Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Характер и механизмы нарушений неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты при остром отравлении веществом BZ

На правах рукописи

СИДЕЛЬНИКОВА НАТАЛИЯ МИХАЙЛОВНА

ХАРАКТЕР И МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЙ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ ПРИ ОСТРОМ ОТРАВЛЕНИИ ВЕЩЕСТВОМ BZ

14.00.16 - Патологическая физиология 14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САРАТОВ-2004

Работа выполнена в Саратовском государственном медицинском университете и. в Саратовском военном институте радиационной, химической и биологической защиты.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Понукалина Е. В.

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Трошкин Н. М.

доктор медицинских наук, профессор Брилль Г. Е.

доктор медицинских наук, профессор Саяпина Л.В.

Ведущая организация:-Самарский государственный медицинский университет

Защита состоится « ^ »<3г. в » часов и а заседании диссертационного совета Д. 208.094.03 в Саратовском государственном медицинском университете по адресу: г. Саратов, Театральная площадь, 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Саратовского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан <<Я£»> 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук, доцент Бабиченко Н.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современной медицинской науке проблемы, комплексной оценки характера и механизмов нарушений неспецифической резистентности организма (НРО) и специфической иммунной защиты при остром токсическом действии опасных химических веществ приобрели первостепенное значение в связи с необходимостью патогенетического обоснования и разработки научных принципов, средств и методов, с помощью которых удается проводить эффективную медикаментозную коррекцию постинтоксикационного иммунодефицитного состояния после, интоксикации токсичными химикатами. Фундаментальными работами отечественных и зарубежных авторов создана обширная теоретическая база, основанная на экспериментальных и клинических исследованиях, раскрывающих патогенез формирования иммунодефицитных состояний при самых разнообразных патологических процессах, вызванных токсическим действием ксенобиотиков [Денисенко П.П., 1980; Петров Р.В. и соавт., 1981а; Саватеев Н.В., Куценко С.А., 1982,1993; Ройт А., 1991; Хаитов P.M. и соавт., 1995; Забродский П.Ф., 1998, 2002; Забродский П.Ф. и соавт., 2003; Descotes J., 1986; Luster M. J. et al., 1987; Sullivan J. В., 1989].

Поэтому исследование изменений иммунного гомеостаза под влиянием м-холиноблокаторов является актуальной и важной научно-практической задачей патофизиологии и иммунотоксикологии. Атропиноподобный синтетический м-холиноблокатор - 3-хинуклидилбензилат (вещество BZ), является психотропным боевым отравляющим веществом (БОВ) и подлежит уничтожению согласно « Конвенции...». Однако не исключена вероятность применения данного высокоактивного психотомиметика и его аналогов рядом стран в качестве основы химического оружия. Возможно также использование вещества BZ для совершения террористических актов. К настоящему времени в результате целенаправленного научного поиска синтезированы и прошли всестороннюю военно-химическую оценку ряд аналогов 3-хинуклидилбензилата, которые отличаются более выраженной специфической психотропной эффективностью и способностью проникать через кожные покровы [Сокольский Г.А и соавт. 1983; Антонов Н.С., 1994; Rosenblatt D.H. et al., 1977; Wills J.H., 1982]j КромялТОГОн

I библиотека j

! ж<

изучения 3-хинуклидилбензилата обусловлена тем, что м-холиноблокаторы широко исследуются и используются в качестве медикаментозных средств для антидотного лечения при интоксикации фосфорорганическими соединениями (ФОС) и другими ядами [Голиков С.Н., 1968; Саватеев Н.В., Куценко С.А., 1982, 1993; Забродский П.Ф., 1998, 2002]. Не исключено также и использование м-холиноблокаторов (атропиноподобных препаратов) в качестве наркотических средств [Крылов С.С. и соавт., 1999].

Известно, что острые интоксикации м-холиноблокаторами относятся к наиболее распространенным лекарственным отравлениям [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 1998, 2000]. Возможно чрезмерное использование м-холиноблокаторов при интоксикации ФОС легкой степени тяжести [Могуш Г., 1984; Бадюгин И.С. и соавт., 1992; Маркова И.В. и соавт., 1998], а также их применение с суицидальными целями.

Исследованиями многих авторов доказано, что при остром токсическом действии на организм м-холиноблокаторов; в частности при интоксикации 3-хинуклидилбензилатом; возможны резко выраженные изменения гуморального иммунного ответа и клеточных иммунных реакций, что может приводить после интоксикации в дальнейшем к развитию инфекционных и онкологических заболеваний [Забродский П. Ф., 1993, 1995, 1998, 2002; Хаитов P.M. и соавт., 2000; Трошкин Н.М. и соавт., 2004; Ferluga J. et al., 1972; Loose L.D., 1986; Miller К., 1985; Tiefenbach В., Wichner S., 1985; Descotes J., 1986; Luster M. J. et al., 1987; Kimber I., 1996]. Изучение иммунотропных свойств вещества BZ позволит расширить существующие представления о влиянии большой группы м-холиноблокаторов на НРО и иммунный статус [Трошкин Н.М. и соавт., 2004]. В то же время комплексное состояние НРО и специфических иммунологических механизмов защиты после интоксикации веществом BZ и его аналогами практически не изучены и по этому поводу имеются лишь отдельные сообщения.

Недостаточно изученными остаются вопросы фармакологической коррекции нарушений иммунного гомеостаза в постинтоксикационном периоде под влиянием м-холиноблокаторов, в том числе и вещества BZ. Эта проблема имеет важное теоретическое и практическое значение и нуждается во всестороннем исследовании для целенаправленной разработки научных основ медикаментозной коррекции нарушений системы иммунитета с

применением иммунокорректоров из большого арсенала известных сейчас веществ данного класса [Ширинский B.C., Жук Е.А., 1991; Хаитов Р. М. и соавт., 1995; Забродский П.Ф. и соавт., 2001].

Таким образом, исследование по изучению характера нарушений НРО и специфических иммунологических механизмов защиты при остром токсическом действии м-холиноблокаторов с целью разработки способов фармакологической коррекции изменений иммунного гомеостаза в постинтоксикационном периоде является актуальным и важным как в теоретическом, так и в практическом отношении.

Цель исследования: изучить характер и механизмы нарушений неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты в условиях острой интоксикации отравляющим веществом BZ и разработать патогенетически обоснованные принципы медикаментозной коррекции сдвигов иммунного гомеостаза.

Задачи исследования:

1. Оценить комплексное состояние неспецифической резистентности организма и специфических иммунных механизмов защиты у животных при экспериментальной инфекции после острой интоксикации веществом BZ по величине летальности животных, среднелетальной дозы P. vulgaris и среднеэффективному времени жизни животных.

2. Выявить закономерности острого действия вещества BZ на состояние неспецифической резистентности организма в условиях экспериментальной инфекции по величине летальности крыс, среднелетальной дозы Е. coli и среднеэффективному времени жизни животных.

3. Исследовать характер и механизмы острого действия вещества BZ на факторы неспецифической резистентности организма (показатели бактерицидной активности сыворотки крови, сывороточной активности лизоцима, тромбоцитарного катионного белка, комплемента и фагоцитарной активности нейтрофилов).

4. Установить характер нарушений специфических иммунных механизмов защиты организма при воздействии возрастающих доз вещества BZ по ряду интегральных показателей оценки функционального состояния центральных и периферических органов иммунной системы.

5. Изучить влияние возрастающих доз вещества Б/ на Т-зависимый гуморальный иммунный ответ в различные фазы антителогенеза (титр антител в крови, содержание антителообразующих клеток в селезенке ) и на кооперацию Т- и В-лимфоцитов.

6. Оценить состояние Т-независимого гуморального иммунного ответа в различные фазы антителопродукции по титру антител в крови и показателям содержания антителообразующих- клеток в селезенке при остром отравлении веществом Б/.

