Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Характеристика ядрышкового антигена клеток человека, выявляемого новым моноклональным антителом

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВ АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ХАРАКТЕРИСТИКА ЯДРЫШКОВОГО АНТИГЕНА КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, ВЫЯВЛЯЕМОГО НОВЫМ МОНОКЛОНАЛЬНЫМ АНТИТЕЛОМ.

14 00.29. - гематология и переливание крови 03.00 04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

003171131

Работа выполнена в Государственных некоммерческих учреждениях «Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук» и «Институт биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова Российской Академии Наук»

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Т И Булычева,

Доктор биологических наук, профессор О В Зацепина ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ Доктор медицинских наук, профессор В М Погорелов Доктор биологических наук А В Филатов ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Российский онкологический научный центр имени Н Н Блохина РАМН, Москва

У CJ Í-

Защита диссертации состоится « л/f » 'UtVf-t9l- 2008 года в /7 часов на заседании диссертационного совета Д 001 042 02 при Государственном учреждении «Гематологический научный центр» Российской Академии Медицинских наук по адресу 125167, Москва, Новозыковский проезд, дом 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения «Гематологический научный центр» Российской Академии Медицинских наук

Автореферат разослан «_» _ 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Е Е Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Ядрышко эукариотической клетки является динамической структурой, в которой происходят транскрипция рибосомных генов (рДНК), процессинг рРНК и сборка прерибосомных субъединиц Кроме того, эта органелла принимает участие в процессах пролиферации, клеточного старения и апоптоза Известно, что структурное состояние ядрышка зависит от уровня метаболизма и способности клеток к пролиферации Поэтому морфология ядрышек, а также его отдельных компонентов в митозе (ядрышковых организаторов) часто принимаются во внимание в медицинской практике для уточнения прогноза течения заболевания и выбора адекватного курса лечения Хорошо известно, что состояние ядрышка изменяется в ответ на стрессовые воздействия или после обработки токсическими веществами, подавляющими, например, синтез рРНК или влияющими на уровень фосфорилирования ключевых ядрышковых белков Однако в современной литературе содержатся лишь отдельные сведения о реакции ядрышка на действие ингибиторов белкового синтеза, включая те из них, которые вызывают гибель клеток путем апоптоза

Согласно последним данным масс-спектрометрического анализа, в составе ядрышка присутствует около 700 белков, которые в зависимости от аминокислотного состава или функциональной значимости могут быть объединены в несколько основных групп. Одна из таких групп включает белки, принимающие участие в регуляции транскрипции рибосомных генов (рДНК) и входящие в состав транскрипционного комплекса РНК полимеразы I Общим свойством белков этой группы является прочная связь с рДНК, которая сохраняется не только в активных ядрышках в интерфазе, но и во время митоза, когда транскрипция рДНК прекращается Известно, что некоторые из этих белков изменяют локализацию в ответ на действие химических агентов или физических факторов Определение реакции белков ядрышка к действию стрессовых агентов, таких, как ингибиторы транскрипции рибосомных генов и синтеза белка, лежит в основе изучения механизмов их действия на нормальные и опухолевые клетки человека.

Одним из подходов к изучению ядрышка является изучение его белков на иммуноцитохимическом уровне, в основе которого лежит использование специфических - поликлональных или

моноклональных антител. В лабораторных условиях моноклональные антитела (МКА) обычно получают путем иммунизации животных очищенными антигенами или клеточными структурами с дальнейшим применением методов гибридомной биотехнологии Этим путем были получены МКА к ядерным белкам В23/нуклеофозмину, Ki-67, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) и др

Способность антител специфически узнавать антигены активно используется при изучении свойств и функций белков Однако панель антител к белкам ядрышка, обладающих высокой иммунореактивностью и видовой специфичностью, пригодных для проведения медико-биологических исследований, в настоящее время является достаточно ограниченной В связи с этим, целенаправленное получение новых МКА к ядрышковым антигенам клеток человека с целью их дальнейшей идентификации представляет несомненный как научный, так и практический интерес.

Целью работы явилась изучение иммуноцитохимических особенностей ядрышкового антигена, выявляемого новым моноклональным A3, в клетках человека с различным уровнем пролиферации, а также реакции A3 антигена на обработку клеток ингибиторами белкового синтеза

Задачи работы.

1 Отработать оптимальные условия иммуноцитохимического окрашивания ядрышкового антигена новым моноклональным антителом, названным «МКА A3».

2 Определить видовую и тканевую специфичность МКА A3, а также описать локализацию A3 антигена в разных типах клеток человека и на основных стадиях клеточного цикла

3 Изучить локализацию антигена A3 при активации лимфоцитов периферической крови здоровых доноров к пролиферации с помощью стимуляции фитогемагглютинином (ФГА).

4 Изучить влияние ингибиторов синтеза белка (анизомицина, пуромицина и циклогексимида) на локализацию A3 антигена

5. Исследовать колокализацию A3 антигена с известными белками ядрышка клеток человека до и после действия на клетки ингибиторов белкового синтеза.

6 Определить взаимосвязь между изменениями в локализации АЗ антигена и гибелью клеток, вызываемую подавлением синтеза белка

Научная новизна. С помощью нового моноклонального антитела, секретируемого мышиной гибридомой АЗ, выявлен антиген, располагающийся в ядрышках клеток человека, обладающий четкой видовой специфичностью, названный "АЗ антиген", и имеющий основные свойства, характерные для компонентов комплекса РНК полимеразы I Дана характеристика и выявлены особенности АЗ антигена Показано, что в пролиферирующих клетках человека в отличие от покоящихся АЗ антиген выявляется в виде многочисленных дискретных фокусов, расположенных исключительно в зоне ядрышка. Количество фокусов АЗ антигена уменьшается при ингибировании транскрипции рДНК Отличительной особенностью АЗ антигена является его высокая лабильность, которая проявляется в его миграции из ядрышка в нукпеоплазму под действием ингибиторов белкового синтеза Обнаружено, что изменения в локализации АЗ антигена предшествуют массовой гибели клеток путем апоптоза, что позволяет рассматривать этот феномен как маркер ранних стадий апоптотической гибели клеток человека в культуре

Обнаружено, что при длительном культивировании (в течение 4-6 месяцев) человеческих клеток НеЬа наблюдается спонтанная «миграция» АЗ антигена из ядрышка в нукпеоплазму, что сопровождается повышением чувствительности культуры к внешним воздействиям.

Теоретическое и практическое значение.

