Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Нарушения в системе крови у больных раком молочной железы в процессе лечения по схеме CAF и возможность их фармакологической коррекции

На правах рукописи

Хричкова Татьяна Юрьевна

НАРУШЕНИЯ В СИСТЕМЕ КРОВИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ ПО СХЕМЕ CAF И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ

14.00.25-Фармакология, клиническая фармакология 14.00.14 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2002

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте фармакологии и Научно-исследовательском институте онкологии Томского научного центра СО РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Гольдберг В.Е.

доктор медицинских наук Жданов В.В.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН Новицкий В.В.

доктор биологических наук, профессор Чердынцева Н.В.

Ведущая организация: Новосибирская государственная медицинская академия (г. Новосибирск)

Защита состоится "_"_2002 г. в__часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01. при НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

Автореферат разослан "_"_2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Р>Г63 ГоЪ

— Амосова Е.Н.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АКТГ - адренокортикотропный гормон АФК - активные формы кислорода ГИМ - гемопоэзиндуцирующее микроокружение Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ИЛ-3 - интерлейкин-3

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцито-макрофагальная

КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроидная

КСА - колониестимулирующая активность

НСТ - нитросиний тетразолий

ОКЛ - общее количество лейкоцитов

РМЖ - рак молочной железы

БИ - фактор Стала (фактор стволовой клетки)

Актуальность проблемы. Высокая смертность от рака молочной железы, занимающего одно из ведущих мест по частоте распространенности среди злокачественных новообразований, во многом обусловлена ранним метастази-рованием и недостаточной эффективностью используемых способов лечения. При распространенных формах рака молочной железы наиболее целесообразным способом лечения является цитостатическая терапия. Ее использование позволяет продлить жизнь больных, улучшить ее качество, а в ряде случаев - добиться длительной ремиссии [Дымарский Л.Ю., 1980; Блохин H.H., Переводчикова Н.И., 1984; Моисеенко Б.М., Семиглазов В.Ф., Тюлян-дин С.А., 1997]. Однако возможности химиотерапии лимитируются выраженными побочными эффектами цитостатических препаратов и в первую очередь - токсическим действием в отношении системы крови. Снижение числа форменных элементов в периферической крови в ряде случаев становится основным показанием для прерывания лечения онкологических больных [Гершанович M.JL, 1982; Гольдберг Е.Д., Новицкий В.В., 1986; Переводчикова Н.И., 1996].

В связи с этим в настоящее время при проведении химиотерапии назначают препараты, обладающие гемостамулируюицнм действием. К ним относятся неспецифические протекторы гемопоэза - зимозан, спленин, витамины группы В, предшественники синтеза нуклеиновых кислот - нуклеиново-кислый натрий, пентоксил, метацил. Свойством стимулировать гемопоэз обладают гормоны, соли лития [Алмазов В.А., Афанасьев Б.В., Зарицкий А.Ю., Шишков A.J1., 1981; Закенфельд Г.К., 1985; Мороз Б.Б., Дешевой Ю.Б., Цы-банев O.A., 1986]. Однако применение вышеперечисленных препаратов в эксперименте и клинике показало, что они либо малоэффективны при выраженных миелодепрессиях, либо вызывают истощение костного мозга [Платонова Г.В., Софьянова З.П., 1975; Алмазов В.А., Афанасьев Б.В., Зарицкий А.Ю., Шишков АЛ., 1981; Гершанович М.А., 1982; Закенфельд Г.К.,1985; Patchen M.L., MacVittie T.J., 1985].

С патогенетических позиций наиболее перспективными для клинического применения можно считать препараты качественно нового типа, созданные на основе эндогенных регуляторов гемопоэза (колониестимулирую-щие факторы, интерлейкины, эритропоэтин). Однако их терапевтическое применение также ограничено вследствие возможности развития побочных эффектов, а также очень высокой стоимости [Козлов В.А., Громыха Н.Ю., 1987; Moore М.А., Warren D.I., 1987; Leary A.G., Ikebuchi К., Hirai Y. e.a.. 1988; Mittelman M., Lessin L.S., 1994; Nguyen Y.K.., 1994; Scagni P., Saracco P. Timeus F. e.a., 1998].

В связи с вышесказанным становится весьма перспективным поис* эффективных стимуляторов кроветворения среди препаратов природногс происхождения, обладающих низкой токсичностью, отсутствием или слабой выраженностью побочных эффектов, возможностью длительного примене ния без развития толерантности.

В этом отношении большой интерес для исследования представляет новый препарат животного происхождения, получаемый из крови марала по оригинальной технологии - кропанол, разработанный в НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. Проведенные ранее в лаборатории патофизиологии НИИ фармакологии экспериментальные исследования показали высокую гемо-стимулирующую активность пантогематогена-сухого, являющегося действующей субстанцией кропанола, на модели миелосупрессии, вызванной у мышей введением цикпофосфана. При этом препарат активировал преимущественно процессы регенерации костномозгового грануломоноцитолоэза [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Суслов Н.И., 1997; Жданов В.В., Симанина Е.В., Поженько Н.С., 1999; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 2000; Грибов С.А., 2000; Гурьянцева JI.A., 2001].

Цель исследования. Изучить нарушения, возникающие в системе крови у больных раком молочной железы III-IV стадии при проведении противоопухолевой химиотерапии по схеме CAF, определить возможность их фармакологической коррекции кропанолом и вскрыть механизмы, лежащие в основе гемостимулирующего влияния исследуемого препарата.