7. Определить характер нарушений клеточного звена иммунного ответа при острой интоксикации веществом Б/ по реакции торможения миграции лейкоцитов, формированию гиперчувствительности замедленного типа, антителозависимой клеточной цитотоксичности, активности естественных клеток-киллеров.

8. Провести обоснование и разработать патогенетически обоснованную коррекцию нарушений неспецифической резистентности организма и основных гуморальных и клеточных иммунных, реакций при остром отравлении веществом Б/ с использованием антидота аминостигмина и иммуномодуляторов.

Научная новизна. В результате проведенного исследования впервые показано, что под влиянием вещества Б/ в дозах 0,2; 0,5 и 0,7 ЛД50 происходит снижение комплексных показателей состояния неспецифической резистентности организма и специфических иммунологических механизмов защиты, которое проявляется дозозависимым увеличением летальности крыс от экспериментальной инфекции, а также уменьшением ЛД50 Р.уи^айз и Е. соН и среднеэффективного времени жизни животных.

Экспериментально показано, что при острой интоксикации веществом Б/ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 происходит дозозависимое снижение бактерицидной активности сыворотки крови, сывороточной активности лизоцима, содержания тромбоцитарного катионного белка, фагоцитарной активности нейтрофилов.

Установлен характер нарушений специфических иммунных механизмов защиты организма при воздействии возрастающих доз вещества Б/, связанных с функциональным состоянием центральных и периферических органов иммунной системы. Показано, что вещество Б/

вызывает дозозависимое снижение числа КОЕ в селезенке. Установлено снижение числа Т-лимфоцитов в тимусе в течение 1-2 сут в прямой зависимости от дозы вещества BZ. Количество лимфоцитов в селезенке-через 1 сут после действия вещества BZ прямо пропорционально дозе уменьшается. Через 2 сут доза вещества BZ, составляющая 0,5 ЛД50, приводила к увеличению содержания лимфоцитов в селезенке крыс, а доза вещества BZ 1,0 ЛД50 вызывала противоположный сдвиг показателя. Вещество BZ через 1 сут дозозависимо повышает количество лимфоцитов в костном мозге и вызывает снижение содержания этих клеток в лимфоузлах, а через 2 сут реализуются противоположные эффекты.

Доказано, что острое действие вещества BZ вызывает прямо связанную с дозой (0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50) редукцию антителообразования. Иммунотоксический эффект вещества BZ более выражен в индуктивной фазе антителогенеза при иммунизации Т-зависимым антигеном и в продуктивной фазе иммуногенеза при иммунизации Т-независимым антигеном. Под влиянием вещества BZ in vitro происходит прямо связанное с концентрацией снижение кооперации Т - и

В-лимфоцитов вследствие преимущественного нарушения функции Т-клеток.

Выявлено, что вещество BZ вызывает прямо связанное с дозой снижение функции Т-клеток и реакции гиперчувствительности замедленного типа, супрессию активности антителозависимой клеточной цитотоксичности преимущественно спленоцитов по сравнению с тимоцитами. Острое отравление веществом BZ (0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50) в прямой зависимости от дозы уменьшало активность естественных клеток-киллеров спленоцитов крыс до 6 сут. Действие вещества BZ in vitro в прямой зависимости от концентрации вызывало редукцию активности естественных клеток-

киллеров.

Впервые экспериментально показано, что коррекция нарушений показателей неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты при острой интоксикации веществом BZ (1,0 ЛД50) достигается комбинированным применением иммуностимулятора имунофана и антидота аминостигмина..

Практическая значимость работы заключается в экспериментальном определении при острой интоксикации веществом BZ показателей неспецифической резистентности организма, параметров системы гуморального и клеточного иммунитета, свидетельствующих о развитии постинтоксикационного иммунодефицитного состояния, которое требует применения медикаментозных средств для его фармакологической коррекции. Обосновано и экспериментально доказано, что при остром отравлении веществом BZ восстановление показателей неспецифической резистентности организма и системы иммунитета достигается применением иммуностимулятора имунофана (ежедневная доза 10 мкг/кг в течение 3 сут) в комбинации с антидотом аминостигмином (в первые сутки в дозе 0,1 мг/кг 2 раза).

Положения, выносимые на защиту

1. Острая интоксикация веществом BZ в условиях эксперимента на животных в дозах 0,2 - 1,0 ЛДзо вызывает, прямо связанную с дозой супрессию комплексных показателей, неспецифической резистентности организма и специфических иммунологических механизмов защиты, основных параметров гуморальных и клеточных иммунных реакций.

2. Острое действие вещества BZ вызывает дозозависимую редукцию антителообразования. Иммунотоксический эффект вещества BZ более выражен в индуктивной фазе антителогенеза при иммунизации Т-зависимым антигеном и в продуктивной фазе иммуногенеза при иммунизации Т-независимым антигеном.

3. Механизмы снижения специфической иммунной защиты при действии вещества BZ обусловлены снижением миграции колониеобразующих единиц в селезенку; изменением содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета в зависимости от воздействующей дозы и времени с момента интоксикации; нарушением кооперации Т - и В-лимфоцитов, приводящим к редукции антителообразования вследствие преимущественного поражения' Т-лимфоцитов; супрессией клеточных иммунных реакций.

4. Коррекция нарушений неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты после острой интоксикации веществом

Б/ достигается комбинированным применением аминостигмина и иммуностимулятора имунофана.

Апробация работы, публикации. Результаты исследований были доложены на заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и уничтожения химического оружия Поволжского отделения АВН (март 2002 г., февраль 2003 г., апрель 2004 г.), на Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (СПб, май 2004 г.), юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы корабельной токсикологии, радиологии, обитаемости кораблей и медицинского обеспечения личного состава ВМФ» (СПб, май 2004 г.), научно-практических конференциях Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты (2002, 2003, 2004 гг.), совместном заседании кафедры нормальной физиологии, кафедры патологической физиологии Саратовского государственного медицинского университета, кафедры технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты, кафедры токсикологии, радиологии и медицинской защиты Саратовского военно-медицинского института (май 2004 г.).

По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований и практические рекомендации внедрены в учебный процесс на кафедре технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты и на кафедре токсикологии, радиологии и медицинской защиты Саратовского военно-медицинского института. Материалы исследований широко используются при проведении лекций, практических и лабораторных занятий у курсантов и слушателей курсов повышения квалификации, первичной специализации и усовершенствования врачей. По материалам диссертации издано учебное пособие «Основы токсикологии».

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 168 страницах машинописного текста (включая таблицы и список литературы),

состоит из обзора литературы (глава 1); материалов и методов исследований (глава 2), собственных экспериментальных исследований (главы 3-7); заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 33 таблицами Список литературы включает 241 наименование, из которых отечественных - 166 и зарубежных - 75

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследований

Исследования проводились на 1088 беспородных крысах и на 84 беспородных белых мышах обоего пола в равных соотношениях с массой тела соответственно 180-260 г и 18-24 г. Эксперименты на животных проводили в соответствии с требованиями Женевской конвенции «International Guiding Principles for Biomedical Research Inroling Animals» (Geneva, 1990)

Вещество BZ растворяли в 0,1 н. растворе НС1. Далее водные рабочие растворы вещества BZ вводили внутримышечно в дозах 0,2; 0,5 и (0,7) 1,0 ЛД50. Среднелетальные дозы вещества BZ для крыс и мышей при внутримышечном введении составляли соответственно и

мг/кг.

В качестве иммуностимулятора использовали имунофан, который вводили в дозе 10 мкг/кг внутримышечно ежедневно в течение 3 сут. Первую дозу животные получали через 30 мин после острой интоксикации с применением и без применения антидотного средства (аминостигмина). Аминостигмин применяли внутрибрюшинно в дозе 0,1 мг/кг 2 раза в первые сутки.