Выявлен ядрышковый антиген белковой природы, названный АЗ антиген, обладающий не только видовой специфичностью, но и способностью изменять локализацию под действием ингибиторов белкового синтеза, что дополняет фундаментальные представления о свойствах белков ядрышка.

Разработан метод объективной визуальной оценки общего состояния культур клеток человека , определяемого по локализации АЗ антигена Показано, что появление клеток с атипичной -внеядрышковой - локализацией АЗ антигена указывает на "старение" клеток и их повышенную чувствительность к внешним воздействиям.

Видовая специфичность МКА A3 может оказаться полезной для выявления возможной контаминации культур клеток человека клетками другой видовой принадлежности.

Высокая реактивность в иммуноцитохимических реакциях позволяет использовать МКА A3 в качестве положительного контроля в клинико-лабораторных исследованиях при тестировании различных антител

Изменения в локализации A3 антигена, наблюдаемые при ингибировании синтеза белка, позволяют использовать этот феномен при изучении механизмов действия новых антибиотиков и цитостатических препаратов, а также оценке их способности ингибировать синтез белка в опухолевых клетках человека in vitro. Положения, выносимые на защиту:

1 Антиген, выявляемый МКА A3, является ядрышковым белком, относящимся к комплексу РНК полимеразы I

2 Обработка клеток ингибиторами белкового синтеза (анизомицином, пуромицином или циклогексимидом) приводит к миграции A3 антигена из ядрышка в нуклеоплазму, где он локализуется в виде дискретных фокусов

3 Изменения в локализации A3 антигена относятся к ранним маркерам апоптотической гибели клеток человека в культуре

4 Длительное культивирование клеток HeLa приводит к спонтанной релокализации A3 антигена из ядрышка в нуклеоплазму Апробация работы.

Основные положения диссертации были представлены в виде постерных докладов на конференции Annual BIOCITY Symposium CELL STRESS, (Turcu, Финляндия) в августе 2006 , а также на VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва) в сентябре 2006 г. Диссертационная работа апробирована 24 декабря 2007 на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология, гемобластозы и депрессии кроветворения» ГУ ГНЦ РАМН

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на _ страницах машинописного

текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных данных, заключения, выводов и библиографического указателя. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами, 2 гистограммами и 21 фотографией

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали клетки человека как монослойных, так и суспензионных культур, включая клетки В-лимфобластоидной линии Ramos, первичные фибробласты человека, клетки карциномы шейки матки HeLa Клетки выращивали на покровных стеклах или в матрасах и использовали в экспоненциальной фазе роста

Использовали также лимфоциты здоровых людей в двух вариантах, неактивированные (интактные) и стимулированные фитогемагглютинином (ФГА) Для этого лимфоциты выделяли из венозной крови доноров с помощью градиентного центрифугирования на фиколле (d=l,077 г/смЗ, Pharmacia, Швеция), дважды промывали средой RPMI 1640 и помещали в среду RPMI 1640, содержащую 10% пуловой сыворотки человека AB (1Y) группы, 0 01 М буфера HEPES, глутамин и гентамицин Для стимуляции лимфоцитов добавляли 50 мкг/мл ФГА (Difco, США) Культивирование производили в пластиковых матрасах из расчета 1 млн лимфоцитов в 1 мл среды при 37° С в течение 16 ч, 45 ч и 72 часов В качестве контроля использовали лимфоциты, которые культивировали в тех же условиях без ФГА

После фиксации клеток препараты отмывали стандартным фосфатным буфером PBS, обрабатывали 0 5%-ным Тритоном Х-100 на PBS в течение 10 мин, отмывали в PBS 3 раза по 5 мин и инкубировали во влажной камере с МКА A3 в течение 1 ч при комнатной температуре После отмывки в трех сменах PBS по 10 мин клетки метили антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с TRITC или FITC, при комнатной температуре в течение 40 мин

Препараты изучали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия), используя фазово-контрастный объектив ПланАпохромат ЮОх (числовая апертура 1 3) и соответствующий набор фильтров Некоторые препараты изучали под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом LSM510 (Карл Цейсс, Германия), используя гелий-неоновый лазер (длина волны - 543 нм) и аргоновый лазер (длина волны 483 нм) для возбуждения флуоресценции в красной и зеленой областях спектра, соответственно

Инкубацию клеток с анизомицином (100 мкМ), пуромицином (100 мкг/мл), циклогексимидом (100 мкг/мл) или эметином (100мкг/мл) производили в течение 1-4 ч при 37° С до фиксации клеток

Для колокализации A3 антигена с другими белками ядра и ядрышка клетки HeLa метили МКА A3 и антителами к UBF (специфический ко-фактор РНК полимеразы I), NoppMO (неспецифический ко-фактор РНК полимеразы I), фибрилларину (фактор раннего процессинга пре-рРНК) или коилину (маркер телец Кахала) После отмывки в трех сменах PBS по 10 мин производили мечение вторичными антителами. Для выявления UBF и фибрилларина использовали антитела к иммуноглобулинам человека, конъюгированные с TRITC или FITC. Для выявления Noppl40 и коилина использовали антитела к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с TRITC или FITC Клетки отмывали от вторичных антител в трех сменах PBS по 10 мин и окрашивали 0 1 мкг/мл DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиндол) в течение 10 мин, отмывали в PBS и заключали в Мовиол

Фрагментацию ядерной ДНК выявляли с помощью метода TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling), используя набор реагентов «Túnel Apoptosis Detection Kit» (Upstate, США) и следуя рекомендациям производителя Клетки HeLa фиксировали 4%-ным параформальдегидом на PBS в течение 15 мин, отмывали PBS 3 раза по 10 мин и обрабатывали 0 5%-ным Тритоном Х-100 15 мин при комнатной температуре В качестве позитивного контроля использовали клетки, инкубированные 60 мин в PBS, содержащем 2-5 мкг/мл ДНКазы I, а затем - 15 мин в PBS без нуклеазы Клетки инкубировали с реакционной смесью, состоящей из биотинилированного dUTP (Bio-dUTP), TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) и TdT-буфера, 60 мин при 37° С После отмывки в PBS инкубировали с МКА A3 (45 мин), а затем - в смеси авидина, меченного FITC, и антител к IgG мыши, меченных Техасским красным Препараты заключали в Мовиол и изучали, как описано выше

