Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование некоторых нестероидных противовоспалительных средств

На правах рукописи

ВАТАЛЁВ АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ НЕСТЕРОИДНЫХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СРЕДСТВ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

5 ДЕК 2013 005542559

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Санкт-Петербург 2013

005542559

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации на кафедре фармацевтической химии.

Научный руководитель: Куклин Владимир Николаевич

доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты: Калекин Роман Анатольевич

доктор фармацевтических наук, ст. научный сотрудник ФГБУ «Российский центр судебно — медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Рощина Любовь Леонидовна

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры управления и экономики фармации, фармацевтической технологии, фармацевтической химии и фармакогнозии ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный университет им. И.И.Мечников» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится "26" декабря 2013 г. в 16.00 на заседании Диссертационного Совета Д 208.088.01 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 14, лит. А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197277, Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д. 14).

Автореферат разослан "ноября 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, Д 208.088.01, кандидат фармацевтических наук, /

доцент . // Марченко Наталья Владимировна

- /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время число лиц употребляющих нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) в мире составляет несколько сотен миллионов человек. В практической медицине используется более 1000 лекарственных препаратов, содержащих НПВС в виде таблеток, мазей, растворов для парентерального введения и др., отпуск, которых является безрецептурным. Большая популярность применения этих средств объясняется тем, что они обладают широким спектром фармакологического действия и часто используются в качестве средств при болях разной этиологии, а так же наркозависимыми людьми в период абстиненции. К современным средствам этой группы относятся мелоксикам, нимесулид, диклофенак, кеторолак, ибупрофен, пропифеназон, кетопрофен и другие. Широкое применение среди наркозависимых людей нашли комбинированные препараты, содержащие, кроме НПВС, кодеина фосфат (нурофен плюс, каффетин и др.) и используюемые для синтеза наркотического средства - дезоморфина.

Методики химико-токсикологического анализа биологических объектов на присутствие нимесулида, мелоксикама, ибупрофена и пропифеназона, в сочетании с наркотическими анальгетиками отсутствуют, что не позволяет экспертам сделать заключение об отравлении этими средствами или исключения факта их использования в немедицинских целях, в том числе при приеме совместно с наркотическими средствами, психотропными и другими токсическими веществами.

Цель работы. Разработка методик химико-токсикологического анализа нестероидных противовоспалительных средств - нимесулида, мелоксикама, ибупрофена и пропифеназона (два последних входят в состав комбинированных препаратов, содержащих кодеина фосфат) в лекарственных формах и биологических жидкостях и внедрение их в практику химических отделений БСМЭ и химико-токсикологических лабораторий наркологических диспансеров России.

Задачи исследования. Для реализации поставленной нами цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать методику изолирования исследуемых веществ из биологических жидкостей (кровь, моча).

2. Разработать методики качественного определения нимесулида, мелоксикама и ибупрофена, пропифеназона методами тонкослойной хроматографии (ТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), газовой хроматографии в

сочетании с масс-селекгивным детектором (ГХ/МС), ультрафиолетовой (УФ) и инфракрасной (ИК) спектроскопии, цветных и осадочных реакций.

3. Предложить разные методы количественного определения исследуемых веществ, выделенных из биологических жидкостей. Сравнить их сопоставимость и воспроизводимость.

4. Установить сроки сохраняемости нимесулида, мелоксикама, ибупрофена и пропифеназона в биологических жидкостях.

5. Разработать общую схему химико-токсикологического анализа при отравлениях изучаемыми веществами.

Научная новизна работы. Впервые выявлены особенности изолирования изучаемых веществ из водных растворов и биологических жидкостей разными органическими растворителями и их смесями. Установлено, что на процесс изолирования из биологических жидкостей методом жидкость-жидкостной экстракции влияет структура анализируемого соединения, его константа диссоциации, связь с биологической матрицей, рН среды, растворитель или смесь растворителей.

Цветные и осадочные реакции, метод ТСХ следует использовать на предварительном этапе исследования. Разработаны подтверждающие методики УФ спектроскопия, ВЭЖХ, ГХ/МС и денситометрия для обнаружения нимесулида, ибупрофена, мелоксикама и пропифеназона, которые могут быть использованы для их качественного и количественного определения в лекарственных формах и биологических жидкостях с использованием оборудования, рекомендованного Минздравом РФ для оснащения химико-токсикологических лабораторий и Центров по лечению острых отравлений.

Установлено, что ИК-спекгроскопия не может быть использована для анализа изучаемых веществ, выделенных из биологических жидкостей, а только для веществ, выделенных из лекарственных форм. Метод УФ спектроскопии и ВЭЖХ в градиентном режиме могут быть использованы в скрининге анализируемых веществ совместно с другими НПВС и наркотическими анальгетиками. Метод ГХ/МС позволяет идентифицировать исследуемые вещества, выделенные из биологических жидкостей по времени удерживания, молекулярному иону и масс-спектру.

Впервые определены необходимые объем и полнота судебно-химического исследования исследуемых веществ, позволяющие достоверно установить факт отравления.

Практическая значимость работы. Разработаны простые методики изолирования, обнаружения и количественного определения нимесулида, ибупрофена, пропифеназона, мелоксикама в лекарственных формах и биологических жидкостях (кровь, моча). Удалось в одной пробе разделить лекарственные вещества, содержащиеся в комбинированных препаратах нурофен-плюс (ибупрофен, кодеин) и каффетин (пропифеназон, парацетамол, кофеин и кодеин), используя для экстракции разные органические растворители и варьируя значения рН среды.

