Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Глюкуронат натрия как новое средство стимуляции функций макрофагов при цитостатической болезни в условиях присоединяющейся инфекции

РГБ ОД 2 6 ФЕВ »

Нй правах рукописи

МУШТОВАТОВА Людмила Сгепаяовна

ГЛЮКУРОИАТ НАТРИЯ К/УС НОВОЕ СРЕДСТВО СТИМУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ МАКРОФАГОВ ПРИ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ В УСЛОВИЯХ ПРИСОЕДИНЯЮЩЕЙСЯ ИНФЕКЦИИ

14.00.25. — Фармакология

14.00.16. — Патолотчеосая френология

Автореферат диссертации на соискание ученоЯ степени кандидата биологических наук

Тома: - ¡595

Работа выполнена на кафедрах мшеробиологин и Патофизиологии Сибирского ысдицинскол) университета и лаборатории пммунофарма-ко:гапш н токенкологт; г _ютивоопухсшевых препаратов Инсппута фармакологам ТНЦ РАМН

Научные руководители:

академик МАН ВШ, профессор В.В.Новицкий чл.-корр. МАН ВШ, профессор ЮЛЗ.Федоров

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАМН, профессор А.М.Дыгай кандидат биологических 1аук ТАЛамощина

Ведущее учреждение — НИИ онкологии Томского научного • центра РАМН

За>цнга состоится « малы .1996 г. в /¿Г ч. на за седа -

ш диссертационного совета КОЗ 133.01. при научно-исследовательском иняппу^е фармакологии Томского научного центра РАМН (634028, г.Тоыас, пр. Ленина, 3).

С диссертацией ыо>:сно ознакомиться в библиотеке научно-кгс-чвдовательсхого института фармакололш Томского научного центра РАМН.

Автореферат разослан «_» ' _1996 г.

Ученый секретарь

специализированного совета, ^

кг.;!д!гда.т биологических наук ' ВЛС Горшкова

Актуальность темы. Одной из наиболее актуальных проблем созре-' чной онкологии остается разработка методов рациональной хнмноте-1ии злохачеспзенньк новообразований.

К числу основных недостатков большинства известных з настоящее :мя цитостатическнх лекарств, лимитирующих их применение в кли-се, относится токсичность действия данных препаратов на кроветво-1ие и иммунопоэз (Ларионов Л.Ф., 1962, Балнцкий К.П. и соавт., 1970; rtler, 1980; Забиров И.И., 1984; Лазарева Д.Н.Длехин Е.К., 1985; «.дберг ЕЛ- Новицкий В.В., 1986; Nikkeis, 1987; Гольцберг В.Е., Ды-! A.M.. Новицкий В.В., 1992).

Возникающее вследствие этого снижение резерва клеточных и гумо-гьны.х факторов иммунитета проявляется в последствиях, потешшаль-опасных, по крайней мере, в трех направлениях: повышением вое-шмчивосги к инфекции, диссгминацисй уже существующей опухали, никновеннем новых (вторичных) злокачественных новообразований, и этом установлено, что снижение иммунологической реактивности •аннзма при действии противоопухолевых препаратов является прн-юй развития вторичной инфекции у 50 - 75 % онкологических боль-с (Гершанович МЛ., 1932; Блохин H.H., Перезодчикова Н.И., 1984; ntagna М.Т., Larossa A.M.Y., Barfcuti S., 1987; Булкина З.П., 1991; [ьдберг В.Е., Дыгай A.M., Новицкий В.В., 1992). В езязи с этим изучение особенностей течения инфекционного про-;а на фоне действия цитостатичесхих препаратов имеет не только тео-¡ческое, но и большое практическое значение. Особый интерес б об-цаемем аспекте представляет, на наш взгляд, определение функцио-ыюго состояния клеток СМФ и разработка эффективных способов рекции и проф1шактики нарушений функций макрофагального им-итета, возникающих при применении цитостатических препаратоз. С целыо коррекции нммунодефицитных состояний в клинике ис-ьзуют самые различные препараты иммуномодулирующгго действия амизол, зимозан, иродигиозан, пирогенал и др.) (Закеифельд Г.К., 5; Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985, 1987; Рахмилевич А.И., 1990; ринский B.C., Жук ЕЛ., 1990; Абрамова Е.В., Дыгай А.М., Гольд* В.Е., 1991: Агафоноз В.И., 1993; Гольдбфг ЕЛ- Дыгай А.М., Лит-;нхо В.И., Попова Т.П., Суслов Н.И., 1994), большинство из кото. однако, не обладают строгой специфичностью действия и воздей-ют не на патологический эффект или возбудителя заболевания, а на 1ецифическуто активацию популяций макрофагов, Т- и В-лнмфсцнтов субпопуляций (Растунова ГА. и соавт., 1981; Шнринсхнй B.C., Жук . 1990). Известно также, что большинство используемых в клини-ой практшее иммуномодуляторов является малоэффективными и сб-1от достаточно широким спектром побочных эффектов (головная

боль, лихорадка, диарея, тромбоцитопения, лейкопения и др.) (Зат фельд Г.К., 19S5; Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985; Земсков В.М., 199! Булкнна З.П., 1991), которые регистрируются -у 20 - 30 % пациенто (Ширинсхнй B.C., Жук Б А., 1990).

В связи с этим важным управлением исследований в области пс вышення эффективности используемой в онколопiческой практике нм муномодулирующей терапии является поиск высокоэффективных н од повременно малотоксичных препаратов или их комбинаций, обла дающих менее выраженными побочными эффектами и способных повы cjm, резистентность организма к действша инфекционных возбуд1Гтелс11 Одним из перспективных направлений в этой области является, на hsl взгляд, использование естественных биологически активных веществ.

