Иммуноцитохимический анализ ядерных антигенов лимфоцитов человека, выявляемых с помощью моноклональных антител

Артеменко, Елизавета Георгиевна

Диссертации по медицине → Гематология и переливание крови

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Иммуноцитохимический анализ ядерных антигенов лимфоцитов человека, выявляемых с помощью моноклональных антител

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Артеменко, Елизавета Георгиевна Москва 2004 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.29

Автореферат диссертации по медицине на тему Иммуноцитохимический анализ ядерных антигенов лимфоцитов человека, выявляемых с помощью моноклональных антител

На правах рукописи

АРТЕМЕНКО ЕЛИЗАВЕТА ГЕОРГИЕВНА

ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЯДЕРНЫХ АНТИГЕНОВ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, ВЫЯВЛЯЕМЫХ С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ.

14.00.29. - гематология и переливание крови 03.00.04.-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Государственном некоммерческом учреждении «Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук»

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Т.И. Булычева, доктор биологических наук О.В.Зацепина

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор В.М. Погорелов, доктор биологических наук Е.С. Надеждина

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита диссертации состоится «_»_2004 года в_часов

на заседании диссертационного совета Д 001.042.02 в Гематологическом научном центре РАМН (125167, Москва, Новозыковский проезд, дом 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан «_»_2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, старший научный сотрудник,

кандидат биологических наук В.Д. Реук

ÜOOS-Ч

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Исследования клеток, проводимые методами иммуноцитохимии с использованием антител, получили очень широкое распространение как в фундаментальной клеточной биологии, так и в повседневной клинической практике. На сегодняшний день благодаря достижениям гибридомной биотехнологии в распоряжении исследователей имеется большое количество различных моноклональных антител (MICA) - стандартных и однородных реагентов, доступных для получения в лабораторных условиях в неограниченном количестве. Одной из областей их применения является изучение клеточной пролиферации, поскольку изменения в наличии или распределении различных антигенов, происходящие в клетках по ходу клеточного цикла, можно идентифицировать с помощью соответствующих антител. Помимо этого, в клинической практике количественный показатель пролиферативной активности, определяемый с помощью МКА, является важной характеристикой неопластической клеточной популяции и используется для прогнозирования скорости опухолевого роста.

Антигенные структуры, экспрессия которых ассоциирована с клеточным циклом, могут быть локализованы на мембране и в цитоплазме, однако наибольший интерес вызывают ядерные антигены, так как основные изменения в процессе деления клеток сосредоточены именно в клеточном ядре. В мире получен ряд моноклональных антител к ядерным антигенам, ассоциированным с клеточной пролиферацией, часть из которых локализуется в особом компартменте клеточного ядра -ядрышках.

Ядрышко является обязательным структурным компонентом ядер клеток эукариотов, в котором происходит синтез рибосомных РНК и сборка прерибосомных частиц. Изменение функционального состояния ядрышка в ходе клеточного цикла сопровождается также изменением его иммуноцитохимических особенностей, что отчетливо проявляется при использовании антител к различным ядрышковым белкам. За последние два десятилетия в результате получения и применения моноклональных антител был открыт ряд новых белков, имеющих ядрышковую локализацию, антитела к которым нашли применение в клинической практике. Наиболее известным является белок Ki-67, выявляющийся в поздней G1-стадии, S, G2 и М-фазах клеточного цикла, но отсутствующий в Go-периоде (Gerdes J. et al., 1983). Кроме того, известен ряд других белков ядрышка, которые можно рассматривать в качестве возможных маркеров клеточной пролиферации. К ним, в частности, можно отнести основной ядрышковый белок В23/нуклеофозмин, а также белки, которые участвуют в транскрипции рибосомных генов. Эти белки обладают, как правило, аргентофильными свойствами и окрашивании клеток солями серебра

в интерфазе и ядрышковых организаторов хромосом в митозе. Известно, что количество аргентофильных белков, определенное цитохимически на тотальных препаратах клеток или с помощью блотов в клеточных экстрактах, отражает способность клеток к пролиферации, закономерно изменяется в динамике клеточного цикла и является надежным цитохимическим маркером клеточного метаболизма в целом (Derenzini M. et al., 1990; Roussel P., Hernandez-Verdun D., 1994). Однако в литературе до сих пор отсутствуют прямые доказательства того, что локализация и количество белка В23 в клетках действительно изменяются с течением клеточного цикла, которые были бы получены с использованием антител к этому белку. В то же время, набор моноклональных антител к индивидуальным ядрышковым белкам, которые можно было бы использовать не только для изучения фундаментальных вопросов, связанных с биогенезом рибосом, но и для решения прикладных задач, на сегодняшний день является явно недостаточным. В связи с этим, детальное изучение нового моноклонального антитела ЗС9, полученного в лаборатории клинической иммунологии ГНЦ РАМН (зав. лаб. - проф. Булычева Т.И.), которое направлено к ядрышковому антигену, является на сегодняшний день крайне актуальной задачей.

Целью работы явилась идентификация антигена, выявляемого новым моноклональным антителом ЗС9, а также изучение возможности использования этого антитела для анализа пролиферативной активности клеток в лабораторной и клинической практике.

Задачи работы.

1. Определить электрофоретическую подвижность и описать локализацию антигена, выявляемого моноклональным антителом ЗС9, с помощью световой иммуноцитохимии. Методом иммунопреципитации выяснить возможное соответствие ЗС9-антигена основному белку ядрышка В23/нуклеофозмину.

2. Разработать оптимальную методику для иммунофлюоресцентного и иммунопероксидазного выявления антигена с помощью антитела ЗС9 на фиксированных препаратах клеток, учитывая его принадлежность к IgM-классу иммуноглобулинов.

3. Определить качественные и количественные изменения выявляемого антигена при переходе клеток из состояния покоя к пролиферации на модели первичной культуры донорских лимфоцитов, стимулированных фитогемагглютинином.

4. Провести сравнительный анализ динамики антигена, выявляемого антителом ЗС9, и известного маркера клеточного цикла белка Ki-67 при индуцированной активации лимфоцитов к пролиферации.

5. Оценить возможность использования антитела ЗС9 для анализа пролиферативной активности клеток в лабораторной и клинической практике при различных злокачественных заболеваниях системы крови.

Научная новизна.

Установлено, что полученное моноклональное антитело ЗС9 выявляет ядрышковый белок В23/нуклеофозмин.

Разработан оптимальный режим для иммунофлюоресцентного и иммунопероксидазного выявления белка В23 с помощью антитела ЗС9 на препаратах фиксированных клеток.

С помощью антитела ЗС9 выявлены количественные и качественные изменения в распределении В23 в лимфоцитах периферической крови человека, стимулированных к пролиферации фитогемагглютинином.

Моноклональное антитело к В23 было впервые использовано для оценки пролиферативной активности гемопоэтических клеток. Сравнительный анализ показал, что накопление белка В23 происходит уже в ранней G1-стадии, до появления в них известного маркера пролиферирующих клеток белка Ю-67. Полученные данные указывают на то, что антитело ЗС9 позволяет выявить более ранние стадии пролиферации, чем антитело Е1-67.

Показаны статистически значимые различия (р<0,05) по экспрессии В23 в лимфоцитах здоровых лиц и больных различными лимфопролиферативными заболеваниями.

Теоретическое и практическое значение.

Полученный в лаборатории штамм гибридомных клеток ЗС9 является пригодным для создания препарата моноклонального антитела к белку В23 в лабораторном и промышленном производстве. Секретируемое им антитело может служить инструментом для фундаментальных исследований в области цитологии и молекулярной биологии. Помимо этого, оно может быть рекомендовано в качестве реагента, используемого в дополнение к существующей диагностической панели моноклональных антител для иммунофенотипирования клеток больных лейкозами и лимфомами, позволяя производить оценку пролиферативной активности патологических клеток. Иммунопероксидазная методика упрощена и адаптирована для дальнейшего широкого лабораторного использования. Отработана оптимальная методика проведения иммунофлюоресцентного окрашивания, позволяющая выявлять типичный для белка В23 характер свечения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Моноклональное антитело ЗС9 выявляет антиген, соответствующий основному ядрышковому белку В23/нуклеофозмину, и направлено к его обеим изоформам (В23.1 и В23.2).

2. На модели стимулированной фитогемагглютинином культуры донорских лимфоцитов выявлено, что белок В23 является надежным иммунохимическим маркером последовательных стадий активации лимфоцитов человека к пролиферации. Ядрышковый белок В23 начинает

выявляться в клетках раньше маркера репликативного периода - белка Ю-67.

3. На основании клинико-лабораторного анализа обследуемых лиц (30 здоровых и 70 больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями) показана положительная корреляция между экспрессией антигенов В23 и Е1-67 (г=0,2; р<0,05). Выявлены статистически значимые различия (р<0,05) по степени экспрессии В23 в лимфоцитах здоровых лиц и больных всех нозологических форм лимфопролиферативных заболеваний, а также больных хроническим В-лимфолейкозом и лимфосаркомой.

Апробация работы состоялась на заседании проблемной комиссии «Кроветворение в норме и патологии, молекулярная биология, биотехнология» Гематологического научного центра РАМН. Материалы диссертации были доложены на XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, октябрь 1999 г.), на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, июнь 2000 г., июнь 2002 г., июнь 2004 г.), на I Всероссийском съезде гематологов (Москва, апрель 2002 г.), на научно-практической конференции «Новое в гематологии и клинической трансфузиологии» (Москва, апрель 2003 г., апрель 2004 г.), на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, сентябрь 2004 г.), на Международном научном семинаре «Современная диагностика лимфопролиферативных заболеваний» (Санкт-Петербург, октябрь 2004 г.). По материалам диссертации опубликовано три статьи в центральных журналах и трое тезисов, в том числе одна статья - в зарубежной печати.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на_страницах машинописного текста,

состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных данных, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 244 работы, в том числе 17 отечественных авторов. Диссертация иллюстрирована 4 таблицами, 3 рисунками и 11 фотографиями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе исследовали клетки перевиваемых линий различной видовой и тканевой принадлежности (суспензионные культуры: Daudi, Ramos, полученные из трансформированных клеток хронического В-лимфоцитарного лейкоза человека; монослойные культуры: HeLa - из клеток карциномы шейки матки человека, СПЭВ - из клеток свиной почки эмбрионального возраста, ЗТЗ - из мышиных фибробластов), лимфоциты,

выделенные из периферической крови практически здоровых лиц (30 доноров), а также лимфоидные клетки, выделенные из периферической крови, селезенки и лимфатических узлов больных с реактивными состояниями и лимфопролиферативными заболеваниями, находящихся на лечении в клинических отделениях ГНЦ РАМН (70 человек). Клетки были использованы для постановки иммунологических реакций, культивирования, получения гибридом и так далее.

Определение природы антигена, выявляемого антителом ЗС9, проводили методом иммунопреципитации в сочетании с иммуноблотированием. Для этого клетки линий Ramos и HeLa лизировали, затем лизаты иммунопреципитировали добавлением антитела ЗС9. После этого преципитаты, нанесенные на нитроцеллюлозную мембрану, инкубировали с антителами с известной направленностью к белку В23 (20В2 и анти-В23, любезно предоставленные д-ром Чаном (Dr. P. К. Chan; Baylor College of Medicine, Houston, Texas 77030, USA)), а также с ЗС9. Выявление связавшихся антител производили иммунопероксидазным методом, используя аминоэтилкарбозоль в качестве колориметрического агента.

Изучение локализации антигена в фиксированных клетках проводили непрямым иммунофлюоресцентным и иммунопероксидазным методами, причем и в том, и в другом случае потребовалось отрабатывать специальные протоколы проведения реакций, учитывая, что антитело ЗС9 относится к IgM-классу иммуноглобулинов. Непрямую иммунофлюоресцентную реакцию проводили на клетках, нанесенных на 8-луночные стекла, предварительно обработанные поли-Ь-лизином, которые затем центрифугировали для более прочного прикрепления клеток к поверхности стекла. Из-за специфических свойств антитела ЗС9 оказалось затруднительным выбрать адекватный метод фиксации клеток, который позволил бы получить в результате специфическое ядрышковое свечение. Из множества опробованных вариантов был выбран следующий: обработка 0,5 %-ным Тритоном Х-100 на фосфатном солевом буфере (PBS, рН 7,5) 5 мин, затем фиксация 2%-ным параформальдегидом на PBS 20 мин при комнатной температуре. Зафиксированные препараты клеток инкубировали с антителом ЗС9 либо с другими, затем - с козьими антителами к иммуноглобулинам мыши, мечеными ФИТЦ (FITC, Sigma), и докрашивали флюоресцентным красителем на ДНК, ДАПИ (DAPI, Sigma).