Кровь для исследования факторов НРО и титра антител в динамике забирали из подъязычной вены животных. Органы системы иммунитета (тимус, селезенку, лимфоузлы, клетки костного мозга) извлекали у животных после цервикальной дислокации.

Комплексную оценку антиинфекционной неспецифической резистентности организма без предварительной иммунизации, а также НРО в сочетании со специфическими иммунологическими механизмами защиты с предварительной иммунизацией определяли по летальности крыс от

экспериментальной инфекции, по среднелетальной дозе соответственно Е. coli (перитонит) и P.vulgaris (пневмония) и среднеэффективному времени жизни крыс (Etjo) в опытной и контрольной группах [Забродский П. Ф., 1987], рассчитанных методом пробит-анализа [Беленький М.Л., 1963]. Факторы НРО - бактерицидную активность сыворотки крови (БАСК), содержание лизоцима, активность комплемента и тромбоцитарного катионного белка (ТКБ) в крови определяли общепринятыми методами, а фагоцитарную активность нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием [Гембицкий Е.В. и соавт., 1987]. Влияние вещества BZ на обсемененность селезенки и циркулирующей крови крыс проводили общепринятыми методами [Ремезов А. И., Башмаков Г. А. , 1976] после внутрибрюшинного введения Е. coli в дозе 2,0 млрд микробных тел. Суспензию Е. coli вводили через 30 мин после применения вещества BZ. Селезенку и кровь брали у животных через 24 ч.

Влияние вещества BZ на функцию стволовых кроветворных клеток (СКК) проводили путем определения миграции колониеобразующих единиц в селезенку (КОЕс) из костного мозга (КМ) методом эндогенного колониеобразования [Till J. E., Me Culloch E. А., 1961; Петров Р.В., Хаитов P.M., 1972]. Вещество BZ вводили через 30 мин после облучения животных.

Лимфоциты в органах системы иммунитета подсчитывали исходя из их относительного содержания в окрашенных мазках исследуемого органа.

Исследование показателей Т-зависимого и Т-независимого гуморального иммунного ответа проводили у крыс по отрицательному двоичному логарифму титра антител (ОДЛТА) к эритроцитам барана (ЭБ) и Vi-антигену (Vi-Ag) в периферической крови через 5, 8 и 11 сут после иммунизации соответственно ЭБ и Vi-Ag, а также через 5 сут по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке [Jerae N. К., Nordin А. А., 1963]. Иммунизацию проводили ЭБ клеток) и Vi-Ag (8 мкг/кг) при

изучении действия вещества BZ в индуктивную фазу гуморального иммунного ответа одновременно с их введением, а в продуктивную - после введения вещества BZ через 3 сут после иммунизации. Изучение кооперации Т- и В- лимфоцитов in vitro под влиянием вещества BZ для оценки роли Т- и В-лимфоцитов в обеспечении антителопродукции проводили по методу J. К. Thomas, T. Imamura (1986).

Изучение состояния клеточного звена системы иммунитета после действия вещества BZ проводилось путем определения функции Т-лимфоцитов по секреции ими фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов [Гембицкий Е.В. и соавт., 1987], реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и показателя антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) [Зимин Ю.И., Ляхов В.Ф., 1985]. Оценка активности естественных клеток-киллеров (ЕКК) проводилась в условиях in vivo и in vitro спектрофотометрическим методом [Гордиенко С. М., 1984].

Полученные данные обрабатывались с использованием общепринятых статистических методов [Урбах В.Ю., 1975]. Расчеты проводились на ЭВМ с использованием пакета программ Statgraphics.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние вещества BZ на комплексные показатели специфических

иммунологических механизмов защиты и неспецифическую резистентность организма

В результате проведенных экспериментов установлено, что под влиянием вещества BZ в дозах 0,2; 0,5 и 0,7 ЛД50 происходит прямо связанное с дозой увеличение летальности крыс от экспериментальной пневмонии (после предварительной иммунизации), уменьшение ЛД50 P.vulgaris и Et50, что свидетельствует о редукции комплексного состояния неспецифической резистентности организма и специфических иммунологических механизмов защиты. Острое отравление веществом BZ приводит к дозозависимому увеличению летальности крыс от экспериментальной инфекции, статистически значимому при дозе вещества BZ, составляющей 0,7 ЛД50 (р<0,05), существенному снижению ЛД50 Е. coli и Etjo при дозах вещества BZ 0,5 и 0,7 ЛД50 .Под влиянием вещества BZ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 происходит прямо связанное с дозой увеличение содержания числа микробных тел Е. coli в циркулирующей крови и селезенке крыс после их введения по сравнению с контролем. Полученные данные свидетельствуют о снижении комплексной неспецифической резистентности организма.

Исследование БАСК у крыс под влиянием вещества BZ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 показало, что острая интоксикация приводит к редукции БАСК через 1-3 сут после отравления в дозах 0,5 и 1,0 ЛД50 (р<0,05). На 5/сут отмечалась тенденция к снижению БАСК, а на 7 сут происходило полное восстановление показателя. Так, через 1, 3, 5 сут после введения вещества BZ в дозе 1,0 ЛД50 БАСК уменьшалась соответственно в 1,27; 1,19 и 1,10 раза В дозе 0,2 ЛД50 вещество BZ существенного уменьшения БАСК по сравнению с контролем не вызывает.

Проведенные эксперименты показали, что острая интоксикация веществом BZ в дозе 0,2 ЛД50 существенно не влияет на активность лизоцима в крови. В дозах 0,5 и 1,0 ЛД50 вещество BZ приводит к снижению показателя соответственно через 1 и 1-3 сут. Так, через 1 и 3 сут после введения вещества BZ в дозе 1,0 ЛД50 активность лизоцима уменьшалась соответственно в 1,78 и 1,64 раза (р<0,05). На 5 сут сохранялась тенденция к снижению активности лизоцима (р>0,05) при действии вещества BZ в дозах 0,5 и 1,0 ЛД50. На 7 сут активность лизоцима восстанавливалась.

Нами установлено, что острая интоксикация веществом BZ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 вызывает прямо связанное с дозой снижение активности ТКБ через 1-3 сут. Статистически значимое уменьшение параметра отмечалось при дозе вещества BZ, составляющей 1,0 ЛД50, через 1 сут. Через 5 сут активность ТКБ восстанавливалась до контрольного уровня.

Наши исследования показали, что под влиянием вещества BZ в дозе 1,0 происходит незначительное снижение содержания комплемента в сыворотке крови крыс через 1-3 сут после интоксикации.

Экспериментально установлено, что под влиянием вещества BZ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 происходит дозозависимое снижение фагоцитарной активности нейтрофилов через 1-3 сут. Статистически значимые изменения отмечались при действии вещества BZ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 соответственно через 1 и 1-3 сут. Так, при дозах вещества BZ 0,2 и 0,5 ЛДя через 1 сут индекс активности нейтрофилов снижался в 1,24 и 1,35 раза (р<0,05). Показатель при дозе вещества BZ, составляющей 1,0 ЛД50, через 1 и 3 сут уменьшался соответственно в 1,64 и 1,20 раза (р<0,05). На 5-7 сут фагоцитарная активность нейтрофилов практически полностью восстанавливалась.

Таким образом, под влиянием острой интоксикации веществом Б/ происходит прямо связанное с дозой снижение НРО, редукция комплексного состояния неспецифической резистентности организма и специфических иммунологических механизмов защиты, основных факторов НРО - БАСК, сывороточной активности лизоцима, ТКБ, комплемента, фагоцитарной активности нейтрофилов.

