Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-фармакологическое изучение гумата натрия из сапропеля

На правах рукописи

КАРБЫШЕВ АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ХИМИКО - ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ГУМАТА НАТРИЯ ИЗ САПРОПЕЛЯ

15.00.02. - фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пепмь-1999

Работа выполнена в Сибирском государственном медицинском университете и Башкирском государственном медицинском университете.

Научный руководитель: ■ доктор фармацевтических наук, профессор Дмитрук С.Е.

Научный консультант: в заслуженный деятель науки Республики Башкортостан, доктор медицинских наук, профессор Насыров Х.М.

Официальные опп.оненты: в доктор фармацевтических наук, профессор Фурса Н.С. в кандидат фармацевтических наук, доцент Решетникова М.Д.

Ведущая организация - Самарский государственный меди- " цинский университет.

седании Диссертационного совета Д 084.70.01 при Пермской фармацевтической академии (614000 Пермь, ул. Ленина, 8., тел.: 48-17-56).

Защита состоится

г. в часов на за

В

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермс&й фармацевтической академии.

Автореферат разослан 1999 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 084.70.01 Метелева Е В.

Метелева Е.В.

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Обоснование темы и цели. К числу важнейших задач медицинской и фармацевтической науки относится изыскание эффективных лекарственных средств на основе природных биологически активных веществ (БАВ). В пользу последних особенно убедительно говорит низкая токсичность и ограниченный спектр побочных явлений, что выгодно отличает их от препаратов микробного и химического синтеза. Поэтому, не случайно, в настоящее время лекарственные вещества природного происхождения, особенно растительного, составляют около 30 % всех препаратов, применяемых в современной медицине. Во многих случаях доля лекарственных препаратов из растений и других природных источников БАВ значительно превышает указанный процент. Это касается прежде всего сердечно - сосудистых, нервных, же-лудочно - кишечных заболевший, отдельных болезней кожи, печени и почек. После потери интереса к природным БАВ и фитотерапии в целом, наблюдаемого в 50-70-ые годы, начиная с конца 80-х годов и особенно за последние 5-7 лет, вновь отмечается значительный рост производства лекарственных средств растительного происхождения.

На актуальность поиска новых высокоэффективных средств природного происхождения серьезный отпечаток накладывает и ресурсный фактор, так как в современных рыночных условиях доступность сырья, наряду с фармакологическими свойствами его БАВ, в конечном итоге, определяют спрос на предлагаемый препарат. С данной точки зрения наше внимание привлекли широко распространенные в Сибири и Томской области, такие источники БАВ, как торф и сапропели (или пелоиды). Указанные источники БАВ получили признание и активно используются в санаторно - курортном лечении. В отечественной медицинской практике достаточно известны биогенные стимуляторы, которые получают из торфа и сапропеля (ФиБС, пепоидодистиллят, пе-лоидин, торфот, гумизоль). Используются они для лечения язвенной болезни желудка, двенадцатиперстной кишки, гастритов, гнойных ран, невралгии, конъюктиьитов, кератитов и др. Однако все перечисленные препараты производятся за пределами России и, кроме того, спектр установленного для них терапевтического действия не охватывает тег фармакологических возможностей, которые способны обеспечить БАВ, содержащиеся в этих, бесспорно, ценных прирочных источниках. Следовательно, для Сибири, располагающей огромными ресурсами торфа и сапропеля, химическое и фармакологическое изучение биологически активных соединений, наряду с поиском новых путей применения выделенных комплексов в медицине и сельского хозяйстве, является весьма актуальной задачей.

Цель работы - провести направленное изучение торфа и сапропеля с выявлением перспективного комплекса БАВ и созданием на его основе лекарственного средства для лечения заболеваний кожи.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

■ Провести сравнительный химический анализ основных БАВ, содержащихся в торфе и сапропеле.

■ В условиях in vitro провести сравнительный анализ на противогрибковую активность суммарных комплексов, выделенньч из торфа и сапропеля.

■ Провести углубленный химический анализ сапропелг и перспективного биологически активного комплекса.

■ Разработать лекарственную форму на основе гумата натрия из сапропеля и дать оценку ее фармакологических свойств.

в Разработать проекты ВФС на сапропель, раствор гумата натрия и 5% мазь гумата натрия; разработать лабораторный регламент на производство мази «Пелоидерм».

Научная новизна работы. Впервые проведен целенаправленный химико - фармакологический анализ биологически активных веществ, содержащихся в торфе и сапропеле, запасами которых богат регион Сибири и Томская область в том числе. На основании экспериментальных исследований дано теоретическое обоснование возможности использования нового сырьевого источника для получения эффективного средства терапии заболеваний кожи.

В исследуемых источниках сырья выявлены такие группы БАВ, как гуминовые кислоты, фульвокислоты, полисахариды, фенолокисло- -ты, липиды, карстиноидные пигменты, макро- и микроэлементы, кате-хины, флавонолы.

Впервые для суммарных комплексов, выделенных ия торфа и сапропеля, дана оценка их противогрибковой активности, а для гумино-вых кислот и гумата натрия, выделенного из сапропеля, установлена антимутагенная активность на фоне экспериментального радиационного воздействия и противоопухолевых агентов, которая распространяется и на факторы инфекционного мутагенеза.

Экспериментально доказано, что гуминовый комплекс, выделенный из сапропеля по разработанной нами технологии, проявляет высокую степень фармакологической активности и обеспечивает, кроме противогрибковых и антимутагенных, противовоспалительные и рано-заживляющие свойства. Для разработанного средства доказана безвредность и обоснованы показатели норм качества сырья сапропеля, обеспечивающие объективную оценку его доброкачестьенности.

Практическая значимость работы. Теоретические разработки и проведенные эксперименты показали целесообразность использования сапропеля месторождений, расположенных на территории Томской обпасти, в качестве источника БАВ для создания на их основе лекар-

ственного средства с выраженными антигрибковыми, противовоспалительными, ранозаживляющими и антимутагенными свойствами.