Из созданных в последние годы препаратов мммуномодулирующеп типа действия весьма перспективным, по нашему мнению, является гаю куроиат натрия (соль хлкжуроновой кислоты, биологически высокоак тивного соединения углеводного характера), полученный в Институт органического синтеза АН Латвии. В предварительных исследования; по изучению свойств данного препарата сотрудниками Института фар маколопш Томского научного центра РАМН (неопубликованные дан ные) было установлено, что ггаокуронат натрия оказывает стимулирую щее действие на функции нейтрофнлов крови — более-выраженное i пролонгированное, чем широко применяемый в клинической практик! имыуномодулятор продигиозан. При этом показано, что глюкурона: натрия относ»гтся к числу малотоксичных препаратов и повышает устой ч ив ость ыышей к Стафилококковой инфекции (неопубликованные данные).

Исходя из полученных данных, а также, учитывая, что влияние ппо-згуроната натрия на клетки СМФ до сих пор не изучалось, нам представлялось актуальным изучить возможность использования данного препарата как корректора нарушений в клетках СМФ при цитосгатическо!: болезни и инфекционном процессе, возникающем на фоне, применения цнтостатиков.

Цадь исследований. Изучить в эксперименте возможности коррекции п профилактики функциональных нарушении в клетках СМФ при лисге-риозе и лнетерийной инфекции, протекающей на фоне действия цнтоста-тического препарата.

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи: х

1. Опредсгппъ LDj'o Listeria monocytogenes для интактных животных и мышей, инфицированных на фоне действия пнохуроната натрия.

2. Установить особенности действия глзокуронзта латрия на функциональную активность клеток СМФ у интактных азшотных.

3. Определить xapa>rrq) влияния возбудт-еля лисгериоза на функциональное состояние клеток СМФ у шгсактных животных.

4. Выявить основные зффе'яы действия циклофосфана па функциональный статус клеток СМФ у шггактлых штатных.

5. Установить особенности фушлшонального состояния клеток СМФ у мышей, инфицированный Listeria monocytogenes поете пргдва-ритсльного введения циклофосфана.

6. Установить особенности функционального состояния icrxroi: СМФ при действии культуры Listeria monocytogenes в условиях профи-тактического и терапевтического введения пнокуроната натрия.

7. Изучить особенности функционального статуса клеток СМФ при действии циклофосфана в условиях профнлакшчгского и терапевтнче-:кого введения плскуроната натрия.

3. Выявить особенности сочетаиного действия культуры Listeria monocytogenes и циклофосфана на фагоцитарную активность и фермен-гагивнын статус клеток СМФ в условиях профилактического и тердпез-шческого введения ппскурсната натрия.

Научная нознзпа. Впервые изучено функциональное состояние клг-гск СМФ при введении нового лскарстхспкого препарата иммуномоду-трующсго типа деЛавия — пкекуронлга натрия. Установлено, '»то грехкратное ежедневное внутривенное введение ппокуронзта "атрня в юзе 50 мг/кг (суммарная доза 150 мг/кг) вызывает у нптактных жзшот-ibui повышение фагоцитарной и цитохимической (кислая фосфатаза, ке-;пецнфнческая эсгераза) активности клеток СМФ.

Впервые показано таккг, что профилактическое введение гшокуро-(ата натрия (50 нг/кг х 3 ежедневно) приводит к увеличению величины IDw возбудителя лисгерноза в 2 раза. Обосновано, тго как терапедтиче-жог, так и профилактическое введение плскуроната натрия жизотным с жепери;ментальным лнетериозем приводит к увеличению фунхцнонлд'л-¡сй активности клеток СМФ, что сопровождается сокращением периода зысеваемости •микроорганизмов и уменьшение.'.! их количества в селгзен-сс, печени и крови.

Установлено так;хе, что введение возбудителя лнетерноза мышам с лггостатнческой' болезнью (индуцированной однократным введение.'.: шклофосфапа в МПД) приводит к более выраженному п продслжнтель-10!,¡у во времени (по сравнению с действием цптосглтика) угнетению фл,--ошгтарной акптнссш пернтонеальных макрофагов и актвпоети хне-¡сй фосфатазы и неспенифической эсгеразы моноцитов периферической срови, а таз г,; х- к более длительно!! во времени циркуляции листсрнй в зргаихч и крови, чем при инфицировании интахтпых ;ч-ипогных. Профн-гакгическое и терапевтическое введение ппокурочпггг натрия (50 мг/гсг -) ежедневно) ¡-чпиотаым, инфицированным лнетериядш па фоке прнмене-шя циклофосфана, приводит к выралсенпой стимуляции ¿у:псцисн;1ль-гой активности клеток СМФ и уменьшению келпчееггл микроорганчз-г?ов в органах н ¡срови подопытных ленготны:-:. Установлено, что тер-з-кзтнческое введение лгюкуропата натрия (50 мг/кг 3 етеднезно) У".'-

вотным с листернозом, цитостатаческой болезные и мышам, инфицированным Listeria monocytogenes на фоне действия цитостатика, приводит к более выраженному увеличению функциональной активности клеток СМФ ы сокращению числа и продолжительности времени циркуляции микроорганизмов в органах а крови, чем при его профилактическом воздействии в аналогичном режиме введения.

Нпучно-практичсская значимость. Экспериментально обоснована и доказана возможность применения гшокуроната натрия в качестве высокоэффективного стимулятора клеток системы мононуклеарных фагоцитов (Заявка № 9400142 на изобретение «Протнвоикфекциокное средство» с приоритетом от 12.01.94 и Заявка № 94007979 на изобретение «Средство, стимулирующее функции клеток системы мононуклеарных фагоцитов» с приоритетом от 05.03.1994).

Ан]юбация работы. -Материалы диссертации докладывались и обсуждались на заседаниях кафедры микробиологии СГМУ (Томск, 1993 — 1995).. на итоговых конференциях ЦНИЛ СГМУ (Томск, 1993 - 1995), на заседании комиссии по апробации кандидатских диссертаций НИИ фармакологии ТНЦ РАМН (1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Обн структура работы. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка шггературы, включающего 279 источников, из которых 192 отечественных и 87 иностранных. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами, 3 рисунками.