Острое действие вещества Б/ на содержание лимфоцитов в органах системы иммунитета

Наши исследования показали, что под влиянием вещества Б/ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 происходит дозозависимое снижение числа КОЕс. Так, вещество Б/ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 снижало содержание КОЕс соответственно в 1,61 (р>0,05), 2,38 и 2,90 раза (р<0,05).

При исследовании числа Т-лимфоцитов в тимусе под влиянием вещества Б/ установлено, что в дозе 0,2 ЛД50 вещество Б/ через 1-2 сут после введения практически не влияет на содержание клеток в этом органе системы иммунитета. Статистически достоверное увеличение показателя (р<0,05) происходило при действии вещества Б/ в дозе 0,5 ЛД50 через 1 сут в 1,36, а через 2 сут число Т-лимфоцитов в тимусе достоверно снижалось в 1,43 раза. В дозе 1,0 ЛД50 острая интоксикация веществом Б/ приводила к достоверному снижению числа Т-лимфоцитов в тимусе через 12 сут соответственно в 1,31 и 1,26 раза. Восстановление показателя до контрольного уровня отмечалось при всех использованных дозах 3-хинуклидилбензилата через 4 сут. Аналогично изменялось содержание лимфоцитов в селезенке.

В ходе экспериментов установлено, что вещество Б/ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД51) через 1 сут после его введения повышало содержание лимфоцитов в костном мозге соответственно в 1,06; 1,14 (р>0,05) и 1,24 раза (р<0,05). В лимфоузлах вещество Б/ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 через 1 сут после острого воздействия уменьшало количество лимфоцитов в 1,25 (р>0,05), 1,67 и 2,14 раза соответственно (р<0,05). Через 2 сут вещество Б/ вызывало прямо связанное с дозой снижение лимфоцитов в костном мозге и увеличение их содержания в лимфоузлах. Так, в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 вещество Б/

уменьшало содержание лимфоцитов в костном мозге соответственно в 1,09 (р>0,05), 1,23 и 1,35 раза (р<0,05). В лимфоузлах вещество BZ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 через 2 сут увеличивало число лимфоцитов в 1,15 (р>0,05), 1,31 и 1,54 раза (р<0,05) соответственно. Через 3 сут после введения вещества BZ содержание лимфоцитов в костном мозге и лимфоузлах восстанавливалось до контрольного уровня.

Вероятно, снижение миграции лимфоцитов из костного мозга и тимуса под влиянием вещества BZ приводит к уменьшению их числа в лимфоузлах [Петров Р В. и соавт., 1972, 1981; Петров Р.В, 1987; Хаитов P.M. и соавт., 2000]. Наши экспериментальные исследования свидетельствуют, что после прекращения действия вещества BZ эффекты, обусловленные ацетилхолином в синапсах нервных окончаний холинергической системы, иннервирующей КМ и лимфоузлы, временно усиливаются.

Влияние вещества BZ на В-звено системы иммунитета

При изучении содержания антителообразующих клеток (АОК) в селезенке к ЭБ у крыс после острой интоксикации веществом BZ в дозах. 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 через 5 сут после иммунизации в индуктивной и продуктивной фазах антителогенеза было установлено (таблица 1), что под влиянием вещества BZ отмечается дозозависимая редукция синтеза IgM, о чем свидетельствовало снижение числа АОК в селезенке животных.

Таблица 1

Влияние вещества BZ на число АОК к ЭБ (103), синтезирующих IgM,

в селезенке крыс через 5 сут после иммунизации ЭБ (M±m,n=5-8)

Доза, ЛД50 Время интоксикации после иммунизации, сут

0 3

Контроль 38,5+3,1

0,2 27,6+3,0* 31Д±3,2

0,5 23,6+2,8* 27,9+2,5*

1,0 19,9+2,9* 23,5+2,6*

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем.

При введении вещества BZ в дозах 0,2, 0,5 и 1,0 ЛД50 одновременно с иммунизацией число АОК к ЭБ в селезенке крыс снижалось соответственно в 1,39, 1,63 и 1,93 раза (р<0,05), а при введении вещества BZ через 3 сут после иммунизации ЭБ - соответственно в 1,24 (р>0,05), 1,38 и 1,64 раза (р<0,05) В среднем в индуктивном и продуктивном периоде антителогенеза при действии различных доз вещества BZ число АОК к ЭБ в селезенке крыс уменьшалось соответственно в 1,69 и 1,42 раза

Результаты свидетельствуют о снижении под влиянием вещества BZ функции ТЫ-лимфоцитов, индуцирующих синтез IgM [Pfeifer С. et al, 1991] плазмоцитами селезенки, в большей степени в индуктивной фазе антителогенеза по сравнению с продуктивной

В проведенных нами экспериментах установлено, что при введении вещества BZ в дозах 0,2, 0,5 и 1,0 одновременно с иммунизацией

(оценка в индуктивной фазе антителогенеза) число АОК к Vi-Ag в селезенке крыс снижалось соответственно в 1,15; 1,27 и 1,46 раза (р<0,05), а при введении 3-хинуклидилбензилата через 3 сут после иммунизации Vi-Ag (оценка в продуктивной фазе антителогенеза) - соответственно в 1,26 (р>0,05), 1,51 и 1,76 раза (р<0,05) В среднем в индуктивном и продуктивном периоде антителогенеза при действии различных доз вещества BZ число АОК к Vi-Ag в селезенке уменьшалось соответственно в 1,29 и 1,51 раза.

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что снижение под влиянием вещества BZ при иммунизации Т-независимым антигеном функции В-лимфоцитов, продуцирующих IgM [Ройт А. и соавт., 2000], характерно в большей степени в продуктивной фазе антителогенеза по сравнению с индуктивной

Нами показано, что вещество BZ in vitro в концентрациях 105, 104 и 10"3 М уменьшает функцию В-клеток в кооперации с Т-лимфоцитами соответственно в 1,16 (р>0,05), 1,32 и 1,70 раза (р<0,05), а функцию Т-клеток - в 1,46, 2,20 и 3,01 (р<0,05) раза соответственно

Таким образом, острое действие вещества BZ вызывает прямо связанную с дозой (0,2, 0,5 и 1,0 ЛД50) редукцию антителообразования Токсический эффект более выражен в индуктивной фазе антителогенеза при иммунизации Т-зависимым антигеном и в продуктивной фазе иммуногенеза при иммунизации Т-независимым антигеном.

Действие вещества BZ на клеточное звено системы иммунитета

В наших исследованиях установлено, что вещество Б/ вызывает дозозависимое снижение функции Т-лимфоцитов у крыс через 1 и 2 сут. Так, при дозах вещества Б/ 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 отмечалось увеличение реакции торможения миграции лейкоцитов (снижение функции Т-клеток) через 1 сут соответственно на 9,0 (р>0,05), 18,8 и 20,9% (р<0,05), а через 2 сут - на 8,1; 12,9 (р>0,05) и 18,8% (р<0,05) соответственно. Через 6 сут функция Т-клеток, оцениваемая по РТМЛ, полностью восстанавливалась.

Исследование реакции ГЗТ при остром действии вещества Б/ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 в экспериментах на крысах выявило редукцию формирования ГЗТ соответственно в 1,35; 1,51 и 1,90 раза (р<0,05).

Нами установлено (таблица 2), что при интоксикации веществом Б/ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 АЗКЦ спленоцитов дозозависимо снижалась через 5 сут после иммунизации ЭБ соответственно в 1,38; 1,88 и 2,76 раза (р<0,05) Отмечалась связанная с дозой редукция АЗКЦ тимоцитов через 5 сут после иммунизации ЭБ соответственно в 1,25 (р>0,05), 1,60 и 2,37 раза (р<0,05)

Таблица 2

Влияние вещества Б/ на АЗКЦ через 5 сут после иммунизации, %

ПМ6-Й)

Доза, ЛД5о К-клетки селезенки К-клетки тимуса

Контроль 15,2+1,2 9,0+1,0

0,2 11,0+1,1* 7,2+1,3

0,5 8,1±1,4* 5,6+1,2*

1,0 5,5±1,0* 3,8+0,6*

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем.