Использование цветных и осадочных реакций, ТСХ (на предварительном этапе), ВЭЖХ, УФ, ИК спектроскопии, ГХ/МС (на подтверждающем этапе) позволяет достоверно установить факт наличия изучаемых веществ в исследуемых объектах. Обосновано применение этих методик в практике химико-токсикологических лабораторий, что позволяет сократить время диагностирования отравления изученными препаратами, дать оценку степени отравления для оказания своевременной медицинской помощи. Установлены сроки сохраняемости исследуемых веществ в биологических жидкостях.

Разработанные методики апробированы, утверждены и внедрены в практику работы судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы г. Санкт-Петербурга, Ленинградской, Новгородской областей, химико-токсикологическую лаборатории Центра по лечению острых отравлений СПб НИИ Скорой помощи им.И.И. Джанелидзе, в учебный процесс ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России, ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России.

Методология и методы исследования. Исследование проводилось в период с 2009 по 2013 гг. Базовыми объектами являлись лекарственные препараты из фармакологической группы НПВС. Теоретическую основу исследования составляли труды зарубежных и отечественных ученых, и документы по производству судебной экспертизы в РФ. Методология исследования заключалась в создании алгоритма судебно-химического исследования биологических жидкостей при отравлении некоторыми НПВС.

При проведении исследования был использован комплекс химических, физико-химических, математических методов анализа и обработки результатов.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные работы доложены на научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2009), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009), Всероссийской межвузовской научной

конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений» (Санкт-Петербург, 2009), Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2011), Всероссийской научно - практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации» (Санкт-Петербург, 2013).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения соответствуют формулам специальностей 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области специальности, пункту 4 паспорта «фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Публикации. Основное содержание диссертации представлено в 12 публикациях, в том числе 7 статей в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, рекомендованный ВАК РФ.

Связь задач исследования с планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом исследовательских работ ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России в рамках одного из основных научных направлений «Синтез, изучение строения, фармакологического действия новых биологических веществ или модифицированных субстанций, препаратов и разработка валидированных методик их стандартизации» (номер государственной регистрации ЦИТиФ 01201252028).

Личный вклад автора. Автор непосредственно участвовал в проведении экспериментальной работы (разработка и валидация методик, пробоподготовка образцов, работа на приборах для ГХ/МС, ВЭЖХ, УФ и ИК-спекгроскопии, использование тонкослойной хроматографии) и в обсуждении полученных результатов исследования; проводил изолирование исследуемых веществ из крови и мочи методом прямой жидкость-жидкостной экстракции, последующий их анализ. Автором создан алгоритм судебно-химического исследования биологических жидкостей при отравлении изученными веществами, совместно с другими НПВС и наркотическими анальгетиками. В целом степень участия автора в получении результатов работы составляет более 85%.

Положения, выносимые на защиту

1. Обоснование экспериментальных исследований по определению нимесулида, мелоксикама, а также ибупрофена и пропифеназона, входящих в состав комбинированных препаратов нурофен-плюс и каффетина, содержащих кодеина фосфат, на предварительном

и подтверждающем этапах судебно-хпмического исследования биологических жидкостей с использованием современных физико-химических методов.

2. Определение условий изолирования исследуемых веществ из лекарственных форм и биологических жидкостей

3. Разработка методик обнаружения и количественного определения изученных веществ, выделенных из биологических жидкостей, с использованием методов УФ, ИК спектроскопии, ТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС и денситометрии.

4. Данные о сохраняемости исследуемых веществ в биологических жидкостях.

5. Алгоритм судебно-химического исследования биологических жидкостей при отравлении изученными веществами.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 166 страницах машинописного текста, иллюстрирована 86 рисунками и 33 таблицами, состоит из введения обзора литературы, экспериментальной части (4 глав), выводов, списка литературы, включающего 111 наименований (37 источников зарубежной литературы) и приложения.

В качестве объектов исследования были выбраны НПВС, которые наиболее часто встречаются в судебно-медицинской практике:

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Нимесулид С13Н12К2038, М.м. 308,3

Рисунок 1. №(4-Нитро-2-феноксифенил) метансульфон амид, относится к производным сульфонамида, является селективным ингибитором циклооксигеназы-2

Мелоксикам C14H13N3O4S2, М.м. 351,4

Рисунок 2. 4-гидрокси-2-метил-№(5-метил-2-тиазолил)-2Н-

О О

СНз 1,2-бензотиа-зин -3-карбоксамид-1,1-доксид, относится к произодным оксикамов, является селективным ингибитором циклооксигеназы-2

СНз Ибупрофен С13Н18О2, М.м. 206,3

-V. Рисунок 3. ((1-2-(4-Изобутилфенил)-пропионовая кислота,

относится к производным пропионовой кислоты. Не

селективно ингибирует циклооксигеназу-1 и циклооксигеназу-2, входит в состав комбинированного препарата нурофен-плюс (ибупрофен и кодеина фосфат сесквигидрат)

Пропифеназон С^Н^ИгО, М.м. 230,3

Рисунок 4. 1,2-дигидро-1,5-диметил-4-( 1 -метилэтил)-2-фенил-ЗН-N сн, пира-зол-3-он относится к производным феназона, не селективно _/ ингибирует циклооксигеназу-1 и циклооксигеназу-2, входит в состав

НзС—{ СНз комбинированного препарата каффетин.