Для выявления специфического ядрышкового окрашивания с помощью непрямой иммунопероксидазной реакции также потребовался подбор адекватной фиксации. С этой целью клеточную суспензию подготавливали и наносили на стекла, как описано выше, а затем препараты обрабатывали следующим способом: фиксация абсолютным ацетоном 10 мин при -20°С; высушивание в течение 10 сек. Зафиксированные клетки инкубировали с первыми антителами, затем - со вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, после чего на препараты наносили готовый к работе субстрат-хромоген

аминоэтилкарбозоль (AEG, DAKO). Полученные препараты докрашивали гематоксилином Майера. Иммунофлюоресцентные и

иммунопероксидазные препараты клеток исследовали и фотографировали с помощью микроскопов "Аксиофот" (Carl Zeiss, Германия) и Leuka (Leuka, Германия). В контроле ко вторым антителам вместо первых антител использовали PBS.

Для того, чтобы изучить качественные и количественные изменения выявляемого антигена при переходе клеток от состояния покоя к пролиферации, была использована модель первичной культуры лимфоцитов здоровых доноров, стимулированных фитогемагтлютинином (ФГА). Выделенные из крови лимфоциты культивировали в присутствии митогена в течение различных промежутков времени, после чего фиксировали и окрашивали иммунофлюоресцентным и иммунопероксидазным методами. Параллельно на тех же сроках проводили количественное определение белка В23 на иммуноблотах ФГА-стимулированных лимфоцитов (совместно с к.б.н. Дергуновой Н.Н.). Для этого использовали цветовое сканирование и компьютерный денситометрический анализ с применением программы «Chromo» (Dergunova N.N. et al., 2002). Помимо изучения динамики белка В23 в активированных клетках, на каждом сроке культивирования определяли степень пролиферативной активности лимфоцитов по уровню включения 3Н-тимидина (совместно с к.м.н. Шпаковой А.П.). В качестве контроля к каждому опыту использовали лимфоциты, которые инкубировали в тех же условиях без ФГА.

Первичная оценка диагностического и прогностического значения антигена, выявляемого МКА ЗС9, при различных злокачественных заболеваниях системы крови была проведена совместно с сотрудниками клинических подразделений ГНЦ РАМН. Статистическая обработка данных, полученных при исследовании экспрессии антигена, выявляемого МКА ЗС9, в различных типах клеток, проводилась с использованием статистического пакета «Statistica», v. 5.0 (совместно со ст.н.с. Э.Г. Гемджяном, лаборатория биостатистики ГНЦ РАМН).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Идентификация антигена, выявляемого моноклональным антителом ЗС9.

В результате проведенной гибридизации в лаборатории был получен клон клеток, который продуцировал моноклональное антитело (МКА) ЗС9, специфически окрашивающее ядрышки в клетках Ramos после их фиксации ацетоном (рис. 1).

Рис. 1. Окрашивание интерфазных клеток культуры Ramos антителом ЗС9 а -непрямая иммунофлюоресценция; б - соответствлющий фазовый контраст. Антитело окрашивает ядрышки (стрелки), нуклеоплазма и цитоплазма практически не окрашены Увел х2000.

Начальное изучение внутриклеточной локализации антигена и предварительное определение электрофоретической подвижности давали основание полагать, что МКА ЗС9 реагирует с ядрышковым белком В23. Для окончательной идентификации антигена, узнаваемого МКА ЗС9, нами были параллельно использованы МКА 20В2 и анти-В23, обладающие доказанной специфичностью к белку В23. На Вестерн-блотах тотальных клеточных лизатов, полученных из культур Ramos и HeLa, все три антитела проявляли себя сходным образом: выявляли одну доминантную (тяжелую) и одну-две минорных (более легких) полосы в области 35-40 кДа (рис. 2). Кроме того, все антитела давали практически идентичное окрашивание методом непрямой иммунофлюоресценции

ЗС9 20В2 а-В23

Рнс 2

Вестерм-блот тотальных Р* * Щ клеточных яизатов Ramos

~ окрашенных антителами

ЗС9 20В2 и анти В23

1 2 3

Окончательно природа антигена, узнаваемого МКА ЗС9, была затем прямо установлена методом иммунопреципитации. Антиген, иммунопреципитируемый из экстрактов клеток HeLa с помощью ЗС9, реагировал с контрольными антителами к В23, 20В2 и анти-В23, демонстрируя при этом практически тот же характер окраски, что и в тотальных клеточных лизатах (рис. 3). На основании результатов иммуноцитохимического окрашивания различных клеток антителом ЗС9, иммуноблотинга и иммунопреципитации было сделано заключение о том, что МКА ЗС9 специфически реагирует с ядрышковым белком В23/нуклеофозмином.

Рис 3

Вестерн блот тотальных клеточных лизатов HeLa (дорожки 1 и 3) и преципитатов из лизатов клеток HeLa (дорожки 2 и 4) окрашенных антителами ЗС9 или 2082

Подбор оптимальных иммуноцитохичическш способов выявления ядрышкового антигена с помощью МКА ЗС9

Как указывалось выше, с помощью МКА ЗС9 удавалось получить специфическое иммунофлюоресцентное окрашивание ядрышек в клетках Ramos после их фиксации ацетоном, однако данный способ фиксации давал нестабильные результаты как внутри одного препарата, так и от опыта к опыту.

Таблица 1 Результаты окрашивания интерфазных клеткок разных культур млекопитающих моноклональным антителом ЗС9 в зависимости от \словий их фиксации (иммунофлюоресцентный метод)

Способ фиксации Клеточные культуры

Daudi I Ramos HeLa спэв зтз

абсолютный ацетон 10 мин, -20° С +- +- +- +-

2% параформ-альдегид 20 мин, затем 0,5% Тритон X-100 на PBS 5 мин, 20 °С

0,5% Тритон Х-100 на PBS 5 мин, затем 2% параформальдегид 20 мин, 20 ° С -н- ++ ++ ++

абсолютный метанол 10 мин, -20° С - - - - -

абсолютный метанол 10 мин, затем абсолютный ацетон 10с,-20°С

Обозначения:

++ Маркируемый антиген в интерфазных клетках выявляется только в ядрышках, характер иммуномечения клеток одинаков на всей площади препарата, результаты окраски стабильно воспроизводятся от опыта к опыту;

+- Характер окрашивания клеток варьирует на разных участках препарата и в разных опытах, ядрышки окрашиваются только в части клеток;

Избирательное иммуномечение ядрышек в клетках отсутствует, окрашиваются нуклеоплазма и цитоплазма.

Из таблицы 1 видно, что способность антитела связываться с антигеном обнаруживала сильную зависимость от условий обработки и фиксации клеток, но в одних и тех же условиях разные клетки демонстрировали идентичный характер окрашивания ядрышек. После тщательного подбора фиксаторов и условий фиксации был выработан специальный протокол иммуноцитохимического выявления ядрышкового антигена с помощью МКА ЗС9. Из всех использованных вариантов только предварительная обработка клеток 0,5 % раствором Тритона Х-100 с последующей фиксацией 2 % параформальдегидом позволяла получать стабильное и специфическое окрашивание ядрышек во всех использованных типах клеток.

В данных условиях контрольные антитела анти-В23 и 20В2 окрашивали ядрышки так же, как ЗС9, то есть ярко и практически однородно, при этом флюоресценции цитоплазмы в интерфазных клетках не наблюдалось.

В работе было уделено особое внимание разработке оптимального протокола проведения иммуноцитохимической реакции с использованием вторых антител, меченых пероксидазой хрена, для того, чтобы обеспечить возможность применения МКА ЗС9 в рутинных лабораторных исследованиях. Было установлено, что способность антител связываться с антигеном так же, как и в случае непрямой иммунофлюоресценции, обнаруживала сильную зависимость от условий обработки и фиксации клеток. При фиксации клеток 2% параформальдегидом с последующей пермеабилизацией Тритоном Х-100 или ацетоном, а также в случае последовательной фиксации метанолом и ацетоном характер окрашивания варьировал на разных участках препарата, при этом, помимо ядрышек, часто оказывались окрашенными цитоплазма и нуклеоплазма. Из всех опробованных вариантов только обработка клеток ацетоном (-20° С, 10 мин) с последующим кратковременным (не более 30 сек) высушиванием позволяла получать стабильное и специфическое окрашивание ядрышек во всех использованных типах клеток.

Изучение локализации антигена, выявляемого МКА ЗС9, в динамике клеточного цикла.

Для того, чтобы описать характер иммунофлюоресцентного окрашивания клеток антителом ЗС9 в митозе, мы использовали монослойную культуру клеток ИеЬа, поскольку в этих клетках

индивидуальные стадии митоза могут быть легко идентифицированы по морфологии и после окрашивания хромосом красителем ДАЛИ. Характер иммуномечения митотических клеток HeLa антителом ЗС9 в целом оказался идентичным таковому при окраске антителами 20В2 и анти-В23. На стадии прометафазы и в метафазе антиген был локализован преимущественно вокруг митотических хромосом. Кроме того, в клетках на стадии прометафазы отчетливо была видна окраска центросом. В анафазе В23 располагался на поверхности хромосом, а также был виден в составе цитоплазматических ярко флюоресцирующих гранул, которые получили название ядрышковых дериватов. В ранней телофазе окрашивались формирующиеся ядрышки и многочисленные мелкие проядрышки; в цитоплазме сохранялись ядрышковые дериваты. В ходе телофазы количество проядрышек и цитоплазматических включений постепенно уменьшалось, так что к концу митоза характер окрашивания дочерних клеток соответствовал таковому в интерфазе.

Изменения в локализации В23 в лимфоцитах при переходе от состояния покоя к пролиферации под действием фитогемагглютинина.

В качестве модельной системы для изучения перехода клеток от состояния покоя к активной пролиферации были выбраны лимфоциты периферической крови человека, активированные ФГА. Клетки культивировали в присутствии митогена в течение 6, 16, 24, 48, 72 и 96 часов, после чего фиксировали и проводили иммунофлюоресцентный анализ- препаратов. В качестве контроля ко всем срокам инкубации использовали лимфоциты, которые культивировали без добавления ФГА.

Для контроля за активностью пролиферации параллельно измеряли уровень включения 3Н-тимидина на эти же сроки инкубации. Было установлено, что средний уровень включения 3Н-тимидина в исходных и контрольных лимфоцитах колебался пределах тех же значений, что и в лимфоцитах, которые были активированы ФГА в течение 6-24 ч. Максимальное включение предшественника наблюдалось через 48-72 ч после ФГА-стимуляции, но понижалось к 96 ч.

Вступление ФГА-стимулированных лимфоцитов в S-период в условиях наших экспериментов было также изучено с помощью антитела к белку Ю-67, который является известным ядерным маркером начала репликации ДНК. Первые положительно меченные анти-Кл-67 ядрышки наблюдали через 24 ч после начала активации клеток. На 48-72 ч около 80% лимфоцитов содержали положительно окрашенные ядрышки.

В контрольных (ФГА-нестимулированных) лимфоцитах ядрышки окрашивались антителом ЗС9 сравнительно слабо и преимущественно по периферии. Однако в процессе культивирования лимфоцитов с митогеном характер окрашивания ядрышек резко изменялся. Первые признаки накопления В23 в ядрышках проявлялись уже через 16 ч после ФГА-стимуляции. Эти изменения включали в себя увеличение интенсивности окрашивания и размеров ядрышек до 1.3-1.7 мм в диаметре.

Однако наиболее заметные изменения в локализации В23 наблюдали в лимфоцитах на 48 и 72 ч активации, когда уровень включения 3Н-тимидина возрастал на несколько порядков по сравнению с контролем. Кроме того, на 48-72 ч подавляющее большинство клеток имели ядрышковую локализацию Ki-67. В этих же условиях ядрышки максимально интенсивно окрашивались антителом к В23 и по своей морфологии не отличались от ядрышек активно пролиферирующих клеток линий Ramos и Daudi.

Параллельно иммуноцитохимическим исследованиям, на каждом этапе культивирования был проведен количественный анализ содержания белка В23 на иммуноблотах ФГА-стимулированных лимфоцитов (рис. 4).

Все изменения в характере окрашивания лимфоцитов антителом ЗС9 были подтверждены полученными количественными данными. Возрастание количества В23 демонстрировало экспоненциальную зависимость от времени. При этом на начальных этапах стимуляции (6 ч) оно было незначительным и статистически незначимым. Однако уже к 16 ч количество В23 увеличивалось примерно в два раза, и по мере инкубации клеток с ФГА продолжало постепенно возрастать. После 24 ч культивирования уровень белка В23 в лимфоцитах начинал стремительно подниматься, и к 72 ч достигал максимального значения, которое в 30-50 раз превосходило изначальный показатель. Количественный анализ В23 в лимфоцитах после 72 ч инкубации с ФГА и клетках культуры Ramos показывал очень близкие значения содержания В23.