Гумат натрия в виде 5% мази предложен в качестве нетоксичного эффективного средства для лечения воспалительных процессов в присутствии микробных ассоциаций, а также для лечения детских дерматозов аллергического характера.

Указанное средство на фоне существующих препаратов проявило высокий терапевтический эффект при лечении хромоты ног у крупного рогатого скота.

Полученные в экспериментальных условиях результаты дают основание полагать, что выделенный из сапропеля гуминовый комплекс, ч равной степени как и раствор гумата натрия, можно использовать в реабилитационном процессе с целью профилактики онкологических заболеваний. Их применение целесообразно в комплексной терапии вирусных, бактериальных и протозойных инфекций с целью стимуляции иммунной системы и стабилизации генетического аппарата.

Полученные в результате экперименталькых исследований данные легли в основу разработанных проектов ВФС на сапропель, раствор гумата натрия и 5% мазь гумата натрия «Пелоидерм», а также в лабораторный регламент на производство мази «Пелоидерм». Выявленные новые виды фармакологической активности для БАВ сапропеля, позволяют расширить спектр его применения и в бальнеологии.

На защиту выносятся результаты химико - фармакологического исследования БАВ торфа и сапропеля месторождений Томской области и обоснование возможности создания на их основе лекарственного средства антигрибкового, противовоспалительного, ранозаживляюще-го и антимутагенного действия.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: II Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1995); III международном микологическом симпозиуме «Патогенез, диагностика и терапия микозов и микогенной аллергии» (Санкт - Петербург, 1995); научной конференции Алтайского мед. университета (Барнаул, 1995); научно - практической конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета (Самара, 1996); научной конференции, посвященной памяти профессора Л.Н. Беретнеговской (Томск, 1996);Всероссийской научной конференции «От Materia medica к современным медицинским технологиям» (Санкт - Петербург, 1998); международном совещании, посвященном памяти В.Г. Минаевой (Новосибирск, 1990); IV международной научно - практической конференции «Природные и интеллектуальные ресурсы Сибири» (Барнаул, 1998).

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии с курсом ботаники Сибирского государственного медицинского Университета и кафедры фармакологии Башкирского государственного медицинского университета, а также комплексной целевой программы Ccí АМН Российской Федерации «Здоро-

вье человека в Сибири» (№ Государственной регистрации 01.9.2002479)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 работ и 2 методических разработки. о

Объем и структура диссертационной работы. Материалы исследования изложены на 147 страницах машинописного текста. В тексте приведено 30 таблиц и 7 рисунков. Библиографический указатель включает 161 источник литературы, из них 28 - зарубежной.

Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, выводов, списка использованной литература и приложения.

В первой главе приведены данные литературы по характеристике ресурсов торфа и сапропеля в Томской области, показана степень химической изученности содержащихся в них БАВ, а также медицинские аспекты использования этих веществ.

Вторая глава посвящена описанию объектов исследования и методов химико - фармакологического анализа.

В третьей главе изложены материалы сравнительного фитохими-ческого анализа основных групп БАВ, содержащихся в торфе и сапропеле месторождений Томской области, дана оценка их фунгистатиче-ской активности.

В четвертой главе приведены результаты углубленного химического исследования сапропеля и его биологически активного комплекса, дана оценка антигрибковых свойств выделенных из сапропеля фракций.

В пятой главе изложены вопросы оптимизации способа получения из сапропеля биологически активного комплекса, дано теоретическое обоснование подбора компонентов и технологии приготовления лекарственной формы.

Шестая глава посвящена изучению токсико - фармакологических свойств субстанции и мази на основе Iумата натрия.

Приложение включает проект ВФС «Сапропель», «Раствор гума-та натрия» и «5% мазь гумата натрия»; лабораторный регламент на производство мази «Пелоидерм», а также представлены акты внедрения результатов исследования, подтверждающие практическую с значимость проведенных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования.

Объектами исследования антифунгальных, противовоспалительных и ранозаживляющих свойств служили торф месторождения «Гу-севское» и сапропель озера «Карасевое» Томской области.

Торф указанного месторождения низинный осоковый - представляет собой плотную темно - бурую массу без запаха, со степенью раз-

ложения 35%, влажностью 82,5%, содержанием золы Э,4%. Его ботанический состав определяют осока волосистая (65%), вахта (15%), гипны (5%), осока бутыльчатая (5%) и неопределенные остатки (10%). Отбор проб торфа производился в сентябре 1995 года. Собранные образцы хранились в подвальном помещении при температуре +5+7°С.

Сапропель озера «Карасевое« по физико - химическим показателям относится к пресноводным бессульфидным среднезольным сапропелевым лечебным грязям. Геологические запасы составляют 453 тыс. м3. Внешне сырье представляет собой массу черного цвета со степенью разложения 60%, влажностью 91,4%, содержанием золы 35%. Отбор проб сапропэля производили также осенью 1995 года и хранили в условиях, указанных выше.

Для изучения антигрибковых и других фармакологических свойств БАВ содержащихся в торфе и сапропеле, а также получения на их основе лекарственных средств нами выделены и изучены в условиях in vitro более 70 различных экстрактов, фракций веществ, по-лисахаридных и фенольных комплексов, ряд индивидуальных веществ. В качестве тест - микроорганизмов использовали возбудителей основных грибковых заболеваний: дерматофитии, кандидоз и аспер-гиллез. Выделение и химическое изучение БАВ проводили с использованием современны -, физико - химических методов анализа, в т.ч. хроматографии ( бумажная, тонкослойная, градиентная), и инструментальных методов ана; иза. Для качественного исследования присутствующих в торфе и сапропеле БАЗ использовали метод хроматографии. Исследуемые вещества сравнивали со стандартными образцами.

2. Получение биологически активных комплексов из сапропеля и торфа и оценка их антигрмбковь.х свойств.