Автор выражает глубокую благодарность руководителю лаборатории патофизиологии НИИ фармакологии ТНЦ РАМН, член-корресионденту РАМН, профессору Александру Михайловичу Дыпио за предоставленную возможность экспериментального изучения нового препарата иммуномодупирующет» типа действия — гшокуроната натрия и первичную документацию по этому препарату.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на 884 беспородных мышах обоего пола массой 10-12 граммов, полученных из питомника «Рассвет» Томского НПО «Вирионя. Перед началом эксперимента животных выдерживали в течение 7-14 дней на обычном пищевом рационе в пластиковых клетках по б - 7 особей в каждой. Распределение животных по сериям экспериментов, проведенных в соответствии с поставленными в работе задачами, представлено в табл. L

Забор материала для исследования у мышей осуществляли на 2, 3,5, 7,10, 14,21 н 28-е сух после введения препаратов и (или) инфекционного агента. Мышей умерщвляли мстодо?,! смещения шейных позвонков, со-

Таблица 1

Распределение экспериментальных животных в зависимости от содержания эксперимента п сроков

исследования

№п/и - .........—.....- — 1. — —— Содержание эксперимента Количество животных Сроки исследования, сут

t 2 3 4

1. Определение величины LDso Listeria monocytogenes у ци-тактных животных 30 в течение 10 сут

2. Определение величины LDso Listeria monocytogenes у мышей, инфицированных на фоне действия глюкуроната натрия 30 в течение 10 сут

3. Изучение фагоцитарной и цитохимической активности макрофагов у шггактных животных 24

4. Изучение фагоцитарной и цитохимической активности макрофагов у мышей после введения глюкуроната натрия 50 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28-е

5. Изучение фагоцитарной и цитохимической активности макрофагов у мышей после однократного введения цнкло- фосфана в МПД 50 2,3,5,7,10,14.21,28-е

6. Изучение высгваемости возбудителя лнетерноза из органов и периферической крови, исследование фагоцитарной и цитохимической активности макрофагов у мышей, зараженных Listeria monocytogenes (LDso) 100 2, 3, 5,7, 10, 14, 21, 28-е

7. Изучение высеваемость возбудителя лнетериоза из органов и периферической крови; исследование фагоцитарной и цитохимической активности макрофагов у мышей, зараженных Listeria monocytogenes (LDso), через 1 сут после однократного введешш циклофосфана в МПД 100 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28-е

1 1 2 3 4

8. Изучение высеваемости лнстерпй из органов и периферической крови; исследование фагоцитарной и цитохимической активности макрофагов у мышей, зараженных Listeria monocytogenes (LDjo) на фоне действия ппокурона-та натрия 100 2, 3, 5, 7, 10. 14,21, 28-е

9. Изучение фагоцитарной п днтохимя ческой активности макрофагов у мши ей после однократного вьедения цнхло-фосфана в МПД на фоне действия пиокуропата натрия 50 2, 3, 5, 7, 10, 14,21, 28-е

10. Изучешзие высеваемости листсрш"! цз органов и периферической крови; исследованпе фагоцитарной н щггохнмн-чсской активности макрофагов у мышей, зараженных Listeria monocytogenes (LDso) через 1 сут после однократного введения цшсдофосфана па фоне действия ппокуроната натрия 100 2,3, 5,7, 10, 14,21.28-е

11. Изучение высеваемости возбудителя листериоэа го органов и периферической крови; исследование фагоцитарной и цитохимической активности макрофагов у животных, инфицированных Listeria monocytogenes .и с последующим введением ппокуроната натрия 100 2,3, 5,7,10,14,21,28-е

12. Изучение фагоцитарной активности и цитохимических показателей макрофагов у животных при введении цнкло-фосфанап последующем введении ппокуроната натрия 50 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28-е

13. Изучение высеваемости лнстсрий ii3 органов н периферической крови; исследование фагоцитарной п шгтохимн-ческой активности макрофагов у мышей, зараженных Listeria monocytogenes (LDso) на фоне действия цшслофос-фана и с последующим введением ппокуроната натрия 100 2,3, 5,7, 10, 14, 21, 28-е

бшсдая «Празила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных МЗ РФ.

Для моделирования цитостатическси болезни нспользогалн аптечный препарат циклофосфана (Минмедпром, Саранский комбинат «Биохимик»), который непосредственно перед употреблением растворяли в стерильном физиологическом растворе и вводили однократно внут-рнбрюишнно в МПД, рассчитанной методом графического пробт-анали-за по Litschfield, Wilcoxon (1948).

Моделирование инфехционного процесса проводил:) однохратаым внутрибрюшинным введением полулетальной дозы суточной культуры тистерий (Listeria monocytogenes, штамм 5Б' +), полученной га :лузгя ка-редры микробиологии СГМУ, куда она поступила из Омского научно-ясследовательского ветеринарного института. Для расчета LD<<> возбутш-геля листериоза использовали метод Керберз в модифшеации И.П. Аш-ларнна (1978).

Для изучения особенностей состояния клетск СМФ при ннфекпнен-юм процессе, протекающем на фоне цнтоггатичсской болезни Listeria nonocytogenes вводили через 1 сут после инъекции шгхлофосфана.

В качестве средства, стимулирующего функции клеток СМФ, приме-1яли ггаокуронат натрия. Введение птюкуроната натрия ?.о ~-:сх сериях жепернмелтев проводили, знутривенно ежедневно в течение трех дней в юзе 50 мг/кг (суммарная доза 150 ?.«г/кг). Дгп изучения протекторного >ффе:<та ппокуроната натрия на клетки СМФ при действии цтглофосфа-ia введение щггсстатнка производили через 1 сут. посла трехкратного последней третьей инъекции) введения гякжуронатл натрия.-Ддч гт/чс-г.;я возможности коррекции нарушении в клетках СМФ при цитссктаг-к-ской болезни введение ппекгуропатц натрия осуществляли »:ерез 1 сут юсле введения циклофосфана. Для изучения особенностей течения инфекционного процесса на фоне применения ппокуроната натр ил шф|-¡нреванне мышей проводили через. 1 сут после последней инъекции пге-:арата. Для изучена"? зозмоягнссти коррскц:ш нарушений в клетк.гх ¡акрофаггльноП системы при инфекционном процессе, вмтплпнсу. зоз-»удителем листериоза, введение гшокурспата гатрлл производили "срез суг после сведения культуры микроорганизма* Для изучений :;оз>.:с:к-юсти 'профилактики функциональных нарушений з клетка:: СМФ при нфехционпем процессе, протекающем па фоне действия щклсфссфана, ;нтостатик вводили через 1 суг после введения хлюкуронатл натри::; заражение мышей возбудителе»; листериоза проводили на 2-е сут поел; ейсттзня циклофосфана. Для изучения возможности коррекции функ-нональных нарушений в клетках СМФ при г:нфекшгоннсм процессе, ротекаюшег.! на фоне цнтостатичесхой белгзпи, инфицирование ::шгот-ых возбутштелем листериоза проводили на 2-е сут после действия шс:-офосфана; введение ПЕскурсната натрия осуществляли через 1 сут после сражения животных.

KoinpcjtbHOii группе животных внутрибрюшинно вводили изотонический раствор хлорида натрия.

Фагоцитарную активность макрофагов перитонеального экссудата оценивали по проценту активных клеток (индекс Райта), количеству микроорганизмов, погаощенчых одним фагоцитирующим макрофагом (индекс Гамбургера), показателю завершенности фагоцитоза, который определяли с использованием НСТ-теста (Фрейдлин И.С., 1986). Активность кислой фосфатазы в моноцитах периферической крови определяли методом азосочетания (Burstone, 1958, Li, 1979); активность неспецифической эстеразы по метоцуХейхоу (1975). Учет активности ферментов на мазках периферической крови проводили по методу Karlow (1957) в модификации Astaldi н Vergo (1957).

Учет высеваемостн возбудителя из органов (печень, селезенка) проводили путем подсчета колоний, выросших на чашках Петри, и идентификации возбудителя по морфологическим, культуральным и серологическим свойствам. Для этого в заданные сроки кусочки органов массой пэ 200 мг отмывали от крови трижды в стерильном физиологическом растворе, гомогенизировали и готовили 5 % взвесь. 0,1 мл взвеси, разведенной в соотношении 1 :10, высевали на чашки Петри с сахарным агаром. Полученную, из сердца кровь засевали в пробирки с 1 % сахарным бульоном. Пробу по исследованию крови на нзличие возбудителя листе-риоза, считали положительной при помутнении сахарного бульона и выявлении Listeria monocytogenes в мазках, приготовленных из данного посева и окрашенных по Граму.

Статистическую обработку проводили с использованием t-критерия Стьюдента (Лахин Г.Ф., 1986).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ НАБЛЮДЕНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты показали,что внутривенное трехкратное ежедневное введение глюкуроната натрия в дозе 50 мг/кг (суммарная доза 150 мг/кг) нтакткым мышам приводило к выраженному повышению функциональной активности клеток СМФ, о чем свидетельствовало статистически значимое увеличение индекса Райта (на протяжении всего периода наблюдения — в среднем на 178,7 % по сравнению с контро-лем),индекса Гамбургера (в. период с 5-х .по 10-е сут эксперимента — в среднем на 46 %), показателя завершенности фагоцитоза (в период с 5-х по 10-е суг — в среднем на 88,8 %) перитонеальных макрофагов, а также повышение активности кислой фосфатазы (в среднем на 161 % в период с 3-х по 28-е сут исследования) и неспецнфическои эстеразы (в период со 2-х по 28-е сут — в среднем на 290 %) в моноцитах периферической крови (рис. 1,23).

2 3 5 7 10 14 21 28

- Сроки исследования, сут

Ч £00,

400

300

200

100

о

3 5 7 10 14 21 28

Срост исслщдинии. сут

2 3 5 7 10 14 21 28

Сроен иуследовлния, сут

2 3 5 7 10 14 21 28

Сроки исстдомсш, сут

2 3 5 7 10 14 21 28

Сроси исследования, сут

Рис. 1. Динамика фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов и цитохимической активности (СЦК) моноцитов периферической крови (% от нормы) у мышеи после введения глюкуроната натрия (светлые столбики), инфицирования возбудителем листе-риоза (ЬЭя)) (темные столбики). заражения лнетериями на фоне действия глюкуроната натрия (пунктир) и инфицирования лнетериями с Последующим введением глюкуроната натрия (сплошная линия).

ИР — индекс Райта; ИГ — индекс Гамбургера; ПЗФ — показатель завершенности фагоцитоза; КФ — активность кислой фос-фатазы; НЭ — активность неспецифической эстеразы.

' % 350

зоо!

250 i IJ

i f 200 f-

150: ;

100 •

50 !

o-2

%

350 : 3001 250 i 200 ; 150 ¡ 100 i 50 0

%

600 500

3 5 7 10 14 21 28

Cpom иссмоованкя, сут

2 3 5 7 10 14 21 28

Срони мссачутчим. сут

3 5 7 10 14 21 28 Срош исследования, сут

lila Li Lili lJ:.í:j¡

2 3 5 7 10 14 21 28 Сроки «ссмдовзимя. сут

300 200 100 о

Lf-5 'г?1 г ¿11 Í1 i i- I.' Л'.1-г |

.IÍLÜlíÉLl;JiJlj;J¡

2 3 5 7 10 14 21 28 Сроки исследования, сут

Рис. 2. Динамика фагоцитарной.активности перитонеальных макрофагов н цитохимической активности (СЦК) моноцитов периферической крови (% от нормы) у мышей после введения глюкуроната . натрия (светлые столбики), однократного введения циклофосфа-на (МПД) (темные столбики), введения циклофосфана на фоне действия глюкуроната натрия (пунктир); при введении глюкуроната натрия на фоне действия цитостатика (сплошная линия). ИР — индекс Райта; ИГ — индекс Гамбургера; ПЗФ — показатель завершенности фагоцитоза; КФ — активность кислой фос-фатазы; НЭ — активность неспецифической эстеразы.

(

%

350 300 250 200 150 100 50 0 I

%

250 200 150 100 50

3 5 7 10 14 21 23 Сроки исследования, сут

2С0 150 100 50 0

3 5 7 10 14 21

Сроки исслмоыния. сут

%

200 г-700 к-еоо !-

500|• ; • -400 \—+ 300-! , у

200! Дпи^гг г;

01

3 5 7 10 14 21 23

Сроки исследования, сут

2 3 3 7 10 14 21

Сроки исел*де«»ияя. с/т

I ! I 'Ч 1 ' Г" М г-З^ч?—I

. и!. ii.lL ЫЬЦдР;'

2 3 5 7 10 14 21. 23

Среги иссгкдссянак, сут

ис. 3. Динамика фагоцитарной активности перптонеальных макрофагов и цитохимической актиниости (СЦК) моноцитов периферической крови (% от нормы) у ¿кНвотных после введения глюку ропат а натрия (светлые столбики), заражения листериями после однократного введения цнклофосфзна (МПД) (темные столбики),, инфицирования листериями после введения шгшстатика на фоне действия глкжуроната натрия (пунктир); заражения возбудителем листериоза на фоне действия циклофосфана и с послелую-шим введением..глкжуроната натрия (сплошная линия). ИР — индекс Раита; ИГ — индекс Гамбургера; ПЗФ — показатель завершенности фагоцитоза; КФ — активность кислой фос-Фагаты: НЭ — активность неспецифической зстеразы.

2

2

Индуцнроваиное действием гпкжуроната натрия повышение функциональной активности клеток махрофагальной системы было обусловлено, по всей видимости, увеличением числа зрелых, функционально полноценных клеток СМФ.

Известно, что Д-пвокуроновая кислота, солыо которой является гаюкуронат натрия, способна стимулировать процессы пролиферации клеток-предшественниц типа колониеобразующнх единиц транулоци-тарно-макрофагальных (КОЕ-ГМ), гранулоцнтарных (КОЕ-Г), макро-фагальных (КОЕ-М), дающих при культивировании в плазменном сгустке начало (соответственно) колониям гранулоцнтарно-макрофагального, гранулоцнтгрного и ыакрофагального типа. Исходя из этого, можно предполагать, что Д-пвокуроновая кислота (гаюкуронат натрия) способна стимулировать процессы пролиферации и дифференцировки морфологически дифференцируемых клеток СМФ, как это бьшо показано при изучении влияния Д-глюкуроновой кислоты на гранулоцитарный росток костного мозга (Симанина ЕЛ., 1990; Гольдберг ЕД. и соавт., 1993).

Кроме того, установлена способность гяюкуроната натрия вызывать снижение 5-нуклеотидазы в макрофагах перитонеального экссудата мышей, что свидетельствует об активации клеток СМФ (Кнрнлличева Г.Б., Синииова НГ., Туманян МА., 1988).

Изучению влияния гшокуроната натрия на функциональную активность клеток СМФ при листерийкой инфекции предшествовало исследование фагоцитарной функции перитонеальных макрофагов и цитохимической активности моноцитов периферической крови при экспериментальном пистериозе у мышей.

Проведенное исследование позволило установить, что внутрибрю-шинное введение животным возбудителя листсриоза (штамм 5Б+, LDso) приводило к увеличению фагоцитарной и цитохимической активности клеток СМФ. Инфицирование животных культурой -Listeria monocytogenes (LDjo) вызывало увеличение индекса Райта (в среднем на 22,6% в период со 2-х по 21-е сут эксперимента), индекса Гамбургера (в среднем на 10,7 % в период со 2-х по 7^е сут) и показателя завершенности фагоцитоза (в среднем на 963 % в период со 2-х по 10-е сут). СЦК кислой фосфатазы моноцитов периферической крови у животных данной экспериментальной группы в период со 2-х по 14-е сут превышал (в среднем на 99,1 %) соответствующие значения у интактных животных. СЦК неспецифичесхоЗ эстсразы в перирд со 2-х по 21-е сут также достоверно превышал (в среднем на 168 %) фоновые значенная (рис. 1).

Высеваемосгь листернй из селезенки и печени инфицированных возбудителем листсриоза (LDso) животных была зафиксирована на 2,3, 5 и 7-е сут, а из крови на 2,3 и 5-е сут эксперимента. Наибольшее количество листернй бьшо выделено из селезенки на 3-й (4020,0 ±28,5 тыс), а из печени — на 5-е сут опыта (147,5 £ 4,7 -шс).

Полученные нами результаты подтверждают данные литературы о том, что листерии охазывают стимулирующее воздействие на клетки макрофагалыюй системы. Установлено, в частности, что способность листернй активировать макрофаги связана, прежде всего, с усилением пролиферации их костномозговых предшественников и сокращением времени генерации моноцитов (Романова Т.И., 1972; Рассадкнн Ю.Н., Одинцов Ю.Н., 1973; Маянскнй Д.Н.,'Цырендоржиев Д.Д., IS90; Маянский Д. Н., 1991, 1992).

Для стимулированных макрофагов характерно увеличение количества лизосом, усиление их функции. Такие клетки более активны в разрушении бактерий, что может быть связано с высоким содержанием в них гидролитических ферментов и с повышением интенсивности кисло-родзависимого метаболизма в клетке (Маянский Д.Н., 1990,1991).

Следует также учитывать, что живые микробы активируют макрофаги не только прямо, но и опосредованно под влиянием лимфокинов (КаррЯ., 1978; Маянскнй АЛ., Маянский ДЛ., 1983).

Введение глюкуроната натрия до заражения животных возбудителем листериоза приводило к увеличению LDjo в 2 раза: 629500 микробных тел в группе животных, инфицированных Listeria monocytogenes, и 1256000 микроорганизмов if группе мышей, зараженных возбудителем листериоза после предварительного введения глюкуроната натрия.

Исследования действия гщокуроната натрия на функциональный статус клеток СМФ при экспериментальном листериозе показало, "что предварительное введение препарата приводило к более выраженной и продолжительной во времени стимуляции активности перитонеальных макрофагов и моноцитов периферической крови, чем при действии возбудителя листериоза на интактных животных. Так, статистически значимое увеличение индекса Райта перитонеальных макрофагов у мышей этой экспериментальной 1руппы бьшо отмечено в период со 2-х по 14-е сут исследования (в среднем на 183,6 %), индекса Гамбургера — в период с 5-х по 7-е сут (в среднем на 82,2 %), показателя завершенности фагоцитоза — в период с 3-х по 10-е сут (на 105,6 %). Показатели активности кислой фосфатазы и неспецнфнчесхой эсгеразы в моноцитах периферической крови во все сроки исследования превышали исходные значения в среднем (соответственно) на 183.8 и 517 %.

Высеваемостъ лнегерий из селезенки и печени у животных, инфицированных Listeria monocytogenes (LDjo) после введения глюкуроната натрия, была зафиксирована на 2,3 и 5-е сут опыта. Наибольшее количество микробных клеток бьшо выделено из селезенки и печени на 3-й сут — 76,0 ± 1,2 тыс и 37,8 ± 9,6 тыс соответственно. Выделение возбудителя листериоза из крови представлялось возможным лишь на 2 и 3-й сут. Таким образом, введение животным возбудителя листериоза на фоне действия глюкуроната натрия приводило к значительно менее выраженной и продолжительной во времени циркуляции Listeria monocytogenes в op-

ганах и крови, чем при введении лнстсрнй ннтактным животным. .

Терапевтическое введение гшокуроната натрия животным, зараженным Listeria monocytogenes, приводило к увеяиченшо индексов Райта и Гамбургера для перитонеальных макрофагов (в среднем на 198 и 203 % соответственно), определяемому на протяжении всего периода наблюдения; показателя завершенности фагоцитоза — в период с 5-х по 28-е сут исследования (в среднем на 173 %). Статистически значимое увеличение СЦК кислой фосфатазы (в среднем на 254 %) и неспецифической эстера-зы (в среднем на 540 %) в моноцитах периферической крови у животных, инфицированных возбудителем листериоза до введения глюкуроната натрия, определялось также на протяжении всего периода наблюдения (рис. 1).

Высеваемосгь листерий из селезенки и печени у животных данной экспериментальной группы была зарегистрирована на 2 и 3-й сут опыта. Наибольшее количество листерий из селезенки и печени (44,0 ± 8,5 тыс и 11,6 ± 2,4 тыс соответственно) было выделено на 2-е сут эксперимегта. В крови возбудителя листериоза определяли лишь на 2 и 3-й сут исследования.

Таким образом, изменения функциональной активности клеток мак-рофагальной системы при комбинированном введении возбудителя листериоза и гшокуроната натрия, выявленные в результате проведенных экспериментов, имели однонаправленный харжгар с аналогичными изменениями у животных, инфицированных Listeria monocytogenes. Нужно отметить, что зФеличение показателей фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов и цитохимической активности моноцитов периферической крови у животных этих экспериментальных групп оказалось в большей степени выраженным, чем при действии Listeria monocytogencs на ннтактных мышей. г

Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что ппокуронат натрия обладает противоинфекциоиньш действием и повышает устойчивость мышей к листерийноП инфекции, Данный эффект препарата можно объяснить активирующим воздействием препарата на клетки ыакрофапшьиой системы. Для активированных макрофагов характерны снижение активности 5-нузслеотидазы, высокая бактерицидная активность, способность вырабатывать фактор некроза опухоли (ФНО) (Кирплличева Г.Б. с соавт., 1988; Маянскиа Д.Н., Цырендоржпев ДД., 1990; Маянский Д.Н., 1991). Вместе с тем установлено, что ФНО-познтивная сьшоротка in vitro защищает животных от заражения Klebsiella pneumoniae и Listeria monocytogencs (Маянский Д.Н., 1991).

Изучению влияния глюкуроната натрия на функциональную активность клеток макрофагальиой системы при цигостатической терапии предшествовало изучение фагоцитарной функции перитонсальных макрофагов и цитохимической активности моноцитов периферической крови у мышей после однократного введения шисдофосфана в МП Д.

Установлено, что однократное ввсдениг цшслофосфзна в МИД Бывало статистически значимое сшскзнне индекса Райта (о среднем на ,6 % по сравнению с контролем) в период со 2-х по 10-е сут опыта, ин-к'са Гамбургера (б среднем на 33,2 %) — в период со 2-х по 10-е суг и казателя завершенности фагоцитоза (з среднем на 34,8 %) з период со с по 14-е сут. Достоверное снижение акпюности кислой фосфатазы бы-зарегнстрнровано в период со 2-х по 21-е суг (в среднем иа 26,7 % по авненшо с фоновыми значениями), неспгцифнчссхой эстеразы — в пе-од с 3-х по 14-е суг опыта (в среднем на 28,0 %) (рис. 2).

Полученные результаты подтверждают данные литеразуры об осо-нностях действия циклофсгфзна на клетки СМФ. Сншхгние функцио-лыюй активности клеток макрофагальной системы при денстзнн ш ¡топика может быть связано с сокращение.'.! пула как морфологически фференцируемых форм макрофагов, так н числа незрелых предше-зенников клеточных элементов этого ряда вследствие повреждающего нствия цнхлофосфана на синтез нуклеиновых кислот (Ларионов Л.Ф., 62; Гершановнч МЛ., 1982; Блохнн H.H., Переводчиком II.II., IPS4; глк«!.ча ЗЛ., 1991 и др.). Известно также, что циклофосфап способен ¡звать нарушения ферментативных систем клеток СМФ. К:::: было но-зано И.Ш. Забнровьш и соазт. (1984), метаболиты цшслофосфана вы-!вают перехиснос окисление лншщоз клеточных мембран, продукты горого оказысагот отрицательное дейстзиг на структуру и функцию сток, следствием чего является нарушение проницаемости клеточных ■мбран, что в конечном итоге приводит к упг-теннто функциональней тивности клепок макрофагальной системы.

Введение цнклофосфзнд на фоне дейстагя пжясуроната натрия прудило у мышей к достоверному увеличению индекса Рантз для перито-альных макрофагов в период со 2-х по 21-г суг эксперимента. з среднем 143,8 % по сравнению с фонозыми значениями. Достоверное увелтг-le индекса Гамбургера (на 69 %) у ::я:вотиых этой экелгримешелыга" уппы было зарегистрировано :га 5-е суг. В остальные сроки иссл-до-ння величина данного показателя варьировала п предел?-!, достоверно отличавшихся от исходных значений. Показатель 32Еерш::шосгн фя-нитоза перитонсальных ыакрофагоп з период с 7-х пс 25-2 сут вания был достоверно выше (л среднем на 87 %) контрольных значе-1Й. Активность кислой фосфатгзы моношггез периферической ггревн стовсрно превышала соответствующие значения у шгспгшых .мышей 3, 5 и 7-е сут опыта ( з среднем на 29,3 %). Статистически знзчюкзг сличение актизности неспецнфпчесхсй эстеразы было sapenicipnpcm-> в период со 2-х по 28-е сут исследованиями среднем иа 23,2 %).

Терапевтическое введение гшокурсната натрия етгаотлытг. подувшим шссяофссфзн (МПД), сопровюхдзлось достоверным увгя«7«н{-I индексов Райта (в среднзм на 137 %) и Гамбургера (п среднем на 140,4 ) перитснеальных какрофагоз, определяемым на прогя::«гпл1 легто пе-

»кода наблюдения. Бьугвлгнпсг з триод со 2-х но 21-е сут увеличение показателя завершенности фагоцитоза у животных данной экспериментальной группы также оказалось сгатастнческн значимым (в среднем на

106.8 % но сравнению с контрольными значениями). На протяжении всего периода наблюдения опред^ылось также увеличение ахтивкости кислой фосфатазы (в среднем на 242 %) и неспецнфнческой зстеразы (на

387.9 %) в моноцитах Пфнферичсской );рови (рис. 2).

Таким образом, как профилактическое, так и (особенно) терапевтическое введение глюкуроната натрия приводило к увеличению функциональной активности клеток СМФ у животных с цитостатнческой болонью, вызванной однократным введением циклофосфана в МПД.

Как было установлено Е.В. Снмзннной (1990), Д-ггаокуроновая кислота обладает способностью стимулировать процессы костномозгового кроветворения в условиях химиотерапии опухолей. В связи с этим есть все основания предполагать, что гяюхуронат натрия оказывает прямое стимулирующее влияние на клетку(и) предшественницу(ы) миело-поэза (КОЕ-ПЛ, КОЕ-Г, КОЕ-М) с последующим увеличением числа зрелых, активно функционирующих макрофагальных элементов.

Изучению влияния глмкуроната натрия на функциональную активность клеток СМФ и выссвасмостг, лнстернй из органов и крови при сочетанием применении циклофосфана и возбудителя листерноза предшествовало исследование фагоцитарной активности пернтонеальных макрофагов л шггохимичсской активности моноцитов периферической крови у мышей, зараженных возбудителем лнетериоза после однократного введения циклофосфана.

Установлено, что инфицирование мышей через 1 сут после введения цитостатика приводило к достоверному снижению индекса Райта пернтонеальных макрофагов в период со 2-х no 10-е суг (в среднем на 30 %), индекса Гамбургера — в период со 2-х по 7-е сут (в среднем на 34,2 % ), показателя завершенности фагоцтоза — в период со 2-х по 14-е суг (в среднем на 42 %). Статистически значимое снижение СЦК кислой фосфатазы в моноцитах периферической крови у животных данной экспериментальной группы было зафиксировано в период со 2-х по 21-е сут (в среднем на 343 %), неспецнфнческой эстсразы — в период с 3-х по 10-е суг (в среднем на 40,8 %) (рис. 3).

Таким образом, инфицирование животных возбудителем листерноза на фоне действия циклофосфана сопровождалось статистически значимым угнетением всех изучаемых показателей фагоцитарной активности клеток макрофагальной системы, в равной степени выраженном, как и у животных, получавших только шшюфосфан.

Высеваемость листерий из органов (селезенка, печень) и крови у мышей, зараженных возбудителем листерноза через 1 сут после однократного введения циклофосфана, была зарегистрирована на 2, 3, 5, 7 и 10-е суг эксперимента. При этом максимальное число микробных клеток

в селезенке обнаруживалось на 5-е суг (49225,0 ± 120,0 тыс), в печени — на 3-н суг (1670,0 ± 45,0 тыс).

Таким образом, введение Listeria monocytogenes животным на фоне действия циклофосфана приводило к более выраженной и продолжительной во времени циркуляции микроорганизмов в органах (печень, селезенка) и крови, чем при введении листерий ннтактным животным.

Усиление угнетающего эффекта циклофосфзна на изучаемые показатели футсцнональиой активности клеток макрсфагальной системы может быть связано с нарушением его метаболизма микросомальнымн фермен-тзмн печени через антигенную стимуляцию, что приводит к длительной циркуляции активной формы цигостатнческого препарата и его продуктов метаболизма в организме животных (Гершанович МЛ., 1932). Известно также, что введение циклофосфана в организм приводит к образованию популяции макрофагов с ограниченной переваривающей способностью или вовсе ее не имеющих. Результатом взаимодействия микроорганизмов с такими макрофагами является даигтельиая их персистен-ция в органах и крови (Фрейдлнн И.С., 1984).

Комбинированное применение цнклофосфаиа и Listeria monocytogenes на фоне действия ппокуроната натрия приводило к статистически значимому увеличению индекса Райта перитонеальных макрофагов в период со 2-х по 21-е суг исследования (в среднем на 131,4 %), индекса Гамбургера — в период с 7-х по 10-е суг (в среднем на 39 %). Статистически значимое увеличение показателя завершенности фагощггоза у животных этой экспериментальной группы было зафиксировано на 5 и 7-е сут эксперимента, коща его величина превышала фоновые значения в среднем на 333 %. СЦК неспецифической эстеразы моноцитов периферической крови в период со 2-х по 21-е сут превышал контрольные значения в среднем на 175 %, а статистически значимое увеличение активности кислой фосфатазы было зарегистрировано только на 7-е суг исследования.

Выссваемость листерий id селезенки и печени мышей этой экспериментальной группы была зарегистрирована на 2, 3 и 5-е сут. При этом наибольшее количество возбудителя листериоза было выделено из селезенки на 2-е сут (314,4 ± 2,7 тыс), из печени — на 3-й сут эксперимента (62,4 ±3,2 тыс).

Терапевтическое введение ппокуроната натрия животным на фоне комбинированного воздействия циклофосфана и Listeria monocytogenes приводило к статистически значимому увеличению индекса Райта перитонеальных макрофагов (в среднем на 174,5 %), определяемому на протяжении всего периода наблюдения, индекса Гамбургера — в период с 7-х по 28-е сут (в среднем на 75,8 %), показателя завершенности фагоцитоза — в период с 5-х по 10-е сут (в среднем на 74 %). СЦК кислой фосфатазы н неспецифнческой эстеразы в моноцитах периферической крови превышал аналогичные значения в контроле (соответственно на 198 и

329 %) на протяжении всего периода наблюдения (рис. 3).

Таким образом, как профилактическое, так и (особенно) терапевтическое введение гшокуроната натрия животным, зараженным возбудителем листериоза на фоне действия цнклофосфана, приводило к повышению фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов и активности ферментов моноцитов периферической крови (кислая фосфатаза, неспецифическая эстсраза).

Высеваемость листерий из селезенки и печени у подопытных животных этой экспериментальной группы была зарегистрирована на 2,3 и 5-е сут. При этом максимальное число микроорганизмов было выделено из селезенки и печени на 2-е сут (120,0 ± 1.7 тыс и 6,4 ± 13 тыс соответственно).

Таким образом, профилактическое и (особенно) терапевтическое введение глюкуроната натрия (50 мг/кг х 3 ежедневно) приводило к резкому умснынсншо числа высеваемых из селезенки и печени возбудителей листериоза и сокращало период циркуляции микроорганизмов в rmix органах и крови по сравненшо с таковыми у животных, инфицированных Listeria monocytogenes через 1 сут после однократного введения цнклофосфана.

Таким образом, способность глюк-уроната натрия стимулировать функции клеток СМФ при воздействии возбудителя листериоза и цнклофосфана была отчетливо выражена и в условиях комбинированного воздействия листерий и цитостатнка, что позволяет рекомендовать его в онкологической практике при лечении больных в период проведешгя (или после окончания) антибластомной полихимнотерапин в условиях присоединяющейся инфекции.

ВЫВОДЫ

1. Внутривенное взеденне гшокуроната натрия (50 мг/кг х 3 ежедневно в течение трех дней) вызывает у мышей повышение функциональной активности клеток системы моионуклеарных фагоцитов.

2. Профилактическое введение глюкуроната натрия (50 мг/кг х 3 ежедневно в течение трех дней) в 2 раза повышает устойчивость мышей к лнстерийной инфекции.

3. Профилактическое и терапевтическое введение гтокуроиата натрия животным с листернозом приводит к яозышешпо функциональней активности клеток системы моионуклеарных фагоцитов, что сопровождается сокращением периода циркуляции микроорганизмов и уменьшением их количества в органах и крови.

4. Действие глюкуроната натрия в условиях его проф!шакпiческ ого и терапевтического введения животным, инфицированным лнетернями на фоне цитостатической болезни, характеризуется выраженной стимуляцией функциональной активности клеток системы моионуклеарных

фагоцитов и уменьшением числа микроорганизмов в органах и крови зараженных жш-отных.

5. Терапевтическое введение ппокуроната натрия (50 мг/кг х 3 ежедневно в течение трех дней) мышам с.лнстериозом, цитостатической болезнью и животным, зара;кенным Listeria monocytogenes (LD30) на фоне действия циклофосфана, приводит к более выраженной стимуляции функциональной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов и сокращению числа и продолжзгтельностн времени циркуляции микро организмов в органах и крови, чем в условиях его профилактического введения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Особенности функционального статуса клеток СМФ при листе-рнйной инфекции, протекающей на фоне цитостатической болезни/Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. — Томск. — 1993. - Т. 6. - С. 54 - 56 (соавторы: И .Б. Тихонова, В.В. Новицкий).

2. Новые фармакологические средстиа для профилактики и коррекции нарушений функций клеток СМФ//Экоген. —Томск. - 1994. - Ч. 4. — С. 22 (соавторы: И.Б.Тихонова, Ю.В.Федоров, В.В.Новицкнй).

3. Влияние циклофосфана на высеваемость листерий из органов и крови//Экоген. — Томск. - 1994. - Ч. 4. — С.23 (соавторы: И.Б. Тихонова, Ю.В. Федоров. В.В. Новицкий).

4. Оценка цитохимической активности моноцитов периферической крови при листерий)юй инфекции у мышей на фоне применения цитоста-тика//СОорннк трудов аспирантов и соискателей Сибирского медицин- -ского университета. — Томск. - 1994. — С. 21 (соавтор: И.Б.Тихонова).

5. Новые фармакологические препараты как средства, повышающие устойчивость мышей к лнстериозу//Сборник трудов аспирантов и соискателей Сибирского медицинского университета. -— Томск. - ¡994. - С. 22 (соавтор: И.Б. Тихонова).

6. Высеваемость листерий из органов и крови при цитостатической тсрапии//Сборник трудов аспирантов и соискателей Сибирского медицинского университета. — Томск. - 1994. — С. 24 (соавтор: И.Б. Тихонова).

7. Заявка № 94091421 на изобретение "Противсинфекционное средство" с приор!гтетом от 12.01.94 г.

8. Заявка № 94007979 на изооретенне "Средство, стимулирующее функции клеток системы мононуклеарных фагощгтов" с приоритетом от 05.03.94 г. ' . *

«. '¿"""И . '_____