СН3

При разработке методик определения нимесулида, мелоксикама, а также ибупрофена и пропифеназона, входящих в состав препаратов Нурофен-шпос и Каффетин, соответственно, были решены две основные задачи:

- изолирование исследуемых веществ из биологических жидкостей;

- идентификация их, в том числе при совместном присутствии с другими НПВС, а также с наркотическими и психотропными средствами и их количественное определение.

1. Идентификация ибупрофена, нимесулида, пропифеназона, мелоксикама

Нами была изучена возможность использования для обнаружения нимесулида, ибупрофена, пропифеназона, мелоксикама всех доступных для нас методов, применяемых в химико-токсикологическом и судебно - химическом анализе: цветные и осадочные реакции, УФ, ИК-спектроскопия, ТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС и денситометрия.

Анализируемые вещества дают цветные и осадочные реакции с реактивами, наиболее часто используемыми в фармацевтическом анализе. Для каждого соединения

были подобраны реактивы, дающие характерное окрашивание (таблица 1).

Таблица 1 - Детекция нимесулида, ибупрофена, пропифеназона и мелоксикама

Препарат/ Реактив Визуальная окраска Уф-свет Реактив Драгендорфа Железа (III) хлорида 10% раствор

Нимесулид желтое фиолетовое оранжевое -

Ибупрофен - фиолетовое - бурое

Пропифеназон - фиолетовое оранжевое оранжево-бурое

Мелоксикам - фиолетовое оранжевое серое

Хроматографирование в тонком слое сорбента осуществлялось на пластинках «Сорбфил - ПТСХ-П-А-УФ» в разных системах растворителей. Хроматографическая подвижность ибупрофена, нимесулида, пропифеназона и мелоксикама определялась, как

при их совместном присутствии так и в сравнении с другими НПВС, а также наркотическими анальгетиками (таблица 2). Детекцию проводили реактивами Драгендорфа, в УФ-свете при 254 им.

Таблица 2 - Значения М исследуемых веществ при хроматографировании в разных системах растворителей на пластинке «Сорбфил ПТСХ-П-А- УФ»

Препарат/ система Хлороформ-ацетон (9:1) Х™±ДХ Этилацетат-этанол-аммиак водный (17:2:1) х^дх Этанол-аммиак водный (100:1,5) Х„„±ДХ

Нимесулид 0,78+ 0,04 0,39+ 0,03 0,82+ 0,05

Ибупрофен 0,52+ 0,03 0,18± 0,02 0,66± 0,05

Пропифеназон 0,58± 0,05 0,89+ 0,06 0,86+ 0,05

Мелоксикам 0,16+0,02 0,24+ 0,02 0,85+ 0,05

Морфин 0,30+0,02 0,22+ 0,04 0,32+ 0,05

Кодеин 0,18+0,04 0,35+ 0,05 0,33± 0,04

Парацетамол 0,12+0,02 0,68+ 0,04 0,79+ 0,05

Диклофенак 0,10+0,02 0,20+ 0,02 0,81± 0,06

Кеторолак 0,15+ 0,03 0,10+0,02 0,76+ 0,05

Кетопрофен 0,28+ 0,03 0,18+ 0,02 0,60+ 0,05

Метамизол натрия 0,05+0,01 0,05+ 0,01 0,57+ 0,05

Буторфанол 0,05+0,01 0,89+0,06 0,82+ 0,05

Полученные результаты свидетельствуют о том, что оптимальное хроматографическое разделение изучаемых веществ, в том числе при совместном присутствии с другими НПВС и наркотическими анальгетиками достигается в системе

хлороформ:ацетон (9:1).

В качестве частных систем при целенаправленном исследовании анализируемых веществ были выбраны следующие системы: для ибупрофена - гексан-этилацетат-уксусная кислота концентрированная (30:5:2); для нимесулида - гексан-ацетон (2:1); для пропифеназона - гексан-ацетон (4:6); для мелоксикама - хлороформ-этанол- аммиак водный (32:7:1), в том числе в комбинированных препаратах нурофен-плюс и каффетин.

Предел обнаружения исследуемых веществ методом ТСХ при детекции реактивом Драгендорфа: нимесулид - 1мкг, пропифеназон - 8мкг, мелоксикам - 2 мкг; железа (III) раствором хлорида 10%: ибупрофен -1мкг.

Хроматоденситометрия значительно превосходит традиционную ТСХ по чувствительности и позволяет в одной пробе проводить одновременно идентификацию и количественное определение исследуемых веществ. Исследование изучаемых соединений проводили с помощью видеоденситометра «ДенСкан» после хроматографирования образцов на пластинке «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» в частных системах растворителей, перечисленных выше. Проявление хроматограмм проводили УФ свете при длине волны 254нм. Предел обнаружения изучаемых веществ составил для: ибупрофена - 0,25 мкг, нимесулида- 0,25 мкг, пропифеназона - 1,0 мкг, мелоксикама - 0,5 мкг.

Количественное содержание исследуемых веществ, выделенных из лекарственных форм и биологических жидкостей методом денситометрии, определяли по заранее построенным калибровочным графикам в интервале концентраций: для ибупрофена - 1,08,0 мкг/мл, для нимесулида - 2,0-7,0 мкг/мл, для пропифеназона - 0,5-2,5 мкг/мл, для

мелоксикама - 2-6 мкг/мл.

Нами была исследована возможность применения ИК спектроскопии для идентификации изучаемых соединений. Сухие остатки, полученные в результате экстракции исследуемых веществ из лекарственных форм и биологических жидкостей таблетировали с калия бромидом, снимали ИК-спектры в дисках на спектрофотометре «Спекорд М-80» в пределах 400-4000 см"1 и сравнивали со спектрами стандартных образцов или образцов, выделенных из лекарственных форм, структура, подлинность и чистота, которых доказана химическими и физико-химическими методами.