Для проведения сравнительного химического анализа основных групп БАВ и их антигрибковых свойств, из сапропеля и торфа на начальной стадии исследования были получены экстракты. В качество эктрагентов использовали горячую ( 98 - 100°С) и холодную воду (20°С), этанол (70%1, эт..пацетат, хлороформ, диэтиловый эфир и гексан. Полученные извлечения после высушивания исследовали на способность задерживать реет патогенных грибов. В результате установлено, что суммарные комплексы, выделенные из сапропеля и торфа, в предельных конце", рациях (1000 мкг/мл) не эффективны в отношении белой Кандида и черного аспергилла (табл.1). В то время как возбудители дерматофитии ( Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Мкгиь^чгит canis) весьма чувствительны к ним. Особенно обращают на себя внимание результаты для эчетрактоэ, полученных с помощью горячей воды. Их высокая способнсть задерживать рост указанных возбудите/Гей находилась на уровне таких из-

Таблица 1

АНТИГРИБКОВАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ САПРОПЕЛЯ И ТОРФА, МКГМ1

ЭКСТРАГЕНТ Вода 20 С Вода 98-100"С ИСТОЧНИК БАВ ТЕСТ - МИКРООРГАНИЗМЫ

Trichophyton rubrum Trichophyton mentagrophytes Microsporum cants Aspergillus nlger Candida albicans

сапропель 62,5-125 31,2-52,5 7,8-31,2 н/а н/а

сапропель 7,8-31,2 7,8-15,6 7,8-15,6 н/а н/а

Эганоп 70% сапропель 125-250 250-500 250-500 н/а н/а

Этилацетаг сапропель 500-1000 250-1000 125-500 н/а н/а

Хлороформ сапропель 500-1000 1000 1000 н/а н/а

/[илиловьтэфир___ Гексан сапропель 1000 1000 1000 н/а н/а

сапропель к/а н'а н/а н/а н/а

-

Пода 20'С________ Иода 93-1 (ЮС торф 125-250 62,5-250 62,5-125 н/а н/а

торф 15,6-62,5 15,6-31,2 15,6-31,2 н/а н/а

Эгшш 70%______ Пгилацетаг торф 250-500 500-1000 125-250 н'а н/а

торф 1000 н'а 500 н/а н/а

Хлороформ____ /[изгиповийсмирг_ Геке»!___________ Препараты сраинемия. с торф н/а 1000 500 н/а н/а

торф н/а н/а 1000 н/а н/а

торф н/а 500 500 н/а н/а

сашвиритрин Иигрофунгим фиэеофульвин .1,9-7,8 15 -31,2 7,8-15,6 1.9-3,9 15,6-31,2 3.9-7.8 3,9-15,6 7.8-31,2 3.9-7.8 7,8-31,2 1000 15,6-31,2 /50-500 1000

11РИМЕЧАНИЕ: н/а - фушисгажческого эффекта не наблюдалось при концентрации вещества 1000 мкг/мл

вестных противогрибковых препаратов, как гризеофульвин и нитро-фунгин ( 7,8 • 31,2 мкг/мл). Заметно ниже уровень антигрибковой активности был отмечен для экстрактов полученных холод"ой водой и этанолом.

Для экстрактов, полученных остальными растворителями ( этил-ацетат, хлороформ, диэтилово1Й эфир .ксан) указанный показатель в зависимости от тест - гриба находит . за пределами практически значимых уровней, или же совсем не проявлялся в предельных концентрациях (1000 мкг/ мл). Сравнение антигрибковой активности водных экстрактов ( вода 98-100°С) из сапропеля и торфа показывает несколько высший уровень активности для извлечения полученного из сапропеля. Данное обстоятельство в дальнейшем побудило нас рассматривать сапропель, как основной объект исследования.

Кроме выявления антигрибкового действия для БАВ экстрактов торфа и сапропеля, появлялся закономерный вопрос, а какая группа БАВ несет ответственность за указанное действие? Исходя из этого, в указанных объектах нами было установлено присутствие, а затем и выделены: гуминовые вещества, битумы ( боско - смоляной комплекс), водорастворимые, легко и трудногидролизуемые вещества, лигнин. Количественное содержание гуминовых и фульвокислот в сапропеле и торфе находилось соответственно в пределах 2,3%; 8,4% и 5,1%; 19,5%. Выход других фракций БАВ для торфа, в т.ч. водорастворимых "веществ, легко- и трудногидролизуемых веществ составил соответственно 11,3%; 34,2% и 7,8%. При этом содержание в этом же сырье битумов зафиксировано на уровне 4,3%; лигнина - 8,0%, диоксанового ■ экстракта 17,2% и диоксан лигнина 17,7%.

Изучение выделенных фракций на антигрибховую активность показало их неперспективность для дальнейшего практического применения, т.к. все они ингибиругат рост только возбудителей дерматофи-тии и в достаточно неперспективных концентрациях ( 62,5 - 1000 мкг/ мл). И только гумат натрия на этом фоне заметно выделяется, проявляя антигрибковые свойства на уровне нитрофунгина ( 7,8 - 15,6 мкг/ мл).

3. Химическое исследование сапропеля и выявление

биологически 'чтиьного комплекса

Выраженная антигрибковая активность, установленная для водного экстракта и гумата натрия из сапропеля озера Карасевое, послужила основанием для углубленного химического исследования, содержащихся в них БАВ. Параллельно решению еоретических вопросов, связанных с составом БАВ, преследовалась также цель выяснения класса или группы соединений ответственных за антигрибковое действие указанного источника БАВ. Используя известные методы, из сапропеля получали полисахари^ный и фенольный комплексы, фракцию каротиноидных пигментов и гуминоэые вещества, а после экс-

тракции сапропеля щелочными растворами натрия, калия и аммония получали соответствующие гуматы.