усл. ед.

50 ■ 45 " 40 ■ 35 ■ 30 • 25 ' 20 ' 15 ' 10 ■ 5

0 —

0 6 16 24 48 72

часы

Рис. 4. Компьютерный денситометрический анализ содержания белка В23 в неактивированных лимфоцитах, лимфоцитах после стимуляции ФГА и в клетках культуры Ramos.

Каждая точка является средним значением от трех сканирований. • -

экспериментальное определение; • ~ откорректированное (расчетное) определение; • - нестимулированные лимфоциты через 72 ч культивирования; верхняя точка (о) соответствует количеству белка В23 в клетках Ramos. Очень слабое увеличение количества В23 после 6 часов стимуляции не является статистически значимым, тогда как между остальными точками имеются статистически значимые различия (р<0,05).

Экспрессия белка В23 в лимфоцитах доноров и пациентов с различными лимфопролиферативными заболеваниями (оценка с помощью непрямого иммунопероксидазногометода).

После подсчета результатов иммунопероксидазного окрашивания с целью их дальнейшей обработки экспрессия антигена В23 была подразделена на 4 степени:

1. единичные клетки окрашены (<10%);

2. преобладание неокрашенных клеток (11-50%);

3. преобладание окрашенных клеток (51 - 90%);

4. практически все клетки окрашены (>90% ).

В результате иммунопероксидазной реакции донорских лимфоцитов с МКА ЗС9 в некоторых клетках можно было наблюдать слабо окрашенные небольшие округлые зоны, соответствующие ядрышкам. Необходимо отметить, что при данных условиях проведения реакции в клетках культуры Ramos, использованных в качестве положительного контроля, ядрышки окрашивались интенсивно и четко.

Выявлено, что основная масса донорских лимфоцитов в большинстве случаев оставалась неокрашенной. Лица, у которых клетки практически не окрашивались (1-ая степень), составили 53% от общего числа обследованных доноров, а те, у которых на препаратах наблюдали менее половины окрашенных клеток, составили 30% (1-ая и 2-ая степени экспрессии, соответственно). Доноры с 3-ей степенью экспрессии составили 17 %, при этом ни в одном случае не было выявлено максимального значения экспрессии В23, соответствующего 4-ой степени (таблица 2).

Среди всех обследованных больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями ни один не принадлежал к 1-ой группе по степени экспрессии В23, к которой было отнесено большинство доноров. Среди пациентов с низкозлокачественными формами лимфопролифераций, такими, как доброкачественная форма хронического В-лимфоцитарного лейкоза, в пределах одной нозологической группы наблюдались различные варианты окрашивания, от слабого до максимально выраженного (таблица 2). В случаях же неоплазий с высоким индексом пролиферации, определяемым по мечению клеток антителом Ki-67, всегда наблюдалось интенсивное окрашивание антителом ЗС9 (4-ая степень экспрессии В23) (таблица 2).

Таблица 2. Экспрессия В23 у здоровых лиц и больных различными лимфопролиферативными заболеваниями

Нозологическая форма Количество больных с указанной степенью экспрессии белка В23

1 степень 2 степень 3 степень 4 степень

Норма (доноры) 17 9 4 -

Реактивные состояния 2 12 5 2

Хронический В-лимфоцитарный лейкоз 9 12 2

Лимфома из клеток мантийной зоны - - 4 4

Центрофолликулярная лимфома - 1 - 2

Лимфома из клеток маргинальной зоны - 1 3 3

Волосатоклеточный лейкоз - 2 - 2

Беркиттоподобная лимфома / диффузная В-крупноклеточная лимфома 4

На ограниченном контингенте больных было проведено изучение взаимосвязи между экспрессией белка В23 и некоторыми клинико-лабораторными показателями заболевания, которые учитываются при диагностике и/или прогнозировании течения болезни. В эту группу вошли экспрессия маркера пролиферации антигена Е1-67, экспрессия поверхностного активационного маркера СБ38, распространенность заболевания и ответ на терапию. Выраженность этих показателей так же, как и экспрессия В23, была поделена на ранговые группы. В результате было получено, что между экспрессией В23 и Е1-67 имеется положительная корреляция (коэффициент ранговой корреляции Спирмена гз=0,2; р<0,05); между другими параметрами корреляции не обнаружено.

Для выявления различий между отдельными нозологическими группами по степени экспрессии белка В23 был проведен корреляционный анализ исследуемого показателя у больных с учетом нозологии заболевания. В результате было выявлено, что группы «хронический В-лимфоцитарный лейкоз» и «диффузная В-крупноклеточная лимфома/лимфома Беркитта» различаются статистически значимо (И-критерий Манна-Уитни; р<0,05). Для других групп значимые различия не

обнаружены. При этом показано, что степень экспрессии В23 в группе доноров наименьшая и значимо отличается (р<0,05) от всех нозологических групп, включая лимфопролиферативные заболевания с низкой степенью злокачественности.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Основным результатом настоящей работы явилась идентификация антигена, выявляемого новым моноклональным антителом ЗС9, а также изучение возможности использования этого антитела для анализа пролиферативной активности клеток в лабораторной и клинической практике.

Сравнение полученного МКА и имеющихся в нашем распоряжении лабораторных образцов антител анти-В23 и 20В2 (Chan P.K. et al, 1985; Ochs R. et al., 1983) с установленной специфичностью к белку В23 показало, что эти антитела обладают сходными, но не идентичными свойствами. ЗС9 отличается от известных антител тем, что относится к IgM классу иммуноглобулинов и при проведении реакции непрямой иммунофлюоресценции проявляет специфическую активность только в условиях экстракции клеток перед фиксацией. Очевидно, это связано с тем, что иммуноглобулины класса М (IgM) имеют сложную пентамерную организацию и большие, по сравнению с иммуноглобулинами других классов, размеры. Весьма вероятно, что в стандартных условиях фиксации клеток параформальдегидом или метанолом доступ к внутриклеточным антигенам для таких антител затруднен. Предфиксационная экстракция клеток буфером, содержащим Тритон Х-100, очевидно, делает эпитопы в молекуле В23 "открытыми" для взаимодействия с антителами. В условиях, оптимальных для работы с антителом ЗС9, контрольные антитела 20В2 и анти-В23 также окрашивали ядрышки равномерно и интенсивно, при этом флюоресценции цитоплазмы в интерфазных клетках не наблюдалось. Существенно, что артефактного перераспределения антигена в данном случае не происходило, поскольку контрольные антитела окрашивали экстрагированные и неэкстрагированные клетки сходным образом.

Как нами было показано, на иммуноблотах лизатов клеток Ramos три разных антитела к В23 выявляли одну доминантную (тяжелую) и одну-две минорных (более легких) полосы в области 35-40 кДа, что хорошо соответствовало данным, полученным для МКА 20В2 и анти-В23. Такой характер окрашивания объясняется тем, что фосфопротеин имеет, по крайней мере, 2 изоформы: В23.1 и В23.2 (а и ß, соответственно), различающиеся по электрофоретической подвижности. Поскольку на иммуноблотах все три антитела проявляли себя сходным образом, а также давали практически идентичное окрашивание методом непрямой иммунофлюоресценции, то эти наблюдения позволили

предположить, что все антитела выявляют одинаковые изоформы В23. Известно, что антитело к В23, описанное Ochs с соавторами, в основном взаимодействует с фосфорилированной доминантной изоформой В23, -В23.1, которая имеет электрофоретическую подвижность около 40 кДа. Мы полагаем поэтому, что ЗС9 также преимущественно взаимодействует с В23.1.

В соответствии с известными данными о распределении белка В23 на разных стадиях клеточного цикла наши наблюдения также показали, что внутриклеточная локализация В23 изменялась в ходе митоза. При этом существенно, что МКА ЗС9 окрашивало митотические клетки HeLa аналогично другим антителам к В23. В наших условиях, как правило, не удавалось выявить только нуклеоплазматический (в интерфазе) и цитоплазматический (в митозе) В23. Есть все основания полагать, что эти фракции белка В23 экстрагируются при обработке нефиксированных клеток буфером, содержащим детергент. В пользу этого говорит тот факт, что в пермеабилизованных клетках В23 не выявлялся также ни одним из контрольных антител, хотя при стандартных условиях фиксации нуклеоплазматический и цитоплазматический В23 сохранялись.

Известно, что при переходе клеток из состояния покоя к активной пролиферации происходят значительные изменения в распределении В23. Так, например, при исследовании ткани печени было установлено, что в усиленно делящихся опухолевых клетках количество В23 выше, чем в нормальных покоящихся гепатоцитах, примерно в 5-10 раз. Кроме того, существующие данные по взаимодействию В23 с РНК, ДНК и некоторыми белками, участвующими в регуляции клеточного цикла (Hingorani К. et al., 2000), позволяют предположить, что В23 ассоциирован с клеточной пролиферацией. В пользу этого также говорят наблюдения о том, что нарушение экспрессии В23 может приводить к дерегуляции клеточного цикла и к неконтролируемому злокачественному росту клеток.

Было установлено, что белок В23 можно рассматривать в качестве маркера пролиферации в случае регенерации печени и гиперплазии печеночных клеток (Yun J. et al., 2002). В дополнение к существующим данным, результаты настоящей работы, проведенной на ФГА-стимулированных лимфоцитах человека, не только показывают, что характер окрашивания ядрышка антителом ЗС9, как и количество самого белка В23, оказывается в прямой зависимости от пролиферативного статуса клеток, но и свидетельствуют о том, что эти изменения происходят до появления в клетках известного маркера репликативного периода, каким является антиген Ki-67. Многочисленные исследования взаимодействия МКА Ki-67 с различными типами клеток показали, что антиген Ki-67 экспрессируется в пролиферирующих, но не в покоящихся (Go) клетках. Методы с применением МКА Ki-67 являются достаточно популярными и доступными для клиник. Однако, необходим внимательный подход при их использовании для оценки ростовой фракции опухолевых клеток. Так, в некоторых случаях, Ki-67-позитивные клетки

описывают как клетки, аналогичные опухолевым, хотя в определенных тканях всегда существует ростовая фракция нормальных клеток, в частности, в зародышевых центрах лимфатических узлов. В то же время, имеются данные о том, что в некоторых случаях при использовании МКА Ki-67 существенно недооценивается ростовая фракция опухолевых клеток, в сравнении с результатами гистологического исследования.

Так, например, в экспериментах на культуре ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови доноров было выявлено, что антиген, связываемый МКА Ki-67, начинает экспрессироваться в поздней Gi-стадии, и его уровень поддерживается в S, G2 и М-фазах клеточного цикла. Очень важно отметить, что клетки, которые переходят в Gt из G0 под воздействием митогена, на ранних этапах не содержат Ki-67, в то время как клетки, перешедшие в Gt из митоза, всегда Ki-67-позитивны (Gerdes J. et al, 1984). Из этого следует, что клетки после митоза проходят иные метаболические превращения, чем Go-клетки, впервые вступающие в цикл. Исходя из этих данных, можно предположить, что ранние стадии стимуляции митогеном, не выявляемые с помощью МКА Ki-67, представляют собой начальный этап пролиферации и не являются частью клеточного цикла. Именно поэтому наше особое внимание при изучении динамики В23 в ходе ФГА-стимуляции было направлено на изучение ранних «Ki-67--негативных» этапов активации лимфоцитов.

В лимфоцитах, не стимулированных ФГА, наблюдали слабо окрашенные кольцевидные зоны, соответствующие ядрышкам. Такой характер окраски ядрышек определялся их крайне низкой транскрипционной активностью и общей архитектурой. Известно, что в нестимулированных лимфоцитах центральная часть ядрышка занята крупным фибриллярным центром, лишенным В23, а гранулярный компонент, являющийся структурным "вместилищем" В 23, сильно редуцирован и смещен на периферию ядрышка (Зацепина О.В., Сметана К., 1985).

По мере активации лимфоцитов к пролиферации происходили значительные изменения в распределении белка В 23. Первые признаки накопления В23 появлялись уже через 14-16 ч инкубации, т.е. до вступления лимфоцитов в S-фазу и появления в них маркера репликативного периода антигена Ki-67, которое происходило только через 24 ч после начала ФГА-стимуляции. По-видимому, это накопление белка В23 связано с активацией ядрышек при вступлении клеток в Gj-период, сопровождающийся подъемом синтеза рРНК.