Нам не удалось полностью избавиться от компонентов биологической матрицы при определении анализируемых веществ, выделенных из биологических жидкостей, поэтому ИК спектроскопия, по нашему мнению, может быть использована, только для идентификации изучаемых фармацевтических субстанций, выделенных из лекарственных форм.

Сравнительный анализ исследуемых веществ, других НПВС и наркотических анальгетиков, с использованием УФ спектрофотометрии показал, что для скрининга данный метод может быть использован при записи спектров в разных растворителях после хроматографического разделения. Спектры поглощения исследуемых веществ записаны на спектрофотометре "8ресог(Г-М-40 в пределах длин волн 220-400 нм в хлористоводородной кислоты растворе 0,1М, натра едкого растворе 0,1М и в этаноле (таблица 3).

и

Таблица 3 - Максимумы поглощения исследуемых веществ в разных растворителях

Вещество Хмах (HCL 0,1 М), нм Хмах (NaOH 0,1 М),нм Хмах (С2Н5ОН), нм

Буторфанол 278±2 - -

Диклофенак 273±2 273±2 285±2

Кеторолак 248,317±2 248, 323±2 245, 317±2

Морфин 285±2 298±2 282±2

Кодеин . 284±2 -

Анальгин 239,258±2 275±2 275±2

Пропифеназон 285±2 - 240±2

Нимесулид 396±2 305±2

Ибупрофен . 262±2 262±2

Мелоксикам 343±2 364±2 364±2

Парацетомол 245±2 257±2 250±2

Кофеин 273±2 - -

Кетопрофен 260±2 262±2 256±2

Количественное определение нимесулида, ибупрофена, пропифеназона и мелоксикама методом УФ-спектрофотометрии проводили по предварительно построенным калибровочным графикам зависимости оптической плотности веществ от их концентрации, подчиняющиеся закону Бугера-Ламберта-Бера. Для ибупрофена (длина волны - 262 нм, интервал концентраций 5-90 мкг/мл), нимесулида (длина волны 396 нм, интервал концентраций 4-20 мкг/мл) анализ проводили в натра едкого растворе ОДМ, для мелоксикама (длина волны - 364 нм, в интервал концентраций 2,5 - 20 мкг/мл), пропифеназона (длина волны 240 нм, интервал концентраций 5-30 мкг/мл) в этаноле.

Для идентификации исследуемых веществ, как при их совместном присутствии так и в сравнении с другими НПВС, наркотическими анальгетиками, а также продуктов их дериватизации (пентафторпропионильные производные) использовали метод ГХ/МС. Анализ проводили на квадрупольном хроматомасс-спектрометрическом комплексе Agilent Technologies в следующих условиях: газовый хроматограф 6890 N с автоматическим устройством ввода пробы 7683В. Условия анализа: инжектор капиллярный, колонка THERMO TR - 5MS длиной 30м, диаметром 0,25мм. Режим программирования температуры термостата колонок: Т-нач. 60°С последующей изотермой 0,5 мин и дальнейшем подъемом температуры ДТ-20°/мин. до 290°С и изотермой 10 мин. Температура инжектора 270°С, интерфейса 290°С. Скорость газа-носителя гелия 1мл/мин, ввод без деления потока 2 мин. Масс-спектрометр 5973N, с источником электронного удара и энергией ионизации 70е.в., квадрупольным масс фильтром, температурой источника 230°С и квадруполя 150°С.

В масс-спектрах анализируемых веществ с разной интенсивностью присутствуют пики молекулярного иона и других характеристичных ионов, при этом спектры исследованных соединений имеют совпадение на 95% со спектрами библиотек (таблица 4). Таблица 4 - Характерные ионы в масс-спектрах исследуемых веществ

Соединение М.м. Ионы

Буторфанол 327 272,273, 327*. 254,41,157,136,227

Декстрометорфан . 271 59.271*, 150,270.31,214,42,171

ДиклоФенак 296 78, 89,107,151. 179,214,242,277

КетопсоФен 254 105, 77,177,209.254*, 210,103,181

Кеторолак 255 211,77,106,134.182,196

Мелоксикам 351 211.76,118,152. 105, 169, 253

Пропифеназон 230 215,230*, 56,216,96,41,39

Ибупрофен 206 162,163,01,119.107,206*, 145

Нимесулид 308 154.229, 308*. 77. 51, 183, 199

Кодеин 317 299.42,162,229.115.214, 124,188

Морфин 285 285*, 162,42,215. 286,124, 44,284

Парацетамол 151 109, 151*, 43, 80, 108,81,53,52

Кофеин 194 194*,109,55,67, 82, 195,42, 110

Парацетамол-ПФП 297 108,119,225,80,297*,52,134,208

Кодеин-ПФП 445 282,445*,283.446.281,229,59,225

Морфин-2ПФП 577 414, 577*,415,42,364,70,578,361

В масс-спектре мелоксикама отсутствует пик молекулярного иона, но наблюдаются характеристичные осколочные ионы m/z 152, 211, 253, по которым следует идентифицировать исследуемое вещество. Пределы обнаружения исследуемых веществ при анализе методом ГХ/МС составляют: ибупрофен - 1 нг/мл, нимесулид - 2 нг/мл,

пропифеназон - 2 нг/мл, мелоксикам -1 нг/мл.

