Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Характеристика нарушений клеточной биоэнергетики и возможности их коррекции янтавитом при поликистозной болезни почек и болезни де Тони-Дебре-Фанкони у детей

На правах рукописи

Кирилина Светлана Александровна

Характеристика нарушений клеточной

биоэнергетики и возможности их коррекции янтавитом

при поликистозной болезни почек и болезни де Тони-Дебре-Фанкони у детей

14.00.09 - педиатрия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва, 2005

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

профессор, доктор медицинских наук М.С. Игнатова профессор, доктор медицинских наук П. В. Новиков

Официальные оппоненты:

профессор, доктор медицинских наук H.H. Захарова профессор, доктор медицинских наук В .А. Кириллов

Ведущая организация: Российский Государственный Медицинский Университет (РГМУ)

Защита состоится «У/^У> 2005 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д-208.043.01 при Московском научно-исследовательском институте педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 125412, г. Москва, Талдомская ул., д.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИП и ДХ МЗ РФ.

Автореферат разослан «_»_2005 года.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат мед. наук

З.К. Землянская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Достижения медицинской науки в области биохимии, клинической морфологии и медицинской генетики последних десяти лет позволили выделить новый гетерогенный пласт наследственных болезней у детей, обусловленных энергетической недостаточностью клеток, вследствие нарушения структуры и функций митохондрий. Длительно такие нарушения клеточной биоэнергетики рассматривались только в связи с нервно-мышечными расстройствами (DiMauro S. et al, 1990). Однако, по мере накопления научных данных о состоянии митохондрий -ключевого звена энергообразования в организме, показано, что нарушение клеточной биоэнергетики может приводить к полисистемным заболеваниям, при этом страдают все энергозависимые органы и ткани: почки, сердце, печень (Bruce H, Choln M.D., 1997). Самые богатые митохондриями клетки находятся в проксимальных и дистальных извитых канальцах коркового слоя почки, а также восходящей части петли Генле. В связи с этим, диагностическим ориентиром почечной митохондриальной дисфункции, прежде всего, служит нарушение деятельности именно этих структур нефрона, что важно для ранней диагностики патологии.

Доказано наличие первичных митохондриальных нарушений при таких нефропатиях как: синдром де Тони-Дебре-Фанкони (Morris AM. et al, 1995), дистальный почечный канальцевый ацидоз (Matsutani H. et al, 1996), тубулопатия подобная синдрому Барттера (Goto Y. at all, 1992) и проксимальный почечный канальцевый ацидоз (Matsutani H. et al, 1992).

Патогенетическим фактором в данном случае могут быть дефекты пируватдегидрогеназного комплекса (Kitano А. et al, 1986) и нарушения в дыхательной цепи на уровне Ш комплекса (коэнзим Q-цитохром С редуктаза) и IV комплекса - ключевого элемента дыхательной цепи- цитохрома С оксидазы. (Seigle R. et al 1994; Sped B. et al, 1998).

В литературе имеются сведения о развитии кист при тубулопатиях, связанных с митохондриальной недостаточностью. Предполагается, что дисфункция митохондрий эпителия почечных канальцев, и связанная с ней слабость клеточной энергетики способствуют, вероятно, ухудшению белкового синтеза и ослаблению межклеточных контактов со склонностью к образованию кист в том органе, патология которого имеет яркие проявления, в частности, в почке. (Клембовский А.И., 2000). Описан поликистоз проксимальных извитых канальцев при врожденном нефротическом синдроме финского типа, при котором обнаружен высокий уровень процессов пероксидации в патологически измененных митохондриях нефрона. (HolthoferH.etal,1999).

Следует отметить, что на 16 хромосоме (16 р13) выявлена локализация генов АТФ-синтетазы и других митохондриальных белков (Materials of the Human Genome Meeting, 2000). Близость расположения мутаций может приводить к схожести симптоматики поликистозной болезни почек и первичных митохондриальных заболеваний.

В последние десятилетия отмечено нарастание частоты патологии органов мочевой системы у детей в России (Папаян A3. и соавт., 1997). В большей мере это касается наследственных и врожденных нефропатий, при которых уже в детском возрасте возможно развитие почечной недостаточности (Игнатова М.С., 2001). Одно из наиболее распространенных наследственных заболеваний почек - поликистозная болезнь почек является причиной 5-10 % всех случаев развития почечной недостаточности (Giaretto G. et al, 1990).

Для наследственных нефропатий характерно сочетание изменений почек с пороками развития других органов и систем ребенка (глухота, отставание в умственном развитии, изменения скелета и др.), вялость, слабость, непереносимость физических нагрузок, снижение мышечного тонуса.

Исследованиями последних лет отмечена тяжесть биохимических и морфофункциональных нарушений при идентифицированных митохондриальных болезнях, однако, в литературе практически отсутствуют данные о митохондриальной дисфункции и связанной с ней недостаточностью клеточной биоэнергетики при многих наследственных заболеваниях почек, в том числе поликистозной болезни почек и болезни де Тони-Дебре-Фанкони.

Разработана и с успехом применяется терапия детей, страдающих идентифицированными первичными митохондриальными заболеваниями (Казанцева Л.З., Николаева ЕА, 2001), однако лечение заболеваний, связанных с недостаточностью клеточной энергетики, представляет большие трудности.

Цель исследования: установить наличие и характер клеточного энергодефицита у детей с аутосомно-доминантным, аутосомно-рецессивным типом поликистозной болезни почек и с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони и оценить возможность их медикаментозной коррекции энерготропным препаратом янтавит.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

1.Установить характер и степень нарушений клеточного энергодефицита на основании определения уровня молочной и пировиноградной кислот крови, их соотношения у детей с поликистозной болезнью почек и с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони.

2.Определить признаки митохондриальной дисфункции с использованием цитохимического исследования активности ферментов биоэнергетического обмена в лимфоцитах периферической крови у больных с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони.

З.Оценить состояние перекисного окисления липидов у детей с поликистозной болезнью почек, болезнью де Тони-Дебре-Фанкони.

4.Обосновать назначение и определить эффективность лечения энерготропным препаратом янтавит при выявлении недостаточности клеточной биоэнергетики у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони.

Научная новизна работы.

Впервые выявлено нарушение клеточного энергообмена у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони на основании биохимических и цитохимических методов обследования.

Впервые при поликистозной болезни почек и болезни де Тони-Дебре-Фанкони определено нарушение процессов пероксидации, что может расцениваться как следствие клеточного энергодефицита

Выраженность цитохимических показателей митохондриальной недостаточности (снижение активности ферментов энергетического обмена: а-ГФДГ, ГДГ, СДГ) коррелирует с тяжестью течения и со степенью снижения почечных функций при поликистозной болезни почек.

Научно обоснованы необходимость и эффективность использования препарата янтавит для уменьшения степени клеточного энергодефицита и нормализации процессов пероксидациии, что сопровождается улучшением состояния больных.

Практическая значимость.

Обоснована практическая значимость исследования нарушений клеточной биоэнергетики у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони.

Установлена необходимость и доказана эффективность медикаментозной коррекции выявленных изменений клеточного энергетического обмена, что позволяют включить в существующие способы лечения этих заболеваний препарата янтавит, благоприятно влияющего на процессы биоэнергетического обмена.

Решение поставленных задач осуществлялось в отделах наследственных и приобретенных болезней почек (руководитель - профессор, доктор медицинских наук М.С. Игнатова) и наследственных и врожденных заболеваний с нарушением психики (руководитель - профессор, доктор медицинских наук П.В. Новиков) Московского НИИ педиатрии и детской хирургии (директор - профессор, доктор медицинских наук А.Д. Царегородцев) Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Апробация работы.

Материалы работы доложены и обсуждены на совместном методическом совещании отдела наследственных и приобретенных болезней почек и наследственных и врожденных заболеваний с нарушением психики МНИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ. Основные положения диссертации доложены на нефрологической секции Московского общества детских врачей 13 марта 2003 г., на

Международном Нефрологическом Конгрессе (8-12 июня 2003 г., Берлин, Германия), на Ш Российском конгрессе педиатров-нефрологов (2-4 декабря 2003 г., С-Петербург).