Для проверки предположения, что изменения в локализации A3 антигена происходят предпочтительно на стадии репликации ДНК, исследовали клетки на разных стадиях клеточного цикла, для чего клетки HeLa инкубировали с анизомицином в течение 4 ч, а затем - с 10 мкМ BrdU 15 мин Клетки фиксировали 2%-ным параформальдегидом и метили МКА A3, как описано выше После дополнительной фиксации 2%-ным параформальдегидом 15 мин при комнатной температуре, препараты обрабатывали 4M НС1 в течение 30 мин Тщательно отмывали в PBS и инкубировали с антителами к BrdU, а затем - с антителами к IgG мыши, конъюгированными с FITC,

45 мин при 37° С Докрашивали 0 1 мкг/мл DAPI (10 мин), промывали дистиллированной водой и заключали в Мовиол

Выявление аргентофильных белков ядрышка производили по методике Кунафиной и др, (2005) Перед окрашиванием на аргентофильные белки проводили иммуноцитохимическое окрашивание в соответствии с протоколом, описанным выше Затем проводили дополнительную фиксацию смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3.1 в течение 10 мин. Далее промывали 3 раза в бидистиллированной воде Потом наносили 5 мкл желатины (2 % желатины и 1 % муравьиной кислоты на бидистиллированной воде) на парафильм В ту же самую каплю добавляли 10 мкл AgN03 (50 % AgNC>3 на бидистиллированной воде) Затем на каплю помещали стекла клетками вниз и инкубировали в течение 15 мин в темноте После промывания бидистиллированной водой препараты заключали в Мовиол.

Для выявления микрофиламентов клетки культуры HeLa фиксировали 2%-ным раствором параформальдегида на PBS в течение 15 мин при комнатной температуре, затем пермеабилизовали 0 1%-ным Тритоном Х-100 на PBS в течение 3 мин и окрашивали МКА A3 по методике, описанной выше Для выявления микрофиламентов в раствор вторичных антител, конъюгированных с FITC, добавляли фаллоидин-родамин (Sigma, США) Затем клетки промывали в PBS 3 раза по 10 мин, окрашивали 0 1 мкг/мл DAPI в течение 10 мин при комнатной температуре и заключали в Мовиол.

Для определения природы A3 антигена клетки HeLa, зафиксированные абсолютным ацетоном (10 мин, 4° С), обрабатывали 1 мкм/мл РНКазы A (Sigma) на PBS в течение 30-60 мин при 37° С или 0 01 %-ньш пепсином (1-5 мин, Sigma), в соответствии с описанной методикой (Zatsepina et al, 1997, Гурченков и др, 2005). Клетки метили антителами и изучали под микроскопом

Для постановки иммуноблотов готовили суммарный и обогащенный фракцией ядер лизат клеток HeLa в экспоненциальной фазе роста Клетки лизировали в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, рН 6 8, 20% глицерина, 4% SDS, 200 мМ |3-меркаптоэтанола, 0 1% бромфенолового синего. Электрофорез проводили в 10%-ном полиакриламидном геле на установке фирмы Amersham Biosciences (США) по методу Лэммли (Laemmli, 1970) Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, Франция) с диаметром пор 0.22 мкм осуществляли в камере для влажного переноса (Amersham

Biosciences, США) при напряжении 70 В и силе тока 200 мА Перенос происходил в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl, рН 7.6, 38 мМ глицина, 01% SDS, 20% метилового спирта в течение 2 ч. Нитроцеллюлозную мембрану инкубировали с МКА A3 в разведении 1- 3000 1 ч и отмывали в буфере TBST 5 раз по 5 мин Инкубировали с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированным с пероксидазой хрена, в течение 1 ч, в качестве субстрата использовали 3,3'-диаминобензидин (DAB). Отмывали в TBST 5 раз по 5 мин и высушивали на воздухе Для контроля мембраны окрашивали МКА ЗС9 к белку В23 по методике, описанной ранее (Dergunova et al., 2002).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Оптимизация условий выявления A3 антигена в разных типах клеток

Для оптимизации условий выявления A3 антигена клетки человека Ramos и HeLa фиксировали одним из следующих фиксаторов

2%-ный параформальдегид (20 мин), абсолютный ацетон (-20° С, 10 мин),

абсолютный метанол (-20° С, 10 мин), смесь метанола (3 части) и ледяной уксусной кислоты (1 часть) (-20° С, 10 мин). Полученные результаты показали, что МКА A3 проявляют иммунореактивность при всех тестированных способах фиксации, но наилучшую - при использовании 2% парафармальдегида. В этих условиях наблюдалось яркое окрашивание. Важно отметить, что антитела сохраняли способность окрашивать клетки даже после фиксации в смеси метанола и уксусной кислоты, те., когда большинство ядерных антигенов не узнаются специфическими антителами, что указывает на высокую иммунореактвность МКА A3 Определение видовой специфичности МКА A3

Из всех клеток, использованных в работе (клетки В-лимфобластоидной культуры Ramos, лимфоциты человека, первичные фибробласты человека, клетки карциномы шейки матки HeLa, фибробласты мыши L929 и NIH/3T3, клетки свиньи СПЭВ, крысы С6, китайского хомячка СНО, сирийского хомячка ВНК-21, кенгуровой крысы РТК1, быка МПТР, мартышки Vero), окрашивание наблюдалось только в клетках человека и мартышки. В клетках других видов реакции не наблюдалось, что свидетельствует о видовой, но не о тканевой специфичности полученных антител

Локализация АЗ-антигена в интерфазных и митотических клетках.

В ядрышках интерфазных клеток НеЬа МКА АЗ выявляло многочисленные гранулы, часто образующие розетко-подобные структуры или протяженные цепочки (рис.1).

а 6 i

». А* * « »с.

як

« »

>

Рис.1. Иммуномечение клеток культуры НеЬа МКА АЗ

а- окрашивание МКА АЗ, б- фазовый контраст, в- совмещение, масштабная

линия 2 мкм

Подобная локализация была характерна для других типов клеток -фибробластов кожи, клеток Ramos и ФГА-стимулированных лимфоцитов (рис.2).

а \ . i » \ \ : ( ) * i В 9

» • : •

Рис. 2. Иммуномечение различных культур клеток, фиксированных

парафармальдегидом, МКА АЗ .

а - фибробласты человека ; б - суспензионная культура Ramos; в - ФГА стимулированные лимфоциты человека. Пунктирная линия очерчивает ядро.

В митотических клетках МКА АЗ окрашивало одиночные гранулы, расположенные на некоторых хромосомах, что особенно хорошо видно при анализе клеток в метафазе митоза (рис. 3).