Подобраны условия определения изучаемых веществ методом ВЭЖХ. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографическом комплексе НР-1100 с диодно-матричным детектором (ДМД). Условия анализа: колонка ODS Hypersil 150 х 4,6 мм, размер частиц сорбента - 5 мкм, диапазон длин волн 180-400 нм, температура термостата колонки 30°С, объем вводимой пробы 10 мкл. Наилучшие результаты определения и разделения исследуемых веществ (таблица 5) были получены при использовании градиентного режима анализа с применением в качестве компонентов подвижной фазы смеси ацетонитрила и фосфатного буферного раствора (pH среды 3,8). В качестве внутреннего стандарта использовали 5-(4-метилфенил)-5-фенилгидантоин (МРРН). Идентификацию веществ, проводили по абсолютному и относительному временам удерживания.

Таблица 5 - Времена удерживания веществ (метод ВЭЖХ, концентрация исследуемых

соединений -10 мкг/мл)

№ Вещество (мин.) ПЯТ

1 Буторфанол 7,85 0,53

3 Кеторолак 11,39 0,77

4 Диклофенак 21,90 1,48

5 Морфин 1,66 0,11

7 Кофеин 3,47 0,23

8 Парацетамол 2,75 0,18

9 Кодеин* 2,85 0,19

11 Пропифеназон 13,56 0,9

12 Ибупрофен 22,46 1,57

13 Мелоксикам 16,51 1,12

14 Нимесулид 12,63 1,42

15 МРРН (внутренний стандарт) 14,74 1

Предложенный нами метод ВЭЖХ с использованием внутреннего стандарта позволил определить микроколичества веществ в извлечениях, выделенных из биологических жидкостей, и одновременно разделить, идентифицировать и произвести количественное определение искомых веществ. Определение проводили при длине волны с максимумом абсорбции для каждого препарата по предварительно построенным калибровочным графикам. Пределы обнаружения: ибупрофен - 4 нг/мл, нимесулид - 10 нг/мл, пропифеназон - 2 нг/мл, мелоксикам - 2 нг/мл. Метод ВЭЖХ позволяет проводить количественное определение ибупрофена, нимесулида, пропифеназона, мелоксикама и других веществ одновременно в одной пробе. Калибровочные графики для определения исследуемых веществ, строили в интервале концентраций: для ибупрофена - 0,5-20 мкг/мл, для нимесулида - 1,0-20 мкг/мл, для пропифеназона - 5,0-30 мкг/мл, для мелоксикама -0,5-20 мкг/мл.

Для метода ВЭЖХ были определены некоторые валидационные характеристики. Параметр линейности определяли путем измерения растворов исследуемых веществ на 5 уровнях концентраций. Значение коэффициента корреляции находилось в пределах 0,99 < Я < 1,0. Прецизионность метода устанавливали по показателям сходимость и внутрилабораторная воспроизводимость. Относительное стандартное отклонение при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышало 2,3% (при

ИЗБ < 3% изменчивость вариационного ряда считается незначительной), и полученные данные являются сходимыми, а методика воспроизводима.

Правильность методики определяли путем измерения растворов исследуемых веществ с известной концентрацией. Открываемость находится в диапазоне 97,8-101,1% (должна укладываться в предел 97-103%). При оценке робастности оценивали соотношение элюентов подвижной фазы, ее рН среды, тип колонки, ее температура, скорость подачи подвижной фазы.

Относительная погрешность количественного определения исследуемых веществ с использованием методов УФ спектрофотометрии, хроматоденситометрии и ВЭЖХ составляла 1,1-3,0%. Результаты методов близки и воспроизводимы и их можно считать достоверными с вероятностью 95%.

2. Изолирование нбупрофена, нимесулида, пропнфеназона, мелоксикама из водных растворов и биологических жидкостей

Нами было изучено влияние природы растворителя и рН среды на эффективность экстракции исследуемых веществ из водных растворов. В качестве экстрагентов использовали органические растворители и их смеси, наиболее часто применяемые в химико-токсикологическом анализе: хлороформ, гексан, этилацетат, хлороформ-гептан-2-пропанол (50:33:17); значения рН среды при извлечении варьировали в интервале 2,0-12,0 (таблица 6). Полученные данные использовали при изолировании изучаемых веществ из лекарственных форм и биологических жидкостей.

Таблица 6 - Условия экстрагирования исследуемых веществ

Соединение рН среды Экстрагент

Нимесулид рН 4,0 Этилацетат

Ибупрофен рН 2,0 Гексан

Пропифеназон рН 2,0 Гексан

Мелоксикам рН2,0 Хлороформ

Для изучения степени извлечения исследуемых веществ из биологических жидкостей использовали контрольные образцы крови и мочи с концентрацией веществ 10 мкг/мл. Изолирование веществ из биологических жидкостей проводили жидкость-жидкостной экстракцией при значениях рН среды и растворителями, подобранными для изолирования исследуемых веществ из водных растворов. Для разрушения комплексов исследуемых веществ с белками в плазме крови применяли метод осаждения белков. Разрушение в моче глюкуранидов, образующихся в процессе метаболизма изучаемых

веществ, использовали кислотный гидролиз (за исключением мелоксикама). Степень извлечения из крови и мочи составила для пропифеназона - 58,8; 77,4%; для ибупрофена -63,5%; 79,0%; для мелоксикама - 55,4; 74,8%; соответственно, для нимесулида - 67,4;

83,6%.