На поздних сроках ФГА-стимуляции (48-72 ч) ядрышки лимфоцитов по своей морфологии и характеру окрашивания не отличались от ядрышек активно пролиферирующих клеток культур Ramos и Daudi. В этих же условиях уровень включения 3Н-тимидина достигал максимального значения, что, очевидно, свидетельствует о наибольшей пролиферативной активности клеток. Иными словами, на поздних сроках основная масса

лимфоцитов находилась в S-Gj-периодах клеточного цикла. Данное предположение подкрепляется результатами положительного Ki-67-окрашивания большинства клеток, и, помимо этого, находится в полном соответствии с литературными данными о динамике изменений структуры и числа ядрышек в ответ на ФГА-стимуляцию (Petrzilka G., Schroeder Н., 1979; Wachtler F. et al., 1980,1982).

Проведенный количественный анализ содержания В23 в активированных лимфоцитах полностью соответствует динамике окрашивания лимфоцитов антителом ЗС9. Первые статистически значимые различия в содержании В23 выявлены уже на сроке 16 ч. В этот период большинство клеток находилось в начальной/средней Gt -стадии клеточного цикла, и, по нашим данным, их еще нельзя идентифицировать с помощью МКА Ki-67. Уровень содержания В23 в лимфоцитах достигал наибольшего значения к 72 ч стимуляции, когда, как было показано выше, пролиферативная активность лимфоцитов максимальна, и оказывался практически таким же, как в клетках культуры Ramos.

Таким образом, можно заключить, что характер окрашивания ядрышек антителом к В23 является надежным иммуноцитохимическим маркером пролиферативного статуса клеток. Более того, при дополнительном проведении количественного анализа,

иммуноцитохимическое выявление В23 может быть использовано, как более ранний, чем Ki-67, маркер активации лимфоцитов, и, вследствие этого, может найти применение в клинической практике.

Иммуноцитохимическое выявление основных компонентов ядрышка, таких, как белок В23, коррелирующих с пролиферативным статусом клетки, могло бы служить важным инструментом при индивидуальном изучении опухолевых патологий. Результаты, подтверждающие данное предположение, были получены для нескольких типов злокачественных новообразований, таких как карцинома простаты, прямой кишки, желудка (Bocker Т. et al., 1995; Nozawa Y. et al., 1996; You B.J. et al., 1999). Возможность подобного использования МКА ЗС9 в онкогематологии была изучена нами на клетках доноров и больных различными лимфопролиферативными заболеваниями. Для этих целей нами был выбран непрямой иммунопероксидазный метод выявления В23 с помощью МКА ЗС9. Преимуществами данного метода являются простота и доступность для большинства гематологических учреждений страны, а также практически неограниченный срок хранения препаратов.

После проведения иммунопероксидазной реакции с МКА ЗС9 было отмечено, что в большинстве случаев основная масса донорских лимфоцитов оставалась неокрашенной. Полученные данные хорошо согласуются с имеющимися в литературе сведениями, касающимися морфофункциональных особенностей малоактивных ядрышек лимфоцитов (Wachtler F. et al., 1982). Характерно, что ни в одном случае не было выявлено максимальное значение экспрессии, соответствующее 4-ой

степени. В зависимости от природы заболевания клетки больных по частоте реагирования с МКА ЗС9 занимали промежуточное место между лимфоцитами доноров и активно пролиферирующими клетками лимфобластоидных линий (Daudi, Ramos). Важно отметить, что ни один из обследованных больных, в том числе и с неагрессивной формой заболевания, не был отнесен к 1-ой группе по степени экспрессии В23, в которой оказалось большинство доноров. Характерно, что в случаях неоплазий высокой степени злокачественности всегда наблюдали интенсивное окрашивание антителом ЗС9 (4-ая степень экспрессии В23). Статистически значимые различия по экспрессии В23 были выявлены между группами «хронический В-лимфоцитарный лейкоз» и «диффузная В-крупноклеточная лимфома/ Беркиттоподобная лимфома», а также между донорами и каждой из групп больных. Тот факт, что не во всех случаях удалось получить значимые различия, в значительной степени объясняется малочисленностью больных в группах с редко встречающимися нозологиями. Помимо этого, необходимо отметить, что больные, принадлежащие к одной нозологической группе, могут значительно различаться по некоторым клинико-лабораторным параметрам, в том числе и по пролиферативной активности патологических клеток, что может свидетельствовать о том, что классификация не всегда точно отражает природу заболевания.

Обнаруженная незначительная корреляция между экспрессией В23 и Ki-67 свидетельствует о том, что стадии клеточного цикла, в течение которых выявляются данные белки, совпадают лишь частично. Это предположение находится в соответствии с полученным нами данным по динамике В23 и Ki-67 в ФГА-стимулированных лимфоцитах.

Большой интерес представляет продолжение исследований в этом направлении с дальнейшим накоплением количественных данных, результатом которого может стать повышение достоверности начальных результатов исследования, а также выявление более тонких различий между отдельными нозологическими группами с помощью МКА ЗС9. Однако уже данное исследование, выявившее определенные корреляции, свидетельствует о том, что оценка количества В23 с помощью МКА ЗС9 может быть важной для диагностики различных злокачественных заболеваний системы крови, а также использоваться при прогнозировании течения заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Идентифицирован ядрышковый антиген с электрофоретической подвижностью 35-40 кДа, выявляемый моноклональным антителом ЗС9. Доказано, что он соответствует основному ядрышковому белку В23/нуклеофозмину.

2. Показано, что антитело ЗС9 направлено к обеим изоформам белка В23 -доминирующей В23.1 (электрофоретическая подвижность 37-38 кДа) и минорной В23.2 (электрофоретическая подвижность 35-36 кДа).

3. Разработаны оптимальные условия иммунофлюоресцентного и иммуно-пероксидазного выявления белка В23 в различных типах клеток с учетом принадлежности антитела ЗС9 к IgM-классу иммуноглобулинов.

4. Прослежены качественные и количественные изменения в распределении ядрышкового белка В 23 в динамике клеточного цикла. Установлено, что белок В23 является надежным иммунохимическим маркером последовательных стадий активации лимфоцитов человека к пролиферации.

5. На модели ФГА-стимулированной культуры донорских лимфоцитов показано, что белок В23 начинает выявляться в клетках раньше маркера репликативного периода белка Ki-67.

6. Выявлена положительная корреляция между экспрессией антигенов В23 и Ki-67 (г=0,2; р<0,05) в клетках больных с различными лимфопролиферативными заболеваниям. Обнаружены статистически значимые различия (р<0,05) по степени экспрессии В23 между группой здоровых лиц и больными каждой из нозологических форм, а также между больными с хроническим В-лимфолейкозом и В-лимфосаркомой.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Артеменко Е.Г., Булычева Т.И., Дергунова Н.Н., Малашенко О.С., Зацепина О.В., Дудник О.А. «Отечественные моноклональные антитела к ядрышковому белку В23 и их применение для анализа пролиферативной способности клеток». Цитология, 2000, №3, т. 42 (10), стр. 259-260.

2. Булычева Т.Н., Артеменко Е.Г., Дергунова Н.Н., Дудник О.А., Шпакова А.П., Малашенко О.С., Зацепина О.В. «Анализ пролиферативной активности клеток с помощью новых моноклональных антител к ядрышковому белку В23/нуклеофозмину». Цитология, 2000, №3, т. 42 (10), с. 944-954.

3. Булычева Т.Н., Артеменко Е.Г., Калинина И.А., Дергунова Н.Н., Малашенко О.С., Зацепина О.В., Дудник О.А. «Выявление ядрышкового антигена в различных клетках с использованием отечественных моноклональных антител». Клиническая лабораторная диагностика, 2000, №1, с.37-38.

4. N.N. Dergunova, T.I. Bulycheva, E.G. Artemenko, A.P. Shpakova, A.N. Pegova, E.G. Gemjian, O.A. Dudnik, O. V. Zatsepina, O.S. Malashenko. «A major nucleolar protein B23 as a marker of proliferation activity of human peripheral lymphocytes». Immunology Letters, 2002, 83, pp 6772.

5. Булычева Т.И., Дергунова Н.Н., Артеменко Е.Г., Малашенко О.С., Зацепина О.В. «Новая роль ядерного белка В23 как маркера ранней пролиферативной активности лимфоцитов человека». Материалы конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», 2002, стр. 102-103.

6. Булычева Т.И. , Артеменко Е.Г., Дергунова Н.Н., Шпакова А.П., Малашенко О.С., Калинина И.А., Дейнеко Н.Л., Карасева О.В., Зацепина О.В. «Новые моноклональные антитела к антигену клеточной пролиферации - ядрышковому белку В23/нуклеофозмину». Проблемы гематологии и переливания крови, 2003, №2, стр. 34-35.

Подписано в печать 21.102004 г. Формат 60x90,1/16. Объем 1,5п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 452

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Русаковская, д.1. т. 264-30-73 №^^.Ь1ок01 centre.narod.ru Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций.

№21509

РНБ Русский фонд

2005-4 19955

Оглавление диссертации Артеменко, Елизавета Георгиевна :: 2004 :: Москва

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ «Ядерные антигены, ассоциированные с пролиферацией клеток, и методы их выявления».

1.1. Понятие «клеточный цикл», его фазы, состояние 12 пролиферативного покоя («вне цикла»), принципы регуляции клеточного цикла.

1.2. Ядерные антигены пролиферирующих клеток (Ki-67, PCNA, 15 ДНК-полимераза альфа и т. д.).

1.3. Основной ядрышковый белок В23.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Подбор оптимальных иммуноцитохимических способов 60 выявления ядрышкового антигена с помощью моноклонального антитела ЗС9.

3.2. Идентификация антигена, выявляемого антителом ЗС9.

3.3. Изучение локализации антигена, выявляемого МКА ЗС9, в 70 динамике клеточного цикла.

3.4. Изменения в локализации В23 при стимуляции клеток к 72 пролиферации.

3.5. Исследование лимфоцитов доноров и больных с различными 82 формами лимфопролиферативных заболеваний с помощью непрямого иммунопероксидазного метода.

3.6. Получение новых гибридом, продуцирующих моноклональные 90 антитела к ядерным антигенам лейкоцитов крови человека.

Введение диссертации по теме "Гематология и переливание крови", Артеменко, Елизавета Георгиевна, автореферат

Актуальность темы:

Исследования клеток, проводимые методами иммуноцитохимии с использованием антител, получили очень широкое распространение как в фундаментальной клеточной биологии, так и в повседневной клинической практике. На сегодняшний день благодаря достижениям гибридомной биотехнологии в распоряжении исследователей имеется большое количество различных моноклональных антител (МКА) - стандартных и однородных агентов, доступных для получения в лабораторных условиях в неограниченном количестве. Одной из областей их применения является изучение клеточной пролиферации, поскольку изменения в наличии или распределении различных антигенов,' происходящие в клетках по ходу клеточного цикла, можно идентифицировать с помощью соответствующих антител. Помимо этого, в клинической практике количественный показатель пролиферативной активности, определяемый с помощью МКА, является важной характеристикой неопластической клеточной популяции и используется для прогнозирования течения опухолевого заболевания.

Ядрышко является обязательным структурным компонентом ядер клеток эукариот, в котором происходит синтез рибосомных РНК- и сборка прерибосомных частиц. Изменение функционального состояния ядрышка в ходе клеточного цикла сопровождается также изменением его иммуноцитохимических особенностей, что отчетливо проявляется при использовании антител к различным ядрышковым белкам. За последние два десятилетия в результате получения и применения моноклональных антител был открыт ряд новых белков, имеющих ядрышковую локализацию; антитела к которым нашли применение в клинической практике. Наиболее известным является< белок Ki-67, выявляющийся в поздней Gi, S, G2 и М-фазах клеточного цикла, но отсутствующий в Go-периоде (77). Кроме того, известен ряд других белков ядрышка, которые можно рассматривать в качестве возможных маркеров клеточной; пролиферации. К ним, в частности, можно отнести основной ядрышковый белок В23/нуклеофозмин, а также белки, которые участвуют в транскрипции рибосомных генов. Эти белки, как правило, обладают аргентофильными свойствами и проявляются при селективном окрашивании клеток солями серебра. Они локализуются в районе ядрышек в интерфазе и ядрышковых организаторов хромосом в митозе. Известно, что количество аргентофильных белков, определенное цитохимически на тотальных препаратах клеток или методом Вестерн-блоттинга в клеточных экстрактах, отражает способность клеток к пролиферации, закономерно изменяется в* динамике клеточного цикла и является надежным цитохимическим маркером клеточного; метаболизма в целом (54, 181). Однако в литературе до сих пор отсутствуют прямые доказательства того, что локализация и количество белка В23 в клетках действительно изменяются с течением клеточного цикла, которые были бы получены с использованием антител к этому белку. В то же время, набор моноклональных антител к индивидуальным ядрышковым белкам, которые можно было- бы использовать не только для изучения фундаментальных вопросов, связанных с биогенезом рибосом, но и для решения прикладных задач, является на сегодняшний день явно недостаточным. Как правило, в распоряжении исследователей имеются аутоиммунные или поликлональные антитела к ядрышку, количество которых в силу их происхождения ограничено. В связи с этим, детальное изучение нового моноклонального антитела ЗС9, полученного в лаборатории клинической иммунологии ГНЦ РАМН (зав. лаб. - проф. Булычева Т.И.), которое направлено к ядрышковому антигену, является на сегодняшний день крайне актуальной задачей.