а" ♦ б • 41 г и д » •

¿Jm W б* • в* «ч

- •• б** 1Г КЗ

Рис. 3. Локализация A3 антигена в интерфазных и митотических клетках HeLa.

а-а*- интерфаза ; б-б* - профаза; в-в* - метафаза; г-г*- анафаза; д-д*- телофаза.

а-д - иммуномечене МКА A3; а*-д*- окрашивание DAPI, а**-д**-совмещение

Результаты определения электрофоретической подвижности A3 антигена на иммуноблотах.

Для выяснения массы антигена, выявляемого МКА A3, был применен метод иммуноблотов с использованием суммарных лизатов клеток HeLa и лизатов, полученных из обогащенной фракции ядер. В качестве контроля использовали МКА к белку В23/нуклеофозмину (МКА ЗС9). Однако в условиях, когда МКА ЗС9 отчетливо выявляло В23/нуклеофозмин, на мембранах, окрашенных МКА A3, реакции не наблюдалось. В связи с этим, для получения данных о природе A3 антигена была произведена его колокализация с хорошо изученными белками ядрышка.

Колокализация A3 антигена с известными белками ядрышка.

Сначала антиген A3 был колокализован с белком UBF, являющимся обязательным и специфическим компонентом комплекса РНК полимеразы I. Для анализа препаратов использовали метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Было замечено, что в интерфазных ядрышках места расположения антигена A3 полностью совпадают с участками, содержащими UBF (рис.4).

Рис. 4. Колокализация A3 антигена и UBF (конфокальная микроскопия).

а- локализация A3, б - локализация UBF, в - совмещение, масштабная линия 2 мкм

В то же время АЗ антиген не колокализовался с другими исследованными белками ядрышка такими, как фибрилларин (рис.5) и ИоррИО (рис.6).

а б в

1 *

—

Рис. 5 Колокализация АЗ антигена и фибрилларина в клетках НеЬа а - локализация АЗ антигена, б - локализация фибрилларина, в - совмещение,

а б в

ч • • ф Ф • - <£ С*'

Ниг *

——

Рис. 6 Колокализация АЗ антигена и №рр140 в клетках НеЬа а - локализация антигена АЗ, б - локализация Морр140, в - совмещение,

Колокализация АЗ антигена с аргентофильными белками ядрышка.

Окрашивание на аргентофильные белки является одним из наиболее распространенных видов окрашивания, которое позволяет оценить функциональное состояние ядрышка. При одновременном окрашивании на аргентофильные белки и иммуномечении МКА АЗ было обнаружено, что участки локализации АЗ антигена и участки локализации аргентофильных белков полностью совпадают. Локализация АЗ антигена после обработки клеток актиномицином Д.

Клетки НеЬа инкубировали с актиномицином Д в концентрации, избирательно ингибирующей транскрипцию рДНК (0.05 мкм/мл) в течение 4 часов, а затем окрашивали МКА АЗ и антителом к белку фибрилларину. Такое воздействие приводило к характерной сегрегации ядрышка, после чего становилось хорошо видно, что АЗ антиген и фибрилларин располагаются в разных компартментах сегрегированных ядрышек. Реакция АЗ антигена на действие ингибиторов синтеза белка.

Реакция клеток человека на ингибирование синтеза белка была сначала изучена на клетках НеЬа. Как показано на рис. 7, обработка клеток ингибитором белкового синтеза анизомицином приводила к миграции АЗ антигена из ядрышка в нуклеоплазму уже через 1 ч после начала воздействия.

Рис. 7. Изменение локализации АЗ антигена после обработки клеток НеЬа 100 мкМ анизомицина в течение разного времени.

а-в - иммуномечение МКА АЗ, а*-б* - фазовый контраст; б**- в** -

ОАР1.

а - локализация АЗ антигена в ядрышке и в нуклеоплазме через 1 ч инкубации с ингибитором, стрелка - фокус локализации АЗ в нуклеоплазме; б -преимущественная локализация АЗ антигена в нуклеоплазме через 2 ч инкубации с анизомицином; в - гетерогенность ответа клеток на ингибирование трансляции, наблюдаемая через 2 ч инкубации с анизомицином, стрелка - клетка с локализацией АЗ в ядрышках, две стрелки -клетка с нуклеоплазматической локализацией АЗ антигена, звездочка -апоптотическая клетка, як-ядрышко. Масштабная линия: 2 мкм.

Характерно, что обработка клеток анизомицином сопровождалась

появлением клеток, в которых вместо округлых ядер присутствовали фрагментированные ядра, что является одним из признаков гибели клеток НеЬа путем апоптоза (Плетюшкина и др., 2006) Число таких клеток прогрессивно увеличивалось по мере инкубации с ингибитором. Динамика изменений числа клеток с характерной локализацией антигена АЗ в ядрышках, аномальной локализацией антигена АЗ в нуклеоплазме и апоптотических клеток показана на гистограмме 1

Гистограмма 1. Реакция клеток НеЬа на действие 100 мкМ анизомицина

100

90-

^ 80-о""*

ш 70-

0 60 ® 50

1 40-

§ 30 4 20 10 ■ о

М

И

Нколичество клеток с ядрышковой локализацией АЗ

□ Количество клеток с релокализацией АЗ

□ количество апоптотических клеток

контроль 1 час 2 часа 3 часа 4 часа время обработки

Из гистограммы видно, что при увеличении времени инкубации с анизомицином увеличивалось количество клеток с релокализацией АЗ антигена, а также увеличивалось количество апоптотических клеток

Следует отметить, что на всех сроках инкубации с анизомицином на препаратах оставались клетки, в которых АЗ антиген располагался только в ядрышках

Аналогичная релокализация АЗ наблюдалась также в других культурах человека, что свидетельствует об универсальности ответа АЗ антигена на ингибирование синтеза белка

Определение стадии клеточного цикла, на которой происходит релокализация АЗ антигена после действия анизомицина

Было отмечено, что клетки, находящиеся в й0 периоде клеточного цикла, включая фибробласты, культивируемые в среде без ростовых факторов, и нестимулированные лимфоциты, не реагируют

на действие анизомицина. Это позволило высказать предположение, что АЗ антиген обладает повышенной «чувствительностью» к действию анизомицина только в пролиферирующих клетках. Для проверки данного предположения клетки HeLa обрабатывали 4 ч анизомицином, а затем инкубировали 30 мин с предшественником синтеза ДНК - BrdU и фиксировали 2% параформальдегидом, как описано выше. Результаты этих экспериментов показали, что практически во всех ядрах, включивших BrdU, АЗ антиген располагался не только в ядрышках, но и в нуклеоплазме. Это свидетельствует о том, что релокализация АЗ антигена из ядрышка в нуклеоплазму наблюдается, главным образом, на стадии репликации ДНК.