Экспериментально показано, что вещество Б/ (0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50) в прямой зависимости от дозы уменьшает активность ЕКК. Так, острое отравление веществом Б/ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 через 1 сут вызывает супрессию функции ЕКК соответственно в 1,59; 2,45 и 2,98 раза (р<0,05), а через 3 сут - соответственно в 1,36 (р>0,05), 1,72 и 1,93 раза (р<0,05). Через

6 сут происходило полное восстановление ЕЦ при дозе 0,2 ЛД50 и частичное восстановление активности ЕКК при дозах 0,5 и 1,0 ЛД50 (р>0,05).

В опытах in vitro нами установлено, что при концентрациях вещества BZ, составляющих 10 s, 104 и 10"3 М, происходит уменьшение активности ЕКК соответственно в 1,35; 2,13 и 3,74 раза (р<0,05).

Коррекция нарушений неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты при остром отравлении

веществом BZ

Нами установлено, что для снижения иммуносупрессивных эффектов может быть использован антидот вещества BZ аминостигмин, который, ингибируя ацетилхолинэстеразу, вызывает накопление ацетилхолина в синапсах холинергических структур лимфоидных органов. При этом вполне обоснованно можно ожидать иммунопротективного действия обратимого ингибитора холинэстеразы аминостигмина (АС). Кроме того, применение АС в комбинации с имунофаном может полностью восстановить нарушения НРО и иммунного гомеостаза, вызванные острым отравлением веществом BZ [Михайлова М.Н. и соавт., 2003; Забродский П.Ф., 2003,2004].

Установлено, что под влиянием вещества BZ происходило увеличение летальности крыс от экспериментального перитонита, снижение ЛД50 E.coli и а использование АС в качестве антидота статистически значимо (р<0,05) снижало супрессию данных показателей. При использовании АС после отравления крыс веществом BZ в дозе 1,0 через 3 сут отмечалось существенное уменьшение БАСК и сывороточного содержания лизоцима, достоверное повышение индекса активности нейтрофилов в НСТ-тесте, обсеменен кости периферической крови и селезенки Е. coli по сравнению с показателями при остром отравлении (р<0,05). При этом восстановления до контрольных значений сниженных действием вещества BZ показателей НРО не происходило (р>0,05). Применение АС в комбинации с имунофаном приводило к полному восстановлению показателей НРО.

Нами установлено, что применение АС или имунофана частично восстанавливает гуморальный иммунный ответ к Т-зависимому и Т-независимому антигенам при остром отравлении веществом Б/. Так, интоксикация веществом Б/ снижала число АОК к ЭБ в селезенке крыс в 1,93 раза (р<0,05), а применение АС и имунофана приводило к увеличению показателя соответственно в 1,31 и 1,33 раза. При этом он оставался ниже контрольного уровня (р<0,05). Комбинированное использование АС и имунофана полностью восстанавливало Т-зависимое и Т-независимое антителообразование.

Нами установлено (таблица 3), что применение только АС или имунофана частично восстанавливает основные показатели клеточного звена иммунитета при острой интоксикации веществом Б/. Так, по сравнению с контролем острая интоксикация веществом Б/ снижала реакцию ГЗТ, ЕЦ и АЗКЦ соответственно в 2,09; 2,08 и 2,15 раза (р<0,05).

Таблица 3

Влияние имунофана и аминостигмина на основные показатели клеточного иммунитета после острого отравления веществом BZ в дозе 1,0 ЛД» (M±m, n=7-12)

Препараты Реакция ГЗТ, % ЕЦ, % АЗКЦ, %

Контроль 33,5+2,0 32,1+3,1 12,5 ±1,4

BZ 16,0+2,1* 15,4+3,4* 5,8+1,3*

BZ +аминостигмин 25,8 + 1,9* 23,2 ±2,8* 8,7 ±1,0*

BZ +имунофан 26,0 ±1,8* 25,9 ±2,6 9,0 ±0,9*

BZ +аминостигмин +имунофан 35,3+2,2 34,3± 3,3 14,0 ±1,5

Примечание: ЕЦ определяли в конце 3-х сут после отравления веществом В1, * - р<0,05 по сравнению с контролем.

Экспериментально показано, что использование только АС или имунофана приводило к уменьшению реакции ГЗТ по сравнению с контролем собтветственно в 1,30 и 1,29 раза (р<0,05), при применении этих же препаратов ЕЦ оставалась сниженной по сравнению с. параметрами контрольной группы соответственно в 1,38 (р<0,05) и 1,25 раза (р>0,05). АС

и имунофан при их изолированном использовании сохраняли редукцию. АЗКЦ по сравнению с показателями в контроле соответственно в 1,44 и 1,39 раза (р<0,05). Комбинированное воздействие АС и имунофана полностью восстанавливало основные показатели клеточного иммунитета после острого отравления веществом BZ в дозе 1,0 ЛД50

Таким образом, после острого отравления веществом BZ в дозе 1,0 ЛД50 использование имунофана (10 мкг/кг ежедневно в течение 3 сут) в комбинации с аминостигмином (в дозе 0,1 мг/кг 2 раза в первые сутки) восстанавливало основные показатели НРО, гуморального и клеточного звена иммунитета.

Выводы

1. Острая интоксикация веществом BZ в дозах 0,2; 0,5; 0,7 и 1,0 ЛД5о в условиях эксперимента на животных вызывает снижение неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты у животных при экспериментальной инфекции, редукцию основных гуморальных и клеточных иммунных реакций. Коррекция нарушений неспецифической резистентности организма и иммунного статуса при острой интоксикации веществом BZ достигается комбинированным применением антидота аминостигмина и иммуностимулятора имунофана.

2. Вещество BZ при остром действии вызывает прямо связанное с дозой увеличение летальности крыс от экспериментальной инфекции, вызванной Е. тоН, уменьшение ЛД50 Е. тоН и среднеэффективного времени жизни животных, а также аналогичные изменения данных параметров при использовании P.vulgaris после предварительной иммунизации, что свидетельствует о снижении неспецифической резистентности организма и специфических иммунных механизмов защиты.

3. При острой интоксикации веществом BZ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛДзо происходит дозозависимое снижение бактерицидной активности сыворотки крови, сывороточной активности лизоцима, тромбоцитарного катионного белка и фагоцитарной активности нейтрофилов в течение 1-5 сут.

4. Характер нарушения специфических иммунных механизмов защиты при воздействии возрастающих доз вещества BZ определяется

дозозависимым снижением числа колониеобразующих единиц в селезенке, фазовыми изменениями лимфоидного индекса тимуса и селезенки, содержания лимфоцитов в тимусе, селезенке, костном мозге и лимфоузлах в разные сроки интоксикации.

5. Острое действие вещества BZ вызывает прямо связанную с дозой редукцию антителообразования. Иммунотоксичность вещества BZ более выражена в индуктивной фазе антителогенеза при иммунизации Т-зависимым антигеном и в продуктивной фазе иммуногенеза при иммунизации Т-независимым антигеном. Под влиянием вещества BZ in vitro происходит прямо связанное с концентрацией

снижение кооперации Т- и В-лимфоцитов вследствие преимущественного нарушения функции Т-клеток.

6. Острое отравление веществом BZ приводит к дозозависимому снижению функции Т-клеток и активности естественных клеток-киллеров; реакции гиперчувствительности замедленного типа, антителозависимой. клеточной цитотоксичности преимущественно спленоцитов по сравнению с тимоцитами.Действие вещества BZ in vitro в прямой зависимости от концентрации снижает активность естественных клеток-киллеров.