3. Изолирование и определение исследуемых веществ из крови и мочи

экспериментальных животных

Разработанные методики анализа были апробированы на биологических жидкостях

экспериментальных животных - белых беспородных крысах массой тела 180-220 г. Препараты, в зависимости от токсической дозы, ибупрофен в количестве 30 мг (нурофен плюс), нимисулид в количестве 16мг (найз), пропифеназон (каффетин) в количестве 33,3мг, мелоксикам (мовалис) в количестве 5 мг вводили в желудок через зонд в виде взвеси растертых таблеток в Твин-80 с последующей водной нагрузкой. Забор крови производили через 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 24 ч (в зависимости от фармакокинетических констант

анализируемых веществ), мочу собирали в течение 24 и 48 ч.

Методика изолирования К 1 мл крови с исследуемым веществом, разведенной водой очищенной до 3 мл, добавляли натрия вольфрамата раствор 10% в серной кислоте растворе 10% до рН=2 среды по универсальному индикатору, перемешивали, центрифугировали 3 мин при скорости 3000 об/мин. Надосадочную жидкость переносили в делительную воронку, устанавливали определенное значение рН среды, прибавляли 5 мл экстрагента и экстрагировали трижды в течение 5 мин. Извлечения объединяли, фильтровали через слой натрия сульфата безводного в фарфоровые чашки и растворитель

выпаривали до сухого остатка.

В связи с образованием коньюгатов анализируемых веществ, при анализе мочи, стадии изолирования предшествует стадия кислотного гидролиза для их разрушения. При изолировании мелоксикама кислотный гидролиз не проводился, так как при этом

происходит его частичное разрушение.

К 3 мл мочи с исследуемым веществом (нимесулид, ибупрофен, пропифеназон) прибавляли 300 мкл кислоты хлористоводородной концентрированной, нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин в герметично закрытом сосуде, охлаждали, осадок отделяли путём центрифугирования и отбрасывали. Надосадочную жидкость переносили в делительную воронку прибавляли 5 мл экстрагента, доводили до соответствующего значения рН среды аммиаком водным и экстрагировали трижды в течение 5 мин.

Извлечения объединяли, фильтровали через слой натрия сульфата безводного в фарфоровые чашки и растворитель выпаривали до сухого остатка.

При изолировании мелоксикама 3 мл мочи помещали в делительную воронку с хлористоводородной кислоты раствором 10% до рН=2 среды, прибавляли 5 мл хлороформа, и экстрагировали трижды, в течение 5 мин. Извлечения объединяли, фильтровали через слой натрия сульфата безводного в фарфоровые чашки и растворитель выпаривали до сухого остатка.

При исследовании разными видами хроматографии и УФ спектрометрии было установлено, что полученные результаты для исследуемых веществ, выделенных из крови и мочи, были идентичны и соответствуют параметрам изучаемым соединениям, выделенным из лекарственных форм.

Количественное определение нимесулида, ибупрофена, пропифеназона и мелоксикама выделенных из биологических жидкостей экспериментальных животных проводили параллельно методами УФ спектрометрии, хроматоденситометрии и ВЭЖХ. При использовании метода ВЭЖХ, к пробе прибавляли 10 мкл раствора внутреннего стандарта (МРРН) с концентрацией 30 мкг/мл (таблица 7,8).

Таблица 7 - Результаты количественного определения ибупрофена и пропифеназона

Вещество Концентрация, мкг/мл

ВЭЖХ УФ спекгрофотометрия Хроматоденситометрия

Кровь моча моча моча

0,5ч 1ч 2ч 24ч 24ч 24ч 24ч

Ибупрофен 3,4 3,2 - 13,9 13,5 13,3

Пропифена зон 3,8 5,6 3,3 0,2 19,5 - 18,0

Таблица 8 - Результаты количественного определения нимесулида и мелоксикама

Вещество Концентрация, мкг/мл

ВЭЖХ УФ-спекгрофотометрия Хроматоденситометрия

кровь моча кровь моча кровь моча

2ч Зч 5ч 24 ч 48 ч 2ч Зч 5ч 24ч 48ч 2ч Зч 5ч 24ч

Нимесу лид 6, 10 3,1 5 - - - 5,9 3,0 - - - 6,0 3,0 '

Мелокси кам - - 5,7 9 5,4 9 11, 15 2,8 - 6,0 5,71 11,5 5 6,20 1,21

Для нимесулида количественное определение в моче не проводили, так как вещество в организме экспериментальных животных практически полностью подвергается метаболизму с образованием 4-гидроксинимесулида, что доказано методом ГХ/МС.

Полученные результаты свидетельствуют о сопоставимости трех предложенных методов количественного определения исследуемых веществ, однако предпочтительным остается использование метода ВЭЖХ, как наиболее современного и точного из использованных.

4. Определение изучаемых веществ, в крови и моче при совместном присутствии с другими нестероидными противовоспалительными средствами и

наркотическими анальгетиками

Для определения изучаемых веществ при совместном присутствии с другими НПВС и кодеином использовали кровь и мочу, доставленные для судебно-химического исследования, в которых предварительно были обнаружены кодеин, кофеин, парацетамол. В кровь и мочу были добавлены стандартные метанольные растворы исследуемых веществ, таким образом, что концентрация пропифеназона составила 20 мкг/мл, нимесулида и ибупрофена -10 мкг/мл, а мелоксикама - 5 мкг/мл.

Экстракцию анализируемых веществ из крови и мочи проводили по методикам

разработанным для биологических жидкостей.