Цель работы:

Идентификация антигена, выявляемого новым моноклональным антителом ЗС9, а также изучение возможности использования этого антитела для анализа пролиферативной активности клеток в лабораторной и клинической практике.

Задачи работы:

1. Определить электрофоретическую подвижность и описать локализацию ■ антигена, выявляемого моноклональным антителом ЗС9, с помощью световой иммуноцитохимии. Методом иммунопреципитации выяснить возможное соответствие ЗС9-антигена основному белку ядрышка В23/нуклеофозмину.

Научная новизна:

Установлено, что полученное моноклональное антитело ЗС9 выявляет ядрышковый белок В23/нуклеофозмин.

Моноклональное антитело к В23 было впервые использовано для оценки пролиферативной активности гемопоэтических клеток. Сравнительный анализ показал, что накопление белка В23 происходит уже в ранней Gi-стадии, до появления в них известного маркера пролиферирующих клеток белка Ki-67. Полученные данные указывают на то, что антитело ЗС9 позволяет выявить более ранние стадии пролиферации, чем антитело Ki-67.

Теоретическое и практическое значение:

Положения, выносимые на защиту:

3. На основании клинико-лабораторного анализа обследуемых лиц (30 здоровых и 70 больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями) показана положительная корреляция между экспрессией антигенов В23 и Ki-67 (г=0,2; р<0,05). Выявлены статистически значимые различия (р<0,05) по степени экспрессии В23 в лимфоцитах здоровых лиц и больных всеми нозологическими формами лимфопролиферативных заболеваний, а также больных хроническим В-лимфолейкозом и В-лимфосаркомой.

Апробация работы состоялась на заседании проблемной комиссии «Кроветворение в норме и патологии, молекулярная биология, биотехнология» Гематологического научного центра РАМН. Материалы диссертации были доложены на XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, октябрь 1999 г.), на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, июнь 2000 г., июнь 2002 г., июнь 2004 г.), на I Всероссийском съезде гематологов (Москва, апрель 2002 г.), на научно-практической конференции «Новое в гематологии и клинической трансфузиологии» (Москва; апрель 2003 г., апрель 2004 г.), на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, сентябрь 2004 г.), на Международном научном семинаре «Современная диагностика лимфопролиферативных заболеваний» (Санкт-Петербург, октябрь 2004 г.). По материалам диссертации опубликовано три статьи в центральных журналах и трое тезисов, в том числе одна статья — в зарубежной печати.

Работа выполнена в лаборатории клинической иммунологии Гематологического научного центра РАМН (зав. лаб. - проф., д.м.н. Булычева Т.И.) и в лаборатории ультраструктуры клеточного ядра сектора электронной микроскопии Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова (зав. лаб. - д.б.н. Зацепина О.В.).

Заключение диссертационного исследования на тему "Иммуноцитохимический анализ ядерных антигенов лимфоцитов человека, выявляемых с помощью моноклональных антител"

ВЫВОДЫ.

1. Идентифицирован ядрышковый антиген с молекулярной массой 35-40 кДа, выявляемый моноклональным антителом ЗС9. Доказано, что он соответствует основному ядрышковому белку В23/нуклеофозмину.

2. Показано, что антитело ЗС9 направлено к обеим изоформам белка В23 — доминирующей В23.1 (молекулярная масса 37-38 кДа) и минорной В23.2 (молекулярная масса 35-36 кДа).

3. Разработаны оптимальные условия иммунофлюоресцентного и иммунопероксидазного выявления белка В23 в различных типах клеток с учетом принадлежности антитела ЗС9 к IgM-классу иммуноглобулинов.

4. Прослежены качественные и количественные изменения в распределении ядрышкового белка В23 в динамике клеточного цикла. Установлено, что белок В23 является надежным иммуноцитохимическим маркером последовательных стадий активации лимфоцитов человека к пролиферации.

6. Выявлена положительная корреляция между экспрессией антигенов В23 и Ki-67 (г=0,2; р<0,05) в клетках больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями. Обнаружены статистически значимые различия (р<0,05) по степени экспрессии В23 между группой здоровых лиц и больными каждой из нозологических форм, а также между больными с хроническим В-лимфолейкозом и Беркиттоподобной лимфомой.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2004 года, Артеменко, Елизавета Георгиевна

1. Барышников Ю.А. Моноклональные антитела серии ИКО к дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека. // Гематол. трансфузиол. 1990; 35(8): 4-7.

2. Браун Дж., Линг Н.Р. Моноклональные антитела мыши. // в кн. Кэтти Д. (ред.) Антитела. Методы. Кн.1 -М.: Мир, 1991; 117.

3. Ерифанова О.И. Общие принципы регуляции клеточного цикла. // в кн. «Лекции о клеточном цикле» М.: КМК Scientific Press, 2003; 151.

4. Короткова О.В., Барышников А.Ю., Тупицин Н.Н. и др. Моноклональные антитела ИКО-10 к антигену Thy-Г. // Эксперим. онкол. 1989; 11(2): 33-35.

5. Крокер Д.Ж. Показатели клеточной пролиферации при злокачественных лимфомах с особым рассмотрением ядрышкообразующих районов.//Гематол. Трансфузиол. 1994; 39(6): 12-19.

6. Малашенко . О.С., Самойлова Р.С., Булычева Т.И. Иммуноцитохимический метод оценки пролиферативного статуса лимфоидных клеток при лимфопролиферативных заболеваниях. // Клиническая лабораторная диагностика. 1995; 3: 51-54.

7. Мамаев Н.Н., Мамаева С.Е. Структура и функция ядрышковых организаторов хромосом: молекулярные, цитологические и клинические аспекты. // Цитология. 1992; 34(10): 3-25.

8. Мамаев Н.Н., Мартинес У., Морозова В.О., Иванова Н.А. Характеристика окрашенных серебром ядрышек в бластных элементах разного диаметра больных острыми лейкозами. // Цитология. 1988; 30: 1478-1482.

9. Новикова Н.Н., Митерев Г.Ю., Новикова М.С. и др. Моноклональные антитела ВСА-09, направленные к поверхностномуантигену бластных клеток при остром миелобластном лейкозе. // Гематол. трансфузиол. 1991; 36(1): 31-32.

10. Погорелов В. М. Оценка Ag-положительных ядрышкообразующих районов хромосом в нуклеолах интерфазных злокачественных клеток. // Гематол. Трансфузиол. 1994; 39(6): 19-21.

11. Сидоренко С.П., Шлапацкая JI.H., Ветрова Е.П. и др. Моноклональные антитела ИПО-38 к ядерному антигену пролиферирующих клеток. // Эксперим. онкол. 1994; 16: 145-149.

12. Упоров А. В., Цирлина Е.В., Пожарский К.М. Сравнительное исследование пролиферации (по выявлению Ki-67 антигена) и активности ядрышкообразующих районов в клетках рака молочной железы. // Вопр. Онкол. 1998; 44(3): 316-324.

13. Филатов А.В., Бачурин П.С., Щербухин В.В. и др. Исследование экспрессии пан-Т- клеточных маркеров лимфоцитов человека при первичных иммунодефицитах. // Иммунология. 1987; 5:81-84.

14. Филатов А.В., Бачурин П.С., Маркова Н.А. и др. Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов человека. // Гематол. трансфузиол. 1990; 35(4): 16-19.

15. Челидзе П.В., Зацепина О.В. Морфо-функциональная классификация ядрышек. // Усп. Совр. Биол. 1988; 105: 252-258.

16. Шпакова А.П., Булычева Т.И. 1992. Определение совместимости по локусу HLA-D в смешанной культуре лимфоцитов при трансплантации костного мозга. // Клиническая лабораторная диагностика. 1-2: 36-39.

17. Зацепина О.В., Сметана К. Электронно-микроскопическое исследование локализации Ag-белков в ядрышках лимфоцитов человека. // Цитология. 1985; 27(11): 1228-1234.

18. Aoyagi К., Kohfuji К., Yano S., et al. The expression of proliferating cell nuclear antigen, p53, p21, and apoptosis in primary gastric lymphoma. // Surgery. 2002; 132(1): 20-26.

19. Bocker Т., Bittinger A., Wieland W. et al. In vitro and ex vivo expression of nucleolar proteins B23 and p 120 in benign and malignant epithelial lesions of the prostate. //Mod. PathoL 1995; 8(3): 226-31.

20. Bolton W., Freeman J., Mikulka W. et al. Expression of proliferation-associated antigens (PCNA, pi20, pl45) during the reentry of G0 cells into the cell cycle. // Cytometry. 1994; 17(1): 66-74.

21. Bravo R., Macdonald-Bravo M. Changes in the nuclear distribution of cyclin/PCNA but not its synthesis depend on DNA replication. // EMBO J. 1985; 4: 655-659;

22. Bravo R., Macdonald-Bravo M. Existence of two populations of cyclin/proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle/ Association with DNA replication sites. // J. Cell Biol. 1987; 105: 1549-1555.

23. Brons P., Raemaekers J., Bogman M. et al. cell cycle kinetics in malignant lymphoma studied with in vivo iododeoxyuridine administration, nuclear Ki-67 staining, and flow cytometry. //Blood. 1992; 80(9): 2336-2343.

24. Broun D., Gatter K. Monoclonal antibody Ki-67: its use in histopathology. // Histopathology. 1990; 17(6): 489-503.

25. Broun D., Gatter K., Nason D. Proliferation in non-Hodgkin's lymphoma: a comparison of Ki-67 staining on fine needle aspiration and cryostat sections.// J. Clin. Pathol. 1990; 43(4): 325-328.

26. Bruno S., Darzinkievwicz Z. Cell Cycle dependent expressin and stability of the nuclear protein detected by Ki-67 antibody in HL-60 cells. // Cell Prolif. 1992; 25(1): 31-40.

27. Burford-Mason A., MacKay A., Cummins M. et al. Detection of proliferating cell nuclear antigen in paraffin-embedded specimens is dependent on preembedding tissue handling and fixation. // Arch. Pathol. Lab. Med. 1994; 118(10): 1007-1013.

28. Bush C., Price A., Norton J. et al. Proliferation in human bladder carcinoma measured by Ki-67 antibody labeling: its potential clinical importance. //Br. J. Cancer. 1991; 64(2): 357-360.

29. Canet V., Montmasson M.P., Usson Y. et al. Correlation between silver-stained nucleolar organizer region area and cell cycle time. // Cytometry. 2001; 43(2): 110-116.

30. Carr I., Pettigrew N. How malignant is malignant? A brief review of the microscopic assessment of human neoplasms, and the prediction of whether they will metastasize and kill. // Clin. Exp. Metastasis. 1991; 9(2): 127-137.

31. Ceccarelli C., Trere D., Santini D. et al. AgNORs in breast tumours. // Micron. 2000; 31(2): 143-149.

32. Chan P.K. Characterization and cellular localization of nucleophosmin/B23 in HeLa cells treated with selected cytotoxic agents (studies of B23-translocation mechanism). // Exp. Cell Res. 1992; 203(1): 174-181.

33. Chan P.K., Aldrich M., Busch H; Alterations in immunolocalization of the phosphoprotein B23 in HeLa cells during serum starvation. // Exp. Cell Res. 1985; 161(1): 101-110.

34. Chan P.K., Chan F.Y. Nucleophosmin/B23 (NPM) oligomer is a major and stable entity in HeLa cells. // Biochim. Biophys. Acta. 1995; 1262(1): 3742.

35. Chan P.K., Liu Q.-R, Durban E. The major phosphrylation site of nucleophosmin (B23) is phosphorylated by a nuclear kinase II. // Biochem. J. 1990; 270: 549-552.

36. Chan P.K., Qi Y., Amley J., Koller C.A. Quantitation of the nucleophosmin/B23-translocation using imaging analysis. // Cancer Lett. 1996; 100(1-2): 191-197.

37. Chang J.-H. and M.O.J. Olson. Structure of the gene for rat nucleolar proteinB23. III. Biol. Chem. 1990; 265(30): 18227-18233.