Полисахариды Выделение и исследование полисахаридного комплекса ( ПС К) показало, что в его состав входят нейтральные й кислые полисахариды. В указанном ПСК преобладают фракции водорастворимых полисахаридов ( ВРПС) и гемицеллюлозы А, составляющие в сумме 9,5%. Несколько меньшим о количественном отношении отмечено содержание гемицеллюлозы Б (ГЦБ) и особенно пектиновых веществ (0,3%). Методом бумажной хроматографии в продуктах кислотного гидролиза ПСК сапропеля установлено присутствие глюкозы, галактозы, арабинозы, рамнозг, ксилозы, манозы и галактуроновой кислоты. По качественному набору моносахаров отличается фракция пектиновых веществ в которой выявлено 5 моносахаров ( глюкоза, галактоза, арабиноза, ксилоза, галактуроновая кислота). По 4 компонента содержат фракции ВРПС и ГЦБ, а в составе гемицелюлизы А их представляют только арабиноза, галактоза и глюкоза.

Фенопьные соединения. После отделения полисахаридного комплекса, надосадочную жидкость сгущали под вакуумом и последовательно обрабатывали петролейным эфиром, хлороформом, этилацета-том, смесью хлороформ - этилацетат. Фракции органических растворителей отделяли от спирто - водной фазы и сушили безводным натрия сульфатом с последующим концентрированием под вакуумом. В каждой из указанных фракций, используя методы хроматографии, устанавливали присутствие фенолкарбоновых кислот, флавоноидов и кумаринов. В результате было установлено, что спирто - водная и этипацетатная фракции содержат 7 веществ, отнесенных к фенолкар-боновым кислотам, в т.ч. феруловую, и п- гидроксибензойную кислоты. В этилацетатной фракции было доказано также присутствие 4 веществ флавоноидной природы из которых идентифицировали кверци-тин и кемпферол. Качественными реакциями, г также хроматографией на бумаге и в тонком слое доказано отсутствие в сапропеле озера Карасевое кумаринов.

Г у миновые вещества. Выполненными экспериментами, кроме ПСК и фенольного комплекса, было доказано присутствие в сапрсЙ1е-ле и такой специфической группы , как гуминовые вещества, в составе которых на долю гуминовых кислот приходилось 3,6%, фульвокис-лот - 8,4%, гумата натрия - 2,7%. Выделенную фракцию гуминовых кислот исследовали методом ИК спектроскопии. В.результате было отмечено отсутствие разрешения в области 3900 - 3700 см-1 - поглощение метальных и этильных групп, что, по видимому, объясняется сложной структурой полимера. Четкие максимумы поггощения в области от 1300 до 950 см-' соответствуют валентным колзбаниям групп, связанных с гетероатомами ( С=Б, С = Р, Р = 0, С=N). С результате элементного анализа фракций гуминовых кислот урт&г'лвлен^ что на долю углерода приходится 49,10%, на долю водорода 5,52%,

азота - 3,68% и на долю с&ры - 0,69%. Приведенные показатели согласуются с данными литературных источников.

Каротиноиды. Эта обширная группа природных пигментов желтого или оранжевого цвета привлекла наше внимание в связи с тем, что по данным литературы отдельные ее представители обладают выраженным противогрибковым действием. В результате химического изучения было установлено, что в выбранном объекте исследования выход каротиноидов составляет 3,68 мг на 1 кг нативного сапропеля. Их качественный состав и спектральные характеристики представлены в таблице 2. Обращает внимание сравнительно малый качественный набор компонентов.

Антигрибковые свойства выделенных БАВ. Выделенные из сапропеля суммарные комплексы и индивидуальные БАВ, после изучения на антигрибковые свойства в условиях in vitro, позволили разделить их на перспективные и неперспективные. В число перспективных в полной мере можно отнести ПСК, который ингибировал рост возбудителей трихофитии и микроспории в концентрациях 7,8 - 31,2 мкг/мл, что соответствовало уровню известного препарата нитрофунгина. Примерно, на таком же уровне проявлялась антигрибковая активность гуматов, в то же время активность самих гуминовых и фульвокислот была значительно ниже (250 - 1000 мкг/мл). Достаточно активно рост указанных возбудителей подавляла фракция фенолкарбоновых кислот ( 15,6 - 62,5 мкг/ мл).По данному критерию ей заметно уступали каро-тиноидные пигменты (62,5 - 250 мкг/ мл).

Выполненный скрининг дал основание в качестве перспективной субстанции выбрать гумат натрия , с последующей отработкой технологической схемы его получения и разработкой лекарственной формы.

4. Способ получения нз сапропеля биологически активного комплекса и рззработка лекарственной формы.

Оптимизация способа получения и стандартизация гуиата натрия. Выполненные на предыдущем этапе углубленные химические исследования и установленные при этом результаты антигрибковой активности для полисахаридов, фенольных соединений, гуминовых веществ, каротиноидов, битумов и др., побудили нас найти оптимальные условия выделения гуминовых кислот из указанного источника сырья, путем изменения некоторых параметров известной методики. В результате было установлено, что повышение температуры уксусной кислоты до 50 °С ( вместо 20 °С) на стадии декальцинирования сапропеля повышает выход гуминовых кислот с 7,8 до 11,4%, а снижение ее концентрации от 0.1н до 0,05н, также увеличивало выход конечного продукта с 7,8 до 10,7%. Увеличение таких параметров, как объем уксусной кислоты и вреы! декальцинирования, практически не

Тзблица 2

СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАРОТИНОИДОВ ВЫЯВЛЕННЫХ В САПРОПЕЛЕ ОЗЕРА КАРАСЕВОЕ

Пимент Е 1% 1 см Максимумы поглощений,нм Молекулярный ион

гексан бензол хлороформ этанол

1 2 3 4 5 6 7

1. Миксоксан- тофилл (оранжевый) 2500 428, 455, 485 445, 471, 503 856

2 Зеаксантин (желто -оранжевый) 2350 422, 445, 484 430, 462, 489 423, 451. 483 568

3. Пигмент -463(кирпично - оранжевый) 444, 463, 491 463 450

4, Лютеин (желтый) 2160 429, 447, 475 429, 454, 485 346, 428, 456 425, 450, 478 586

5. Антеро-ксантим (лимон желтый) 2250 342, 422, 448, 475 428, 462, 494 424,460 346, 447, 472 584

6 Кантаксан-тнн (кирпично - красный) 2200 467 485 482 480 564

7 Эхмненон (оранжевый) 2158 458 475 473 470 550

влияют на выход гуминовьРх кислот. Изменение концентрации натрия гидроксида, его температуры и объема, при обработке сапропеля, не позволили превысить выход гуминовых кислот в сравнении с классической методикой.