7. Коррекция нарушений неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты при острой интоксикации веществом BZ в среднелетальной дозе достигается патогенетически обоснованным применением иммуностимулятора имунофана в комбинации с антидотом аминостигмином.

Практические рекомендации

1. В эксперименте на животных наиболее информативными тестами для оценки иммунотоксичности вещества BZ являются: определение содержания лимфоцитов в тимусе и селезенке, числа антителообразующих клеток в селезенке в различные фазы иммуногенеза, эффекта кооперации Ти В-лимфоцитов in vitro, реакции гиперчувствительности замедленного типа, активности естественных клеток-киллеров, антителозависимой клеточной цитотоксичности спленоцитов.

2. После острой интоксикации веществом Б/ возникает дозозависимая супрессия неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты, требующая применения медикаментозных средств для ее устранения с целью профилактики и лечения возможных инфекционных осложнений и заболеваний.

3. После острого отравления веществом Б/ для восстановления основных показателей неспецифической резистентности организма, гуморальных и клеточных иммунных реакций целесообразно применение алиностигмина в комбинации с имунофаном.

Основные публикации по теме диссертации

1. Сидельникова Н.М. Модуляция антидотами влияния опасных токсических веществ на неспецифическую резистентность организма / Н.М. Сидельникова, П.Ф. Забродский, Е.В. Понукалина: Научный отчет о НИР № 99. - Саратов, СВИ РХБЗ, 2003. - 95 с.

2. Сидельникова Н.М. Фармакологическая коррекция нарушений иммунного гомеостаза под влиянием вещества Би-зэд в постинтоксикационном периоде / Н.М. Сидельникова, Н.М. Трошкин, В.Г. Германчук: Научный отчет о НИР № 101.-Саратов, СВИ РХБЗ, 2004. -74 с.

3. Сидельникова Н.М. Влияние острой интоксикации ипритом и

веществом Би-зэд на неспецифическую резистентность организма / Н.М. Сидельникова, Н.М. Трошкин// Актуальные вопросы военной

медицины: Сб. науч. раб. под общ. ред. В.А. Решетникова. - Сарат. воен.-

мед. ин-т, Саратов, 2003. - С.119-121.

4.Сидельникова Н М. Изменение основных гуморальных и клеточных иммунных реакций при острой интоксикации серным ипритом и веществом Би-зэд / Н.М. Сидельникова, Н.М. Трошкин // Актуальные вопросы военной медицины: Сб. науч. раб. под общ. ред. В.А. Решетникова. - Сарат. воен.-

мед. ин-т, Саратов, 2003. - С.121-123.

5. Сидельникова Н.М. Иммунотоксические свойства вещества Б/ / Н.М. Сидельникова, П Ф. Забродский, Н.М. Трошкин // Медико-

биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты: Материалы Российской научной конференции. - СПб, 2004. - С. 55.

6. Сидельникова Н.М. Иммуномодулирующий эффект антидотов при нарушениях иммунного статуса различными ксенобиотиками / Н.М. Сидельникова, В.Г. Германчук, П.Ф. Забродский // Актуальные вопросы корабельной токсикологии,- радиологии, обитаемости кораблей и медицинского обеспечения личного состава ВМФ: Материалы юбилейной научно-практической конференции. - СПб, 2004. - С. 61.

7. Сидельникова Н.М. Изменение антиинфекционной неспецифической и иммунологической резистентности организма при-отравлении веществом Би-зэд / Н.М. Сидельникова, Н.М.Трошкин//Сб. науч. тр. СВИ РХБЗ. - Саратов, 2004.- Вып. №4. - С. 121.

8. Сидельникова Н.М. Влияние аминостигмина на изменение иммунотоксичности вещества Би-зэд / Н.М. Сидельникова, П.Ф. Забродский, Н.М. Трошкин // Сб. науч. тр. СВИ РХБЗ. - Саратов, 2004. -Вып. №4. -С.122.

9. Сидельникова Н.М. Оценка совместного действия аминостигмина и имунофана на основные параметры клеточного иммунитета при отравлении веществом Би-зэд / Н.М. Сидельникова, Н.М. Трошкин, С.М. Меркина//Сб. науч. тр. СВИ РХБЗ. - Саратов, 2004. - Вып. №4. - С.125.

10. Сиделъникова Н.М. Оценка неспецифических факторов защиты организма при интоксикации веществом Би-зэд / Н.М.Сидельникова, П.Ф. Забродский, Н.М. Трошкин // Сб. науч. тр. СВИ РХБЗ. - Саратов, 2004. -Вып.№4.-С147.

11. Сидельникова Н.М. Оценка влияния острой интоксикации веществом Би-зэд на Т-систему иммунитета / Н.М.Сидельникова, П.Ф.Забродский, Н.М.Трошкин//Сб.науч. тр. СВИ РХБЗ. - Саратов, 2004.-Вып.№4.-С.182-185.

Перечень сокращений

АЗКЦ АОК

- антителозависимая клеточная цитотоксичность

- антителообразующие клетки

»13384

АС - аминостигмин

БАСК - бактерицидная активность сыворотки крови

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ЕКК - естественные клетки-киллеры

ЕЦ - естественная цитотоксичность

КОЕс - колониеобразующая единица селезенки

КМ - костный мозг

НРО - неспецифическая резистентность организма

РТМЛ - реакция торможения миграции лейкоцитов

СКК - стволовая кроветворная клетка

ТКБ - тромбоцитарный катионный белок

ЭБ - эритроциты барана

ЛД50 - средняя смертельная доза

^ - иммуноглобулин

Ейо - среднеэффективное время жизни

ТЫ, ТЬ2 - Т-лимфоциты- хелперы типа 1,2

Уьантиген - тимуснезависимый Уьантиген брюшнотифозной

(УьА^ вакцины

Лицензия ИД № 06268 от 14.11.01

Подписано в печать 16.06.04 Формат 60x84 1/16

Бум. тип. Усл.-печ.л. 1,0 Уч.-изд. л. 1,0

Тираж 100 экз. Заказ 280 Бесплатно

Саратовский государственный технический университет 410054, г. Саратов, ул. Политехническая, 77 Копипринтер СГТУ, 410054, г. Саратов, ул. Политехническая, 77

Актуальность темы. В современной медицинской науке проблемы комплексной оценки характера и механизмов нарушений неспецифической резистентности организма (НРО) и специфической иммунной защиты при остром токсическом действии опасных химических веществ (ОХВ) приобрели первостепенное значение в связи с необходимостью патогенетического обоснования и разработки научных принципов, средств и методов, с помощью которых удается проводить эффективную медикаментозную коррекцию постинтоксикационного иммунодефицитного состояния после интоксикации токсичными химикатами. Фундаментальными работами отечественных и зарубежных авторов создана обширная теоретическая база, основанная на экспериментальных и клинических исследованиях, раскрывающих патогенез формирования иммунодефицитных состояний при самых разнообразных патологических процессах, вызванных токсическим действием ксенобиотиков [Денисенко П.П., 1980; Петров Р.В. и соавт., 1981а; Саватеев Н.В., Куценко С.А., 1982, 1993; Ройт А., 1991; Хаитов P.M. и соавт., 1995; Забродский П.Ф., 1998, 2002; Забродский П.Ф. и соавт., 2003; Descotes J., 1986; Luster М. J. et al., 1987; Sullivan J. В., 1989].