38. Chatterjee A., Freeman J.W., Busch H. Identification and partial characterization of a Mr 40,000 nucleolar antigen associated with cell proliferation.//Cancer Res. 1987; 15;47(4): 1123-1129.

39. Chatterjee A., Freeman J.W., Busch H. Identification and partial characterization of a Mr 105,000 nucleolar antigen associated with cell proliferation. // Cancer Res. 1987; 1;47(23): 6329-6334.

40. Chen J., Jackson P., Kirschner M. et al. Separate domains of p21 invovled in the inhibition of Cdk kinase and PCNA. // Nature. 1995; 374(6520): 386-388.

41. Chiarle R., JGong J.Z., Guasparri I. et al. NPM-ALK transgenic mice spontaneously develop T-cell lymphomas and plasma cell tumors. // Blood. 2002; epub ahead of print.

42. Coltrera M., Gown A. PCNA/cyclin expression and BrdU uptake define different subpopulations in different cell lines. //J. Histochem. Cytochem. 1991; 39(1): 23-30.

43. Cordell J., Pulford K., Bigerna B. et al. Detection of normal and chimeric nucleophosmin in human cells. // Blood. 1999; 93(2): 632-642.

44. Couldwell W., Weiss M., Law R. et al. Paradoxical elevation of Ki-67 labeling with protein kinase inhibition in malignant gliomas. // J. Neurosurg. 1995; 82(3): 461-468.

45. Del Bino G., Li X., Traganos F. et al. Altered susceptibility of differentiating HL-60 cells to apoptosis induced by antitumor drugs. // Leukemia: 1994; 8(2): 281-288.

46. Derenzini M. The AgNORs. // Micron. 2000; 31(2): 117-120.

47. Derenzini M., Pession A., Threre D. Quantity of nucleolar silver-stained proteins is related to proliferating activity in cancer cells. // Lab. Invest. 1990; 63:137-140.

48. Derenzini M., Ploton D. Interphase nucleolar organizer regions in cancer cells. //Int. Rev. Exp. Pathol. 1991; 32: 149-192.

49. Derenzini M., Sirri V., Pession A. et al. Quantitative changes of the two major AgNOR proteins, nucleolin and protein B23, related to stimulation of rDNA transcription. // Exp. Cell Res. 1995; 219(1): 276-282.

50. Derenzini M, Sirri V, Trere D, Ochs RL. The quantity of nucleolar proteins nucleolin and protein B23 is related to cell doubling time in human cancer cells. // Lab. Invest. 1995; 73(4): 497-502.

51. Derenzini M., Trere D. AgNOR proteins as a parameter of the rapidity of cell proliferation. //Zentralbl. Pathol. 1994; 140(1): 7-10 .

52. Derenzini M., Trere D., Pession A. et al. Nucleolar size indicates the rapidity of ceir proliferation in cancer tissues. // J. Pathol. 2000; 191(2): 181186.

53. Derenzini M, Trere D, Pession A, et al. Nucleolar function and size in cancer cells. //Am. J. Pathol. 1998; 152(5): 1291-1297.

54. Van Dierendonck J., Wijsman J., Keijezer R. et al. Cell cycle-related staining patterns of anti-proliferating cell; nuclear antigen monoclonal antibodies. Comparison with BrdUrd labeling and Ki-67 staining. // Am. J. Pathol. 1991; 138(5): 1165-1172.

55. Duchrow M., Schluter C., Wohlenberg C. et al. Molecular characterization of the gene locus of the human cell proliferation-associated nuclear protein defined by monoclonal antibody Ki-67. // Cell Prolif. 1996; 29(1): 1-12.

56. Endl E., Gerdes J. The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function. // Exp. Cell Res. 2000; 257(2): 231-237.

57. Endl E., Gerdes J. J. Posttranslational modifications of the KI-67 protein coincide with two major checkpoints during mitosis. // Cell Physiol. 2000; 182(3): 371-380.

58. Fairman M. DNA polymerase delta/PCNA: action and interaction. // J. Cell Sci. 1990; 95: 1-4:

59. Falini В., Flenghi L., Fagioli M. et al. Evolutionary conservation in various mammalian species of the human proliferation-associated epitope recognized by Ki-67 monoclonal antibody. // J. Histochem. Cytochem. 1989; 37: 1471-1476.

60. Feuerstein N. and Mond J.J. "Numatrin", a nuclear matrix protein associated with induction of proliferation in В lymphocytes. J. Biol. Chem. 1987; 262: 11389-11397.

61. Freeman J., Busch R. Monoclonal antibodies to human tumor nucleolar antigens: probes for studying biological function and determining clinical significance. // Hum. Antibodies Hybridomas. 1991; 2(1): 4-10.

62. Freeman J., Busch R., Gyorkey F. et al. Identification and characterization of human proliferation-associated nucleolar antigen with a molecular weight of 120.000 expressed in early Gi.phase. // Cancer Res. 1988; 48(5): 1244-1251.

63. Freeman J., Hazlewood J., Bondada V. et al. Proliferation related nucleolar antigens pl45 and pl20 associated with separate nucleolar elements and differences in tissue distribution. // Cancer Commun. 1989; 1(6): 367-372.

64. Freeman J., McRoire D., Busch P. et al. Identification and partial characterization of a nucleolar antigen with a molecular weight of 145.000 found in a broad range of human cancers. // Cancer Res. 1986; 46(7): 35933598.

65. Fujimoto J., Shiota M., Iwahara T. et al. Characterization of the transforming activity of p80, a hyperphosphorylated protein in a Ki-1 lymphoma cell line with chromosomal translocation t(2;5). // Proc. Natl; Acad. Sci. USA. 1996; 93(9): 4181-4186.

66. Fukami-Kobayashi J., Mitsui Y. Overexpression of proliferating cell nuclear antigen in mammalian cells negates growth arrest by serum starvation and cell contact. // Jpn. J. Cancer Res. 1999; 90(3): 286-293.

67. Gerdes J., Lemke H., Baisch H. et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation- associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67.//J. Immunol. 1984; 133: 1710-1715.

68. Gerdes J., Li L., Schlueter C. Immunochemical and molecular biologic characterization of the cell proliferation-associated nuclear antigen that is defined by monoclonal antibody Ki-67. // Am. J. Pathol. 1991; 138(4): 867-873.

69. Gerdes J., Schwab U., Lemke H. et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. // Int. J. Cancer. 1983; 31: 12-16.

70. Girod S., Groth W., Junk M. et al. P53 and PCNA expression in malignant melanomas of the head and neck. // Pigment. Cell Res. 1994; 7(5): 354-357.

71. Goodpasture C., Bloom S.E. Visualisation of nucleolar organizer regions in mammalian chromosomes using silver staining. // Chromosoma. 1975; 52: 37-50.

72. Gore S., Weng L., Burke P. Identification of growth factor-responsive acute myelogenous leukemia based on factor-dependence for survival and proliferation. // Leukemia. 1994; 8: 1854-1863.

73. Guillaud P., Vermont J., Seigneurin D. Automatic classification of cells in cell cycle phases based on Ki-67 antigen quantification by fluorescence microscopy. // Cell Prolif. 1991; 24(5): 481-491.

74. Haijolov A.A. The nucleolus and ribosome biogenesis. // Cell Biol. Monography. 1985; 12: 1-268.

75. Haldane J., Scott R., Wright N. Does the use Ki-67 allow the determination of tumor growth fraction? // J. Pathol. 1990; 160: 155-161.

76. Hall P., Kearsey J., Coates P. et al. Characterization of the interaction between PCNA and Gadd45. // Oncogene. 1995; 10(12): 2427-2433.

77. Hall P., Levison D., Woods A. et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunolocalization in paraffin sections: an index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms. // J. Pathol. 1990; 162(4): 285-294.

78. Hall P., Woods A. Immunohistochemical markers of cellular proliferation. // Cell Tissue Kinet. 1990; 23: 505-522.

79. Hartwell L., Weinert T. Checkpoints. Controls that ensure the order of cell cycle events. // Science. 1989; 249: 629-638.

80. Hazlewood J., Fonagy A., Henning D. et al. mRNA levels for human nucleolar protein pi20 in tumor and nontumor cells. // Cancer Commun. 1989; 1(1): 29-34.

81. Hendricks J., Wilkinson E. Quality control considerations for Ki-67 detection and quantitation in paraffin-embedded tissue. // J. Cell Biochem. Suppl. 1994; 19: 105-110.

82. Hernandez-Verdun D. The nucleolus today. // J Cell Sci 1991; 99: 465471.

83. Hernandez-Verdun D., Roussel P., Gebrane-Younes J. Emerging concepts of nucleolar assembly. // J. Cell Sci. 2002; 115(Pt 11) :2265-7220.

84. Hingorani K., Szebeni A., Olson M.O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. // J. Biol. Chem. 2000; 275(32):24451-24457.

85. Hirt A., Werren E., Luethy A. et al. Cell cycle analysis in lymphoid neoplasma in childhood: differences among immunologic subtypes and similarities in the proliferation of normal and leukemic precursor B-cells. // Br. J.Haematol. 1992; 80(2): 189-193.

86. Hofmann-Wellenhof R., Smolle J., Kerl H. The influence of staining procedures on the assessment of cell proliferation as defined by the monoclonal antibody Ki67. // Am. J. Dermapathol. 1990; 12(5): 458-461.

87. Hozak P., Zatsepina O., Vasilyeva J. Chentsov Y. An electron microscopic study of nucleolus organizer regions at some stages of the cell cycle (Gi period, G2 period, mitosis). // Biol. Cell. 1986; 57(3): 197-205.

88. Isola J., helin H., Kellionienei O. Immunoelectron-microscopic localization of a proliferation-associated antigen Ki-67 in MCF-7 cells. // J. Histochem. 1990; 22(9): 498-506.

89. Ivanyi J.L., Kiss A., Telek B. Nucleolar organizer regions in acute and chronic leukaemias. //Acta Histochem 1992; 93(2): 453-461.

90. Iyengar B. Expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA): proliferative phase functions and malignant transformation of melanocytes. // Melanoma Res. 1994; 4(5): 293-295.

91. Izban K.F., Alkan S., Singleton T.P., Hsi E.D. Multiparameter immunohistochemical analysis of the cell cycle proteins. cyclinDl, Ki-67, p21WAFl, p27KIPl, and p53 in mantle cell lymphoma. // Arch. Pathol. Lab. Med. 2000; 124(10): 1457-1462.

92. Jakobisiak M., Bruno S., Skierski J. et al. Cell cycle specific effects of lovastatin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 88(9): 3628-3632.

93. Jiang P.S., Chang J.H., Yung B.Y. Different kinases phosphorylate nucleophosmin/B23 at different sites during G(2) and M phases of the cell cycle. //CancerLett. 2000; 153(1-2): 151-160.

94. Junera' H.R., Masson C., Geraud G. et al. Involvement of in situ conformation of ribosomal genes and selective distribution of upstream binding factor in rRNA transcription. // Mol. Biol. Cell. 1997; 8: 145-156.

95. Kalir Т., Chan K.S., Liu Z. et al. Semi-automatic quantitation of nucleolar organizer regions in non-Hodgkin's lymphomas. // Pathol. Res. Pract. 1994; 190(2): 124-128.

96. Kamel O., LeBrun D., Davis R. et al. Growth fraction estimation of malignant lymphomas in formalin-fixed paraffin-embedded tissue using anti-PCNA/cyclin 19A2. Correlation with Ki-67 labeling. Am. J. Pathol. 1991; 138(6): 1471-1477.

97. Kamerow H., Perchick A., Burstein D. Immunocytochemical detection of cyclin, a proliferation-associated protein, in cytologic preparations. // Acta Cytol. 1991; 35(5): 491-496.

98. Keim D., Hailat N., Hodge D. et al. Proliferating cell nuclear antigen expression in childhood acute leukemia. // Blood. 1990; 76(5): 985-990.

99. Key G., Kubbutat M., Gerdes J. Assessment of cell proliferation by means of an enzyme-linked immunosorbent assay based on the detection of the Ki-67 protein. // J. Immunol. Meth. 1994; 117: 113-117.

100. Keyomarsi K., Sandoval L., Band V. et al. Synchronization of tumor and normal cells from Gi to multiple cell cycles by lovastatin. // Cancer res. 1991; 51(13): 3602-3609.

101. Klobusicka M., Babusikova O. The relationship between argyrophilic proteins and some immunophenotypic markers in acute leukemia cells. // Neoplasma. 1997; 44(6): 356-360.

102. Kondo Т., Minamino N., Nagamura-Inoue Т. et al; Identification and characterization of nucleophosmin/B23/numatrin which binds the anti-oncogenic transcription factor IRF-1 and manifests oncogenic activity. // Oncogene. 1997; 15(11): 1275-1281.