После внесения изменений в методику количественного определения гуминовых кислот в салропеле, их содержание в данном источнике зафиксировано на уровне 7,8 - 8,9%. Из других показателей качества сырья следует отметить, что потеря в массе при высушивании не превышает 90%, содержание золы общей до 24%, золы не растворимой в 10%-ом растворе кислоты хлористоводородной не превышает 16%. Содержание таких примесей, хак глина и песок укладывалось до 35%, а обменная кислотность зафиксирована на уровне 7,5%. Полученные величины, наряду с качественными реакциями были использованы при разработке проекта ВФС- «Сапропель».

Факт плохой растворимости гуминовых кислот в воде и, как следствие, низкий уровень антигрибковой активности, побудил нас получить их натриевую соль ( гумат натрия). С этой целью, на последней стадии выделения гуминовых кислот, их осадок ( после промывания и центрифугирования) в количестве 33.7 г растворяли в 33,5 мл 0,1н раствора натрия гидроксида. Полученный раствор смешивали с 33,5 мл воды и тщательно перемешивали мешалкой. По внешним признакам раствор гумата натрия представляет собой жидкость темно- коричневого цвета, со специфическим запахом, мылкую на ощупь, во всех отношениях смешивающуюся с водой, этанолом, растворами щелочей, не смешивающуюся с хлороформом и гексаном. Его стандартизацию было предложено проводить по содержанию гуминовых кислот. Их количество в гумате натрия колеблется в пределах от 3,0 до 3,3% и практически не меняется в процессе хранения субстанции в течение года. В то же время в ходе экспериментов было установлено, что гумат натрия кьляется очень термолабильным комплексом и его антигрибковая активность зависит от температурного режима сушки. Данное заключение достаточно наглядно демонстрируют результаты, представленные в таблице 3, из которой видно, что на рост возбудителей дерматофитий наибольший ингибирующий эффект оказывает гумат натрия высушенный конвективным и сублимационным способом.

Теоретическое обоснование компонентного состава и разработка мази <гПелоидермПолученные и отмеченные выше экспериментальные данные по химическому составу и антигрибковым свойствам БАВ сапропеля, поспужили основанием для разработки лекарственного средства «Пелоидерм». В его основе хорошо растворимый о воде комплекс гуминовых кислот - гумат натри". Для отработки оптимального варианта мази было изучено 6 различных прописей, которые отличались между собой количественным содержанием компонентов эмульсионной основы ( ланолин б/в, вазелин, вода), глицерина, гуминовых кислот, гумата натрия и витамина А. В результате свой выбор

Таблица 3.

АНТИГРИБКОВАЯ АКТИВНОСТЬ ГУМАТА НАТРИЯ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТЕМПЕРАТУРНОГО РЕЖИМА ЕГО СУШКИ (мкг/ил)

ГУМАТ НАТРИЯ ТЕСТ-ГРИБЫ

№ Способ сушки Темп, режим (°С) ТлсЬорЬуйп гиЬгит ТлсЬорИуЬп шеп1адгорНу1ез Мгсгохрогит сап!з АзрегдШи5 т'дег СатМа а!Ы-сагю

1 кошакшый 35-40" 1000 500 1000 н/а н/а

2 вакуумный 40-45° н/а н/а н/а н/а н/а

3 конвективный 26-28" 15,6 7,8 7,8 н/а н/а

4 сублимационный -60"+30° 31,2 31,2 15,6 н/а н/а

5 Раствор гумата натрия 7,8 3,9 3,9 н/а к/а

ПРИМЕЧАНИЕ: н/а- антигрибковай активности не наблюдалось при концентрации вещества в 1000 т/ил

мы остановили на следующей прописи: ланолина б/в - 15,0 ; вазелина - 65,0; воды - 5,0; глицерина - 9,5; гумата натрия - 5,0; витамина А -0,5. Полученная мазь мягкой консистенции, кофейного цвета с рН = „ 5,5. Схема технологического процесса получения мази «Пелоидерм» представлена на рисунке 1. Подлинность препарата определяется специфическими реакциями на ион натрия и на присутствие гуминовых кислот. Наличие последних подтверждается ИК - спектральным методом. Об их присутствии свидетельствуют четкие максимумы поглощения в области от 1300 до 950 см1, что соответствует е лентным колебаниям групп, связанных с гетероатомами ( С=Р, C=S, Р=0, C=N). Из других показателей, характеризующих качество мази, следует отметить рН = 5,5 и термостабильность , которую оценивали по величине отстоявшегося слоя. Для мази »Пелоидерм» этот показатель составляет 1% от общей высоты, т.е. термостабильность для предлагаемого дерматологического средства составила 99%.

Выше перечисленные показатели, характеризующие качество мази, в числе других необходимых фрагментов, легли в основу разработанного проекта ВФС - мазь «Пелоидерм» и лабораторного регламента на мазь (Пелоидерм».

5. Токсико - фармакологическое изучение

субстанции и 5% мази гумата натрия («Пелоидерм»)

Полученный по модифицированной методике из сапропеля гумат натрия и разработанная на его основе 5% мазь, изучены: на острую токсичность, противовоспалительную активность, влияние на процессы репаративной регенерации в коже и антимутагенные свойства.