Внедрение в практику. Разработанные способы коррекции митохондриальной недостаточности у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони внедрены в клиническую практику отдела наследственных и приобретенных болезней почек и отдела наследственных и врожденных заболеваний с нарушением психики Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ в отечественной и зарубежной научной медицинской печати.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на т страницах машинописного текста, иллюстрирована 50 таблицами, рисунками, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя (цитировано работы, из них

на русском

языке).

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ, ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В исследование были включены 44 ребенка в возрасте 4 до 16 лет (23 мальчика и 21 девочка), из них 4 с аутосомно-рецессивным типом поликистозной болезни почек (АР ПКБ), 30 с аутосомно-доминантным типом поликистозной болезни почек (АД ПКБ) и 10 детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони

Группа контроля, использовавшаяся для оценки биохимических и цитохимических показателей, состояла из 45 практически здоровых детей в возрасте 4 -16 лет. (Тозлиян Е.В., 2003, Яблонская М.И., 2004).

Семейные случаи отмечены у 24 пациентов с АД ПКБ, у меньшей части детей заболевание было спорадическим (6 человек). Было проанализировано 10 родословных семей детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони, в одной из которых имел место кровно-родственный брак. Результаты проведенного анализа родословных показали, что к унаследованным формам болезни де Тони-Дебре-Фанкони можно было отнести 2 детей, у остальных 8 заболевание, вероятно, было обусловлено мутациями de novo.

Средняя длительность заболевания на момент обследования у детей с АД ПКБ при наличии в семье аналогичной патологии составила 3,6 лет, а у детей без наследственной предрасположенности 1,6 года. У детей с АР ПКБ первые проявления в основном развивались в раннем детском возрасте, в основном, на первом году жизни, и средняя длительность была равной 2,7 года.

При анализе клинической картины заболевания основными клиническими проявлениями поликистозной болезни почек были: жалобы на рецидивирующие боли в животе и пояснице, снижение толерантности к физической нагрузке, вялость, быстрая утомляемость, сниженный аппетит. Мочевой синдром не имел специфической выраженности. У детей с АД ПКБ микропротеинурия выявлялась у

33% детей, лейкоцитурия и гематурия у 11%, кристаллурия различного характера, у 26%, сочетание патологии мочевого осадка у 1/4 обследованных пациентов. Изменений в моче не выявлено у 19% больных с АД ПКБ. У детей с АР ПКБ в анализах мочи микропротеинурия была у 75% детей, кристаллурия в сочетании с микрогематурией у 50% больных и абактериальная лейкоцитурия у 25% пациентов. У детей с ПКБ были отмечены симптомы поражения проксимальных канальцев в виде микроальбуминурии, аминоацидурии, глюкозурии (чаще у детей с АР ПКБ). По данным УЗИ почек у детей с АД ПКБ превалировали больные с 5 и более кистами, размером 1-3 см, у большинства пациентов с АР ПКБ отмечалось до 5 кист, размером 1-1,5 см. Кисты в других паренхиматозных органах были выявлены: в печени у 3 детей с АД ПКБ и у 2 с АР ПКБ, в поджелудочной железе у 2 детей (соответственно, по 1 ребенку из каждой группы) и в селезенке у 1 больного с АР ПКБ.

У детей с АД ПКБ преобладали парциальные нарушения почечных функций I степени, в виде нарушения тубулярных функций: концентрационной - у 40%, никтурии - у 47%, снижения показателей ацидо- и аммониогенеза - более чем у половины детей. Реже наблюдались снижение или тенденция к снижению клубочковой фильтрации (30%). Таким образом, парциальные нарушения почечных функций определялось (Игнатова М.С., Гроссман П., 1986) у всех детей с поликистозной болезнью почек, а ранние признаки ХПН (ПН 26) отмечались у 1 ребенка с АД и у 3 детей с АР ПКБ.

Приведенные выше данные о клинических проявлениях поликистозной болезни (клинические данные, изменения со стороны внутренних органов и т.д) совпадают с данными, полученными ранее другими исследователями Guay-Woodfoгd et э1, 1999; Gagnadoux М., Ы а1 2002; Рапегук-ТошаБгеитска М. й а1, 2002).

Среди детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони преобладали больные в возрасте от 7 до 11 лет, со сроком манифестации болезни в среднем в 1,9 года, с поздним сроком диагностирования заболевания (в среднем 3,4 года). У 4 больных выявлена задержка психического и речевого развития разной степени выраженности. У 1 ребенка в анамнезе отмечались судороги. У всех больных отмечалось снижение мышечного тонуса, диффузная гипотония мышц, снижение толерантности к физическим нагрузкам.

У обследованных пациентов обращали на себя внимание множественные рахитические деформации, укорочение конечностей, ограничения подвижности в суставах. Вальгусные деформации нижних конечностей отмечены у 5 детей, варусные - у 2 детей, дискордантные деформации голеней у 3 пациентов. Не ходили 2 из 10 детей. В анамнезе патологические переломы имели 4 ребенка. Показатели физического развития у обследованных детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони были менее 5 центиля. Дисгармоничное физическое развитие за счет дефицита массы тела наблюдалось у 20% больных детей.

У всех детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони имелись: неправильный рост зубов, множественный кариес и дистрофия зубной эмали. Рентгенологически при этой клинической картине у всех пациентов определялись типичные признаки рахитоподобного заболевания: системный остеопороз, остеопения, истончение коркового слоя кости, полосы склероза, поднадкостничные переломы.

У половины пациентов был выявлен неполная триада Фанкони, как правило, преобладали: аминоацидурия, фосфатурия, кристаллурия различного характера. Отмечалась выраженная микроальбуминурия, которая сочеталась с протеинурией.

При анализе структуры сопутствующей патологии у детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони было выявлено наличие сочетанной патологии нескольких органов и систем у 60% детей, наиболее часто было сочетание патологии сердечно-сосудистой системы и нервной системы или поражения желудочно-кишечного тракта совместно с нервной системой и заболеваниями глаз.

Изменения со стороны мочевой системы были представлены такими аномалиями как нефроптоз, повышение подвижности почек. Нефрокальциноз выявлен у 3 больных. Увеличение размера почек, диффузное изменение и утолщение почечной паренхимы по данным УЗИ обнаружено у 6 детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони.

В соответствии с поставленными задачами в работе был использован комплекс клинико-генетических, функциональных, биохимических методов исследования.

Клиническое обследование включало:

1. Клинико-генеалогический анализ - сбор и последующий анализ родословных семей на основе опроса родителей пробандов и изучения данных медицинской документации.

2. Клинический осмотр с оценкой наличия и степени выраженности симптомов интоксикации, величены артериального давления с использованием метода суточного мониторирования, оценивалось состояние мышечного тонуса.

3. Лабораторные методы исследования.

В комплекс обязательных лабораторных исследований входили повторные клинические анализы крови, общие анализы мочи. Осуществлялось исследование экскреции бежа в суточном анализе мочи (норма до 50 мг/24 ч), определение количества эритроцитов (норма до 1000/мл) и лейкоцитов (норма до 2000/мл) в анализе мочи по Нечипоренко. Исследовались анализы мочи на степень бактериурии (норма до 105 микробных тел/мл мочи) с определением чувствительности микробной флоры к антибактериальным препаратам. - Биохимические методы исследования

Биохимический анализ крови проводился на автоматическом анализаторе «Фишгапет» (Финляндия) и включал определение общего белка, белковых фракций, мочевины, креатинина, мочевой кислоты, электролитов (калия, натрия,

ионизированного кальция). Равновесие кислот и оснований крови определялось по методу Андерсена на аппарате «Микро-Аструп».

Функциональное состояние проксимального отдела канальцев определялось по экскреции с мочой кальция, фосфора, глюкозы и аминокислот. Функциональное состояние дистального канальца изучалось на основании концентрационной способности (по пробе Зимницкого, пробе на разведение и концентрацию), а также показателей ацидо- и аммониогенеза: экскреции титруемых кислот и аммиака, pH мочи по методу ацидометрического титрования. Гломерулярная фильтрация оценивалась по клиренсу эндогенного креатинина с пересчетом на стандартную величину поверхности тела ребенка. У всех детей определялась суточная экскреция с мочой оксалатов (метод Сивориновского Г.С.) и уратов (метод Эйхгорна).

В качестве нормативов использовались нормы биохимических показателей, представленные в руководстве для врачей (Игнатова М.С., Вельтищев КЖ, 1989).