Подтверждение совместного присутствия в крови и моче изучаемых веществ, парацетамола, кофеина, кодеина осуществляли методом ТСХ на пластинках «Сорбфил» -ПТСХ-П-А-УФ» в следующей системе растворителей: хлороформ-ацетон (9:1) при детекции реактивом Драгендорфа, а также в УФ-свете. При этом наблюдаемые пятна на хромагограмме по значению Rf и окраскам соответствовали стандартным образцам нимесулида, ибупрофена, пропифеназона, мелоксикама, парацетамола, кодеина и кофеина.

При исследовании извлечения из крови и мочи методом ВЭЖХ (хроматограф «Waters 2695» с ультрафиолетовым детектором «Waters 2996» колонкой Nova Рак С18 4 мкм 3,9x150 мм, объем вводимой пробы 10 мкл, температура колонки 30°С; детектор - УФ Х=220 нм; режим подачи элюента - изократический; время проведения анализа 15 мин) были идентифицированы пики, по времени удерживания и УФ-спекграм совпадающие со стандартными веществами: нимесулидом, ибупрофеном, пропифеназоном, мелоксикамом и кодеином (рисунок 5,6).

ьатлиг

Рисунок 5. ВЭЖХ хроматограмма извлечения из крови, содержащей исследуемые и

наркотические вещества.

Рисунок 6. ВЭЖХ хроматограмма извлечения из мочи, содержащей исследуемые и

наркотические вещества. При ГХ/МС исследовании извлечения из крови и мочи без дериватизации идентифицированы пики нимесулида, ибупрофена, пропифеназона, мелоксикама, кофеина и кодеина (рисунок 7,8).

Рисунок 8. ГХ/МС хроматограмма извлечения из мочи, содержащей исследуемые и наркотические вещества (без дериватизации). Производные парацетамола были определены после обработки пробы дериватизирующими агентами (Рисунок 9,10).

Рисунок 9. ГХ/МС хроматограмма извлечения из крови, содержащей исследуемые и наркотические вещества (после дериватизации).

з: юооо эс мооо

25 ЮООО 2СЮООО 15 30000

1С юооо

£ ЮООО

Рисунок 7. ГХ/МС хроматограмма извлечения из крови, содержащей исследуемые и наркотические вещества (без дериватизации).

наркотические вещества (после дериватизации). 5. Сохраняемость нимесулида, ибупрофена, пропифеназона, мелоксикама в биологических жидкостях

Сохраняемость исследуемых веществ изучали с использованием крови и мочи экспериментальных животных. Биологические жидкости животных хранили при 4-6°С. Химико-токсикологическое исследование крови и мочи осуществляли через 1, 2, 3 и 6 месяцев после забора. Данные, представленные в таблице 9, свидетельствуют о том, что только ибупрофен, нимесулид и пропифеназон могут быть обнаружены в биологических жидкостях через 6 месяцев после взятия пробы, а мелоксикам спустя 3 месяца. Сохраняемость нимесулида в моче не определяли, так как он практически на 100% подвергается метаболизму в организме животных.

Таблица 9 - Сохраняемость (%) исследуемых веществ в крови (к) и моче (м) __подопытных крыс _

Соединение 1 месяц 2 месяца 3 месяца 6 месяцев

к м к м к м к м

Нимесулид 62,3 не опред 42,7 не опред 30,2 не опред 15,3 не опред

Ибупрофен 61,5 82,2 56,2 71,1 42,5 66,7 18,9 24,6

Пропифеназон 59,1 74,5 45,4 62,8 29,9 48,4 11,2 27,8

Мелоксикам 56,0 72,3 38,9 55,5 23,9 31,2 не обнаружен не обнаружен

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные итоги диссертационной работы сводятся к следующим основным положениям:

1. Впервые выявлены особенности и определены оптимальные условия изолирования изучаемых веществ из водных растворов и биологических жидкостей при целенаправленном исследовании и при их совместном присутствии. Установлено, что на процесс изолирования из биологических жидкостей влияет растворитель или смесь

растворителей, рН среды, строение анализируемого соединения и насколько сильно вещество связывается с биологической матрицей. Разработанные методики изолирования исследуемых веществ из биологических жидкостей при целенаправленном исследовании просты и позволяют выделить из крови и мочи: пропифеназон - 58,8; 77,4%; ибупрофен -63,5; 79,0%; мелоксикам - 55,4; 74,8%; нимесулид - 67,4; 83,6% соответственно.

2. Разработаны методики обнаружения и разделения нимесулида, ибупрофена, пропифеназона, мелоксикама методами ТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС, Ж и УФ спектроскопии, применяемыми в химико-токсикологическом анализе и дана их валидационная характеристика. Экспериментально доказано, что ИК-спектроскопия не может быть использована для изучаемых веществ, выделенных из биологических жидкостей, а может применяться только для анализа веществ, выделенных из лекарственных форм. Метод ВЭЖХ может быть использован для анализа нимесулида, ибупрофена, пропифеназона, мелоксикама при их совместном присутствии и с другими НПВС и наркотическими анальгетиками.

3. Разработаны методики количественного определения нимесулида, ибупрофена, пропифеназона, мелоксикама с помощью УФ спектрофотометрии, высокоэффективной денситометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлено, что методы ВЭЖХ, денситометрии не требуют пробоподготовки и позволяют одновременно проводить качественный и количественный анализ исследуемых веществ, в том числе при совместном присутствии с наркотическими и ненаркотическими анальгетиками. При сравнении методов количественного определения исследуемых веществ установлено, что полученные результаты близки и воспроизводимы. Данные методы могут быть использованы в практике работы БСМЭ и наркологических диспансеров с различной степенью

оснащенности приборами.