Острую токсичность гумата натрия сухого и гумата натрия с влажное.ыо 96,7% изучали на 38 белых мышах при введении внутри-брюшинно и внутрь по Литчфильду - Уилкоксону. Результаты выполненных исследований показали, что средняя смертельная доза (ЛДю) для мышей при внутрибрюшинном введении составила: для гумата натрия сухого - 525 '456:603) мг/кг, для гумата натрия водного - 1300 ( 765 : 2210) мг/ кг. Следовательно, изученный гумат натрия из сапропеля по классификации Сидорова К.К. относится к IV классу мало-ток сичных веществ и характеризуется, как продукт малотоксичный. Низкая токсичность гумата натрия была подтверждена и при его введении внутрь.

Противовоспалительную активность гумата натрия ( сухого и влажного) изучали на 150 крысах. В 5 сериях опытов влияние исследуемого средства изучали в сравнении с ортофеном на воспаление лапок крыс, вызваннное каррагенином, гистамином, серотонином, брадикинином и простагландином в динамике. В результате выполненных исследований установлено, что гумат натрия статистически достоверно уменьшает каррагениноаый отек лапок крыс ( табл. 4), en

ТС-1

приготовление эмульсионной основы

ТС-2

приготовление мази

тс-з стандартизация мази

ТС-4 фасовка и оформление

ТО 1.1. подготовка основы

ТО 1.2. расплавление дадолива

ТО 1.3. приготовление в эмульгирование водно • гднаеринового р^-твора

ТО 1.4. введение вазелина

ТО 1.5. эму.тьгнрование основы

ТО 2.1. введение гумата натрия и витамина А

ТО 2.2. гомогенизация

ТО 3 .1. измерение рН

ТО 3.2. исследование кч

ТО 3.3 термосгабилъностъ

ТО 3.1. | подготовка тары

ТО 3.2. заполнение тары

ТО 3.3. оформление

готовый продукт

Рисунок ^

СХЕМА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ МАЗИ «ПЕЛОИДЕРМ»

Таблица 4.

ВЛИЯНИЕ ГУМАТА НАТРИЯ НА ВОСПАЛЕНИЕ ЛАПОК КРЫС, ВЫЗВАННОЕ КАРРАГЕНИНОМ (п=6)

№ ПРЕПАРАТЫ И ДОЗЫ ПРИРОСТ ОБЪЕМА ЛАПОК В МЛ ЧЕРЕЗ о

П/П ВЫГ/КГ 1ч Зч бч 12ч 24 ч 48 ч 72 ч

1 Гумат мафия сухой, 50 0,1110,03 0,1510,04 0,1710,02 0,1710,04 0,1310,05 р< 0,001 0,0510,01 р< 0,05 0,0510,01 р< 0,001

2 Гумат натрия водный, 50 0,21 и 0,05 0,24 Ю, 06 0,2510,05 0,19Ю,05 0,1910,00 р< 0,001 0.12Ю.03 0,0510,007 р<0,01

3 Ортофеи, 10 0,1510,03 0,1410,03 0,0910,Об р< 0,05 0,0910,04 р< 0,05 0,0910,04 р< 0,001 0,0710,03 0,0510,01 р< 0,05

4 Кошроль 0,1910,05 0,2310,04 0,2310,04 0,3010,05 0,6510,05 0,1710,05 0,1510,03

11РИМЕЧА11ИЬ: здесь и далее р - по сравнению с контролем

действие проявляется а основном начиная с 24 часов воздействия флогогена ( р<0,001), в то время как препарат сравнения ортофен противовоспалительное действие оказывал в более ранние сроки -начиная с 6-ти часов. Таким образом, на момент каррагенинового воспаления гумат натрия из сапропеля был менее активным, чем ортофен. В опытах с воспалением лапок крыс вызываемым гистамином, серотонином, простагландином и брадикинином было также доказано, что гумат натрия статистически достоверно угнетает отек, при этом сухой гумат был несколько более эффективен, чем гумат натрия водный.

Таким образом, гумат натрия из сапропеля оказывает противовоспалительное действие за счет антигисттминного, антисеротонино-вого, энтибрадикининового и антипростагландинового эффектов. В серии других опытов было установлено, что исследуемый гумат натрия статистически достоверно угнетает эксудативную и пролиАера-тивную фазу воспаления ( р<0,002 и р<0,01 соответственно).

Влияние гумата натоия на процессы репаоативной регенерации в коже. Кроме выше отмеченных фармакологических тестов в экспериментальных условиях, на 24 мыизх были изучены ранозажив-ляющие свойства 5% раствора гумата натрия. В результате установлено, что исследуемый пре арат подобно синтомициновой эмульсии статистически достоверно уменьшал площадь раны на 7 и 15-й день (рсО.002), с полным заживлением раны на 18 и 17 день соответственно.

В специальной серии опытов на 40 крысах было изучено влияние гумата натрия ( в виде лекарственной формы) на процессы репара-тивной регенерации в коже. В качестве препарата исследования была использована вышеописанная мазь «Пелоидерм». В результате установлено, что исследуемая 5% мазь гумата натрия («Пелоидерм») ускоряет регенерацию экспериментальных ран у крыс на 4 дня , в сравнении с маслом облепиховым. Раны, леченые мазью «Пелоидерм» и маслом облепиховым, полностью закрывались эпителиальной тканью на 7 и 11 сутки соответственно. У нелеченных животных заживление раневого дефекта произошло по истечении 26 суток.