Определение спектра органических кислот и их метаболитов в моче методом газожидкостной хроматографии проводилось детям с болезнью де Тони-Дёбре-Фанкони на аппарате хромато-массспектометре НР-5995 фирмы «Hewlett Packard». - Ультразвуковое исследование.

Обязательным методом исследования у всех детей являлся метод УЗИ почек и органов брюшной полости на аппарате «ALOG-630». Для выявления унаследованных форм заболевания, по показаниям, данное исследование проводилось также родителям и сибсам пробандов.

Для диагностики клеточной энергодефицита при поликистозной болезни почек и болезни де Тони-Дебре-Фанкони применялись следующие специальные методы исследования:

• Определение уровней молочной и пировиноградной кислот с помощью энзиматического метода RoLlinghoff(1967г.) натощак.

Характеристика анаэробных окислительно-восстановительных процессов определялась по содержанию лактата и пирувата в крови. Исследование проводилось натощак и на фоне стандартного глюкозо-толерантного теста (нагрузка глюкозой из расчета 1,75 г/кг массы тела, но не более 50 г) на 60 и 180 минутах. Уровень молочной кислоты в норме составляет от года до 14 лет 1,0-1,7 ммоль/л.

Принцип определения пировиноградной кислоты основан на ее восстановлении под влиянием лактатдегидрогеназы до молочной кислоты. Уровень пировиноградной кислоты в норме составляет от года до 14 лет 0,05-0,09 ммоль/л.

Соотношение показателей лактат/пируват в норме 8-10.

• Оценка состояния процессов перекисного окисления липидов

Оценка окислительного стресса и состояния процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в крови осуществлялась на основе методов определения активности ксантиноксидазы (КО), содержания гидроперекисей (ГП), малонового диальдегида (МДА) и уровня антиокислительной активности плазмы крови (АОА).

Содержание ГП в плазме крови определяли по методу Гаврилова В.Б. и соавт. (1983г.)- Для определения концентрации Ш липидов измеряли ультрафиолетовое поглощение липидных экстрактов крови на спектрофотометре СФ-26. Нормативы ГП: 1,7-2,0отн.Ед/мл.

Содержание малонового диальдегида исследовали в осадке -липопротеидов плазмы по Мтоги I. (1978г.) В основе метода - реакция между МДА и 2-тиобарбитуровой кислотой. Уровень МДА в норме составляет 2-4 нмоль/мл.

АОА плазмы крови, выраженную в %, определяли по методу Клебанова Г.И. и соавт. (1985г.). Уровень АОА плазмы крови в норме составляет 35-52 %.

Определение активности прооксидантного фермента ксантиноксидазы определяли по количеству отщепленного КО от субстрата (ксантин) водорода по цветной реакции с нитротетразолевым синим. Нормальное значение КО - 80-150 мкмоль/л/сек.

• Определение экскреции микроальбумина с мочой иммуноферментным методом. Для определения экскреции микроальбумина (мА) с мочой использовался биохимический анализатор «Униплан» (США) с наборами фирмы «ИаМох» (Великобритания). Метод основан на конкурентном связывании мА мочи и человеческого сывороточного альбумина с антителами коныогата.

Цитохимические методы исследования:

Цитохимическое выявление активности ферментов энергообмена наборами реактивов фирмы ООО МНПК "Химтехмаш", ГосНИИ "ИРЕА": сукцинатдегидрогеназы (СДГ), -глицерофосфатдегидрогеназы ( -ГФДГ), глутаматдегидрогеназы (ГДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в лимфоцитах периферической крови (метод Пирса (1957г.) в модификации Нарцисова Р.П. (1987г.). Метод основан на способности п-нитротетразолия фиолетового в процессе ферментативной реакции образовывать нерастворимые в воде гранулы формазана, число которых можно оценить в каждой клетке. Исследование включало определение активности СДГ, митохондриальных фракций -ГФДГ, ГДГ, а также ЛДГ (число гранул формазана) в лимфоцитах периферической крови в исходном состоянии, через 1 и 3 месяца после лечения. Реакции проводились на мазках крови, приготовленных на обезжиренных предметных стеклах. Среда для выявления активности фермента состояла из инкубационной среды и субстрата, специфичного для выявляемого фермента. Реакция проводилась при рН +7,3 и температуре 37°С в течение 60 минут в водном термостате. Готовые мазки микроскопировались при водной иммерсии на микроскопе Биолам Р-16 (увеличение в 400 раз). Оценка результатов проводилась количественным методом. Для количественного выражения результатов подсчитывалось 30 клеток лимфоцитов периферической крови в каждом мазке крови, дифференцируя их в зависимости количества гранул. Сумма количества гранул во всех 30 клетках делилась на количество клеток, и результат выражался в виде среднего цитохимического показателя (в абсолютных величинах).

Общий объем исследований, проведенных в ходе работы, приведен в таблице 1.

Таблица 1.

Объем проведенных исследований_

№ в/п Название исследования Кол-во обследованных детей Кол-во исследований

1 Цитохимическое исследование активности ферментов клеточного энергообмена в лимфоцитах периферической крови 44 104

2 Определение уровней молочной и пировиноградной кислот в сыворотке крови 40 96

3 Исследование перекисного окисления липидоввкрови 42 100

4 Определение экскреции микроальбумина с мочой иммуноферменгным методом 44 60

5 Определение показателей равновесия кислот и оснований в крови 30 46

Статистическая обработка результатов исследований проводилась с применением методов вариационной статистики, корреляционного анализа. Доверительный интервал для средних величин вычислялся с заданным уровнем достоверности 0,95. Для анализа полученных результатов и определения достоверных отличий между показателями использовался метод математической статистики -критерий Стьюдента (ГланцС, 1999).

Результаты исследования и их обсуждение.

У значительного числа пациентов с ПКБ были изменены показатели молочной и пировиноградной кислот и их соотношения в сыворотке крови: натощак были выявлены лактат- и пируватацидоз. У 73% детей с поликистозной болезнью почек выявлено увеличение уровня лактата в крови, а пирувата у 80% больных. Более чем у 1/3 детей (37%) отмечалось повышение соотношения лактат/пируват натощак. Сдвиг соотношения в сторону молочной кислоты указывает на нарушение окислительно-восстановительного состояния клеток с накоплением редуцирующих эквивалентов в митохондриях и цитоплазме (Chan A., et al, 1998). При проведении нагрузочной пробы (рис.1, 2, 3) глюкозой через 1 час уровни лактата и пирувата в крови достоверно возросли, увеличившись в среднем на 0,31±0,08 ммоль/л и на 0,02±0,01 ммоль/л. Через 3 часа уровень лактата был близок к исходному тощаковому 1,76±0,07 ммоль/л. Через 3 часа после пероральной пробы значение лактата было ниже сходного тощакового уровня. У больных с ПКБ отмечалась тенденция к росту соотношения лактат/пируват в крови, которая была прямо пропорциональна времени от начала нагрузочной пробы глюкозой.

Рис 3 Исходные средние показатети соотношения лактат/пируват в крови у детей с ПКБ (п=30) У детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони проведенное исследование показало, что у 70% и 100% пациентов при первичном обследовании натощак выявилась гиперлактат- и гиперпируватацидемия соответственно Соотношение лактат/пируват повышено не было, что обусловлено высоким уровнем конечного продукта гликолиза - пировиноградной кислоты у данной группы больных Тощаковый и нагрузочный уровни (на фоне стандартного глюкозотолерантного теста) молочной и пировиноградной кислот в крови у детей с болезнью дс Тони-Дебре-

Фанкони был также достоверно выше средних значений в группе контроля (р<0,05) (рис 4,5)

Полученные данные отражают информативность исследования молочной и пировиноградной кислот на фоне стандартного глюкозотолерантного теста в качестве скринирующего биохимического теста для выявления нарушения клеточной энергетики у обследованных больных.

Ядети с болезная де Тони-Да6р8-»ан»оня ■ здоровые дети В дети с болезнью де Тони-Дебре-Фзнкони ■ здоровые дети |

Рис. 4. Исходные средние показатели Рис. 5. Исходные средние показатели уровня лактата в крови у детей с уровня пирувата в крови у детей с

болезнью де Тони- Дебре-Фанкони (п= 10) болезнью де Тони-Дебре-Фанкони (п= 10) В результате проведенного исследования процессов ПОЛ оказалось, что у части наблюдавшихся нами пациентов (10 детей) с поликистозной болезнью почек отмечалось повышение активности КО - фермента метаболизма пуриновых соединений и одного из мощных факторов, индуцирующих процессы перекисного окисления липидов. Повышение общей антиокислительной активности плазмы крови было выявлено у 14 пациентов, а снижение АОА, что является прогностически более неблагоприятным признаком, у 9 больных.