Выявление фрагментации хроматина методом Túnel и окраска на актин.

Для того, чтобы выяснить, связаны ли изменения в локализации АЗ антигена с фрагментацией ДНК, часто наблюдаемой при апоптотической гибели клеток, был применен метод Túnel. Наши наблюдения показали, что клетки с атипичным расположением АЗ антигена в нуклеоплазме не метятся в реакции Túnel, хотя метка отчетливо проявлялась в клетках, содержащих фрагментированные ядра. Это говорит о том, что изменения в расположении антигена не связаны с расщеплением ядерной ДНК.

Учитывая, что в клетках, вступающих в апоптоз, может наблюдаться реорганизация цитоскелета (Плетюшкина и др., 2006), клетки HeLa, обработанные анизомицином, окрашивали МКА АЗ и фаллоидином, меченным родамином (рис.8).

Рис. 8. Двойное окрашивание клеток НеЬа фаллоидином на актиновые филаменты (красный цвет) и антителами АЗ (зеленый цвет), а - распределение филаметов в клетке до обработки анизомицином, б - распределение филаметов после обработки анизомицином, в - апоптотическая клетка,

В результате обнаружено, что реорганизация актинового цитоскелета совпадала с релокализацией A3 антигена. Это указывало на то, что релокализация A3 антигена из ядрышка в нуклеоплазму соответствует ранним стадиям апоптоза

Реакция клеток HeLa на действие других ингибиторов белкового синтеза

При обработке клеток другими ингибиторами белкового синтеза - пуромицином (100 мкг/мл), циклогексимидом (100 мкг/мл) или эметином (100 мкг/мл) - наблюдалась сходная реакция Это указывает на то, что изменения в локализации A3 ангигена не вызываются особенностями действия конкретного ингибитора трансляции, а является универсальным ответом на ингибирование белкового синтеза

Колокализация A3 антигена с другими ядрьшковыми белками после инкубации клеток HeLa с анизомицином

Обработка клеток HeLa анизомицином приводила также к появлению в нуклеоплазме фибрилларина и UBF. Однако фокусы локализации фибрилларина не совпадали с фокусами локализации A3 антигена и уступали им по размерам. При исследовании колокализации A3 антигена с UBF, было выявлено, что во всех клетках, изученных методом конфокальной лазерной микроскопии, фокусы локализации A3 антигена полностью совпадали с фокусами локализации белка UBF. Эти наблюдения позволяют предположить, что A3 антиген может быть специфическим ко-фактором РНК полимеразы I - белком UBF

Изменение свойств культуры HeLa после длительного культивирования

Во время проведения данной работы было выявлено, что непрерывное культивирование клеток линии HeLa в течение 3-4 месяцев приводит к заметному изменению свойств клеток В «старой» культуре даже без обработки ингибиторами белкового синтеза могло присутствовать до 30% клеток, в которых A3 антиген располагался не только в ядрышках, но и в нуклеоплазме (гистограмма 2). При этом отмечено, что «старая» культура клеток HeLa проявляла повышенную чувствительность к действию анизомицина по сравнению с клетками краткосрочного культивирования (гистограмма 1). Так в «старой» культуре HeLa наблюдалась значительно более выраженная реакция на действие анизомицина, чем в «молодой» культуре HeLa, что видно при сравнении динамики ответа клеток на воздействие анизомицина, представленной на гистограммах 1 и 2. Более того, в «старой»

культуре было резко повышено количество апоптотических клеток после обработки анизомицином

Гистограмма 2. Реакция клеток IleLa длительного культивирования ("старая" культура HeLa) на действие 100 мкМ аннздмицина.

100

90

70

к 60

5 50

? 40

о

ч. 30

20

10

0

ta

ñ¡

М

контроль 1 час

2 часа

3 часа

Н количество клеток с ядрышковой локализацией АЗ

□ количество клеток с релокализацией АЗ

□ количество апоптотических клеток

4 часа время жкубации

Таким образом, с помощью нового МКА АЗ был выявлен ядрышковый белок, обладающий свойствами, характерными для компонентов транскрипционного аппарата РНК полимеразы I, особенностью которого является его миграция из ядрышка в нуклеоплазму под действием ингибиторов белкового синтеза ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Полученные результаты показали, что МКА АЗ является видоспецифичным, поскольку выявляет антиген только в клетках культур человека и мартышки По-видимому, это связано с незначительными различиями между ядрышковыми белками, участвующими в регуляции транскрипции рДНК, у человека и других приматов Важно заметить, что после фиксации различными фиксаторами, в том числе после фиксации при жестких условиях - в смеси метанола и уксусной кислоты - наблюдалась характерная локализация АЗ антигена в ядрышке Это говорит о высокой иммунореактивности МКА АЗ на клеточном уровне Тот факт , что обработка пепсином, но не РНКазой А, блокировала иммуномечение ядрышек, указывает на белковую природу АЗ антигена

В клетках культур Vero, HeLa, фибробластов кожи и Ramos наблюдался одинаковый характер распределения антигена АЗ. В интерфазных клетках АЗ антиген выявлялся в виде ожерело-подобных

структур, располагающихся исключительно в области ядрышка, что напоминает распределение белков транскрипционного аппарата РНК полимеразы I (Zatsepina et al, 1993) В митотических клетках A3 антиген выявлялся в виде 7-8 ярких одиночных или парных точек, напоминающих ЯОР хромосом (Zatsepina et al, 1993, Roussel et al, 1996, Russell, Zomerdijk, 2005). A3 антиген также полностью колокализовался со специфическим ко-фактором РНК полимеразы I, белком UBF Места локализации A3 антигена не совпадали с другими белками ядрышка, включая фибрилларин, Noppl40 и коилин Перечисленные выше данные указывают на то, что A3 антиген является компонентом транскрипционного аппарата РНК полимеразы I и, возможно, соответствует UBF

