксианилина в нимесулиде методом производной спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, О. Д. Герасимова, О. С. Дукова // Химия и медицина : тез. докл. IX Всерос. конф. с молодеж. науч. шк. по органич. химии. - Уфа-Абзаково : ИОХ УНЦ РАН, 2013. -С. 123-124.

32. Применение производной спектрофотометрии для определения нимесулида в лекарственных формах / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, М. К. Елизарова, Д. Ю. Кондаурова, А. И. Янченко // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ : материалы 5-й Междунар. науч.-метод, конф. «Фармобразование-2013». - Воронеж : Изд-во ВГУ, 2013. - С. 626-630.

33. Шорманов, В. К. Идентификация некоторых 4-производных 2-феноксифенилметансульфонамида по поглощению электромагнитного излучения в ИК-области спектра / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, Н. Б. Мельникова // Университетская наука: Взгляд в будущее : материалы итоговой науч. конф. сотрудников КГМУ (7 февр. 2013 г.) : в 2 т. - Курск : Изд-во КГМУ, 2013. - Т. II. -С. 162-165.

34. Распределение 4-нитроан11Л11на в организме теплокровных животных / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, В. А. Омельченко, О. И. Гри-шечко, М. А. Останин // Судебно-медицинская экспертиза. - 2013. — Т. 56, № 1. - С. 42-46.

35. Шорманов, В. К. Распределение 4-ами110-2-феноксифенилметан-сульфонамида в организме теплокровных животных / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов И Судебно-медицинская экспертиза. - 2013. - Т. 56, № 6. -С. 25-30.

36. Распределение нимесулида в организме теплокровных животных / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, Л. Е. Спиливая, С. Г. Галушкин, Р. Ю. Симонов // Фармация. - 2013. - Т. 62, № 1. - С. 39-42.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.59 г. Сдано в набор 02.07.2014 г. Подписано в печать 03.07.2014.Г. Формат 30x421/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 273«А». Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.