Антимутагенная активность. Антимутагенные свойства гумата натрия из сапропеля изучали: на фоне ионизирующей радиации; после введения противоопухолевых агентов( препаратов); при инфекционном мутагенезе и при введение 3,4 - бенз(а)пирена. В результате установлено, что гумат натрия проявляет выраженные антимутагенные свойства на фоне экспериментального радиационного воздействия. Он.снижает уровень эритроцитов с микроядрами у мышей на 22 - 46% по пе введения им противоопухолевых препаратов ( табл.5). Нормализация цитогенетического аппарата мышей при введении гумата натрия наступала на 1-4 дня раньше, чем без него. Наиболее выраженное его действие проявлялось у животных, получавших тиофосфамид,

Таблица 5

ВЛИЯНИЕ ГУМАТА НАТРИЯ НА УРОВЕНЬ ЭРИТРОЦИТОВ С МИКРОЯДРАМИ У МЫШЕЙ НА ФОНЕ ВВЕДЕНИЯ ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ

ИССЛЕДУЕМЫЙ ПРЕПАРАТ, СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ И ДОЗА УРОВЕНЬ ЭРИТРОЦИТОВ С МИКРОЯДРАМИ, В СУТКАХ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА %

1 2 4 5 7 9 12 15

Контроль (интактные животные) 2.И0.3 2.21 С. 1 2,610,1 2,010,2 2,310,2 2,110,4 2,010,2 1,910,2 2,ЗЮ,5

Циклофосфан, в/б, 5С ..г/кг 2,310,6 4,6±1,2 5,311,4 3,8+0,8 2,310,5 2,210,7 2,410,6 2,010,1 2,110,3

Циклофосфан и гумат натрия, внутрь, 1 Оьу/кг 2,210,5 3,110,6 3,910,8 2,2±0,4 2,110,5 2,010,3 2.010,5 2,210,4 2,1 ±0,2

Цитарабин, в/б, ЮОмг/хг 2,6 Ю,3 4,011,0 4,310,8 3,510,7 2,910,5 2,410,5 2,310,4 2,010,3 2,110.3

Цитарабин и гумат натрия, ш'б. 10ш/кг 2,310.4 4,110,9 3,010,6 2,910,7 2,410,4 2,010,3 2,310,4 2,210,3 2,410,5

Продолжение табл. 5.

ПРЕПАГАТ 1 2 3 4 5 7 9 12 15

Тиофосфамид, в/б, 25мг/кг 2,110,3 4,2±1,2 4,6±1,3 3,8±0,9 3,110,5 2,410,5 2,1 ±0,4 2,3±0,5 2,1 ±0,6

Тиофосфамид и гуиат натрия, в/б, Юыг/кг 2,210,4 2;8Ю,4 2,4±0,8 2,8±0,8 2,210,5 2,310,7 2,110,3 2,1 ±0,4 .2,410,1

Карминомицин, в/б, 0,5мг/кг 2,210,5 4,8±1,2 6,5±1,2 7,311,3 6,1 ±1,4 4,2±1,0 3,7Ю,7 2,2.М),3 2,4±0,5

Карминомицин и гума* натрия, внутрь, 10мг/кг 2,310,3 2,910,4 3,410,7 4,710,8 4,210,9 3,310,7 2,910,4 2,310,5 2,1±0,4

Рубомнцин, в/б, 2,5мг/кг 2,6Ю,3 3,810,9 4,611,2 4,311,1 3,710,8 2,910,7 2,610,4 2,010,3 2,4±0,6

эРубомицин и гумат натрия, внутрь, 10мг/кг 2,110,4 2,610,4 3,110,6 3,410,8 2,810,7 2,110,4 2,3*0,6 2,010,3 2,1 ±0,5

Блеоыицин, в/б, 1,0мг/кг 2,310,4 4,111,0 4,911,1 4,611,2 3,310,8 3,010,5 2,810,4 2,110,3 2,310,6

Блеомицин и гумат ма-трия, внутрь, 10мг/кг 2,210,4 2,810,5 3,510,9 2,910,5 2,310,4 2,110,7 2,4-. 2.310,6 2,1±0,3

хогда снижение уровня эритроцитов с михроядрами достигало уровня 47,8%.

Исследования антимутагенной активности гумата натрия при инфекционном мутагенезе показали, что при введении оспенной вакцины максимальное повышение уровня эритроцитов с михроядрами наблюдалось на 4-ый день после начала эксперимента, а при введении гумата натрия на фоне той же вакцины указанный показатель был отмечен на 2 ¿ень и постепенно снижаясь до контрольных значений к 7-му дню. В то же время, при действии оспенной вакцины *ез гумата натрия, нормализация наступала только на 12-ый день эксперимента. При введении живой паротитной вакцины и гумата натрия, уровни эритроцитов с микроядрами не отличались ог контрольных значений во все дни эксперимента. При введении животным 3,4-бенз(а)пирена, обладающего выраженной мутагенной активностью было установлено, что уровень эритроцитов с микроядрами начинает1 повышаться с 3-го дня эксперимента и достигает максимума на 7-ой день. В группе животных, получавших гумат натрия в дозах 200 и 400 мг/кг, указанный показатель хотя и был несколько выше, но достоверно от контроля не отличался. Незначительное повышение количества эритроцитов с микроядрами при введении гумата натрия в дозе 400мг/ кг объясняется, видимо, прибпижемием этой дозы к токсической ( 500 мг/кг).

выводы

Впервые для торфа и сапропеля месторождений, расположенных на территории Томской области определено содержание основных групп биологически активных веществ: гуминовые кислоты в количестве 5,1% (торф) и 2,3% (сапропель); фульвокислоты - 19,5% (торф) и

1. 8,4 % (сапропель); гумата натрия - 4,9% (торф) и 2,8% (сапропель); битумы - 4,3% (£орф); лигнин - 3,0% (торф); диоксан - лигнин - 17,7% (торф). становлены антигрибковые свойства указанных соединений и выявлены перспективные из них - гумат натрия, подавляющий рост возбудителей дерматофитий в концентрации 7,8 - 31,2 мкг/мл.