В процессе выполнения работы было обнаружено, что A3 антиген обладает отличительной особенностью, которая проявлялась в его способности мигрировать в нуклеоплазму под действием ингибиторов белкового синтеза. Миграция ядрышковых белков при ингибировании белкового синтеза была описана при анализе транскрипционного фактора РНК полимеразы I TIF-IA Однако, при этом T1F-IA не располагался в дискретных фокусах, а диффузно распределялся по всей нуклеоплазме (Meyer et al, 2005) Важно отметить, что миграция МКА A3 из ядрышка в нуклеоплазму не может быть следствием ингибирования транскрипции рибосомных генов, поскольку обработка актиномицином Д не приводила к образованию фокусов A3 антигена в нуклеоплазме

Миграция A3 наблюдалась в клетках различной тканевой принадлежности Однако в каждой культуре наблюдалась определенная динамика протекания реакции на воздействие. Наиболее чувствительной оказалась культура клеток HeLa, фибробласты были менее чувствительны , а культура Ramos и неактивированные лимфоциты доноров были еще менее чувствительны к действию ингибиторов белкового синтеза Чувствительность оценивалась по количеству клеток в культуре с релокализацией A3 антигена Интересно, что при длительном - около 4 месяцев - непрерывном культивировании клеток линии HeLa в культуре появлялись клетки с нуклеоплазматической локализацией A3 антигена По общей морфологии внеядрышковые фокусы A3 антигена напоминали фокусы, индуцируемые ингибиторами белкового синтеза Характерно, что такая культура была более чувствительна к действию ингибиторов трансляции по сравнению с «молодой» культурой и менее жизнеспособна Эти наблюдения говорят о том, что по характеру

расположения АЗ антигена можно судить об общем состоянии культуры клеток HeLa.

Появление клеток с фокусами АЗ антигена в нуклеоплазме после инкубации с ингибиторами белкового синтеза предшествовало появлению апоптических клеток Однако при выявлении фрагментации ядерной ДНК, являющейся одним из признаков апоптоза, методом Túnel в клетках с релокализацией АЗ антигена фрагментации хроматина обнаружено не было Вероятно, это связано с тем, что при подавлении белкового синтеза фрагментация хроматина происходит на поздних стадиях апоптоза, в то время как изменения в локализации АЗ антигена, скорее всего, происходят в клетках, находящихся на ранних стадиях апоптоза В пользу этого вывода говорят также результаты одновременного окрашивания клеток HeLa, обработанных анизомицином, на актин. Известно, что ранним признаком апоптотической гибели клеток HeLa являются изменения в распределении актиновых микрофибрилл, проявляющиеся в укорочении пучков актина, но увеличении их количества (Домнина и др, 2002) Двойное окрашивание клеток меченным фаллоидином и МКА АЗ показало, что эти изменения характерны для клеток с атипичной локализацией АЗ антигена в нуклеоплазме Эти данные указывают на то, что клетки с внеядрышковым расположением АЗ антигена находятся на ранних стадиях апоптоза

Наблюдения о том, что места локализации АЗ антигена и специфического ко-фактора РНК полимеразы I белка UBF полностью совпадают, позволяют сделать два заключения Во-первых, АЗ антиген и UBF могут являться одним и тем же белком Во-вторых, АЗ антиген и UBF могут мигрировать в нуклеоплазму в составе общего комплекса Белки этого комплекса взаимодействуют друг с другом в ядрышке, и поэтому миграция одного компонента комплекса приводит к релокализации всего комплекса

Гетерогенность ответа клеточной популяции на подавление трансляции позволила предположить, что АЗ антиген более чувствителен к действию ингибиторов белкового синтеза на определенных стадиях клеточного цикла Ряд данных, полученных в настоящей работе, свидетельствует в пользу предполагаемой гипотезы Так, в фибробластах, которые находятся в состоянии контактного ингибирования, те в G0 периоде клеточного цикла, ингибиторы белкового синтеза не вызывали изменений в локализации АЗ антигена, в то время как в пролиферирующей культуре фибробластов наблюдалась выраженная реакция на воздействие

Неактивированные лимфоциты также не реагировали на действие анизомицина, но в ФГА стимулированных лимфоцитах наблюдалась релокализация A3 в нуклеоплазму

Таким образом, все культуры клеток, использованные в данной работе, которые содержали делящиеся клетки, реагировали на действие ингибиторов белкового синтеза Данное воздействие приводило к появлению клеток с нуклеоплазматическими фокусами локализации A3 и, в конечном счете, к массовой гибели клеток путем апоптоза Следует отметить, что выявленный феномен позволяет визуализовывать ранние стадии апоптоти ческой гибели клеток человека in vitro

Следует заметить, что в некоторых работах было показано, что клетки, находящиеся в S фазе, наиболее чувствительны к действию различных препаратов, используемых в терапии для индукции апоптоза раковых клеток В работе Griffiths et al (1987) животным инъецировали ингибиторы белкового синтеза рицин и арбирин. Полученные результаты показали, что это приводит к гибели клеток в тканях, которые содержали активно пролиферирующие клетки. Было выявлено, что морфология многих клеток в околоаортических лимфатических узлах и пейеровых бляшках соответствовала морфологии апоптотических клеток. Характерно, что нарушение регуляции белкового синтеза является основным фактором, способствующим развитию и последующему метастазированию рака. Это подтверждается тем, что гиперэкспрессия некоторых факторов инициации трансляции ведет к злокачественной трансформации и, наоборот, пониженная экспрессия ведет к подавлению развития злокачественных новообразований (Hershey, Miyamoto, 2000) Было показано, что компоненты трансляционного аппарата обычно содержат мутации и (или) гиперэкспрессируются в злокачественных образованиях (Anand et al, 2002, Draptchinskaia et al, 1999) Также было замечено, что многие ключевые компоненты антиапоптотических путей регулируются на уровне трансляции (Holcik et al, 2000), а раковый супрессор pRB непосредственно влияет на процесс трансляции путем изменения общего количества рибосом (Cavanaugh et al., 1995, Ruggero, Pandolfi, 2003)

Предположительно селективность действия ингибиторов белкового синтеза на клетки в S фазе может быть использована для индукции апоптоза в пролиферирующих злокачественных клетках in vivo И хотя на сегодняшний день анизомицин не используется в клинике для химиотерапии опухолей, но известны экспериментальные

работы, в которых показано, что анизомицин в комбинации с другими препаратами, применяемыми in vivo, вызывал массовую гибель опухолевых клеток (Ruller et al, 1999) Также имеется ряд работ, в которых были произведены успешные клинические испытания применения ингибиторов белкового синтеза в химиотерапии опухолей (Ottenheijm, van den Broek, 1988, Hafkemeyer-K et al, 1998, Rinehart, 2000, Kantarjian et al, 2001) Действительно, раковые клетки могут быть особенно чувствительны к ингибированию белкового синтеза, поскольку у них резко повышен общий уровень метаболизма Все эти данные указывают на то, что ингибирование белкового синтеза может явиться перспективным направлением в химиотерапии злокачественных новообразований