Поэтому исследование изменений иммунного гомеостаза под влиянием м-холиноблокаторов является актуальной и важной научно-практической задачей патофизиологии и иммунотоксикологии. Атропиноподобный синтетический м-холиноблокатор - 3-хинуклидилбензилат (вещество BZ), является психотропным боевым отравляющим веществом (БОВ) и подлежит уничтожению согласно « Конвенции.». Однако не исключена вероятность применения данного высокоактивного психотомиметика и его аналогов рядом стран в качестве основы химического оружия. Возможно также использование вещества BZ для совершения террористических актов. К настоящему времени в результате целенаправленного научного поиска синтезированы и прошли всестороннюю военно-химическую оценку ряд аналогов З-хинуклидилбензилата, которые отличаются более выраженной специфической психотропной эффективностью и способностью проникать через кожные покровы [Сокольский Г.А. и соавт. 1983; Антонов Н.С., 1994; Rosenblatt D.H. et al., 1977; Wills J.H., 1982]. Кроме того, актуальность изучения З-хинуклидилбензилата обусловлена тем, что м-холиноблокаторы широко исследуются и используются в качестве медикаментозных средств для антидотного лечения при интоксикации фосфорорганическими соединениями (ФОС) и другими ядами [Голиков С.Н., 1968; Саватеев Н.В., Куценко С.А., 1982, 1993; Забродский П.Ф., 1998, 2002]. Не исключено также и использование м-холиноблокаторов (атропиноподобных препаратов) в качестве наркотических средств [Крылов С.С. и соавт., 1999].

Известно, что острые интоксикации м-холиноблокаторами относятся к наиболее распространенным лекарственным отравлениям [Лужников Е.А., Костомарова JI.Г., 1998, 2000]. Возможно чрезмерное использование м-холиноблокаторов при интоксикации ФОС легкой степени тяжести [Могут Г., 1984; Бадюгин И.С. и соавт., 1992; Маркова И.В. и соавт., 1998], а также их применение с суицидальными целями.

Исследованиями многих авторов доказано, что при остром токсическом действии на организм м-холиноблокаторов, в частности при интоксикации 3-хинуклидилбензилатом, возможны резко выраженные изменения гуморального иммунного ответа и клеточных иммунных реакций, что может приводить после интоксикации в дальнейшем к развитию инфекционных и онкологических заболеваний [Забродский П. Ф.,1993, 1995, 1998, 2002; Хаитов P.M. и соавт., 2000; Трошкин Н.М. и соавт., 2004; Ferluga J. et al., 1972; Loose L.D., 1986; Miller K., 1985; Tiefenbach В., Wichner S., 1985; Descotes J., 1986; Luster M. J. et al., 1987; Kimber I., 1996]. Изучение иммунотропных свойств вещества BZ позволит расширить существующие представления о влиянии большой группы м-холиноблокаторов на НРО и иммунный статус [Трошкин Н.М. и соавт., 2004]. В то же время комплексное состояние НРО и специфических иммунологических механизмов защиты после интоксикации веществом BZ и его аналогами практически не изучены и по этому поводу имеются лишь отдельные сообщения.

Недостаточно изученными остаются вопросы фармакологической коррекции нарушений иммунного гомеостаза в постинтоксикационном периоде под влиянием м-холиноблокаторов, в том числе и вещества BZ. Эта проблема имеет важное теоретическое и практическое значение и нуждается во всестороннем исследовании для целенаправленной разработки научных основ медикаментозной коррекции нарушений системы иммунитета с применением иммунокорректоров из большого арсенала известных сейчас веществ данного класса [Ширинский B.C., Жук Е.А., 1991; Хаитов Р. М. и соавт., 1995; Забродский П.Ф. и соавт., 2001].

Таким образом, исследование по изучению характера нарушений НРО и специфических иммунологических механизмов защиты при остром токсическом действии м-холиноблокаторов с целыо разработки способов фармакологической коррекции изменений иммунного гомеостаза в постинтоксикационном периоде является актуальным и важным как в теоретическом, так и в практическом отношении.

Цель исследования: изучить характер и механизмы нарушений неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты в условиях острой интоксикации отравляющим веществом BZ и разработать патогенетически обоснованные принципы медикаментозной коррекции сдвигов иммунного гомеостаза.

Задачи исследования:

1. Оценить комплексное состояние неспецифической резистентности организма и специфических иммунных механизмов защиты у животных при экспериментальной инфекции после острой интоксикации веществом BZ по величине летальности животных, среднелеталыюй дозы P. vulgaris и среднеэффективному времени жизни животных.

2. Выявить закономерности острого действия вещества BZ на состояние неспецифической резистентности организма в условиях экспериментальной инфекции по величине летальности крыс, среднелетальной дозы Е. coli и среднеэффективному времени жизни животных.

3. Исследовать характер и механизмы острого действия вещества BZ на факторы неспецифической резистентности организма (показатели бактерицидной активности сыворотки крови, сывороточной активности лизоцима, тромбоцитарного катионного белка, комплемента и фагоцитарной активности нейтрофилов).

4. Установить характер нарушений специфических иммунных механизмов защиты организма при воздействии возрастающих доз вещества BZ по ряду интегральных показателей оценки функционального состояния центральных и периферических органов иммунной системы.

5. Изучить влияние возрастающих доз вещества BZ на Т-зависимый гуморальный иммунный ответ в различные фазы антителогенеза (титр антител в крови, содержание антителообразующих клеток в селезенке ) и на кооперацию Т- и В-лимфоцитов.

6. Оценить состояние Т-независимого гуморального иммунного ответа в различные фазы антителопродукции по титру антител в крови и показателям содержания антителообразующих клеток в селезенке при остром отравлении веществом BZ.

7. Определить характер нарушений клеточного звена иммунного ответа при острой интоксикации веществом BZ по реакции торможения миграции лейкоцитов, формированию гиперчувствителыюсти замедленного типа, антителозависимой клеточной цитотоксичности, активности естественных клеток-киллеров.

8. Провести обоснование и разработать патогенетически обоснованную коррекцию нарушений неспецифической резистентности организма и основных гуморальных и клеточных иммунных реакций при остром отравлении веществом BZ с использованием антидота аминостигмина и иммуномодуляторов.

Научная новизна. В результате проведенного исследования впервые показано, что под влиянием вещества BZ в дозах 0,2; 0,5 и 0,7 ЛД50 происходит снижение комплексных показателей состояния неспецифической резистентности организма и специфических иммунологических механизмов защиты, которое проявляется дозозависимым увеличением летальности крыс от экспериментальной инфекции, а также уменьшением ЛД50 P.vulgaris и Е. coli и среднеэффективного времени жизни животных.

Экспериментально показано, что при острой интоксикации веществом BZ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД5о происходит дозозависимое снижение бактерицидной активности сыворотки крови, сывороточной активности лизоцима, содержания тромбоцитарного катионного белка, фагоцитарной активности нейтрофилов.

Установлен характер нарушений специфических иммунных механизмов защиты организма при воздействии возрастающих доз вещества BZ, связанных с функциональным состоянием центральных и периферических органов иммунной системы. Показано, что вещество BZ вызывает дозозависимое снижение числа КОЕ в селезенке. Установлено снижение числа Т-лимфоцитов в тимусе в течение 1-2 сут в прямой зависимости от дозы вещества BZ. Количество лимфоцитов в селезенке через 1 сут после действия вещества BZ прямо пропорционально дозе уменьшается. Через 2 сут доза вещества BZ, составляющая 0,5 ЛД50, приводила к увеличению содержания лимфоцитов в селезенке крыс, а доза вещества BZ 1,0 ЛД50 вызывала противоположный сдвиг показателя. Вещество BZ через 1 сут дозозависимо повышает количество лимфоцитов в костном мозге и вызывает снижение содержания этих клеток в лимфоузлах, а через 2 сут реализуются противоположные эффекты.

Доказано, что острое действие вещества BZ вызывает прямо связанную с дозой (0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50) редукцию антителообразования. Иммунотоксический эффект вещества BZ более выражен в индуктивной фазе антителогенеза при иммунизации Т-зависимым антигеном и в продуктивной фазе иммуногенеза при иммунизации Т-независимым антигеном. Под влиянием вещества BZ in vitro происходит прямо связанное с концентрацией (105, 104 и 103 М) снижение кооперации Т - и В-лимфоцитов вследствие преимущественного нарушения функции Т-клеток.