103. Kotelnikov V. Prognostic significance of neoplastic cell proliferation in human haematological malignancies. // Folia Haematol; 1990; 117(3): 391-397.

104. Krauss J., Pantazis C., Chandler F. The proliferative fraction in lymph nodes: a comparison of proliferating cell nuclear antigen morphometry to flow cytometry. //Ann. Clin. Lab. Sci. 1992; 22(3): 189-196.

105. Kreitz S., Fackelmayer F.O., Gerdes J., Knippers R. The proliferation-specific human Ki-67 protein is a constituent of compact chromatin. // Exp .Cell Res. 2000; 261(1): 284-292.

106. Kreipe H., Heidebrecht H., Hansen S. et al. New proliferation-associated nuclear antigen detectible in paraffin-embedded tissue by the monoclonal antibody Ki-Sl. // Am. J. Pathol. 1993; 142(1): 3-9.

107. Kreipe H., Wacker H., Heidebrecht H. et al. Determination of the growth fraction in non-Hodgkin's lymphomas by monoclonal antibody Ki-S5 directed against a formalin-resistant epitope of the Ki-67 antigen. // Am. J. Pathol. 1993; 142(6): 1689-1694.

108. Kurki P., Vanderlaan M., Polbear F. et al. Expression of proliferation cell nuclear antigen (PCNA/cyclin) during the cell cycle. // Exp. Cell Res. 1986; 2166: 209-219.

109. Kute Т., Quadri Y. Measurement of proliferation nuclear and membrane markers in tumor cells by flow cytometry. // J. Cytochem. Histochem. 1991; 39(8): 1125-1130.

110. Landberg G., Roos G. Washless double staining of PCNA and Ki-67 in FCM cell cycle analysis. // Cell Prolif. 1990; 24(1): 106-111.

111. Landberg G., Roos G. Antibodies to proliferating cell nuclear antigen as S-phase probes in flow cytometric се1Г cycle analysis. // Cancer Res. 1991; 51(17): 4570-4574.

112. Landberg G., Tan E., Roos G. Flow cytometric multiparameter analysis of proliferating cell nuclear antigen/cyclin and Ki-67 antigen: a new view of the cell cycle. // Exp. Cell Res. 1990; 187(1): 111-118.

113. Larsson P. Cell proliferation in renal cell carcinoma. A clinical study with special reference to prognosis. // Scand. J. Urol. Nephrol. Suppl. 1994; 165: 1-8.

114. Laskey R., Fairman M., Blow J. S phase of the cell cycle. // Science. 1989; 246: 609-613.

115. Lee M. Y. W. T., Alegandro R., Toomew N. Immunochemical studies of DNA polymerase delta: relationships with DNA polymerase alpha. // Arch. Biochem. Biophis. 1989; 272: 1-9.

116. Lelle R.J. In situ determination of the Ki-67 growth fraction (Ki-67 GF) in human tumors Article in German. // Acta Histochem. Suppl. 1990; 39: 109124.

117. Leonardi E., Girlando S., Serio G. et al. PCNA and Ki-67 expression in breast carcinoma. Correlations with clinical and biological variables. // J. Clin. Pathol. 1992;45:416-419.

118. Leoncini L., Del Vecchio M., Megha T. et al. Correlations between apoptotic and proliferative indices in malignant non-Hodgkin's lymphomas. // Am. J. Pathol. 1993; 142(3): 755-763.

119. Liu Q.-R, Chan P.K. Characterization of seven processed pseudogenes of nucleophosmin/B23 in the human genome. // DNA and Cell Biol. 1993; 12: 149156.

120. Liu Q.R., Chan P.K. Formation of nucleophosmin/B23 oligomers requires both the amino- and the carboxyl-terminal domains of the protein. // Eur. J. Biochem. 1991; 200(3): 715-721.

121. Liu Y.C., Chen G.S., Liu W.L. et al. Estimation of PCNA mRNA stability in cell cycle by a serum- deprivation method. // J. Cell Biochem. 1995; 57(4): 641-646.

122. Liu H.T., Yung B.Y. In vivo interaction of nucleophosmin/B23 and protein C23 during cell cycle progression in HeLa cells. // Cancer Lett. 1999; 144(1): 45.54.

123. Lohr F., Wenz F., Haas S. et al. Comparison of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) staining and BrdUrd-labeling index under different proliferative conditions in vitro by flow cytometry. // Cell Prolif. 1995; 28(2): 93-104.

124. Lorand-Metze I., Carvalho M.A., Metze K. Relationship between morphometric analysis of nucleolar organizer regions and cell proliferation in acute leukemias. //Cytometry. 1998; 32(1): 51-56.

125. Lundblad D., Landberg G., Roos G. et al. Ki-67 as a marker for cell cycle regulation by interferon. // Anticancer Res. 1991; 11(6): 2131-2136.

126. MacCallum D.E., Hall P.A. Biochemical characterization of pKi67 with the identification of a mitotic-specific form associated with hyperphosphorylation and altered DNA binding. // Exp. Cell Res. 1999; 252(1): 186-198.

127. MacCallum D.E., Hall P.A. The location of pKi67 in the outer dense fibrillary compartment of the nucleolus points to a role in ribosome biogenesis during the cell division cycle. // J. Pathol. 2000; 190(5): 537-544.

128. Marandola P., Lardennois В., Ploton D. et al. A new marker for early detection and indicator of progression of cancer of the bladder. Preliminary results with Ag-NOR index in 38 cases of superficial bladder cancer. // Eur. Urol. 1992; 21(1): 31-33.

129. Marandola P., Lardennois В., Ploton D. et al. Nucleolar organizer regions: preliminary results of the clinical use of a new marker for prostatic carcinoma (40 cases). // Eur Urol 1992; 21(1): 71-74.

130. McGrath P., Holley D., Hamby L. et al. Prospective study correlating pi20 antigen expression with established prognostic factors in breast cancer. // Surg. Oncol. 1994; 3(2): 69-77.

131. Mcintosh I., Koonce M. Mitosis. // Science. 1989; 246: 622-628.

132. Miettinen M., Schwarting R., Hyun B. Immunohistochemical evaluation of hematologic malignancies. // Hematol. Oncol. Clin North Am. 1994; 8(4): 683-701.

133. Mikulka W., Bolton W. methodologies for the preservation of proliferation associated antigens PCNA, pi20, and pi05 in tumor cell lines for use in flow cytometry. // cytometry. 1994; 17(3): 246-257.

134. Mitani S., tango Т., Sonobe Y. et al. Expression of three cell proliferation-associated antigens, DNA polymerase alpha, Ki-67 antigen and transferring receptor in nodal and cutaneous T-cell lymphomas. // Int. J; Hematol. 1991; 54(5): 385-393.

135. Montalban C., Obeso G., Gallego A. Peripheral T-cell lymphoma: a clinicopathological study of 41 cases and evaluation of the prognostic significance of the update Kiel classification. // Histopathology. 1993; 22(4): 303-310.

136. Muro Y., Chan E., Landberg G. et al. A cell-cycle nuclear autoantigen containing WD-40 motifs expressed mainly in S and G2 phase cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 207(3): 1029-1037.

137. Murray A., Kirschner M. Dominoes and clocks: the union of two views of the cell cycle. // Science. 1989; 246: 614-621.

138. Ng I.O., Lai E.C, Fan S.T. et al. Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in hepatocellular carcinoma. // Cancer. 1994; 73(9): 2268-2274.

139. Niewiadomska H., Mirowski M., Kulczycka D. et al. Some oncogene and tumour suppressor gene protein products expression in B-cellchronic lymphocytic leukaemia. //Cytobios. 2000; 103(404):.159-168.

140. Nilsson S., Nordgren H., Eklov S. et al. Expression of Ki-67 a proliferation-associated antigen — in prostatic cancer. // Acta Oncol. 1991; 30(2): 177-179.

141. Nozawa Y., Van Belzen N., Van der Made A.C. et al. Expression of nucleophosmin/B23 in normal and neoplastic colorectal mucosa. // J. Pathol. 1996; 178(1): 48-52.

142. Ochs R., Lischive M.A., O'Leary P., Busch H. Localization of nucleolar phosphoproteins B23 and C23 during mitosis. // Exp.Cell Res. 1983; 146: 139149.

143. Ochs R., Reilly M., Freeman J., Busch H. Intranucleolar localization of human proliferating cell nuclear antigen pi20. // Cancer Res. 1988; 48(22): 6523-6529.

144. Ogata K., Kurki P., Celi J.E.E. et al. Monoclonal antibodies to a nuclear protein (PCNA/cyclin) associated with DNA replication. // Exp. Cell Res. 1987; 168:475-486.

145. Okuda M. The role of nucleophosmin in centrosome duplication. // Oncogene. 2002; 21(40): 6170-6174.

146. O'Rielly R., Crafford A., Miller L. Viral proliferating cell nuclear antigen. //Nature. 1989; 337: 606-611.

147. Ozdemir B.H., Ozdemir O.G., Sertcelik A. The prognostic importance of the nucleolar organizer region (AgNOR), Ki-67 and proliferating cell nuclearantigen (PCNA) in primary nonurachal bladder adenocarcinoma. // APMIS. 2001; 109(6): 428-434.

148. Papadhimitriou S., Daskalopoulou D., Tsaftaridis P. et al. Evaluation of argyrophylic nucleolar organizer regions (AgNORs) in multiple myeloma. // J. Clin Pathol. 2000; 53: 462-465.

149. Parkins C., Bush C., Price P., Steel G. Cell proliferation in human tumor xenografts: measurement using antibody labeling against bromodeoxyuridine and Ki-67. // Cell Prolif. 1991; 24(2): 171-179.

150. Parkins C., Darling J., Gill S. et al; cell proliferation in serial biopsies through human malignant brain tumors: measurement using Ki-67 antibody labeling. // Br. J. Neurosurg. 1991; 5(3): 289-298.

151. Paulin-Levasseur M., Julien M., Horner M., Chen G. Characterization of the 2H12 antigen as a nonshuttling human isoelectric variant of the nucleolar proteinB23. //Exp. Cell Res. 1995; 219: 514-526.

152. Pellicciari C., Filippini C., De-Grada L. et al. Cell cycle effects of hypertonic stress on various human cells in culture. // Cell Biochem Funct. 1995; 13(1): 1-8.

153. Pelusi G., Trere D., Formelli G. et al. AgNOR protein quantity of cervical smears correlates with that of histological sections in cervical intraepithelial neoplasia. // Eur. J. Histochem. 1997; 41(2): 105-110.

154. Pession A., Farabegoli F., Trere D. et al. The Ag-NOR proteins and transcription and duplication of ribosomal genes in mammalian cell nucleoli. // Chromosoma. 1991; 100: 242-250.

155. Petrzilka G., Schroeder H. Activation of human T-lymphocytes. // Cell Tissue Res. 1979; 201: 101 -127.

156. Philipova R., Vassilev A., Kaneva R. et al. Expression of the nuclear protein mitotin in differentiating in vitro HL-60 cells. // Biol. Cell. 1991; 72(1-2): 47-50.

157. Philipova R., Zhelev N., Todorov I. et al. Monoclonal antibodies against nuclear matrix antigen in proliferating human cells. // Biol. Cell. 1987; 60: 1-6.

158. Pich A., Chiusa L., Audisio E., Marmont F. Nucleolar organizer region counts predict complete remission, remission duration, and survival in adult acute myelogenous leukemia patients. // J. Clin. Oncol. 1998; 16(4): 1512-1518.

159. Pogorelov V., Kaplanskaya I., Baydurin S. et al. Computerized histopathologic estimation of malignant potential in non-Hodgkin's lymphomas. // In: Modeling and signal processing of cellular systems. Ulm University, 1991; 221-226.

160. Porschen R., Kriegel A., Langen C. et al. Assessment of proliferative activity in carcinomas of the human alimentary tract by ki-67 immunostaining. // Int. J. Cancer. 1991; 47(5): 686-691.

161. Prelich G., Tan C.K., Kostura M; et al. Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and DNA polymerase delta auxiliary protein. // Nature. 1987; 326: 517-521.

162. Prosperi E. Multiple roles of the proliferating cell nuclear antigen: DNA replication, repair and cell cycle control. // Prog. Cell Cycle Res. 1997; 3: 193210.

163. Prosperi E., Scovassi A., Stivala L., Bianchi L. Proliferating cell nuclear antigen bound to DNA synthesis sites: phosphorylation and association with cyclin D1 and cyclin A. // Exp. Cell Res. 1994; 215(2): 257-262.

164. Qiao L., Pizzolo G., Melamed M. Effects of selected chemotherapeutic agents on PCNA expression in prostate carcinoma cell lines. // Urol. Res. 1994; 22(3): 171-176.