Следует отметить еще один важный феномен при увеличении времени культивирования клеток HeLa появляются клетки, для которых характерна спонтанная «миграция» АЗ антигена из ядрышка в нуклеоплазму При этом наблюдается повышение чувствительности культуры к действию анизомицина Это проявляется в том, что при обработке ингибиторами белкового синтеза «молодой» и «старой» культур при длительном культивировании количество апоптотических клеток значительно превышает количество апоптотических клеток в «молодой» культуре (гистограммы 1 и 2) Подобное явление не было описано в литературе и может учитываться при оценке реакции клеток на действие химиопрепаратов in vivo

В заключение следует отметить, что окончательно понять природу нуклеоплазматических фокусов локализации АЗ антигена позволит лишь определение его аминокислотной последовательности К сожалению, на настоящий момент не удалось произвести выявление АЗ антигена методом иммуноблотирования Однако, особенности АЗ антигена, описанные в настоящей работе, позволяют считать дальнейшие исследования по его идентификации перспективными с возможностью постановки иммунопреципитации

ВЫВОДЫ.

1 Антиген, выявляемый новым моноклональным антителом АЗ, и названный, соответственно, АЗ антиген, является видоспецифичным и локализуется в ядрышках клеток человека вне зависимости от их тканевого или линейного происхождения, АЗ антиген чувствителен к обработке пепсином и нечувствителен к обработке РНКазой А, что свидетельствует о его белковой природе

2. Использованный для определения природы A3 антигена метод колокализации с уже известными ядрышковыми белками позволяет высказать предположение о принадлежности A3 антигена к компонентам транскрипционного комплекса РНК полимеразы I и его соответствии специфическому ко-фактору -белку UBF

3 Особенностью A3 антигена является его миграция из ядрышка в нуклеоплазму в ответ на действие ингибиторов белкового синтеза, а также спонтанная релокализация в нуклеоплазму при длительном культивировании клеток HeLa, свидетельствующая о снижении их жизнестойкости и повышении чувствительности к внешним воздействиям

4 Изменения в локализации АЗ-антигена предшествуют гибели клеток путем апоптоза, что позволяет считать его ранним маркером апоптотической гибели клеток.

5 Изучение локализации A3 антигена с помощью иммуноцитохимических методов может использоваться для оценки состояния клеточных культур, изучения эффективности действия потенциальных ингибиторов белкового синтеза и при подборе химиотерапевтических препаратов in vitro

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Григорьев А А , Жарская О О , Булычева Т И , Зацепина О.В (2006) «Новые моноклональные антитела для выявления изменений ядерных антигенов под действием ингибиторов белкового синтеза в клетках человека» «Аллергология и иммунология», №3, стр. 260

2 Булычева Т.И, Калинина И.А, Григорьев А А, Зацепина О.В "Штамм культивируемых клеток мышиной гибридомы A3, используемый для получения моноклональных антител к антигену ядрышек клеток человека" ГНЦ РАМН, Патент на изобретение, №2005115525/13 от 27 03 2007, приоритет 23 05 05

3 Григорьев А А , Булычева Т И, Шеваль Е В, Калинин И А., Зацепина О В (2008) «Цитологические признаки подавления общего уровня синтеза белка, выявляемые с помощью нового моноклонального антитела » Цитология 50, 338-346

4 Григорьев А А, Жарская О О , Булычева Т И, Зацепина О.В (2007) "Изменения состояния ядрышка при длительном культивировании культуры клеток человека HeLa" Бюллетень экспериментальной биологии и медицины № 9, т. 144, стр 321-325

5 Grigoriev A A , Zharskaya O O , Bulycheva T I, Zatsepina O.V An early nucleolar response to inhibition of protein synthesis in human cultured cells. Abstracts for 16th Annual BIOCITY Symposium CELL STRESS, Turcu August 2006, p 22

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Ядрышко эукариотической клетки является динамической структурой, в которой происходят транскрипция рибосомных генов (рДНК), процессинг рРНК и сборка прерибосомных субъединиц. Показано также, что эта органелла принимает участие как в процессах пролиферации, так и в процессах клеточного старения и апоптоза. Известно, что структурное состояние ядрышка зависит от уровня метаболизма и способности клеток к пролиферации. Поэтому морфология ядрышек, а также его отдельных компонентов в митозе (ядрышковых организаторов) часто принимаются во внимание в медицинской практике для уточнения прогноза течения заболевания и выбора адекватного курса лечения. Хорошо известно, что состояние ядрышка изменяется в ответ на стрессовые воздействия или после обработки токсическими веществами, подавляющими, например, синтез рРНК или влияющих на уровень фосфорилирования ключевых ядрышковых белков. Однако в современной литературе содержатся лишь отдельные сведения о реакции ядрышка на действие ингибиторов белкового синтеза, включая те из них, которые вызывают гибель клеток путем апоптоза.

Согласно последним данным масс-спектрометрического анализа ядрышка, в его составе присутствует около 700 белков, которые в зависимости от аминокислотного состава или функциональной значимости могут быть объединены в несколько основных групп. Одна из таких групп включает белки, которые принимают участие в регуляции транскрипции рибосомных генов и входят в состав комплекса транскрипционного аппарата РНК полимеразы I -комплекса, осуществляющего транскрипцию рДНК. Общим свойством белков этой группы является их прочная связь с рибосомными генами, которая сохраняется не только в активных ядрышках в интерфазе, но и во время митоза, когда транскрипция рДНК прекращается. Известно, что некоторые из этих белков изменяют локализацию в ответ на действие химических агентов или физических факторов. Определение чувствительности белков ядрышка к действию стрессовых агентов, таких как ингибиторы транскрипции рибосомных генов и синтеза белка, лежит в основе изучения механизмов их действия на нормальные и опухолевые клетки человека.

Одним из подходов к изучению ядрышка и его белковых компонентов является иммуноцитохимическое выявление белков ядрышка, в основе которого лежит использование моноклональных антител (МКА). В лабораторных условиях антитела обычно получают путем иммунизации животных антигенами разного происхождения или клеточными структурами с дальнейшим применением методов гибридомной биотехнологии. Этим путем были получены МКА к ядерным белкам В23/нуклеофозмину, Ki-67, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) и др.