Выявлено, что вещество BZ вызывает прямо связанное с дозой снижение функции Т-клеток и реакции гиперчувствительности замедленного типа, супрессию активности антителозависимой клеточной цитотоксичности преимущественно спленоцитов по сравнению тимоцитами. Острое отравление веществом BZ (0,2; 0,5 и 1,0 ЛДзо) в прямой зависимости от дозы уменьшало активность естественных клеток-киллеров спленоцитов крыс до 6 сут. Действие вещества BZ in vitro в прямой зависимости от концентрации

-г -J

10 , 10 и 10 М) вызывало редукцию активности естественных клеток-киллеров.

Впервые экспериментально показано, что коррекция нарушений показателей неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты при острой интоксикации веществом BZ (1,0 ЛД50) достигается комбинированным применением иммуностимулятора имунофана и антидота аминостигмина.

Практическая значимость работы заключается в экспериментальном определении при острой интоксикации веществом BZ показателей неспецифической резистентности организма, параметров системы гуморального и клеточного иммунитета, свидетельствующих о развитии постинтоксикационного иммунодефицитного состояния, которое требует применения медикаментозных средств для его фармакологической коррекции. Обосновано и экспериментально доказано, что при остром отравлении веществом BZ восстановление показателей неспецифической резистентности организма и системы иммунитета достигается применением иммуностимулятора имунофана (ежедневная доза 10 мкг/кг в течение 3 сут) в комбинации с антидотом аминостигмином (в первые сутки в дозе 0,1 мг/кг 2 раза).

Положения, выносимые на защиту

1. Острая интоксикация веществом BZ в условиях эксперимента на животных в дозах 0,2 - 1,0 ЛД50 вызывает прямо связанную с дозой супрессию комплексных показателей неспецифической резистентности организма и специфических иммунологических механизмов защиты, основных параметров гуморальных и клеточных иммунных реакций.

2. Острое действие вещества BZ вызывает дозозависимую редукцию антителообразования. Иммунотоксический эффект вещества BZ более выражен в индуктивной фазе антителогенеза при иммунизации Т-зависимым антигеном и в продуктивной фазе иммуногенеза при иммунизации Т-независимым антигеном.

3. Механизмы снижения специфической иммунной защиты при действии вещества BZ обусловлены снижением миграции колониеобразующих единиц в селезенку; изменением содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета в зависимости от воздействующей дозы и времени с момента интоксикации; нарушением кооперации Т - ,и В-лимфоцитов, приводящим к редукции антителообразования вследствие преимущественного поражения Т-лимфоцитов; супрессией клеточных иммунных реакций. *

4. Коррекция нарушений неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты после острой интоксикации веществом BZ достигается комбинированным применением аминостигмина и иммуностимулятора имунофана.

Апробация работы, публикации. Результаты исследований были доложены на заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и уничтожения химического оружия Поволжского отделения АВН (март 2002 г., февраль 2003 г., апрель 2004 г.), на Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (СПб, май 2004 г.), юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы корабельной токсикологии, радиологии, обитаемости кораблей и медицинского обеспечения личного состава ВМФ» (СПб, май 2004 г.), научно-практических конференциях Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты (2002, 2003, 2004 гг.), совместном заседании кафедры нормальной физиологии, кафедры патологической физиологии Саратовского государственного медицинского университета, кафедры технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты, кафедры токсикологии, радиологии и медицинской защиты Саратовского военно-медицинского института (май 2004 г.).

По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований и практические рекомендации внедрены в учебный процесс на кафедре технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты и на кафедре токсикологии, радиологии и медицинской защиты Саратовского военно-медицинского института. Материалы исследований широко используются при проведении лекций, практических и лабораторных занятий у курсантов и слушателей курсов повышения квалификации, первичной специализации и усовершенствования врачей. По материалам диссертации издано учебное пособие «Основы токсикологии».

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 168 страницах машинописного текста (включая таблицы и список литературы), состоит из обзора литературы (глава 1); материалов и методов исследований (глава 2); собственных экспериментальных исследований (главы 3-7); заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 33 таблицами. Список литературы включает 241 наименование, из которых отечественных - 166 и зарубежных - 75.

16

ВЫВОДЫ

1. Острая интоксикация веществом BZ в дозах 0,2; 0,5; 0,7 и 1,0 ЛД50 в условиях эксперимента на животных вызывает снижение неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты у животных при экспериментальной инфекции, редукцию основных гуморальных и клеточных иммунных реакций. Коррекция нарушений неспецифической резистентности организма и иммунного статуса при острой интоксикации веществом BZ достигается комбинированным применением антидота аминостигмина и иммуностимулятора имунофана.

2. Вещество BZ при остром действии вызывает прямо связанное с дозой увеличение летальности крыс от экспериментальной инфекции, вызванной Е. coli, уменьшение ЛД50 Е. coli и среднеэффективного времени жизни животных, а также аналогичные изменения данных параметров при использовании P.vulgaris после предварительной иммунизации, что свидетельствует о снижении неспецифической резистентности организма и специфических иммунных механизмов защиты.

3. При острой интоксикации веществом BZ в дозах 0,2; 0,5 и 1,0 ЛД50 происходит дозозависимое снижение бактерицидной активности сыворотки крови, сывороточной активности лизоцима, тромбоцитарного катионного белка и фагоцитарной активности нейтрофилов в течение 1-5 сут.

4. Характер нарушения специфических иммунных механизмов защиты при воздействии возрастающих доз вещества BZ определяется дозозависимым снижением числа колониеобразующих единиц в селезенке, фазовыми изменениями лимфоидного индекса тимуса и селезенки, содержания лимфоцитов в тимусе, селезенке, костном мозге и лимфоузлах в разные сроки интоксикации.

5. Острое действие вещества BZ вызывает прямо связанную с дозой редукцию антителообразования. Иммунотоксичность вещества BZ более выражена в индуктивной фазе антителогенеза при иммунизации Тзависимым антигеном и в продуктивной фазе иммуногенеза при иммунизации Т-независимым антигеном. Под влиянием вещества BZ in vitro происходит прямо связанное с концентрацией (105, 104 и 103 М) снижение кооперации Т- и В-лимфоцитов вследствие преимущественного нарушения функции Т-клеток.

6. Острое отравление веществом BZ приводит к дозозависимому снижению функции Т-клеток и активности естественных клеток-киллеров; реакции гиперчувствительности замедленного типа, антителозависимой клеточной цитотоксичности преимущественно спленоцитов по сравнению тимоцитами. Действие вещества BZ in vitro в прямой зависимости от концентрации (105, 104и 103М) снижает активность естественных клеток-киллеров.

7. Коррекция нарушений неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты при острой интоксикации веществом BZ в среднелетальной дозе достигается патогенетически обоснованным применением иммуностимулятора имунофана в комбинации с антидотом аминостигмином.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В эксперименте на животных наиболее информативными тестами для оценки иммунотоксичности вещества BZ являются: определение содержания лимфоцитов в тимусе и селезенке, числа антителообразующих клеток в селезенке в различные фазы иммуногенеза, эффекта кооперации Т- и В-лимфоцитов in vitro, реакции гиперчувствительности замедленного типа, активности естественных клеток-киллеров, антителозависимой клеточной цитотоксичности спленоцитов.

2. После острой интоксикации веществом BZ возникает дозозависимая супрессия неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты, требующая применения медикаментозных средств для ее устранения с целью профилактики и лечения возможных инфекционных осложнений и заболеваний.

3. После острого отравления веществом BZ для восстановления основных показателей неспецифической резистентности организма, гуморальных и клеточных иммунных реакций целесообразно применение аминостигмина в комбинации с имунофаном.