2. Показано, что выделенные из сапропеля озера Карасевое полисахариды ( 4,7%) представлены такими моносахарами, как: глюкоза, галактоза,-арабиноза, рамноза,'ксилоза, маноза, галактуроновая кислота; фенольные соединения - фенолкарбоновыми кислотами (фе-руловая, п- гидроксибензойная, 5 неидентифицированных веществ) и флавоноидами ( кверцитин, кемпферол, 2 неидентифицированные вещества); каротиноиды представляют пигменты миксоксантофил, пигмент 463, лютеин, зеаксанткн, антероксантин, кантоксантин и эхе-ненон;

3. В пределах группы биологически активных веществ, выделен- . ных из сапропеля ( полисахариды, фенольные соединения, гуминовые вещества, каротиноиды) установлено, что для дальнейшей разработки противогрибкового препарата перспективным является гумат натрия, который в условиях эксперимента задерживает рост Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes и Microsporum canis в концентрациях ( 3,9 - 15,6 мкгI мл), что находится на уровне или превышает активность таких известных препаратов как гризеофульвин и нитрофун-гин. Выделенная натриевая соль гуминовых кислот не задерживала в перспективных концентрациях рост белой кандиди и черного аспер-гилла.

4. Исследовано влияние физико - химических факторов (концентрация, объем и температура экстрагента, время экстракции) на выход и антигрибковые свойства гумата натрия. Установлено, что из указанных факторов на выход конечного продукта, заметно влияет концентрац .я и температура уксусной кислоты на стадии декалъцини-рования сапропеля. Антигрибковые свойства в значительной степени зависят от температуры сушки гумата натрия. Указанные параметры ( уксусная кислота - 0,05н при t + 50°С, сушка при t + 26-28°С) заложены в разработанный лабораторный регламент на мазь »Лелоидерм».

5. Доказано, что выделенный по разработанной технологии гу-Ь'.ат натрия, на фоне низкой токсичности (IV класс), обладает кроме антигрибковой активности выраженными ранозаживляющими и противовоспалительными свойствами. Полученная субстанция оказывала также выра~енный антимутагенный эффект на фоне действия проти-

воопухолевых и цитостатических препаратов, при ионизирующей радиации, действии инфекционных агентов и на фоне 3,4 • бенз(а)пирена.

6. Теоретически обоснован и экспериментально доказан оптимальный состав 5% мази гумата натрия - сПелоидерм», которая может быть рекомендована для дальнейшего изучения и применения в качестве средства для лечебного массажа, лечения трихофитии, микроспории, хромоты ног и маститов у крупного рогатого скота.

7. Разработаны проекты ВФС на сырье, субстанции мазь сПелоидерм», включая лабораторный регламент ее получения.

Основное содержание диссертации опубликовано

в следующих работах:

]. Дмитрук С.Е., Карбышев A.B., Бабешииа Л.Г. Поиск антигрибковых средств среди биологически активных веществ торфа и его образо-вателей// Тез. докладов II Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». -М.: РЦ «Фармединфо». - 1995. - С.234 2. Растительные средства в терапии микозов/ С.Е. Дмитрук, С.Г. Ми-левская, A.B. Карбышев и др.// Тез.Ill международ, микологического симпозиума «Патогенез, диагностика и терапия микозов и'микоген-ной аллергии.»- С. Петербург, 1995.- С.44.

. 3. Антигрибковые свойства растительных полисахаридов/

С.Е.Дмитрук, E.H. Сальникова, А.В.Карбышев и др.// Тез. докл. на-учн.конф. «Актуальные проблемы фармации.» - Рарнаул, 1995. -С.157-160.

4. Антигрибковые свойства экстрактов торфа i его фитохимическое исследование/ A.B. Карбышев, С.Е. Дмитрук, В.В. Смородин и др.// Тез докл. научн.-практ. конф. посвящ.^ 25-летию фарм.фак-та.- Самара, 1996.- С.121-122.

5. Влияние гуминового комплекса из торфа на рзпаративные процессы в коже/ Р.Р.Исматова, Х.М.Насыров, P.P. Исматов и др.// Сб. матер.научн.конф., юсвящ. памяти проф. Березнегозской Л.Н.- Теоретические и практические аспекты изучения лекарственных растений. - Томск, 1996. - С.77 80.

6. Выделение, изучение антигрибковых свойств биологически активных веществ торфа и сапропеля Томской области/ С.Е. Дмитрук, А.В.Карбышев, О.В. Якушева и др.11 Сб.матер.научн.конф., посвященной памяти проф. Березнеговсксi Л.Н. - Теоретические и практические аспекты изучения лекарственных растений,- Томск, 1996.-С.61-64.

7. Дмитрук С.Е., Дмитрук С.И., Карбышев A.B.. Теоретическое обоснование и реальные возможности фитотерапии микозов стопII Сб. матер. Всерос. конф.»От MaTepia medica к современным медицинским технологиям».- С.-Петербург, 1998 -С,49.

8. Дмитрук С.Е., Дмитрук С И., Карбышев A.B. Медицинские аспекты практического использования антигрибкозых свойств растений Сибири// Сб. натер.междунар.совещания, посвящ. памяти проф. Минаевой В.Г. - Новосибирск, 1998.- С.112-113.

9. Карбышев A.B., Дмитрук С.Е., Насыоов Х.М. Фармацевтические аспекты практического использования (ь.ологически активных вещестр сапропеля// Природные и интеллектуальные ресурсы Сибири:

Тез.докл.4-й междунаро£..научн.-практ.конф.-Барнаул, 1998.-С.211-212.

ю. Химический состав и фармакологические свойства биологически активных веществ сапропеля/ Карбышев A.B., Дмитрук С.И., Васильев A.C., Дмитрук C.E.II Тез.докл.междун. конф.»Фармация в XXI веке: инновации и традиции.» - С.-Петербург, 1999. - С.160.

11. Методы фармакогностического анализа лекарственного растительного сырья/Дмитрук С.Е., Калинкина Г.И., Гусев И.Ф., Гришин

A.B., Карбышев A.B., Сальникова E.H., Смородин В.В., Тихонов

B.Н.// Методическое пособие для лабораторных занятий. - Томск: СГМУ;1999. - 38 с.

12. Дмитрук С.Е., Карбышев A.B., Исматова P.P. Химический состав и возможности применения в медицине торфа и сапропели'^Методи-ческая разработка для преподавателей и студентов. - Томск: СГМУ, 1998. - 15 с. „ ' /