Способность антител специфически узнавать антигены применяется при изучении свойств и функций белков. Однако панель антител к ядрышковым белкам, обладающих высокой иммунореактивностью, видовой специфичностью и пригодных для проведения медико-биологических исследований, в настоящее время является достаточно ограниченной. В связи с этим, целенаправленное получение новых МКА к ядерным антигенам человека и их идентификация представляет несомненный как научный, так и практический интерес.

Целью работы явилось изучение иммуноцитохимических особенностей ядрышкового антигена, выявляемого новым моноклональным антителом A3, в клетках человека с различным уровнем пролиферации, а также реакции A3 антигена на обработку клеток ингибиторами белкового синтеза.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1.0тработать оптимальные условия иммуноцитохимического окрашивания ядрышкового антигена новым моноклональным антителом, названным «МКА A3».

2.0пределить видовую и тканевую специфичность МКА A3, а также описать локализацию A3 антигена в разных типах клеток человека и на основных стадиях клеточного цикла.

3.Изучить локализацию антигена A3 при активации лимфоцитов периферической крови здоровых доноров к пролиферации с помощью стимуляции фитогемагглютинином (ФГА).

4.Изучить влияние ингибиторов синтеза белка (анизомицина, пуромицина и циклогексимида) на локализацию A3 антигена.

5.Исследовать колокализацию A3 антигена с известными белками ядрышка клеток человека до и после действия на клетки ингибиторов белкового синтеза. б.Определить взаимосвязь между изменениями в локализации A3 антигена и гибелью клеток, вызываемую подавлением синтеза белка.

НОВИЗНА

С помощью нового моноклонального антитела, секретируемого мышиной гибридомой A3, выявлен антиген, располагающийся в ядрышках клеток человека, обладающий четкой видовой специфичностью, названный "A3 антиген", и имеющий основные свойства, характерные для компонентов комплекса РНК полимеразы I.

Дана характеристика и выявлены особенности A3 антигена. Показано, что в пролиферирующих клетках человека в отличие от покоящихся A3 антиген выявляется в виде многочисленных дискретных фокусов, расположенных исключительно в зоне ядрышка. Количество фокусов A3 антигена уменьшается при ингибировании транскрипции рДНК. Отличительной особенностью A3 антигена является его высокая лабильность, которая проявляется в его миграции из ядрышка в нуклеоплазму под действием ингибиторов белкового синтеза. Обнаружено, что изменения в локализации A3 антигена предшествуют массовой гибели клеток путем апоптоза, что позволяет рассматривать этот феномен-как-маркер-ранних-стадий-апоптотической-гибели-клетокчеловекав------культуре.

Обнаружено, что при длительном культивировании (в течение 4-6 месяцев) человеческих клеток HeLa наблюдается спонтанная «миграция» A3 антигена из ядрышка в нуклеоплазму, что сопровождается повышением чувствительности культуры к внешним воздействиям.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Выявлен ядрышковый антиген белковой природы, названный A3 антиген, обладающий не только видовой специфичностью, но и способностью изменять локализацию под действием ингибиторов белкового синтеза, что дополняет фундаментальные представления о свойствах белков ядрышка.

Разработан метод объективной визуальной оценки общего состояния культур клеток человека, определяемого по локализации A3 антигена. Показано, что появление клеток с атипичной - внеядрышковой - локализацией A3 антигена указывает на "старение" клеток и их повышенную чувствительность к внешним воздействиям.

Видовая специфичность МКА A3 может оказаться полезной для выявления возможной контаминации культур клеток человека клетками другой видовой принадлежности.

Высокая реактивность в иммуноцитохимических реакциях позволяет использовать МКА A3 в качестве положительного контроля в клинико-лабораторных исследованиях при тестировании различных антител.

Изменения в локализации A3 антигена, наблюдаемые при ингибировании синтеза белка, позволяют использовать этот феномен при изучении механизмов действия новых антибиотиков и цитостатических препаратов, а также оценке их способности ингибировать синтез белка в опухолевых клетках человека in vitro.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Антиген, выявляемый МКА A3, является ядрышковым белком, относящимся к комплексу РНК полимеразы I.

2. Обработка клеток ингибиторами белкового синтеза (анизомицином, пуромицином или циклогексимидом) приводит к миграции A3 антигена из ядрышка в нуклеоплазму, где он локализуется в виде дискретных фокусов.

3. Изменения в локализации A3 антигена относятся к ранним маркерам апоптотической гибели клеток человека в культуре.

4. Длительное культивирование клеток HeLa приводит к спонтанной релокализации A3 антигена из ядрышка в нуклеоплазму.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные положения диссертации были представлены в виде постерных докладов на конференции Annual BIOCITY Symposium CELL STRESS, (Turcu, Финляндия) в августе 2006 , а также на VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва) в сентябре 2006 г. Диссертационная работа апробирована 24 декабря 2007 на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» ГУ ГНЦ РАМН.

Работа выполнена в лаборатории клинической иммунологии Гематологического научного центра РАМН (зав. лаб. - проф., д.м.н. Т.И. Булычева) и в лаборатории структурной биохимии Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (зав.лаб.-проф., д.б.н. О.В.Зацепина)

ВЫВОДЫ:

1. Антиген, выявляемый новым моноклональным антителом A3, и названный, соответственно, A3 антиген, является видоспецифичным и локализуется в ядрышках клеток человека вне зависимости от их тканевого или линейного происхождения; A3 антиген чувствителен к обработке пепсином и нечувствителен к обработке РНКазой А, что свидетельствует о его белковой природе.

2. Использованный для определения природы A3 антигена метод колокализации с уже известными ядрышковыми белками позволяет высказать предположение о принадлежности A3 антигена к компонентам транскрипционного комплекса РНК полимеразы I и его сходстве со специфическим кофактором — белком UBF.

3. Особенностью A3 антигена является его миграция из ядрышка в нуклеоплазму в ответ на действие ингибиторов белкового синтеза, а также спонтанная релокализация в нуклеоплазму при длительном культивировании клеток HeLa, свидетельствующая о снижении их жизнестойкости и повышении чувствительности к внешним воздействиям.

4. Изменения в локализации АЗ-антигена предшествуют гибели клеток путем апоптоза, что позволяет считать его ранним маркером апоптотической гибели клеток.

5. Изучение локализации A3 антигена с помощью иммуноцитохимических методов может использоваться для оценки состояния клеточных культур, изучения эффективности действия потенциальных ингибиторов белкового синтеза и при подборе химиотерапевтических препаратов in vitro.