В большинстве случаев содержание малонового диальдегида - вторичного продукта процессов пероксидации у детей с ПКБ крови было в пределах нормы. У 10 пациентов отмечено повышение (в 2-4 раза по сравнению с нормой), а у 2 - снижение значений МДА в плазме крови. Средний уровень значения МДА достоверно (р<0,05) превышал аналогичные показатели здоровых детей (рис.9) Повышение первичного продукта ПОЛ -гидроперекисей липидов в плазме крови было повышенным у 4 больных, однако чаще выявлялось нормальное значение ГП

Исследование показателей мембранопатологического процесса выявило высокую частоту встречаемости у больных с поликистозной болезнью почек признаков нестабильности цитомембран и усилении процессов ПОЛ, о чем свидетельствует выраженная липидурия у 67% обследованных пациентов (497 усл

ЕД при N=0), этаноламинурия у 82% больных (553 мг/сут. при N до 100 мг/сут.), наличие перекисей в моче у 52% детей. Аминоацидурия была обнаружена у 20 детей, что составило 74% от общего числа обследованных пациентов. Обращала на себя внимание повышение экскреции с мочой кальция (у 89%), хлора (67%), фосфатов (52%) и метаболитов коллагена (44%). Более чем у 1/3 больных с поликистозной болезнью почек выявлено повышение активности фосфолипаз А до 20,6 Ед/л и С до 7,46 Ед/л (при N=0) в моче. Гидролиз фосфолипазами фосфоинозитидов мембран сопровождается накоплением свободных радикалов жирных кислот (диацилглицеридов), что запускает в свою очередь каскад реакций перекисного окисления липидов. В результате гидролиза также образуется инозитол-3-фосфат, который индуцирует высвобождение ионов кальция из эндоплазматического ретикулума в цитоплазму - порочный круг повреждения митохондрии и клетки в целом замыкается.

У группы детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони показатели уровня малонового диальдегида и гидроперекисей были несколько выше, чем в группе детей с ПКБ и статистически достоверно отличались от контрольных значений (р<0,05) (рис.8, 9). Общая антиокислительная активность, а значит и система защиты, у большинства (70%) детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони была снижена (рис.10).

Известно, что нарушение перекисного окисления липидов имеет важное значение в патогенезе митохондриальной патологии (Chan A. et al, 1998). Вторичное поражение митохондрий может быть обусловлено выраженностью нарушения процессов перекисного окисления у наших пациентов в виде повышения активности трштерного фермента ПОЛ - ксантиноксидазы и увеличения уровня гидроперекисей липидов и малонового диальдегида в плазме крови. Продукты ПОЛ нарушают липидный слой мембран митохондрий, что нарушает функционирование процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях, и как следствие усиливается энергодефицит клетки. Снижение показателей ОАО плазмы свидетельствует об угнетении механизмов для поддержания антиокидантной защиты. Таким образом, выявленные дефекты перекисного окисления липидов у детей с ПКБ и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони свидетельствуют об участии продуктов перекисного окисления липидов в патогенезе данных заболеваний и подтверждают наличие недостаточности клеточного энергообмена.

При проведении цитохимического анализа показателей активности ферментов энергообмена в лимфоцитах периферической крови, участвующих в цикле Кребса и дыхательной цепи, у 97% больных с поликистозной болезнью почек были выявлены различные изменения активности всех исследуемых энзимов. Так, снижение активности а-ГФДГ отмечено у 94%, а ГДГ - у 62% больных. Вместе с тем, повышения уровня активности -ГФДГ и ГДГ не было зарегистрировано ни у одного

из пациентов. Снижение ключевого фермента клеточной биоэнергетики - СДГ наблюдалось у 59% детей.

У 15% детей с поликистозной болезнью почек выявлено повышение активности СДГ по сравнению с нормальными значениями. Следует отметить, что у этих больных параллельно отмечалось повышение активности ЛДГ, что можно рассматривать как компенсаторную реакцию при снижении активности других ферментов энергообмена. В группе же больных со снижением активности ЛДГ характерным было снижение активности всех исследуемых ферментов, что свидетельствует о более тяжелой степени энергодефицита. Более чем у половины детей имела место следующая комбинация показателей активности ферментов биоэнергетического обмена: снижение активности а-ГФДГ+ снижение активности СДГ+ снижение активности ГДГ.

Выявлены различия в степени снижения активности ферментов энергообмена при аутосомно-доминантном и аутосомно-рецессивном вариантах поликистозной болезни почек, так у детей с АР ПКБ степень снижения активности ферментов (СДГ, а-ГФДГ, ГДГ) была более выражена по сравнению с детьми с АД ПКБ. Наиболее выраженным было снижение активности ферментов а-ГФДГ и ГДГ (р<0,05) (рис.6).

Проанализирована зависимость снижения активности митохондриальных ферментов в лимфоцитах периферической крови от количества и размера почечных кист. Результаты исследования показали, что по мере увеличения размеров и количества кист, и как следствие, уменьшения объема функционирующей почечной паренхимы, у детей с поликистозной болезнью почек наблюдается более выраженная тенденция к нарушению биоэнергетического обмена, что проявляется в виде снижения активности СДГ, -ГФДГ и ГДГ у большинства детей с данной патологией. То есть, уменьшение объема нормально функционирующих почечных канальцев, в которых происходят процессы активного транспорта, приводит к усилению митохондриальной дисфункции. Указанные изменения, отражающие структурно-функциональную дезорганизацию митохондрий и, по всей вероятности носят вторичный характер, сопровождая основной патологический процесс.

Нами выявлена зависимость снижения активности митохондриальных ферментов от тяжести заболевания, так, у детей с более выраженной степенью нарушения почечных функций (ХПН), снижение уровня активности ферментов более выражено, чем у детей с минимальным снижением почечных функций (таблица 2).

Таблица 2.

Зависимость активности ферментов биоэнергетического обмена в лимфоцитах периферической крови у больных с поликистозной болезнью почек от степени снижения почечных функций.

Показатели ПН 1 ПН Па хпн контроль

(11=23) (п=6) (п=5) (п-45)

СДГ 19,4±0,3 17,02±0,54 13,89±0,86* 20,1±0,4

а-ГФДГ 8,8±0,15* б,3±0,22* 5,4±0Д8* 12,4±0,2

ГДГ 10Д±0,55* 9,5±0,29* 7,95±0,04* 12,6±0,2

ЛДГ 16,13±0,3 16,8±0,31 18,5±0,78 14,2±0,6

• достоверные различия по сравнению с контрольными значениями (р<0,05)

При анализе состояния активности ферментов клеточного энергообмена в лимфоцитах периферической крови у детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони выявлено снижение активности таких дегидрогеназ как ГФДГ у подавляющего количества больных (90%) и ГДГ (60%). Аналогичные показатели активности данных ферментов у группы контроля достоверно (р<0,05) превышали значение показателей у обследованной группы больных детей. Активность фермента СДГ у обследованных больных была, как снижена (у 50%), так и повышена (30%), однако среднее значение было заметно ниже контрольных значений (р<0,05) (рис.6). Активность ЛДГ была снижена у 50%, что отражает глубокое нарушение процессов энергообеспечения у детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони. Среднее значение активности ЛДГ (13,85±1,2 усл.ед.) имело тенденцию к снижению, но статистически достоверно не отличалось по сравнению с группой контроля.

При сравнительной оценке состояния биоэнергообмена у детей с ПКБ и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони было выявлено, что наиболее выраженные изменения активности ферментов клеточного энергообмена -ГФДГ, ГДГ) выявлены у детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони (рис. 6), что сочетается с выраженным пируватацидозом, как натощак, так и на фоне проведения стандартного глюкозотолерантного теста (рис.7) и усилением процессов пероксидации в виде накопления гидроперекисей (рис.8) и малонового диальдегида в крови (рис.9), а также тенденции к снижению уровня антиокислительной активности плазмы крови (рис. 10). При ПКБ данные менее выражены (рис.8, 9, 10), что свидетельствует о большей сохранности резервных возможностей биоэнергообмена у данной группы больных.

'■АД ПКБ в АР ПКБ аболезнь де Тони-Дебре-Фанкони ^контроль

Рис 6 Средние показатели активности ферментов биоэнергетического обмена при АД ПКБ (п=30), АР ПКБ (п=4) и болезни де Тони-Дебре-Фанкони (п=10) при первичном обследовании

натощак через 1 ч через 3 ч

Вдето с ПКБ вдели с болезнью де Тони Дебре Фанкони □здоровые дети

Рис 7 Средний уровень пирувата в крови натощак и при нагрузке глюкозой при ПКБ (п=30) и болезни де Тони-Дебре-Фанкони (п=10) при первичном обследовании

Рис 8 Среднее содержание гидроперекисей в крови у детей с ПКБ (п=32) и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони (п= 10) при первичном обследовании

Рис 9 Среднее содержание малонового диальдегида в крови у детей с ПКБ (п=32) и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони (п= 10) при первичном обследовании

Рис 10 Средний уровень антиокислительной активности плазмы крови у детей с ПКБ (п=32) и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони (п=10) при первичном обследовании Таким образом, выявленные нами цитохимические и биохимические, а также клинические снижение мышечного тонуса и толерантности к физической нагрузке и другие нарушения свидетельствовали о наличие у детей с ПКБ и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони признаков клеточного энергодефицита, что продиктовало необходимость разработки подходов для коррекции выявленных нарушений Для коррекции обнаруженной недостаточности энергообмена у обеих групп пациентов был применен препарат янтарной кислоты - янтавит (регистрационное удостоверение Минздрава РФ N000999 Р 643 07 99 от 15 июня 1999 года, патент РФ N2113805)

Сукцинат является промежуточным метаболитом 5 и 6 реакций цикла Кребса и входит в состав П комплекса дыхательной цепи, а также влиянием янтарной кислоты на транспорт свободного кислорода в ткани, так как он обеспечивает бесперебойную передачу электронов на Ш и IV комплексы. Янтарная кислота также обладает мощным антиоксидантным действием, которое проявляется в уменьшении продуктов перекисного окисления и активации ферментов антиоксидантной защиты (Кондрашова М.Н., 1999). Препарат эффективно снижает тканевой метаболический ацидоз, что позволяет рекомендовать его как средство, предотвращающее развитие лактатацидоза (Маевский Е.И. и соавт., 1989).

Была разработана схема лечения, направленная на повышение эффективности биологических процессов тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования по высвобождению энергии органических соединений и продукции АТФ в организме.

Было выделено 2 группы детей:

1 группа -10 детей с АД ПКБ почек, которые получали препарат янтавит в дозе 10 мг/кг (но не более 50 мг/сут.) в 2 приема (утро, обед во время еды). Препарат принимался по следующей схеме: 3 дня приема, 4 дня перерыв в приеме, длительность приема составила 1 месяц.

2 группа - 6 детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони, которые принимали препарат янтавит в аналогичной дозе и аналогичным курсом на фоне традиционного комплекса терапевтических средств, направленных на коррекцию фосфорно-кальциевого обмена в обычно используемых дозах: спиртовой раствор витамина Б, оксидевит, глицерофосфат кальция, витамины А и Е.

Оценивалась ближайшая эффективность препарата через 1 месяц, а также отдаленная - через 3 месяца после окончания приема препарата.

В качестве группы контроля была выделена группа 13 детей с АД ПКБ, которые получали комплексное лечение, не включавшее препарат янтавит (витаминотерапию В6, А, Е в возрастных дозировках), и 4 ребенка с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони, получавшие только базисную терапию.

Критериями эффективности лечения служили: клинические симптомы, биохимические и цитохимические параметры. Среди клинических критериев эффективности лечения учитывались следующие: улучшение общего состояния ребенка, снижение слабости, утомляемости, улучшение переносимости физической нагрузки, повышение аппетита.

Основными биохимическими критериями эффективности лечения были: повышение активности ферментов клеточного энергообмена в лимфоцитах периферической крови, а также снижение уровня молочной и пировиноградной кислот в крови натощак, а также уменьшение степени активности процессов перекисного окисления липидов.

В наших исследованиях получен положительный опыт применения янтарной кислоты при нарушениях энергообеспечения у детей с ПКБ и с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони.

Для оценки клинической эффективности энерготропной терапии мы сравнивали жалобы у детей с ПКБ и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони до начала терапии, и после ее проведения. Наши исследования показали улучшение общего самочувствия (90% пациентов), уменьшение вялости, утомляемости у большинства детей, получавших лечение препаратом янтавит. Непереносимость физической нагрузки уменьшилась у половины обследуемых детей. Родители пациентов обратили внимание на улучшение аппетита у 70% детей, улучшение успеваемости в школе, в связи с улучшением процессов запоминания (таблица 3).

Таблица 3.

Частота возникновения и характер жалоб у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони до приема препарата янтавит и через 1 месяц после

проведения курса энерготропной терапии.

Жалобы %' детей с %' детей с %' детей с %1 детей с

ПКБс ПКБс болезнью де болезнью де

наличием наличием Тонн-Дебре- Тони-Дебре-

жалоб до жалоб через 1 Фанконис Фанконнс

лечения месяц после наличием наличием

(п=10) лечения жалоб до жалоб через 1

(п=10) лечения (п=6) месяц после

лечения (п=б)

Вялость 100% 30% 100% 34%

Быстрая 60% 10% 100% 50%

утомляемость,

толерантности к

нагрузке

Снижение 80% 10% 67% 17%

аппетита

Снижение 30% 10% 100% 50%

мышечного

тонуса

Общее Неудовл. 10% Неудовл. 34%

самочувствие самочувствие - самочувствие -

100% 100%

процент детей, имевших указанные параметры, вычислен условно

В процессе динамического наблюдения за детьми использовались биохимические и цитохимические критерии оценки эффективности лечения.

Биохимическими и цитохимическими критериями эффективности терапии служили:

- нормализация показателей уровня молочной и пировиноградной кислот и соотношения лактат/пируват в крови;

- повышение антиокислительной активности плазмы крови и снижение показателей пероксидации в крови (уровня ГП и МДА);

- нормализация активности ферментов клеточного энергообмена в лимфоцитах периферической крови (СДГ, а-ГФДГ, ГДГ, ЛДГ)-

Были выявлены следующие позитивные биохимические и цитохимические сдвиги у детей с поликистозной болезнью почек после проведенного курса энерготропной терапии:

а) Среднее содержание молочной кислоты в крови достоверно (р<0,05) снизилось с 1,53±О,О9 моль/л до 1,47±0,89 моль/л однако данный показатель достоверно превышал контрольные значения (р<0,05) (рис.11). Такая же тенденция отмечалась и в отношении пирувата: среднее содержание пировиноградной кислоты в крови у детей с ПКБ после курса терапии энерготропными препаратами снизилось с 0,15±0,02 ммоль/л до 0,13±0,03 ммоль/л (р<0,05) (рис.12).

На фоне энерготропной терапии у всех 10 детей с ПКБ нормализовался показатель соотношения лактат/пируват.

У детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони наблюдение в динамике показало, что у большинства пациентов содержание молочной и пировиноградной кислот натощак снизилось через 1 месяц после проведения лечения препаратом янтавит, а именно: средний уровень содержания молочной кислоты в крови нормализовался у 4 детей, а пировиноградной у 5 обследованных больных. Средние показатели лактатацидемии на фоне лечения уменьшились на 0,1±0,04 ммоль/л и составили 1,32±0,03 ммоль/л, что было достоверно ниже (р<0,05) контрольных и исходных значений (рис. 11). Отличие показателей пируватацидеми натощак до и после лечения препаратом янтавит носило статистически достоверный характер по сравнению с контрольными значениями (р<0,05) (рис.11). Следует отметить, что исходное содержание пировиноградной кислоты в крови оказалось примерно равным содержанию пирувата после проведенной энерготропной терапии (рис.12).

ПКБ болезнь де Тони-Дебре-

Фанкони

| Н До лечения ■ После лечения □ Контроль I

Рис.11. Динамика средних показателей содержания лактата в крови у детей с ПКБ (п=10) и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони (п=6) на фоне терапии янтавитом

Я До лечения и После лечения о Контроль

Рис.12. Динамика средних показателей содержания пирувата в крови у детей с ПКБ (п= 10) и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони (п=6) на фоне терапии янтавитом

б) У группы детей с поликистозной болезнью почек, которые получали лечение препаратом янтавит, через месяц было исследовано содержание малонового диальдегида. как показателя процессов пероксидации, и уровень антиокислительной активности плазмы крови, характеризующий антиокидантную защиту Проведение курса метаболической терапии вызвало достоверное снижение уровня МДА у детей с ПКБ - 3,97±0,8 нмоль/мт и 2,94±0,2 нмоль/мл соответственно до и после комплексного лечения (р<0,05) (рис 13) Бьпа выявлена тенденция к повышению уровня общей антокислительной активности плазмы крови, что характерно для

компенсации процессов пероксидации Через 1 месяц после лечения средний уровень АОА был равен 44,9±3,7%

У детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони содержание МДА в крови было повышенным до лечения (2,77±0,15 нмоль/л) и после приема препарата янтарной кислоты (2,7±0,3 нмоль/л) (р<0,05) Однако, у детей, получивших энерготропное лечение, имелась тенденция к снижению уровня МДА в крови (рис 16) У данной группы обследованных больных на фоне терапии янтавитом отмечена положительная динамика в виде повышения показателей общей антиокислительной активности плазмы до 54±1,94%, что является компенсаторным механизмом активации антиокидантной защиты

[ВДо лечения В После лечения О Контроль >

Рис.13. Динамика средних показателей содержания МДА в крови у детей с ПКБ (п=10) и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони (п=6) на фоне терапии янтавитом

в) После проведения метаболической терапии препаратом янтавит у детей с поликистозной болезнью почек улучшились количественные показатели активности митохондриального фермента СДГ и стали практически соответствовать нормальным значениям Анализ представленных данных выявил статистически достоверное повышение активности ГДГ при приеме янтавита с 7,47±0,86 усл ед до 10,72±0,9 усл ед, однако данный параметр был ниже контрольных значений (р<0,05) Отмечена тенденция к повышению активности -ГФДГ, однако активность данного фермента оставалась достоверно ниже нормы (р<0,05) Средние показатели активности ЛДГ после проведенного лечения соответствовали нормальным значениям (рис 14)

У группы детей, не получавших энерготропное лечение, имела место отрицательная динамика в виде ухудшения показателей активности митохондриальных ферменгов в лимфоцитах периферической крови Уровень таких ферментов, как СДГ, а-ГФДГ, ГДГ продолжал снижагься, причем, у детей, не получавших энерготропного лечения наблодалось достоверное (р<0,05) снижение средних показателей активноети таких ферментов, как а-ГФДГ(с 8,2±0,99 до

7,48±0,74 усл.ед.) и ГДГ (с 10,37±1,73 до 8,4±0,71 усл.ед.) не только по сравнению с нормальными значениями, но и с активностью данных ферментов у детей, получавших лечение препаратом янтавит (рис.14). Активность ЛДГ у пациентов без лечения препаратом янтавит оставалась повышенной (15,56±0,78 усл.ед.), что может свидетельствовать о дальнейшем усугублении дисбаланса между аэробными и анаэробными процессами энергообмена и сдвига процессов получения АТФ в клетках в сторону гликолиза.

Исследование отдаленной эффективности лечения через 3 месяца показало, что эффект действия препарата янтавит у детей с поликистозной болезнью почек как энерготропного средства сохранялся в течение 1 месяца (рис.14).

До лечения Через 1 месяц Через 3 месяца после лечения после лечения

Рис. 14. Динамика изменения активности ферментов клеточного энергообмена у детей сПКБ(п=10) при приеме препарата янтавит (усл.ед.).

Анализ показателей активности ферментов биоэнергетического обмена в лимфоцитах периферической крови у детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони выявил достоверную (р<0,05) положительную динамику уровня -ГФДГ и ГДГ при лечении янтавитом. Показатели активности СДГ также выросли на 1,98±0,5 усл.ед. и составили 16,17±1,16 усл.ед. Было отмечено некоторое снижение активности ЛДГ по сравнению с его уровнем у больных до лечения препаратом янтавит, что говорит о сохранении напряжения клеточного энергетического обмена (рис. 15).

Цитохимический анализ показателей активности митохондриальных ферментов в лимфоцитах периферической показал, через 3 месяца после окончания энерготропной терапии у детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони вновь отмечается снижение активности СДГ, -ГФДГ, ГДГ и ЛДГ.

Отмечено достоверное снижение активности ГДГ не только по сравнению с нормальными значениями, но и с уровнем активности данного фермента через 1 месяц после лечения (р<0,05)

Средний показатель активности СДГ через 3 месяца после окончания лечения составил 15,44±1,2 усл.ед, а а-ГФДГ - 9,0±0,51 уел ед.

Обращало на себя внимание дальнейшее снижение активности ЛДГ, что свидетельствовало о возобновлении угнетения процессов энергообеспечения у детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони (рис 15).

До лечения Через 1 месяц Через 3 месяца после лечения после лечения

Рис. 15. Изменение активности ферментов клеточного энергообмена у детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони (п=6) при приеме препарата янтавит.

Исследование отдаленной эффективности лечения (через 3 месяца) (рис.14,15) показало, что действие препарата янтавит у детей с ПКБ и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони как энерготропного средства носит краткосрочный характер - 1 месяц, в связи с чем. для пролонгирования и стабилизации положительного результата лечения целесообразны ежеквартальные курсы лечения данным препаратом.

До сих пор не было известным, можно ли успешно корректировать нарушение клеточного энергообмена у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони. Результаты данного исследования убедительно свидетельствуют, что такая возможность есть. При всей тяжести и полисистемности данных заболеваний, процессы энергообразования в клетках, имеют некоторые резервы для коррекции, а значит, имеется и возможность повышения качества жизни больных детей. Применение npeпapaтa янтавит у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони как энерготропного средства способствует уменьшению степени клеточного энергодефицита, уменьшению степени

лактатацидоза и пируватацидоза, нормаллизации процессов пероксидации. У пациентов, не получавших лечение препаратом янтавит, отмечено дальнейшее увеличение клеточного дефицита в виде нарастания дальнейшего снижения активности ферментов биоэнергетического обмена (СДГ, -ГФДГ, ГДГ).

ВЫВОДЫ.

1 .Биохимические и цитохимические методы обследования выявили наличие недостаточности энергетического обмена у всех детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони, которая выражалась в достоверных изменениях цитохимических показателей активности ферментов биоэнергетического обмена ГФДГ, ГДГ, повышении уровней молочной и пировиноградной кислот в сыворотке крови, накоплении продуктов перекисного окисления липидов и снижении уровня антиокислительной активности плазмы крови.

2Лаибольшее снижение показателей активности ферментов клеточной биоэнергетики, повышение степени лактат- и пируватацидоза, усиление процессов пероксидации отмечено при болезни де Тони-Дебре-Фанкони, несколько менее выраженные изменения клеточного энергообмена - при аутосомно-рецессивном типе поликистозной болезни и наименее выраженные - при аутосомно-доминантном варианте поликистозной болезни почек.

3.Выраженность биохимических и цитохимических показателей митохондриальной недостаточности у детей с поликистозной болезнью почек коррелирует с тяжестью течения поликистозной болезни: со степенью нарушения почечных функций, с увеличением количества и размеров кист, и как следствие, с уменьшением объема функционирующей почечной паренхимы.

4.Применение энерготропнного препарата янтарной кислоты - янтавит в лечении поликистозной болезни почек и болезни де Тони-Дебре-Фанкони оказало значительный позитивный эффект, который проявлялся в положительной динамике как клинических (уменьшение жалоб, связанных с со снижением толерантности к физической нагрузке, симптомами интоксикации), так и лабораторных показателей (снижение уровней молочной и пировиноградной кислот в сыворотке крови, нормализация антиокислительной активности плазмы крови и показателей перекисного окисления липидов в крови, повышение активности ферментов биоэнергетического обмена в лимфоцитах периферической крови).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1Для диагностики нарушения процессов клеточного энергообеспечения у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони рекомендуется использовать комплекс клинико-лабораторных методик, включающих цитохимический анализ (визуальная количественная оценка) активности митохондриальных ферментов в лимфоцитах периферической крови, биохимический

скринирующий тест для определения уровней молочной и пировиноградной кислот как натощак, так и на фоне нагрузки глюкозой.

2.При оценке выраженности клеточного энергодефицита у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони следует использовать определение состояния процессов пероксидации.

3.Для коррекции проявлений энергетической клеточной недостаточности у больных с поликистозной болезнью и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони, в клинической картине которых наблюдается плохая переносимость физической нагрузки, снижение мышечного тонуса, сопровождающиеся лактатацидозом, нарушением активности митохондриальных ферментов и процессов перекисного окисления липидов, рекомендуется использовать энерготропный препарат янтавит (соль янтарной кислоты) в дозе не более 10 мг/кг/сутки до еды 2 раза в день (утро, день) по схеме 3 дня - прием препарата, 4 дня - перерыв в приеме препарата в течение 1 месяца. В связи с краткосрочностью положительного эффекта от приема препарата необходимо проводить повторные курсы 1 раз в 3 месяца.

4.Для лабораторного контроля при оценке эффективности препарата янтавит следует применять цитохимический анализ ферментного статуса лимфоцитов периферической крови, с повторным исследованием уровней молочной и пировиноградной кислот, индекса их соотношения в крови и показателей перекисного окисления липидов.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Mitochondrial dysfunction in children with hereditary and asquired renal disease // Mitochondrion l.v.6-2002- P.524 (Co-author. Ignatova M, Nizhegorodtseva Т., Novikov

P.)

2. Митохондриальные дисфункции при наследственных и приобретенных заболеваниях почек у детей // Тез. докл. I Всероссийский конгресс "Современные технологии в педиатрии и детской хирургии" - Москва, 2002 - С. 480 - 481. (соавт. Игнатова М.С., Новиков П.В., Нижегородцева Т.В)

3. Характер митохондриальных дисфункций при наследственных нефропатиях при различном функциональном состоянии почек // Тез. докл. П Российский конгресс "Современные методы диагностики и лечения в детской нефрологии и урологии" -Москва, Салтыковка, 2002 - С. 120 (соавт. Игнатова М.С, Нижегородцева Т.В., Сухорукое B.C.)

4. Митохондриальные дисфункции при наследственных и приобретенных заболеваниях почек у детей // Тез. докл. П Российский конгресс "Современные методы диагностики и лечения в детской нефрологии и урологии"- Москва, Салтыковка, 2002-С. 120 (соавт. Игнатова М.С, Нижегородцева Т.В., Сухорукое B.C.)

5. Activity of mitochondrial enzymes of peripheral blood lymphocytes in children with polycystic kidney disease// The World Congress of Nephrology. June 8-12, Berlin, 2003-P. 520. (Co-author. Ignatova M. Novikov P., Shabelnikova E.)

6. Особенности функционального состояния митохондрий при болезни де Тони-Дебре-Фанкони у детей // Тез. докл. Ш Российский конгресс Педиатров-нефрологов России - Санкт-Петербург, 2002-С. 120 (соавт. Игнатова М.С, Новиков П.В., Шабельникова Е.И.)

7. Дисфункция митохондрий при нефропатиях у детей //Нефрология и диализ, -2003-№4-С. 344-353.

8. Показатели перекисного окисления липидов и структурной нестабильности мембран у детей с поликистозной болезнью почек. // Тез. докл. Ш Всероссийский конгресс "Современные технологии в педиатрии и детской хирургии"- Москва, 2004-С. 271. (соавт. Юрьева ЭА, Игнатова М.С., Новиков П.В.)

Список сокращений.

а-ГФДГ - альфа-глицерофосфатдегидрогеназа

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

ЛДГ - лакгатдегидрогеназа

ГДГ - глутаматдегидрогеназа

МДА - малоновый дильдегид

АОА - антиокислительная активность плазмы крови

КО - ксантиноксидаза

ГП- гидроперекиси

АТФ - аденозинтрифосфат

ПОЛ - перекисное окисление липидов

мА- микроальбумины

ПКБ - поликистозная болезнь почек

АД ПКБ - аутосомно-доминантный тип поликистозной болезни АР ПКБ - аутосомно-рецессивный тип поликистозной болезни

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.06.2000 г. Подписано в печать 12.01.2005 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,75

Печать авторефератов 730-47-74,778-45-60

Í

Kb T \

5 5 - R .

/ t

W* S -

1e! 2 fi

2 2 WAP 2035

Актуальность проблемы.

Достижения медицинской науки в области биохимии, клинической морфологии и медицинской генетики последних десяти лет позволили выделить новый гетерогенный пласт наследственных болезней у детей, обусловленных энергетической недостаточностью клеток, вследствие нарушения структуры и функций митохондрий. Длительно такие нарушения клеточной биоэнергетики рассматривались только в связи с нервно-мышечными расстройствами (DiMauro S. et al, 1993) [80]. Однако, по мере накопления научных данных о состоянии митохондрий — ключевого звена энергообразования в организме, показано, что нарушение клеточной биоэнергетики может приводить к полисистемным заболеваниям, при этом страдают все энергозависимые органы и ткани: почки, сердце, печень (Bruce Н, Choln M.D., 1997) [59]. Самые богатые митохондриями клетки находятся в проксимальных и дистальных извитых канальцах коркового слоя почки, а также восходящей части петли Генле. В связи с этим, диагностическим ориентиром почечной митохондриальной дисфункции, прежде всего, служит нарушение деятельности именно этих структур нефрона, что важно для ранней диагностики патологии.

Доказано наличие первичных митохондриальных нарушений при таких нефропатиях как: синдром де Тони-Дебре-Фанкони (Morris A.M. et al, 1995) [139]., дистальный и проксимальный почечный канальцевый ацидоз (Matsutani Н. et al, 1992) [131]., тубулопатия подобная синдрому Барттера (Goto Y. at al, 1992) [94]. Патогенетическим фактором в данном случае могут быть дефекты пируватдегидрогеназного комплекса (Kitano А. et al, 1986) [114] и нарушения в дыхательной цепи на уровне III комплекса (коэнзим Q-цитохром С редуктаза) и IV комплекса - ключевого элемента дыхательной цепи- цитохрома С оксидазы. (Seigle R. et al 1996; Sperl В. et al, 1998) [170,175].

В литературе имеются сведения о развитии кист при тубулопатиях, связанных с митохондриальной недостаточностью. Предполагается, что дисфункция митохондрий эпителия почечных канальцев, и связанная с ней слабость клеточной энергетики способствуют, вероятно, ухудшению белкового синтеза и ослаблению межклеточных контактов со склонностью к образованию кист в том органе, патология которого имеет яркие проявления, в частности, в почке. (Клембовский А.И., 2000) [15]. Описан поликистоз проксимальных извитых канальцев при врожденном нефротическом синдроме финского типа, при котором обнаружен высокий уровень процессов пероксидации в патологически измененных митохондриях нефрона. (HolthoferH. etal, 1999) [106]. Следует отметить, что на 16 хромосоме (16 р13) выявлена локализация генов АТФ-сшггетазы и других митохондриальных белков (Materials of the Human Genome Meeting, 2000). Близость расположения мутаций может приводить к схожести симптоматики поликистозной болезни почек и первичных митохондриальных заболеваний.

В последние десятилетия отмечено нарастание частоты патологии органов мочевой системы у детей в России (Папаян А.В. и соавт., 1997) [29]. В большей мере это касается наследственных и врожденных нефропатий, при которых уже в детском возрасте возможно развитие почечной недостаточности (Игнатова М.С., 2002) [36]. Поликистозная болезнь почек и болезнь де Тони-Дебре-Фанкони, несмотря на некоторый прогресс в лечении, остаются причиной развития ХПН в детском возрасте [24, 30]. Эти два генетически детерминированных заболевания с прогрессирующим течением объединены одним уровнем анатомического дефекта - вовлечением в патологический процесс канальцевого аппарата почки, а также наличия у пациентов вне зависимости от выраженности мочевого синдрома и наличия клинических признаков снижения почечных функций сочетания почечных изменений с патологией других органов и систем ребенка (глухота, отставание в умственном развитии, изменения скелета и др.), вялостью, слабостью, непереносимостью физических нагрузок, снижением мышечного тонуса.

Исследованиями последних лет отмечена тяжесть биохимических и морфофункциональных нарушений при идентифицированных митохондриальных болезнях, однако, в литературе практически отсутствуют данные о митохондриальной дисфункции и связанной с ней недостаточностью клеточной биоэнергетики при многих наследственных заболеваниях почек, в том числе поликистозной болезни почек и болезни де Тони-Дебре-Фанкони.

Разработана и с успехом применяется терапия детей, страдающих идентифицированными первичными митохондриальными заболеваниями (Казанцева JI.3., Николаева Е.А, 2001) [13], однако лечение заболеваний, связанных с клеточным энергодефицитом, представляет большие трудности.

Цель исследования: установить наличие и характер клеточного энергодефицита у детей с аутосомно-доминантным, аутосомно-рецессивным типом поликистозной болезни почек и с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони и оценить возможность их медикаментозной коррекции энерготропным препаратом янтавит.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

1.Установить характер и степень нарушений клеточной биоэнергетики на основании определения уровня молочной и пировиноградной кислот крови, их соотношения у детей с поликистозной болезнью почек и с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони.

2.Определить признаки митохондриальной дисфункции с использованием цитохимического исследования активности ферментов биоэнергетического обмена в лимфоцитах периферической крови у больных с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони.

3.Оценить состояние перекисного окисления липидов у детей с поликистозной болезнью почек, болезнью де Тони-Дебре-Фанкони.

4.0босновать назначение и определить эффективность лечения энерготропным препаратом янтавит при выявлении недостаточности клеточной биоэнергетики у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони.

Научная новизна работы.

Впервые выявлено нарушение клеточного энергообмена у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони на основании биохимических и цитохимических методов обследования.

Впервые при поликистозной болезни почек и болезни де Тони-Дебре-Фанкони определено нарушение процессов пероксидации, что может расцениваться как следствие клеточного энергодефицита.

Выраженность цитохимических показателей митохондриальной недостаточности (снижение активности ферментов энергетического обмена: а-ГФДГ, ГДГ, СДГ) коррелирует с тяжестью течения и со степенью снижения почечных функций при поликистозной болезни почек.

Научно обоснованы необходимость и эффективность использования препарата янтавит для уменьшения степени клеточного энергодефицита и нормализации процессов пероксидациии, что сопровождается улучшением состояния больных.

Практическая значимость.

Обоснована практическая значимость исследования нарушений клеточной биоэнергетики у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони.

Установлена необходимость и доказана эффективность медикаментозной коррекции выявленных изменений клеточного энергетического обмена, что позволяют включить в существующие способы лечения этих заболеваний препарата янтавит, благоприятно влияющего на процессы биоэнергетического обмена.

Решение поставленных задач осуществлялось в отделах наследственных и приобретенных болезней почек (руководитель — профессор, доктор медицинских наук М.С. Игнатова) и наследственных и врожденных заболеваний с нарушением психики (руководитель -профессор, доктор медицинских наук П.В. Новиков) Московского НИИ педиатрии и детской хирургии (директор — профессор, доктор медицинских наук А.Д. Царегородцев) Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Апробация работы.

Материалы работы доложены и обсуждены на совместном методическом совещании отдела наследственных и приобретенных болезней почек и наследственных и врожденных заболеваний с нарушением психики МНИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ. Основные положения диссертации доложены на нефрологической секции Московского общества детских врачей 13 марта 2003 г., на Международном Нефрологическом Конгрессе (8-12 июня 2003 г., Берлин, Германия), на III Российском конгрессе педиатров-нефрологов (2-4 декабря 2003г., С-Петербург).

Внедрение в практику. Разработанные способы коррекции митохондриалыюй недостаточности у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони внедрены в клиническую практику отдела наследственных и приобретенных болезней почек и отдела наследственных и врожденных заболеваний с нарушением психики Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ.

Выводы

1. У детей с аутосомно-доминантным и аутосомно-рецессивным типами поликистозной болезни почек выявлен лактатацидоз натощак и на фоне проведения стандартного глюкозотолерантного теста. Доказано, что определение молочной и пировнноградной кислот в крови натощак и после нагрузки глюкозой может быть использовано в качестве скринирующего биохимического теста для выявления нарушения клеточной энергетики у обследованных больных.

2. У детей с поликистозной болезнью почек имеет место нарушение биоэнергетических процессов, проявляющихся дисфункцией митохондрий: снижение активности ферментов клеточного энергообмена (а-ГФДГ, СДГ, ГДГ). Степень недостаточности процессов энергообразования в клетках в большей мере выражена при аутосомно-рецессивном типе поликистозной болезни почек и имеет прямую зависимость от тяжести течения заболевания, степени нарушения почечных функций и объема функционирующей почечной паренхимы.

3. Для детей с поликистозной болезнью почек характерно нарушение процессов перекисного окисления липидов в виде повышения активности ксантиноксидазы плазмы, гидроперекисей липидов, уровня малонового диальдегида и общей антиокислительной активности плазмы крови. Указанные изменения клеточного энергообмена сопровождаются признаками структурно-функциональной дезорганизации почечных цитомембран, характеризующимися липидурией, этаноламинурией и повышением уровня перекисей липидов в моче, повышением активности фосфолипазы А.

4. У детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони выявлены тяжелые нарушения клеточной энергетики - угнетение активности всех исследуемых ферментов клеточного энергообмена: а-ГФДГ, СДГ, ЛДГ

ГДГ в сочетании с выявлением гиперлактат-, гиперпируватацидемии натощак и при проведении стандартного глюкозотолерантного теста.

5. Нарушения уровня активности ферментов клеточного энергообмена у детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони сочетаются с выраженными нарушениями процессов перекисного окисления липидов в виде повышения уровня первичных и вторичных продуктов пероксидации в крови и снижения компенсаторных возможностей системы антиокислительной защиты.

6. При использовании в лечении энерготропного препарата янтавит у детей с поликистозной болезнью почек наблюдалось уменьшение или нормализация выявленных у них нарушений клеточной биоэнергетики. Отмечено улучшение состояния больных, и как следствие, повышения качества жизни у детей, получавших энерготропную терапию, по сравнению с больными, не получавшими янтавит, у которых, выявлена отрицательная динамика изменения активности ферментов биоэнергетического обмена и соотношения лактат/пируват наряду с показателями перекисного окисления липидов.

7. Применение препарата янтавит у детей с болезнью де Тони-Дебре-Фанкони как энерготропного средства способствует уменьшению степени клеточного энергодефицита. Эффект действия препарата кратковременный - в течение 1 месяца, что предусматривает ежеквартальные повторные курсы лечения препаратом янтавит для пролонгирования и стабилизации положительного результата лечения

Практические рекомендации

1.Для диагностики нарушения процессов клеточного энергообеспечения у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони рекомендуется использовать комплекс клинико-лабораторных методик, включающих цитохимический анализ (визуальная количественная оценка) активности мнтохондриальных ферментов в лимфоцитах периферической крови, биохимический скринирующий тест для определения уровней молочной и пировиноградной кислот как натощак, так и на фоне нагрузки глюкозой.

2.При оценке выраженности клеточного энергодефицита у детей с поликистозной болезнью почек и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони следует использовать определение состояния процессов пероксидации.

3.Для коррекции проявлений энергетической клеточной недостаточности у больных с поликистозной болезнью и болезнью де Тони-Дебре-Фанкони, в клинической картине которых наблюдается плохая переносимость физической нагрузки, снижение мышечного тонуса, сопровождающиеся лактатацидозом, нарушением активности мнтохондриальных ферментов и процессов перекисного окисления липидов, рекомендуется использовать энерготропный препарат янтавит (соль янтарной кислоты) в дозе не более 10 мг/кг/сутки до еды 2 раза в день (утро, день) по схеме 3 дня - прием препарата, 4 дня - перерыв в приеме препарата в течение 1 месяца. В связи с краткосрочностью положительного эффекта от приема препарата необходимо проводить повторные курсы 1 раз в 3 месяца.

4. Для лабораторного контроля при оценке эффективности препарата янтавит следует применять цитохимический анализ ферментного статуса лимфоцитов периферической крови, с повторным исследованием уровней молочной и пировиноградной кислот, индекса их соотношения в крови и показателей перекисного окисления липидов.