4. Установлены сроки сохраняемости исследуемых веществ в биологических жидкостях. Ибупрофен, нимесулид и пропифеназон могут быть обнаружены в биологических жидкостях через 6 месяцев, в то время как мелоксикам может быть обнаружен спустя 3 месяца после взятия пробы.

5. По результатам исследования разработана общая схема и схемы для целенаправленного исследования анализируемых веществ в биологических жидкостях для обнаружения нимесулида, ибупрофена, пропифеназона, мелоксикама, позволяющие установить или исключить факт приема или отравления исследуемыми веществами.

Создан алгоритм судебно-химического исследования биологических жидкостей при отравлении изучаемыми веществами, совместно с другими НПВС и наркотическими анальгетиками (рисунок 11).

Рисунок 11. Схема химико-токсикологического исследования нимесулида, ибупрофена, пропифеназона, мелоксикама в биологических жидкостях при совместном присутствии их с наркотическими и ненаркотическими анальгетиками

Перспективы дальнейшей разработки темы и внедрения результатов.

В дальнейшем планируется разработка методик химико-токсикологического анализа нимесулида, мелоксикама, ибупрофена и пропифеназона в органах и тканях.

Планируется внедрение разработанных методик в практику работы химико-токсикологических лабораторий, химических отделений БСМЭ, центров по лечению острых отравлений, а также использование результатов работы в медицинских центрах для подбора индивидуальных терапевтических доз лекарственных средств и биофармацевтическом анализе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Ваталёв, A.A. Химико-токсикологическое исследование буторфанола /A.A. Ваталёв, A.B. Киреева, А.Б. Вожева, Н.В. Сайгушкин, C.B. Волченко, В.Н. Куклин // Судебно-медицинская экспертиза. - 2008. - №2. - С.23-26.

2. Ваталёв, A.A. Химико-токсикологическое исследование веществ, обладающих противовоспалительной активностью / A.A. Ваталёв, Т.В. Горбачева, A.B. Киреева, В.Н. Куклин // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорская гос. фармац.академия. - Вып.64. - Пятигорск, 2009. - С.292-293.

3. Ваталёв, A.A. Химико-токсикологическое исследование препарата «Каффетин» / A.A. Ваталёв, H.A. Анисимова, E.H. Степанова, В.Н. Куклин // Труды Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» / Пермская гос. фармац.академия - Пермь, 2009.- С.48-50.

4. Ваталёв, A.A. Обнаружение ибупрофена в биологическом материале / Т.В. Горбачева, A.A. Ваталёв, Е.С. Бушуев, В.А. Бычков // Сборник трудов научного общества судебных медиков. - СПб, 2009. - С.23-34.

5. Ваталёв, A.A. Химико-токсикологическое исследование ненаркотического анальгетика нимесулида / А.А.Ваталёв //Тезисы докладов межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», Санкт-Петербург, 2009. - С. 60-61.

6. Ваталёв, A.A. Тонкослойная хроматография в анализе некоторых противовоспалительных средств / A.A. Ваталёв, Т.В. Горбачева, A.B. Киреева, В.Н. Куклин / / Судебно-медицинская экспертиза. - 2010. - №5 . - С.25-30.

7. Ваталёв, A.A. Хроматография и спектроскопия в анализе некоторых противовоспалительных средств / A.A. Ваталёв, C.B. Волченко, A.B. Киреева, В.Н. Куклин / / Судебно-медицинская экспертиза. - 2010. - №6 . - С.27-30.

8. Ваталёв, A.A. Хроматография и спектроскопия при анализе кеторолака и диклофенака в биологических жидкостях / A.A. Ваталёв, C.B. Волченко, A.B. Киреева, В.Н. Куклин // Судебно-медицинская экспертиза. - 2011. -№1. - С.41-45.

9. Ваталбв, A.A. Химико-токсикологическое исследование препарата мовалис /A.A. Ваталёв, A.B. Тимофеева, E.H. Степанова, В.Н. Куклин II Вестник Российской Военной медицинской академии им. С.М. Кирова. - 2011. - №1(33). - С.156.

10. Вагалёв, A.A. Химико-токсикологическое исследование некоторых нестероидных противовоспалительных средств / АА.Ваталёв //Тезисы докладов Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация-потенциал будущего», Санкт-Петербург, 2011. - С. 90-91.

11. Ваталёв, A.A. Определение некоторых опоидных и неоподных анальгетиков в биологических жидкостях / A.A. Ваталёв, A.B. Киреева, H.A. Анисимова, В.Н. Куклин // Вестник Волгоградского медицинского университета. - 2011. - Вып.4(40). - С. 89-93.

12. Вагалёв, A.A. Определение препарата нурофен-плюс в биологических жидкостях / A.A. Ваталёв, E.H. Степанова, H.A. Анисимова, В.Н. Куклин // Бутлеровские сообщения. - 2012. -Т.32, №13. - С. 128-130.

На правах рукописи

Ваталёв Андрей Александрович

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ НЕСТЕРОИДНЫХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СРЕДСТВ

14.04.02 — «фармацевтическая химия, фармакогнозия»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Печать А. В. Пономарёвой

Подписано к печати 20.11.2013. Формат 60 х 90/16. Бумага тип. Печать ризограф. _Гарнитура «Тайме». Печ. л.1,5. Тираж 120 экз. Заказ 1204

Санкт-Петербург 2013