165. Rao V.V., Dchnittger S., Hansmann I. Chromosomal localization of the human proliferating cell nuclear antigen (PCNA) gene to or close to 20pl2 by in situ hybridization. // Cytogenet. Cell Genet. 1991; 56(3-4): 169-170.

166. Raty R., Franssila K., Joensuu H. et al. Ki-67 expression level, histological subtype, and the International Prognostic Index as outcome predictors in mantle cell lymphoma. // Eur. J. Haematol. 2002; 69(1): 11-20.

167. Raza A., Imren S., Gezer S. et al. Expression of nucleolar antigen p 145 in bone marrow cells of patients with myeloid leukemias. // Cancer Res. 1989; 49(2): 482-487.

168. Rivas C., Echezarreta G., Garcia R. et al. A multiparametric study of malignant lymphoma of mucosa associated lymphoid tissue (MALT). // Leuk. Lymphoma. 1992; 8(1-2): 87-96.

169. Roussel P., Andre C., Comai L., Hernandez-Verdun D. The rDNA transcription machinery is assembled during mitosis in active NGRs and absent in inactive NORs. // J. Cell Biol. 1996; 133: 235-246.

170. Roussel P., Belenguer P., Amalric F., Hernandes-Verdun D. Nucleolin is an Ag-NOR protein this property is determined by its amino-terminal domain independently of its phosphorylation state// Exp. Cell Res. 1992; 203: 259-269.

171. Roussel P. and Hernandez-Verdun D. Identification of Ag-NOR proteins, markers of proliferation related to ribosomal gene activity. // Exp. Cell Res. 1994; 214: 465-472.

172. Sabattini E., Gerdes J., Gherlinzoni F. et al. Comparison between the monoclonal antibodies Ki-67 and PC10 in 125 malignant lymphomas. // J. Pathol. 1993; 169(4): 397-403.

173. Sarraf C., McCormick C., Brown G. et al. Proliferating cell nuclear antigen immunolocalization in gastro-intestinal epithelia. // Digestion. 1991; 50(2): 85-91.

174. Sasaki K., Matsumura K., Murakami T. et al. Intranuclear localization of the Ki-67 reactive nuclear antigen in HeLa cells. Flow cytometric analysis. // Biol. Cell. 1990; 68: 129-132.

175. Sasaki К., Murakami Т., Kawasaki M. et al. The cell cycle associated changes of the Ki-67 reactive nuclear antigen expression. // J. Cell Physiol. 1987; 133: 679-583.

176. Schmidt-Zachmann M.S., Hugle-Dorr В., Franke W.W. A constitutive nucleolar protein identified as a member of the nucleoplasmin family. // EMBO J. 1987; 6: 1881-1890.

177. Scholzen Т., Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. // J. Cell Physiol. 2000; 182(3): 311-322.

178. Schonk D., Kuijpers H., van Drumen E. Assignment of the gene(s) involved in the expression of the proliferation-related Ki-67 antigen to human chromosome 10. //Hum. Genet. 1989; 83: 297-302.

179. Seiter P., Zatsepina O.V., Hoffmann M., Grummt I. Constitutive and strong association of PAF 53 with RNA polymerase I. // Chromosoma. 1997; 106: 216-255.

180. Shaw P.J., Jordan E.G. The nucleolus. // Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 1995; 11:93-121.

181. Shibuya M., Ito S., Miwa Т., et al. Proliferative potential of brain tumors. Analyses with Ki-67 and anti-DNA polymerase alpha monoclonal antibodies, bromodeoxyuridine labeling, and nuclear organizer region counts. // Cancer. 1993; 71(1): 199-206.

182. Sirri V., Roussel P., Gendron M.C., Hernandez-Verdun D. Amount of the two major Ag-NOR proteins, nucleolin, and protein B23 is cell-cycle dependent. // Cytometry. 1997; 28 (2): 147-156.

183. Sirri V., Roussel P., Hernandez-Verdun D. The AgNOR proteins: qualitative and quantitative changes during the cell cycle. // Micron. 2000; 31(2): 121-126.

184. Sirri V., Roussel .P, Trere D. et al. Amount variability of total and individual Ag-NOR proteins in cells stimulated to proliferate. // J. Histochem. Cytochem. 1995; 43(9): 887-893.

185. Smetana K. and Busch H. The nucleolus and nucleolar DNA. The cell nucleus. // New York Academic Press. 1974; 75-148.

186. Smetana K., Ochs R., Lischwe M. et al. Immunofluorescence studies on protein B23 and C23 in nucleoli of human lymphocytes. // Exp. Cell Res. 1984; 152: 195-203.

187. Steck K., el Naggar A. Comparative flow cytometric analysis of Ki-67 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in solid neoplasms. // Cytometry. 1994; 17(3): 258-265.

188. Stein H., Foss H.-D., Durkop H. et al. CD30+ anaplastic large cell lymphoma: a review of its histopathologic, genetic and clinical features. // Blood. 2000: 96(12): 3681-3695.

189. Stephenson C., Desai Z., Bridges J. The proliferative activity of B-chronic lymphocytic leukemia lymphocytes prior to and after stimulation with TP A and PHA.//Leuk. Res. 1991; 15(11): 1005-1012.

190. Subong E.N., Shue M.J., Epstein J.I. et al. Monoclonal antibody to prostate cancer nuclear matrix protein (PRO:4-216) recognizes nucleophosmin/B23. // Prostate. 1999; 39(4): 298-304.

191. Takasaki Y., Deng J.S., Tan E.M. A nuclear antigen associated with cell proliferation and blast transformation. Its distribution in synchronized cells. // J. Exp. Med. 1981; 154: 1899-1903.

192. Tawfic SI, Olson M.O., Ahmed K. Role of protein phosphorylation in post-translational regulation of protein В23 during programmed cell death in the prostate gland. //J. Biol. Chem. 1995; 270(36): 21009-21015.

193. Todorov I. Philipova R., Zhelev N. Changes in a nuclear matrix antigen during the cell cycle: interphase and mitotic cells. // Biol. Cell: 1988; 62: 105111.

194. Trere D., Ceccarelli C., Danova; M., Derenzini M. In vivo bromodeoxyuridine labelling index, AgNOR protein expression and: DNA content in human tumours. // Eur. J. Histochem. .1996; 40(1): 17-26.

195. Trere D., Gramantieri L., Siringo S. et al. In hepatocellular carcinoma AgNOR protein expression correlates with tumour mass doubling time. // J; Hepatol. 1996; 24(1): 60-65.

196. Trere D., Melchiorri C., Chieco P. et al. Interphase AgNOR quantity and DNA content in endometrial adenocarcinoma. // Gynecol. Oncol. 1994; 53(2): 202-207.

197. Trere D., Migaldi M., Montanaro L. et al. p 120 expression provides a reliable indication of the rapidity of cell duplication in: cancer cells independently of tumor origin. // Ji Pathol; 2000; 192(2): 216-220;

198. Trere D., Pession A., Basso G. et al. Prognostic relevance of pretreatment proliferative rapidity of marrow blast cells in childhood acute lymphoblastic leukemia. //Br. J. Cancer. 1994; 70(6): 1198-1202.

199. Tsai S.T., Jin Y.T. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression in oral squamous cell carcinomas. // J. Oral Pathol. Med. 1995; 24(7): 313-315.

200. Tsurimoto T. PCNA binding proteins. // Front. Biosci: 1999; 4: 849-858.

201. Tungekar M., Gatter K., Dunnill M., Mason D. Ki-67 immunostaining and survival in operable lung cancer:// Histopathology. 1991; 19(6): 545-550.

202. Umekawa H., Chang J.-H., Correia J.J. et al. Nucleolar protein B23: bacterial expression, purification, oligomerization and secondary structures of two isoforms. // Cell. Mol. Biol; Res. 1993; 39: 635-645.

203. Verhuijen R., Kuijpers H., Schlingemann R. et al. I. Ki-67 detects a nuclear matrix-associated proliferation-related antigen. I. Intracellular localization during interphase. //J. Cell Sci: 1989; 92: 123-130.

204. Verhuijen R, Kuijpers H., Van Driel R. et al. I. Ki-67 detects a nuclear matrix-associated proliferation-related antigen. II. Localization in mitotic cells and association with chromosomes. //J. Cell Sci. 1989; 92: 131-138.

205. Veronese S., GambacortaM. Detection of Ki-67 proliferation rate in breast cancer. Correlation with clinical and pathologic features. // Am. J. Clin. Pathol. 1991; 95(1): 30-34.

206. Wachtler F., Ellinger A., Schwarzacher H.G. Nucleolar changes in human phytohaemagglutinin-stimulated lymphocytes. // Cell Tissue Res. 1980; 213(2): 351-360.

207. Wachtler F., Mosgoller W., Schwarzacher H.G. Electron microscopic in situ hybridization and autoradiography: localization and transcription of rDNA in human lymphocyte nucleoli. // Exp. Cell Res. 1990; 187(2): 346-348.

208. Wachtler F., Schwarzacher H.G., Ellinger A. The influence of the cell cycle on structure and number of nucleoli in cultured human lymphocytes. // Cell Tissue Res. 1982; 225(1): 155-163.

209. Wang D., Baumann A., Szebeni A., Olson M.O. The nucleic acid binding activity of nucleolar protein B23.1 resides in its carboxyl-terminal end. // J. Biol. Chem. 1994; 269(49): 30994-30998.

210. Wilson G., Saunders M., Dische S. et al. Direct comparison of bromodeoxyuridine and Ki-67 labeling indices in human tumors. // Cell Prolif. 1996; 29(3): 141-152.

211. Wu Y., Luo H., Kanaan N;, Wu J.J. The proteasome controls the expression of a proliferation-associated nuclear antigen Ki-67. // Cell Biochem. 2000; 76(4): 596-604.

212. Yamaguchi A., Takegawa S., Ishida T. et al. Detection of the growth fraction in colorectal tumours by a monoclonal antibody against DNA polymerase alpha. // Br. J. Cancer. 1990; 61: 390-397.

213. Yankulov K., Hadjilov K., Kounev K. The use of monoclonal antibody against a proliferating cell nuclear matrix antigen; in the study of solid human tumours. // Int. J. Cancer. 1989; 42: 800-807.

214. Yee H.T., Ponzoni M., Merson A. et al. Molecular characterization of the t(2;5) (p23; q35) translocation in anaplastic large cell lymphoma (Ki-1) and Hodgkin's disease. //Blood; 1996; 87(3): 1081-1088.

215. Yeo J.P., Toh B.H. Cell-cycle-associated autoantibodies: markers for autoimmunity and probes for molecular cell biology. // Autoimmunity. 1994; 18(4): 291-300.

216. You B.J., Huang I.J., Liu W.H. et al. Decrease in nucleophosmin/B23 mRNA and telomerase activity during indomethacin-induced apoptosis of gastric KATO-III cancer cells.//Arch. Pharmacol. 1999; 360(6): 683-690.

217. Yun J., Liew C.T., Chew E.Q., Chan J.Y. Expression and relocation of B23 in the process of rat liver cell hyperplasia and liver regeneration Article in Chinese. // Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2002; 82(14): 974-978.

218. Yung B.Y., Yang Y.H., Bor A.M. Nucleolar protein B23 translocation after deferoxamine treatment in a human leukemia cell line. // Int. J. Cancer. 1991; 48(5): 779-784.

219. Zatsepina O.V., Rousselet A., Chan P.K. et al. The nucleolar phosphoprotein B23 redistributes in part to the spindle poles during mitosis. // J. Cell Sci. 1999; 112 ( Pt 4): 455-466.

220. Zatsepina O.V., Todorov I.T., Philipova R.N. et al. Cell cycle-dependent translocations of a major nucleolar phosphoprotein, B23, and some characteristics of its variants. // Eur. J. Cell Biol. 1997; 73(1): 58-70.

221. Zatsepina O.V., Voit R., Grummt I. et al. The RNA-polymerase I-specific transcription initiation factor UBF is associated with transcriptionally active and inactive ribosomal genes. // Chromosoma. 1993; 102: 599-611.

222. Zehr R., Bauer Т., Marks K., Weltevreden A. Ki-67 and grading of malignant fibrous histiocytomas. // Cancer. 1990; 66(9): 1984-1990.

Автореферат диссертации по медицине на тему Иммуноцитохимический анализ ядерных антигенов лимфоцитов человека, выявляемых с помощью моноклональных антител

Оглавление диссертации Артеменко, Елизавета Георгиевна :: 2004 :: Москва

Введение диссертации по теме "Гематология и переливание крови", Артеменко, Елизавета Георгиевна, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2004 года, Артеменко, Елизавета Георгиевна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций