Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Характеристика надмолекулярных комплексов поверхностных антигенов лимфоцитов человека



0031G5325

На правах рукописи

КРОТОВ Григорий Иванович

ХАРАКТЕРИСТИКА НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

О

14.00.36. - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 з МАР 2008

Москва, 2008 год

003165325

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

Научный руководитель:

доктор биологических наук А.В. Филатов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.А. Ярилин доктор биологических наук, профессор A.M. Сапожников

Ведущая организация:

НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН

, 11А0

Защита диссертации состоится «¿Л> »2008 г в П часов на заседании диссертационного совета Д 208,017 01 в ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России» по адресу 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России»

<? »оре!)|ихдД

Автореферат разослан с й- » ОГ^ОГ-ДМД 2008 г

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских работ доктор медицинских наук Л С С ее

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хорошо известно, что во многих случаях белки выполняют свою функцию не самостоятельно, а при тесном взаимодействии с другими белками Степень такого взаимодействия может быть различной. От кратковременной ассоциации до образования стабильных комплексов Белковые комплексы контролируют многие клеточные процессы, начиная с транскрипции и заканчивая вирусной инфекцией

Велико значение белок-белковых взаимодействий в иммунной системе Распознавание чужеродного антигена, а также восприятие сигналов многочисленных лимфокинов происходит при участии соответствующих поверхностных рецепторов, представляющих собой комплексные структуры Передача сигнала в цитоплазму лимфоцита также происходит с образование комплексов сигнальных молекул Характеристика и идентификация белковых комплексов лимфоцитов человека имеет большое значение для понимания иммунных процессов, а знание состава и структуры этих комплексов дает информацию для направленной разработки новых фармакологических препаратов, контролирующих иммунный ответ

Существует целый ряд методов, используемых для изучения белковых комплексов Однако наиболее надежным методом доказательства существования белковых ассоциаций продолжает оставаться метод коимму-нопреципитации, когда взаимодействующие белки выделяют из клеточного лизата с помощью иммобилизованных антител, распознающих эпитоп на одном из известных компонентов комплекса Известны две модификации иммунопреципитации. более старая, использующая радиоактивную метку, а также более современная, в которой применяется биотиновая метка Несмотря на широкую распространенность последнего метода, он имеет ряд недостатков, главный из которых состоит в его принципиальной несовместимости с масс-спектрометрическим анализом Это является очень серьезным недостатком, поскольку в эпоху бурного развития протеомики именно масс-спектрометрия становится решающим методом при идентификации различных белков.

В связи с этим представляется актуальным поиск и разработка новых подходов для детекции белков в продуктах иммунопреципитации, а также систематическое изучение белковых комплексов, образуемых поверхностными антигенами лимфоцитов человека.

Цель работы разработать новый метод иммунопреципитации совместимый с масс-спектрометрическим анализом белков и оценить воз-

можности его применения для изучения структуры и состава надмолекулярных комплексов поверхностных рецепторов лимфоцитов человека.

Задачи исследования:

1 Поиск новых подходов для детекции белков, выделяемых методом иммунопреципитации. Разработка метода флуоресцентного иммунопреци-питационного анализа

2 Изучить совместимость флуоресцентного иммунопреципитацион-ного анализа с последующей масс-спектрометрической идентификацией белков

3. Оценка возможности использования метода флуоресцентного им-мунопреципитационного анализа для выделения и изучения белковых комплексов поверхностных антигенов лимфоцитов человека

4 Выделение и масс-спектрометрическая идентификация белков, ассоциированных с молекулой CD4.

Научная новизна. Впервые в качестве альтернативы радиоизотопам и биотиновой метке для регистрации белков в иммунопреципитатах нами было предложено использовать ковалентные флуоресцентные красители Показана совместимость предложенного метода с масс-спектрометрическим анализом.

Впервые проведено протеомное изучение комплекса мембранного белка CD4 Определены основные партнеры молекулы CD4 (CD45, CD71, Lck и LPAP) Впервые показана ассоциация CD4 с трансмембранным белком LPAP и белками цитоскелета. Сделана оценка количественного состава С04-комплекса

Практическая значимость работы. Настоящая работа выполнена в рамках программы фундаментальных исследований Научная значимость настоящего исследования заключается в разработке метода флуоресцентного иммунопреципитационного анализа Предложенный метод позволяет детектировать как мембранные, так и внутриклеточные белки и проводить их последующую масс-спектрометрическую идентификацию Метод также позволяет изучать белок-белковые комплексы, образуемые поверхностными клеточными антигенами и делать количественные оценки их состава Характеристика и идентификация белковых комплексов лимфоцитов человека имеет большое практическое значение для направленной разработки новых фармакологических препаратов, контролирующих иммунный ответ

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, июнь 2005), на 31-ом конгрессе Федерации европейских биохимических сообществ (Стамбул, Турция, июнь 2006), на VIII конгрессе

4

РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммуно-фармакологии» (Москва, июнь 2007), на III российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, сентябрь 2007) По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе по теме диссертации 9, работ, опубликованных, в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных Высшей аттестационной комиссией, 5 работ

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов Список литературы включает 232 источника Работа содержит 6 таблиц и 24 рисунка

Материалы и методы исследования

1.1. Антитела, клетки и их источники.

Мононуклеары периферической крови человека здоровых доноров выделяли центрифугированием при 400 g 30 мин на градиенте плотности фиколл-верографина (р= 1,077) Клеточные линии человека поддерживали культивированием в среде DMEM (ICN, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), 4 мМ L-глутамина и 80 мг/л гентамицина в увлажненной атмосфере с 5%-ным С02 при 37 °С Источником тимоцитов служили фрагменты тимуса, удаляемые во время операций на сердце Суспензию тимоцитов получали с помощью гомогенизатора из измельченных фрагментов тимуса

Большинство моноклональных антител, использованных в данной работе, были получены ранее в лаборатории иммунохимии ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»

1.2. Мечение клеток и белков флуоресцентными красителями.

Для мечения клеток и белков использовали аминореактивные флуоресцентные красители («Синтол», Россия) Клетки (4*107) суспендировали в 1 мл 10 мМ бикарбонатного буфера, содержавшего 150 MMNaCl (pH 8,2) Мечение проводили при комнатной температуре, добавляя к клеткам 50 мкл красителя, растворенного в DMSO, до конечной концентрации красителя 0,1-1,0 мг/мл Через 20 мин реакцию останавливали, отмывая клетки в 10 мМ растворе глицина в PBS

Белки для мечения флуорофорами растворяли в 100 мМ бикарбонате натрия К 1 мл раствора белка добавляли 25 мкл раствора красителя в DMSO (3 мг/мл) и инкубировали 1 ч при комнатной температуре Не связавшийся краситель отделяли от меченого белка с помощью гель-

хроматографии на колонке с Sephadex G-10. Концентрацию белка измеряли, использую набор ВСА™ Protein Assay Kit (Pierce)

1.3. Цитофлуориметрический тест.

К осадку 0,5 х 10б клеток, добавляли 50 мкл первичных антител и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин Затем клетки дважды отмывали в растворе PBS, к осадку клеток добавляли 50 мкл вторичных антител, меченных ФИТЦ, и инкубировали 30 мин Не связавшиеся антитела дважды отмывали в растворе PBS Интенсивность флуоресценции клеток измеряли на проточном цитометре FACScan (BD Biosiences, США)

1.4. Приготовление клеточного лизата и иммунопреципитация.

Клетки (4x107) суспендировали в 1 мл лизирующего буфера с детергентами, содержавшего ингибиторы протеаз После удаления клеточных остатков лизат последовательно осветляли путем инкубирования в течение 118 ч с БСА, нормальным IgGl, предварительно иммобилизованными на BrCN-активированной сефарозе (по 200 мкл 50% суспензии каждого на 1 мл лизата) и протеин А-сефарозой (Bio-Rad, США) (100 мкл 50% суспензии на 1 мл лизата) Полученный лизат клеток использовали для иммунопреци-питации на специфических антителах

Перед иммунопреципитацией антитела предварительно иммобилизовали на протеин А-сефарозе Затем носитель отмывали от не связавшихся антител в PBS При иммуноаффинной очистки белковых комплексов для последующего масс-спектрометрического анализа преформированные комплексы антител ковалентно зашивали на протеин А-сефарозе с помощью диметил пимелимидата На одну иммунопреципитацию брали 100-200 мкл 50% суспензии протеин А-сефарозы. Иммунопреципитацию проводили на ледяной бане в течение 1-18 ч Не связавшие белки отмывали путем трехкратного центрифугирования (2000xg, 5 мин) Выделенные белки элюиро-вали с носителя, добавляя 15 мкл электрофоретического буфера для нанесения образцов (95 °С, 5 мин) В некоторых случаях использовали кислую элюцию, для этого носитель со связавшимися белками переносили в колонку Элюцию вели кислым буфером с pH 2,5, собирая фракции по 100 мкл За выходом целевого антигена следили по интенсивности флуоресценции, измеряемой на флуориметре «Джин», (ДНК-технология, Россия)

1.5. Электрофорез.

После иммунопреципитации белки подвергали электрофоретическому разделению по методу Лэммли в SDS-полиакриламидном геле в ячейке Mini-PROTEAN®3 (Bio-Rad, США) Процентность разделяющего геля в зависимости .от эксперимента варьировала от 5 до 12% После электрофореза визуализацию белков в геле проводили на флуоресцентном сканере Molecu-

lar Imager FX Pro (Вю-Rad) без предварительной фиксации, окрашивания или сушки геля В некоторых экспериментах гели окрашивали Кумаси G-250 или нековалентным флуоресентным красителем SYPRO Red

1.6. Масс-спектрометрическая идентификация белков.

Белковые полоски (~5мм3) вырезали из геля, отмывали, высушивали и

добавляли 5-8 мкл раствора трипсина (Promega, США) в концентрации 25 нг/мкл в 50 мМ бикарбонате аммония Гидролиз белков проводили при 37 °С в течение ночи Пептиды экстрагировали добавлением 12-17 мкл раствора для экстракции (5% ацетонитрила, 0,5% муравьиной кислоты в деиони-зованной воде) в течение 30 мин Полученные пептиды подвергали масс-спектрометрическому анализу Обратнофазную жидкостную хроматографию проводили, используя Agilent 1100 нано-проточную LC систему, соединенную с ионной ловушкой «Agilent 1100 SL Senes MSD Trap» (Agilent Technologies Inc.). Триптические пептиды разделяли, используя линейный градиент 5-80% ацетонитрила, содержавшего 0,1% муравьиной кислоты, в течение 60 мин и детектировали с помощью ионной ловушки в диапазоне от 200 до 1800 m/z.

Идентификацию белков по тандемным масс-спектрам (MS/MS) трип-тических пептидов проводили с помощью программы MASCOT {www matrixscience сот), и все тандемные масс-спектры идентифицировали путем корреляции с последовательностью пептидов человеческих белков присутствующих в базе данных белковых последовательностей NCBI (www nebí nlm nih gov)

1.7. Иммуноблоттинг.

Белки, полученные после иммунопреципитации, разделяли электрофорезом в 10% или 7% SDS-полиакриламидном геле в нередуцирующих условиях в буферной системе Лэммли Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану на приборе Mini Trans-Blot (Вю-Rad) в течение 1 ч при напряжении 100-120 В в буфере следующего состава 25 мМ Триса, 192 мМ глицина рН 8,3, 20%-ный этанол. Мембраны блокировали 5%-ным сухим обезжиренным молоком в PBS с 0,1%-ным Tween 20 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с биотинилированными первичными антителами Мембраны отмывали и инкубировали со стрепта-видином, конъюгированным с пероксидазой хрена (Amersham, США) Визуализацию проводили с помощью хемилюминесценции, используя реагенты фирмы BioRad.

1.8. Конфокальная микроскопия.

Окрашенные клетки помещали на покровные стекла, предварительно покрытые 0,01% полилизином (Sigma, США), и фиксировали 1% раствором

параформальдегида в PBS, pH 7,4. Препарат покрывали средой для заключения (Dako, США) и укрепляли на предметном стекле Измерения выполняли на конфокальном микроскопе Leica TCS SP2 Для возбуждения флуоресценции использовали излучение лазера при 488 нм Изображения редактировали с помощью графической программы Adobe Photoshop 8 О

1.9. Обработка результатов экспериментов.

Изображения гелей обрабатывали с помощью программы Quantity One (Bio Rad), цитометрические данные собирали и анализировали с помощью программного обеспечения CELLQUEST. Обработку цитометрических файлов осуществляли с помощью прикладной программы WinMDI 2 8 Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью программы Excel 2000 фирмы Microsoft

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка метода флуоресцентной нммунопрецнпитации.

Многие биоаналитические методы изначально были разработаны как процедуры, основанные на использовании радиоактивного мечения В качестве примера можно привести твердофазный иммунохимический анализ, который исходно появился как радиоиммунный анализ (РИА), а первым ДНК гибридизационным тестом был Саузерн-блот с ДНК-зондами, меченными радиоактивным фосфором Так как работа с радиоактивными метками имеет множество недостатков, то со временем для большинства вышеупомянутых методов были предложены альтернативные варианты, в которых данные методы переводились в формат колориметрических, флуоресцентных или хемилюменисцентных методик, которые в дальнейшем получили более широкое распространение в практике, чем их родоначальники [Smith, 1986, Tijssen, 1985]

Метод радиоиммунопреципитации (РИЛА) долгое время успешно применялся для определения биохимических характеристик различных антигенов. Несмотря на то, что метод РИПА характеризуется высокой чувствительностью, данный метод имеет ряд существенных недостатков присущих всем радиоизотопным методам Это в первую очередь потенциальная опасность для здоровья исследователя, ограниченное время полужизни радиоактивных меток и высокая стоимость утилизации радиоактивных отходов В качестве нерадиоактивной альтернативы РИПА был предложен метод, где поверхностные белки метят активированными производными биотина [Hurley, 1985, Cole, 1987, Kahne и Ansorge, 1994, Schulberth at al, 1996] Однако в этом случае вводятся дополнительные стадии электропере-

носа белков из геля на мембрану и иммунохимического связывания со стрептавидином, меченным пероксидазой, что значительно увеличивает время анализа

В качестве альтернативы радиоактивным и биотиновым меткам в нашей работе для иммунопрецииитации впервые предложено использовать аминореактивные флуоресцентные красители Несмотря на то, что кова-лентные флуоресцентные красители уже несколько лет успешно применяются в дифференциальном двухмерном электрофорезе, тем не менее, возможность их использования в иммунопреципитации ранее не исследовалась Известно, что флуоресцентные метки позволяют регистрировать очень низкие концентрации белка Еще одним преимуществом флуоресцентных красителей является линейность сигнала в широких пределах концентраций В предварительных экспериментах нами было установлено, что чувствительность определения бычьего сывороточного альбумина (БСА), меченного R6G, оказалась 0,3 нг на полосу Зависимость интенсивности сигнала от количества белка была линейной в диапазоне от 0,3 до 30 нг белка на дорожку

Нами было обнаружено, что живые клетки при комнатной температуре в слабо щелочных растворах хорошо окрашивались такими ковалентны-ми флуоресцентными красителями как FITC, FAM, JOE, TET, HEX, R6G, TAMRA, ROX, и Cy5 При изучении кинетики связывания аминорективных красителей с клетками СЕМ и IM-9 было установлено, что в течение первых 5 мин шло интенсивное включение красителя в клетки, и уже к 10 мин кинетическая кривая мечения выходила на насыщение (рис 1 А) Основываясь на полученных данных, в дальнейшем мечение проводили в течение 20 мин

При изучении зависимости интенсивности флуоресценции клеток от концентрации красителя, было показано, что повышение концентрации красителя приводит к линейному увеличению степени мечения клеток (рис 1 Б) Учитывая то, что излишняя нагрузка белка красителем может приводить к потере его антигенности, вследствие чего специфическое антитело может перестать реагировать с меченым антигеном, в дальнейшем в качестве рабочей концентрации мы использовали умеренные количества красителя в области 0,1-1,0 мг на 4x107 клеток/мл Как показали тесты на жизнеспособность (окрашивание трипановым синим), клетки после мечения сохраняли целостность и оставались живыми Также было установлено, что мечение клеток красителем ROX вплоть до концентрации 1 мг/мл не оказывало какого-либо заметного влияния на последующее связывание антител против CD1 la, CD45 и ряда других антигенов

9

А

Б

R6G

Рис. 1. Окраска клеток флуоресцентными красителями.

Клетки СЕМ были обработаны флуоресцентными красителями FAM или R6G. в концентрации 0,1 мг/мл в PBS (рН 8,0), время инкубации с красителем 20 мин. (А) Кинетика мечения клеток красителем FAM. (Б) Влияние концентрации красителя на интенсивность окраски клеток. (В, Г) Конфокальные флуоресцентные изображения демонстрируют, что FAM (В) окрашивает преимущественно клеточную мембрану, в то время как, R6G (Г) окрашивает как клеточную мембрану, так и цитоплазму.

FAM

Таким образом, в предварительных экспериментах были отработаны условия отдельных стадий процесса иммунопреципитации. Была продемонстрирована эффективность тотального мечения мембранных белков флуоресцентными красителями, сохранение антигенных свойств поверхностных белков после мечения, а также высокая чувствительность детекции флуоресцентно меченых белков в геле после электрофореза. Далее все отработанные стадии иммунопреципитации были объединены в единый процесс, который состоял из следующих этапов: мечение живых клеток флуорес-

10

центными красителями, лизис клеток в растворе детергента, выделение антигена из клеточного лизата на специфических антителах, элюция белка, связавшегося с носителем, электрофоретическое разделение в полиакрила-мидном геле и сканирование геля по флуоресценции. На рис. 2 представлены типичные электрофореграммы, полученные после иммунопреципитации из лизатов клеток HUT-78, IM-9 и Ramos. На рисунке хорошо видно, что использованные антитела распознавали полипептиды с молекулярными массами 95, 67, 93, 45, 120, 30/35, 130, 44, 36 кДа, что соответствует молекулярным массам молекул CD71, CD5, CD54, HLA I, CD22, HLA DR, CD21, CD38 и CD20 кДа.

HUT78 IM9 Ramos

Рис. 2. Характерные электрофореграммы, полученные при флуоресцентной иммунопреципитации ряда поверхностных антигенов.

Клетки HUT-78 и IM-9 метили флуоресцентным красителем R6G, а клетки Ramos красителем HEX. Окрашенные клетки лизировали в буфере с 1% ТХ-100. Антигены преципитировали с помощью антител указанной специфичности, элюирова-ли и подвергали SDS-электрофорезу. Разделенные белки визуализовали с помощью флуоресцентного сканера. В качестве отрицательного контроля использовали преципитацию с нормальным мышиным IgGl (крайняя правая дорожка). На крайней левой дорожке приведены результаты электрофореза тотального лизата клеток HUT-78.

Для того чтобы оценить границы применимости предложенного нами метода флуоресцентной иммунопреципитации был проведен биохимический анализ целого ряда мембранных белков. Нами было тестирована большая панель антител с известной специфичностью против различных поверхностных антигенов. Было обнаружено, что более 30 антител позитивно работали в тесте флуоресцентной иммунопреципитации. В таб. 1 приведен список белков, выявленных в экспериментах по иммунопреципитации.

Антиген Антитело Мол. масса, кДа Антиген Антитело Мол. масса, кДа

ФИПА РИПА* ФИПА РИПА*

CD4 ЕМ4,ОКТ4, МЕМ241, Leu-3a 55 55 CD4S LT45 190-210 180-210

CD5 LT1 68 67 CD49c ЕС13 130,26 125,30

CD9 TRI 2 22 24 CD50 МЕМ-171 122 110-120

CDlla DE4 187 180 CD54 TD3D9 94 95

CD18 DE4 98 95 CD59 МЕМ-43 19-27 19-25

CD20 LT20 36 33,35,37 CD71 LT71 97 95

CD21 IM2 130 130-145 CD95 UT2 45-50 45

CD22 DE7 120 130 CD161 LD3 44 40

CD29 TRI 9 126 130 CD 162 ТВ5 121 110-120

CD31 TRIO 130 130-140 HLAI W6/32 45 45

CD38 EM5 44 45 Рг-микро-глобулнн W6/32 12 12

CD43 MEM-59 118 115-135 HLADR С120 30,35 29, 34

CD44 3C12 81 85 slgM тяжелая цепь МА2 73 75

* Значения взяты из литературных источников

Среди общего количества тестированных антител доля антител работающих в тестах ФИПА примерно равнялась 60%, что близко к соотношению позитивных и негативных антител в РИПА, и, вероятно, отражает встречаемость антител с высокой и низкой аффинностью [van Agthoven, 1997, Kon, 1997] Известно, что для эффективной иммунопреципитации требуются антитела, которые характеризуются константами диссоциации в области от нано- до пико-молярных значений [Bernhard, 2004] Однако нельзя исключить того, что для некоторых антигенов играет роль потеря реактивности с моноклональным антителом после флуоресцентного мече-ния вследствие стерических затруднений Так, например, антитело LT7 против антигена CD7 работало в иммунопреципитации как с радиоактивной, так и биотиновой меткой, но было негативным в тесте ФИПА

Среди преципитированных антигенов мы находим как одно, так и много цепьевые белки, полипептиды, пронизывающие мембрану как один раз, так и многократно (CD9, CD20). Метод применим также к белкам, локализующимся исключительно на внешней стороне мембраны, например, гликозилфосфатидилинозит-заякоренный белок CD59 Есть все основания полагать, что он может использоваться и для цитоплазматических белков.

12

При сравнении различных красителей было отмечено, что R6G и HEX дают более предпочтительные результаты, чем TAMRA, ROX и Су5 Это объясняется тем, что полосы поглощения R6G и HEX более точно подходят под линию лазера 532 нм, которая использовалась для возбуждения флуоресценции при сканировании геля Кроме того, как показали результаты конфокальной микроскопии меченых клеток, при использовании красителей на основе флуоресцеина (FITC, FAM, JOE и HEX) клетки окрашивались преимущественно по поверхности (рис. 1 В). Красители родаминового ряда (R6G, TAMRA и ROX) прокрашивали как клеточную поверхность, так и цитоплазму клеток (рис 1 Г). Как правило, красители родаминового ряда не используются при мечении белков, поскольку в составе нативного белка их флуоресценция гасится В нашем случае белки после SDS-электрофореза находились в денатурированном состоянии и вероятно, это обеспечивало высокую флуоресценцию конъюгированных красителей

Таким образом, предложенный метод пригоден для определения всех основных типов мембранных белков При этом было отмечено, что высокомолекулярные белки детектируются лучше, чем низкомолекулярные Это напрямую связано с тем, что чем крупнее белок, тем большее количество доступных лизинов он имеет в своем составе

Преимуществами предложенного метода являются простота и малое время, требуемое для постановки анализа Весь процесс, начиная от мече-ния клеток до регистрации результатов, может быть выполнен в течение одного рабочего дня. При детекции белков после электрофореза не требуется какого-либо дополнительного окрашивания, фиксации, обесцвечивания или высушивания геля Так как белки в гелях не фиксируются, то это делает возможным электроперенос белков на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану с проведением последующего иммуноблоттинга, а также jV-концевого микроанализа Если развитие метода в этом направлении в данной работе не изучалось, то его совместимость с масс-спектроскопическим анализом была вполне документирована

Совместимость флуоресцентного иммунопреципитационного анализа с последующей масс-спектрометрической идентификацией белков

С целью проверки того, насколько модификация белка флуоресцентными красителями допускает возможность получения пептидных фрагментов при трипсинолизе и влияет на качество масс-спектров, были проведены модельные эксперименты с белком БСА, к которому ковалентно пришивали красители TAMRA или R6G Было обнаружено, что БСА, меченный TAMRA или R6G, достоверно идентифицируется методом LC-MS/MS Количество зарегистрированных пептидов, а также степень покрытия последова-

13

тельности белка выявленными пептидами лишь незначительно снижались в результате мечения, и меченый БСА идентифицировался с достаточно высоким коэффициентом достоверности (MASCOT score) Это может быть связано как с небольшим процентным содержанием таких пептидов, так и разрывом химической связи между флуорофором и пептидом в процессе ионизации [Schnaible, 1999]

Возможность совмещения ФИЛА с масс-спектрометрическим анализом была продемонстрирована на примере восьми мембранных белков CD9, CD20, CD29, CD45, CD59, CD71, HLA I и альфа цепи HLA-DR Специфические полосы, полученные после иммунопреципитации и электрофореза в ПААГ, вырезали и подвергали трипсинолизу в геле Полученные пептидные фрагменты экстрагировали и подвергали масс-спектрометрическому анализу Белки идентифицировали по данным тан-демных масс-спектров триптических пептидов с помощью программы MASCOT {www matrixscience сот), и все тандемные масс-спектры сравнивали с последовательностью пептидов человеческих белков, присутствующих в базе данных белковых последовательностей NCBI (www nebí nlm mh gov).

В результате во всех исследованных случаях масс-спектрометрически идентифицировались именно те белки, которые были иммунопреципитиро-ваны Для каждого из изученных белков было идентифицировано от 2 до 17 пептидов, и степень покрытия варьировала от 4 до 36% Наибольший коэффициент достоверности (MASCOT score) был получен для рецептора трансферрина равный 498 (табл 2). Чувствительность предложенного метода была такова, что антигена из 107 клеток было достаточно для получения надежных масс-спектрометрических данных. В отличие от этого при стандартном иммуноаффинном выделении требуется не менее 10 клеток [Bernhard, 2004]

Таким образом, предложенный нами метод флуоресцентного имму-нопреципитационного анализа является хорошей альтернативой радиоим-мунопреципитации или иммунопреципитации после биотинилирования клеток Разработанный протокол обеспечивает необходимую чувствительность метода при низкой степени замещения аминогрупп белка молекулами красителя, которая не предотвращает антигенное распознавание, драматически не меняет электрофоретическую подвижность, не мешает трипсинолизу и позволяет определять выделенные белки масс-спектрометрическим методом.

Таблица 2. Масс-спектрометрические идентификация иммуно-преципитнрованных мембранных белков.

Белок Sw¡sProt номер Кол-во пептидов Степень покрытия, % МАвСОТ Зсоге*

СБ9 Р21926 3 9,7 116

СБ20 Р11836 2 4,0 77

СБ29 Р05556 14 22,6 276

СБ45 Р08575 6 9,6 141

СБ59 Р13987 2 21,0 50

СБ71 Р02786 15 21,3 498

НЬАI - 5 34,8 358

НЬА БИ - 2 9,8 127

* Указан коэффициент достоверности (в), при значении 3>50 дает ошибку совпадений (р<0,05) для серии экспериментов

Применение флуоресцентного иммунопреципитационного анализа для идентификации специфичности новых антител к поверхностным антигенам клетки.

Несмотря на то, что приведенные выше белки были идентифицированы масс-спектрометрией вслепую на основе объективных показателей, тем не менее, результаты были заранее известны, поскольку использовались антитела уже установленной специфичности На следующем этапе исследования была проведена оценка возможностей ФИПА для идентификации белков, иммунопреципитированных новыми антителами с неизвестной специфичностью

Было проанализировано 11 моноклональных антител неустановленной ранее специфичности Все тестированные антитела были позитивны во флуоресцентной иммунопреципитации (рис 3) Полученные иммунопреци-питаты были идентифицированы масс-спектрометрическим анализом за исключением одного антигена

Совокупность серологических и структурных данных позволила однозначно определить специфичность изученных антител Было обнаружено, что антитела ЕЯ2, Ла4аЗ, 1тш2, ЕС 13 и НеЗ относятся к кластерам С045, СБ54, С023, СБ49с, СБ47, соответственно Было установлено, что четыре антитела Не7, НЯ2, НЮ и ЕЮ направлены к антигену СВ44 При этом антитела Не7, НЮ и ЕЮ относятся к подкластеру СБ448, а антитело НЛ2, которое экспрессировалось исключительно только на клетках 1М-9, принадлежит к подкластеру СВ4411 Моноклональное антитело 1тт6 преципи-

тировало комплекс НЬАI с р2-микроглобулином. Исходя из того, что антитело 1тш6 ярко окрашивало 100% тимоцитов, был сделан вывод о том, что оно реагирует с (32-микроглобулином.

а)

V

в> \ л г> $ д> &

>Р ^ г

HUT-78 СЕМ IM-9 Raji IM-9 ECV-304

Рис 3. Иммунопреципитация клеточных лизатов различными антителами.

В качестве антигенного материала использованы клеточные линии HUT-78 (а), СЕМ (б), IM-9 (в, д), Raji (г) и ECV-304. Электрофорез проводили в присутствии SDS в восстанавливающих (+) или невосстанавливающих (-) условиях в буферной системе Лэммли.

Антитело ER1 из лизата клеток СЕМ надежно преципитировало антиген, который при электрофорезе имел одну широкую полосу около 32 кДа. Тем не менее, в двух независимых экспериментах масс-спектрометрический анализ не дал положительных результатов. Серологические данные указывали на то, что этот белок является антигеном С099, который характеризуется очень высокой степенью гликозилирования и присутствием в структуре рекордного количества остатков пролина (http://ca.expasy.org/sprot/). По-видимому, эти обстоятельства делают невозможным масс-спектрометрическое определение данного белка.

Таким образом, нами продемонстрирована эффективность применения метода ФИПА в совокупности с масс-спектрометрией для идентификации специфичности моноклональных антител в процессе получения новых гибридом. Метод позволяет использовать неочищенные препараты антител, которые доступны на ранних этапах скрининга гибридом. Метод может использоваться для направленного поиска антител определенной специфичности.

Изучения белковых комплексов с помощью флуоресцентного иммуно-преципитационного анализа

Коиммунопреципитация до настоящего времени продолжает оставаться наиболее надежным методом изучения эндогенных белковых комплексов [Adams, 2005] Принцип данного подхода состоит в выделении взаимодействующих белков из клеточного лизата с помощью иммобилизованных антител, распознающих эпитоп на одном из известных компонентов комплекса Визуализацию ассоциированных белков, как правило, осуществляют с помощью иммуноблоттинга [Harlow, 1988] Однако применение иммуноблоттинга как метода детекции в значительной степени лимитировано коммерческой доступностью антител против белков, составляющих комплексы В связи с этим, в последнее время все чаще для идентификации компонентов аффинно-очищенных белковых комплексов используют масс-спектрометрию [Mann, 2001 и Lin, 2003]

На следующем этапе исследования была изучена возможность применения разработанного нами метода флуоресцентного иммунопреципитаци-онного анализа для характеристики белковых комплексов поверхностных антигенов Первоначально нами был поставлен вопрос о возможности получения в дополнение к основному преципитируемому белку копреципита-ционных полос, связных с ассоциированными молекулами Для решения этого вопроса мы обратились к хорошо описанным комплексам. Известно, что рецептор B-лимфоцитов (BCR) представляет собой ассоциат, компонентами которого являются мембранный иммуноглобулин M или D и гете-родимер антигенов CD79a и CD79b [Schamel, 2000] Комплекс BCR выделяли из лизата меченых клеток Ramos на антителах против поверхностного IgM (slgM) Для сохранения целостности слабых белок-белковых взаимодействий в комплексе, клетки лизировали буфере с «мягким» неионным детергентом Вгц97 Данный подход описан в литературе и использовался ранее для выделения белков, взаимодействующих с тетраспаниновой сетью [Claas, 2001; Levy, 2005, Naour, 2006] и изоляции других слабых мембранных латеральных ассоциатов [Dimitrov, 1998, Zaitseva, 2005] Преципитиро-ванные белки элюировали, подвергали SDS-электрофорезу и сканировали по флуоресценции В результате экспериментов в дополнение к двум тяжелым цепям slgM с массами 72 и 80 кДа, наблюдалась копреципитационная полоса 43 кДа, которая соответствовала по массе молекуле CD79

Еще одним хорошо известным примером мембранных белковых ассоциатов являются комплексы, образуемые белками семейства тетраспани-нов, которые способны взаимодействовать как между собой, так и с другими мембранными белками, формируя разветвленную сеть взаимодейст-

17

вующих молекул, называемую тетраспаниновой сетью В качестве объекта исследования нами была выбрана В-клеточная линия Nalm6, которая характеризуется высокой экспрессией двух тетраспаниновых молекул CD9 и CD81 При флуоресцентной иммунопреципитации тетраспаниновых комплексов на антителах TR12 (анти-С09) и МВЗЕ12 (анти-С081) из лизата клеток Nalm6 в 1% Bnj97 в обоих случаях регистрировалась интенсивная широкая полоса в области 26 кДа. Следует отметить, что молекулы CD9 и CD81 имеют близкие молекулярные массы в районе 26 кДа, поэтому обнаруженная полоса, по всей видимости, являлась суперпозицией преципити-руемого белка и связанного с ним белка-партнера Данное предположение было подтверждено результатами иммуноблоттинга Каждый из полученных преципитатов проявлялся антителом как против CD9, так и против CD81 Таким образом, CD9 и CD81 детектировались как при прямой иммунопреципитации, так и при копреципитации. Результаты иммуноблоттинга позволяют однозначно утверждать о сохранении ассоциации молекул CD9 и CD81 при их выделении методом ФИПА. Интегрин-тераспаниновый комплекс наблюдали на эндотелиальной линии ECV-304 Была обнаружена взаимная копреципитация между тетраспанином CD9 и интегриновой молекулой (31а3 (CD29/CD49c)

Выделение и масс-спектрометрическая идентификация белков, ассоциированных с антигеном CD4.

Наиболее подробно был изучен комплекс молекулы CD4 В качестве объектов исследования были использованы две CD4 позитивные линии. Т-клеточная лимфобластоидная линия СЕМ и миелоидная линия U937 При лизисе обоих типов клеток в детергенте Тритон Х-100 и преципитации на антителе ОКТ4 (aHTH-CD4) на электрофореграмме наблюдалась единственная мажорная полоса, с молекулярной массой 55 кДа Результаты иммуноблоттинга показали, что полоса соответствует белку CD4

При лизисе клеток СЕМ в более мягком детергенте Вгу97 наблюдалась более сложная картина На электрофореграмме кроме самого белка CD4 были хорошо видны еще три интенсивные копреципитационные полосы с молекулярными массами 180-200, 90 и 32 кДа, а также ряд минорных полос В то же время иммунопреципитация CD4 из лизата клеток U937 в детергенте Bnj97 выраженных копреципитационных полос не давала

Для того чтобы выделить С04-комплекс в количестве достаточном для MS анализа брали ~3 х Ю8 флуоресцентно меченых клеток СЕМ и U937 и лизировали в буфере с 1% детергентом Вгу97. Комплексы молекулы CD4 выделяли иммуно-аффинно на антителе ОКТ4 и преципитированные белки разделяли электрофорезом После сканирования гелей белковые полосы,

18

отмеченные на рис. 4, вырезали и подвергали трипсинолизу в геле, а полученные пептиды экстрагировали и анализировали с помощью метода тан-демной масс-спектрометрии. В результате нам удалось достоверно идентифицировать несколько мембранных белков. В основной полосе 55 кДа кроме собственно СЭ4 были обнаружены белки, имеющие близкую с СЛ34 электрофоретическую подвижность: тирозин-киназа Ьск, тубулин и вимен-тин. В полосе с молекулярной массой 180-200 кДа была идентифицирована тирозин-фосфатаза (С045), и в одном из экспериментов тяжелая цепь немышечного миозина. В полосе 90 кДа был определен трансферриновый рецептор (СБ71), а в полосе 32 к Да лимфоцитарный фосфатазо-ассоциированный белок (ЬРАР).

19-

Рис. 4. Иммунноаффинное выделение комплекса молекулы СБ4 для последующей масс-спектрометрической идентификации.

Клетки линии СЕМ, меченные родамином бв, лизировали в 1% Вгу97. Иммуно-преципитацию проводили на антителах ОКТ4 (анти-СВ4), ЬТ45 (анти-СЛЭ45) и ЬТ71 (анти-СВ71). В качестве отрицательного контроля использовали нормальный мыши. Полученные иммунопреципитаты разделяли электрофорезом в 9% ПААГ в восстанавливающих условиях. Полосы, отмеченные стрелками, вырезали для последующего масс-спектрометрического анализа.

Для подтверждения того, что СБ71 и С045 входят в состав СП4-комплексов в последующих экспериментах использовали реципрокную им-мунопреципитацию с антителами против антигенов СБ71 и С045 (рис. 4). На антителе ЬТ45 были получены белки с массой 180-200, 90, 55 и 32 кДа. С помощью масс-спектрометрии удалось идентифицировать только три из них. Это СБ45 (белок с массой 180-200 кДа), и копреципитированные с ним

19

СОТ\ (90 кДа) и ЬРАР (32 кДа) Из-за низкой концентрации белка полосу 55 кДа идентифицировать не удалось Однако результаты иммуноблоттинга показали, что в ней находится антиген С04 При иммуно-аффинной очистке на антителе 1Л71 в геле наблюдали основную белковую полосу 90 кДа, и минорную полосу 180 кДа Масс-спектрометрически обе полосы были идентифицированы как трансферриновый рецептор С071 Таким образом, более высокомолекулярная полоса представляла собой димерную форму белка СБ71 Идентичные результаты были получены в трех независимых экспериментах Список идентифицированных белков, которые копреципи-тировали с молекулами СБ4 и СБ45, приведен в табл 3

Таблица 3. Масс-спектрометрическая идентификация белков, выделенных совместно с молекулами СБ4 и СЭ45 при лизисе клеток СЕМ в Вгц97_ _

полоса Белок Номер в базе данных Рп* Мг, кДа МАБСОТ всоге* Количество пептидов

Иммунопреципитация Г*

ОКТ4 ЬТ45

а б в а б

1 Тирозин-фосфатаза СИ45 Р08575 180220 165-369 8 7 9 22 17 32

Миозин-9 (тяжелая цепь, немышечный Па) Р35579 230 1084-1674 - 23 - 33 - 41

2 Трансферриновый рецептор СБ71 Р02786 190 56-414 2 9 4 - 2 11

3 СЭ4 Р01730 55 55-311 5 4 4 - - 8

р5б-Ьск Р06239 56 282-552 10 10 6 - - 14

Виментин Р08670 54 395-1295 - - 22 - 10 25

Тубулин а 6 09В(2ЕЗ 55 78 3 - - - - 3

Тубулин Р Р07437 55 118-325 9 - 3 - - 9

4 Актин Р60709 42 707 н о 16 н о н о н о 16

5 ЬРАР <314761 32 69-231 2 - - 4 4 4

Примечание но - не определялось, прочерк - пептиды белка не были зарегистрированы

* Указаны диапазоны значений коэффициента достоверности (5) При значении 5 > 55

определяется ошибка совпадений (р < 0,05) для серии экспериментов

"Общее число разноименных пептидов, зарегистрированных в пяти экспериментах

Несмотря на то, что на поверхности клеток СЕМ представлено более двух десятков различных мембранных белков, молекула С04 способна об-

разовывать стабильные комплексы только с некоторыми из них Нами определено, что основными партнерами при образовании комплекса были CD45, CD71, LPAP, Lck В то же время другие белки, такие как CD38, CD44, CD47 и HLAI, которые присутствуют на мембране клеток СЕМ вместе с CD4, подобных комплексов не образуют. Взаимодействие между CD4 и CD45 было продемонстрировано как при прямой (на анти-С04 антителе), так и при обратной (на анти-С045 антителе) иммунопреципитации Несмотря на то, что CD71 хорошо копреципитировал с CD4, тем не менее, обратная преципитация на анти-С071 антителе не давала видимой копреци-питации антигена CD4 Не исключено, что антитело, использованное нами для выделения CD71, препятствовало образованию комплекса CD4-CD71 Подобные примеры известны из литературы Например, антитело Al реагирует исключительно с мономерной формой молекулы CD 130 и не связывается с ней после димеризации и образования комплекса с CD 126 [Autissier, 1998]

Из литературы известно о способности молекулы CD4 образовывать комплексы с другими белками [Dianzani, 1995, Doman, 2002] Однако эти данные противоречивы. С помощью конфокальной микроскопии на живых лимфоцитах была показана колокализация CD4 с поверхностными белками, в том числе с CD3, CD5, CD25, CD28, CD44, CD53 и некоторыми другими [Dianzani, 1995] Наконец, комплексы молекулы CD4 были выделены им-муноаффинно и охарактеризованы с помощью масс-спектрометрии [Bernhard, 2004] В этом случае перед лизисом и выделением белки на поверхности клетки ковалентно сшивались с помощью бифункционального реагента дитиобис-сукцинимидилпропионата В качестве основных партнеров, взаимодействующих с молекулой CD4, были идентифицированы белки Lck, CD45, CD71

Полученные нами данные хорошо согласуюься с результатами работы [Bernhard, 2004] Интересно, что при использовании мягкого детергента Вгу97 мы получили такие же результаты, как и при применении жесткого детергента Тритон Х-100 в сочетании с химической сшивкой поверхностных белков В отличие от полученных нами результатов в цитированной работе в составе комплекса были обнаружены также белки CD98 и аннексии II Как заключают авторы, данные молекулы неспецифически связывались с комплексом за счет высокого уровня их экспрессии на клетке. Кроме того, химическая сшивка приводила к частичной утрате реактивности антигена CD4 со специфическими антителами. Использованный нами метод лишен отмеченных недостатков, и он позволяет обнаруживать не только латеральные белковые ассоциации, доступные для химической сшивки, но и

21

белки, ассоциированные через внутриклеточную часть Например, нами в составе СБ4-комплекса в отличие от такового в работе [Bernhard, 2004] была обнаружена молекула LPAP, которая является трансмембранным белком и имеет очень короткий внеклеточный участок [Bruyns, 1995] Среди копре-ципитированных молекул нами было отмечено также несколько компонентов цитоскелета и белков теплового шока Возможно, что они попали в преципитат неспецифически, вследствие своей высокой экспрессии Однако нельзя полностью исключать возможной специфической ассоциации CD4-комплекса с этими белками Так, ранее было показано, что CD45 специфически связывается с цитоскелетным белком фодрином (неэритроцитарный спектрин) [Iida, 1994], который обеспечивает ассоциацию CD45 с актином

Особый интерес представляют межмолекулярные связи в комплексе и порядок вхождения в него отдельных молекул. Известно, что молекулы CD4 и Lck ассоциируют между собой напрямую за счет образования координационной связи между двумя JV-концевыми цистеинами Lck и двумя С-концевыми цистеинами CD4 [Huse, 1998] Связь осуществляется с участием иона цинка Lck является цитозольным белком, однако он локализуется на внутренней поверхности плазматической мембраны, в которой он заякори-вается своим пальмитоилированным ^-концом. Эксперименты с химерными белками показали, что молекулы CD45 и LPAP напрямую взаимодействуют между собой посредством своих трансмембранных доменов [Cahir McFarland, 1997] Кроме этого цитоплазматический участок LPAP, обогащенный кислыми остатками, может связываться также с каталитической областью Lck [Veillette, 1999]

Можно предположить два варианта образования СБ4-ассоциатов. либо CD4-KOMiiiieKC включает в себя все обнаруженные компоненты, либо имеется набор ассоциатов, каждый из которых характеризуется своим составом Отсутствие комплексов между CD4, CD45 и CD71 на клетках U937 свидетельствует о том, что наличие молекул Lck и/или LPAP критично для образования ассоциатов, поскольку эти молекулы не экспрессированы на клетках U937 [Schraven, 1994]

На основе данных по интегральным интенсивностям полос в иммуно-преципитации была проведена количественная оценка соотношения молекул, входящих в С04-комплекс Было установлено, что в комплексе на одну молекулу CD71 приходятся две молекулы CD45 Поскольку CD71 является гомодимером, образованным за счет дисульфидной связи, то фактически на две цепи CD71 приходятся две цепи CD45, который также склонен к диме-ризации [Takeda, 2004; Xu 2002].

Таким образом, с помощью нового протеомного подхода без использования искусственно вводимых химических сшивок нам впервые удалось показать, что такие молекулы, как С045, С071, ЬРАР, а также некоторые белки теплового шока и компоненты цитоскелета входят в состав СБ4-комплекса

Выводы

1 Предложен и разработан оригинальный метод флуоресцентного иммунопрепитационного анализа, в котором белки в составе живых клеток ковалентно метят флуоресцентными красителями, клетки лизируют, интересующие антигены выделяют на специфических антителах, полученные белки разделяют электрофорезом и визуализируют флуоресцентным сканированием геля

2 Разработанный протокол обеспечивает высокую чувствительность определения антигенов, которая не уступает чувствительности традиционных методов радиоиммунопреципитации и иммунопреципи-тации с использованием биотиновой метки Эффективность предложенного метода продемонстрирована на примере изучения более 30 различных мембранных белков лейкоцитов человека

3 Метод флуоресцентной иммунопреципитации совместим с последующим масс-спектрометрическим анализом

4 Показана возможность применения флуоресцентного иммунопрепитационного анализа в совокупности с лизисом клеток в мягких неионных детергентах для изучения надмолекулярных комплексов поверхностных антигенов

5. Изучены межмолекулярные комплексы, образуемые молекулой СБ4 Антиген СБ4 образует комплексы с другими белками на Т-клеточной линии СЕМ, но не на моноцитарной линии Ш37. На клетках СЕМ идентифицировано более 20 белков, ассоциированных с СБ4 Основными компонентами СБ4-комплекса являются тирозин-фосфатаза С045, рецептор трансферрина СР71, тирозин-киназа Ьск и лимфоцитар-ный фосфатазо-ассоциированный белок ЬРАР

6. Ассоциация между молекулами СЭ4, СЭ71 и С045 на клетках линии СЕМ подтверждена результатами иммуноблоттинга

7 Проведена количественная оценка состава СБ4-комплекса Обнаружено, что на две цепи трансферринового рецептора СЭ71 приходится две молекулы тирозин-фосфатазы СЭ45

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Крутикова М.П, Кротов Г И, Филатов А В Изучение транслокаций в липидные микродомены поверхностных рецепторов лейкоцитов человека при их лигировании антителами // Труды конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2005, С 14-17

2 A. Filatov, G Krotov, M Krutikova V Zgoda Fluorescent îmmuno-precipitation assay (FIPA) - a proteomic analysis of cell surface proteins // FEBS Journal, 2006, Vol 273, P 62-63

3 Кротов Г.И, Крутикова M П Протеомика липидных микродоменов (рафтов) // Труды 10-ой школы-конференции «Биология-наука XXI века», 2006, С 81

4 А V Filatov, GI Krotov, V G Zgoda, Y Volkov Fluorescent îm-munoprecipitation analysis of cell surface proteins A methodology compatible with mass-spectrometry // Journal of Immunological Methods, 2007, Vol 319, P 21-33

5 Крутикова M П, Кротов Г И, Згода В Г, Филатов А В Изучение липидных рафтов методом гельфильтрации с предварительным окрашиванием флуоресцентно-меченными антителами // Биологические мембраны, 2007, Том 24, №4, С 323-332

6 Кротов Г И , Крутикова M П, Згода В Г , Филатов А В Профилирование белков рецепторного комплекса молекулы CD4. // Биохимия (Москва), 2007, Том 72, Выпуск 11, С 1495-1505

7 Кротов Г И , Згода В Г, Родионов С В , Крутикова M П, Филатов А В Протеомный подход к определению специфичности антител направленных к поверхностным антигенам лимфоцитов // Иммунология, 2007, Том 28, №5, с 263-268

8 Кротов Г И, Крутикова M П, Филатов А В Протеомная характеристика мультимолекулярных комплексов молекулы CD4 // Российский аллергологический журнал, 2007, №3, приложение 1, С 25-26

9. Филатов А В , Кротов Г И, Крутикова M П, Згода В Г Протеомная характеристика межмолекулярных комплексов поверхностных рецепторов лимфоцитов человека // Труды III Российского симпозиума «Белки и пептиды», 2007, С 15

Подписано в печать 9.0 2.0 & г Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Заказ ? ? Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им Н Н Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш , 24

Актуальность темы диссертации

Хорошо известно, что во многих случаях белки выполняют свою функцию не самостоятельно, а при тесном взаимодействии с другими белками. Степень такого взаимодействия может быть различной. От кратковременной ассоциации до образования стабильных комплексов. Белковые комплексы контролируют многие клеточные процессы, начиная с транскрипции и заканчивая вирусной инфекцией.

Велико значение белок-белковых взаимодействий в иммунной системе. Распознавание чужеродного антигена, а также восприятие сигналов многочисленных лимфокинов происходит при участии соответствующих поверхностных рецепторов, представляющих собой комплексные структуры. Передача сигнала в цитоплазму лимфоцита также происходит с образование комплексов сигнальных молекул. Характеристика и идентификация белковых комплексов лимфоцитов человека имеет большое значение для понимания иммунных процессов, а знание состава и структуры этих комплексов дает информацию для направленной разработки новых фармакологических препаратов, контролирующих иммунный ответ.

Существует целый ряд методов, используемых для изучения белковых комплексов. Однако наиболее надежным методом доказательства существования белковых ассоциаций продолжает оставаться метод коиммунопреципитации, когда взаимодействующие белки выделяют из клеточного лизата с помощью иммобилизованных антител, распознающих эпитоп на одном из известных компонентов комплекса. Известны две модификации иммунопреципитации: более старая, использующая радиоактивную метку, а также более современная, в которой применяется биотиновая метка. Несмотря на широкую распространенность последнего метода, он имеет ряд недостатков, главный из которых состоит в его принципиальной несовместимости с масс-спектрометрическим анализом.

Это является очень серьезным недостатком, поскольку в эпоху бурного развития протеомики именно масс-спектрометрия становится решающим методом при идентификации различных белков.

В связи с этим представляется актуальным поиск и разработка новых подходов для детекции белков в продуктах иммунопреципитации, а также систематическое изучение белковых комплексов, образуемых поверхностными антигенами лимфоцитов человека.

Цель работы

Целью данной работы являлось изучение структуры и состава надмолекулярных комплексов поверхностных рецепторов лимфоцитов человека.

Задачи исследования

1. Поиск новых подходов для детекции белков, выделяемых методом иммунопреципитации. Разработка метода флуоресцентного иммунопреципитационного анализа.

2. Изучение совместимости флуоресцентного иммунопреципитационного анализа с последующей масс-спектрометрической идентификацией белков.

3. Оценка возможности использования метода флуоресцентного иммунопреципитационного анализа для выделения и изучения белковых комплексов поверхностных антигенов.

4. Выделение и масс-спектрометрическая идентификация белков, ассоциированных с молекулой СЭ4.

Научная новизна

Впервые в качестве альтернативы радиоизотопам и биотиновой метке для регистрации белков в иммунопреципитатах нами было предложено использовать ковалентные флуоресцентные красители. Показана совместимость предложенного метода с масс-спектрометрическим анализом.

Впервые проведено протеомное изучение комплекса мембранного белка СБ4. Определены основные партнеры молекулы СБ4 (СЭ45, СВ71, Ьск и ЬРАР). Впервые показана ассоциация С 1)4 с трансмембранным белком ЬРАР и белками цитоскелета. Сделана оценка количественного состава СБ4-комплекса.

Теоретическая и практическая значимость работы

Настоящая работа выполнена в рамках программы фундаментальных исследований. Научная значимость настоящего исследования заключается в разработке метода флуоресцентного иммунопреципитационного анализа. Предложенный метод позволяет детектировать как мембранные, так и внутриклеточные белки и проводить их последующую масс-спектрометрическую идентификацию. Метод также позволяет изучать белок-белковые комплексы, образуемые поверхностными клеточными антигенами и делать количественные оценки их состава.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Ковалентные флуоресцентные красители являются хорошей альтернативой использованию радиоизотопов и биотиновой метки при иммунопреципитации.

2. Иммунопреципитация с флуоресцентными красителями применима для изучения всех основных типов мембранных белков.

3. Иммунопреципитация с флуоресцентными красителями совместима с последующим масс-спектрометрическим анализом.

4. Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ в совокупности с лизисом клеток в мягких неионных детергентах применим для изучения надмолекулярных комплексов поверхностных антигенов клетки.

5. Разработанный метод позволяет оценивать стехиометрию белковых комплексов.

Публикации

Результаты исследований были представлены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, июнь 2005), на 31 -ом когрессе «РЕВБ» (Стамбул, Турция, июнь 2006), на VIII конгрессе РАКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, июнь 2007), на III российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, сентябрь 2007). Материалы диссертации изложены в 9 публикациях.

Выводы

1. Предложен и разработан оригинальный метод флуоресцентного иммунопрепитационного анализа, в котором белки в составе живых клеток ковалентно метят флуоресцентными красителями, клетки лизируют, интересующие антигены выделяют на специфических антителах, полученные белки разделяют электрофорезом и визуализируют флуоресцентным сканированием геля.

2. Разработанный протокол обеспечивает высокую чувствительность определения антигенов, которая не уступает чувствительности традиционных методов радиоиммунопреципитации и иммунопреципитации с использованием биотиновой метки. Эффективность предложенного метода продемонстрирована на примере изучения более 30 различных мембранных белков лейкоцитов человека.

3. Метод флуоресцентной иммунопреципитации совместим с последующим масс-спектрометрическим анализом.

4. Показана возможность применения флуоресцентного иммунопрепитационного анализа в совокупности с лизисом клеток в мягких неионных детергентах для изучения надмолекулярных комплексов поверхностных антигенов.

5. Изучены межмолекулярные комплексы, образуемые молекулой СБ4. Антиген СБ4 образует комплексы с другими белками на Т-клеточной линии СЕМ, но не на моноцитарной линии 11937. На клетках СЕМ идентифицировано более 20 белков, ассоциированных с СБ4. Основными компонентами СБ4-комплекса являются тирозин фосфатаза СБ45, рецептор трансферрина СБ71, тирозин киназа Ьск и лимфоцитарный фосфатазо-ассоциированный белок ЬРАР.

6. Ассоциация между молекулами СБ4, СБ71 и СБ45 на клетках линии СЕМ подтверждена результатами иммуноблоттинга.

7. Проведена количественная оценка состава С04-комплекса. Обнаружено, что на две цепи трансферринового рецептора СБ71 приходится две молекулы тирозин фосфатазы СБ45.