Задачи исследования:

1. Изучить изменения показателей периферической крови и костного мозга у больных раком молочной железы в процессе лечения по схеме CAF.

2. Исследовать нарушения функциональной активности клеток различных отделов системы крови, возникающие под действием препаратов схемы CAF.

3. Оценить возможность коррекции кропанолом нарушений, возникающих в системе крови у онкологических больных в процессе цитостатиче-ской терапии.

4. Вскрыть механизмы стимулирующего влияния кропанола в отношении кроветворения, подавленного препаратами схемы CAF, у больных раком молочной железы.

Научная новизна и практическая значимость. В ходе работы у больных раком молочной железы впервые изучены гематологические эффекты схемы цитостатического лечения CAF, включая показатели периферической крови и костного мозга, в комплексе с параметрами функциональной активности клеток различных отделов системы крови. При этом обнаружено, что лечение больных раком молочной железы с использованием цитостатических препаратов, входящих в протокол CAF, вызывает существенное угнетение различных показателей системы крови, в частности ее лейкоцитарного звена, что сопровождается заметными изменениями свойств нейтрофильных грану-лоцитов.

Впервые продемонстрирована возможность коррекции с помощью кропанола нарушений, возникающих со стороны системы крови у онкологи-

ческих больных, получающих цитостатическое лечение. Показано, что кро-панол стимулирует преимущественно процессы регенерации костномозгового грануломоноцитопоэза и, в меньшей степени - эритро- и тромбоцитопоэза. Установлено, что в основе активирующего влияния на гемопоэз данного препарата животного происхождения лежит повышение колониеобразующей активности гемопоэтических клеток - предшественников с последующим накоплением в костном мозге зрелых нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов, а в периферической крови - нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов. Показано также, что при включении в схему противоопухолевой химиотерапии (САР) кропанола значительно возрастает костномозговой резерв сегмен-тоядерных форм нейтрофильных гранулоцитов и нивелируется токсическое влияние цитостатиков указанной схемы на кислородзависимый метаболизм нейтрофилов периферической крови.

Разработан патогенетически обоснованный метод фармакологической коррекции гипопластических состояний кроветворения, возникающих в условиях цитостатаческой терапии, препаратом животного происхождения.

Полученные результаты могут явиться основой для проведения исследований по изучению возможности применения кропайола с целью коррекции нарушений, возникающих в системе крови при воздействии на организм различных по своей природе экстремальных факторов и для лечения ряда заболеваний системы крови.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции молодых ученых СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (Новосибирск, 2000), на 1-м Международном симпозиуме по изучению и технологии производства продуктов пантового мараловодства (Канада, 2000), на ежегодной научной конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 2000), на втором конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке" (Томск, 2001), на итоговой научной конференции НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии" (Томск, 2001).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 рисунками, 14 таблицами и состоит из введения, 4 глав, выводов и указателя литературы, который содержит 273 источника (129 отечественных и 144 иностранных авторов).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В настоящую работу включены результаты изучения системы крови 78 больных раком молочной железы III-IV стадий, женщин в возрасте от 32 до 72 лет, находившихся на обследовании и лечении в отделении химиотерапии НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН с 1999 по 2001 год и не получавших ранее специальной терапии. Материалом исследования являлись костный мозг, капиллярная и венозная кровь. Диагноз рака молочной железы в каждом случае устанавливался на основании данных клинического, рентгенологического, ультразвукового методов обследования и был верифицирован морфологически. Определялась степень распространенности процесса: у 47 больных установлена III стадия рака молочной железы и у 31 - IV стадия.

Все больные получали противоопухолевую полихимиотерапию по схеме CAF, которая включала в себя введение адриамицина по 30 мг/м2 внутривенно в 1-й и 8-й дни, 5- фторурацила по 500 мг/м2 внутривенно в 1-й и 8-й дни, циклофосфана по 400 мг/м2 внутривенно через день (суммарная доза - 2400 мг/м2). Длительность цикла - 14 дней, интервал между курсами -3 недели. Программа лечения в рамках данного исследования предусматривала проведение 3-х циклов полихимиотерапии. Наряду с указанным лечением 35 больных в перерывах между курсами в течение 2-х недель принимали кропанол по 1 капсуле (0,05 г) 3 раза в день. Больные, не получавшие кропа-нол в процессе специального лечения, составили контрольную группу.

Материал для исследования (капиллярную и венозную кровь) забирали цо и после каждого цикла цитостатического лечения. Проведение преднизо-поновых проб и стернальных пункций осуществляли до начала специфического лечения, а также перед II и III курсом химиотерапии.

Характеристика кропанола

Кропанол разработан в НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН на основе пантогематогена-сухого (регистрационное удостоверение МЗ РФ № 000051/ Э1-2000 от 12.10.2000). Препарат получен путем низкотемпературного обезвоживания и стерилизации крови алтайского марала (Cervus elaphus sibiricus), взятой в период срезки пантов. Представляет собой аморфный порошок буровато-коричневого цвета, со слабым специфическим запахом. Гигроскопичен.

Пантогематоген содержит большое количество биологически активных веществ, включая сложные органические соединения, энзимы, гормонопо-цобные вещества в высоких концентрациях и т. д.

В состав капсулы кропанола (200 мг) входит 50 мг пантогематогена-:ухого, 150 мг глюкозы.

Определение показателей периферической крови (гемоглобин, эритро-диты, лейкоциты, лейкоцитарная формула, тромбоциты) и дифференциальный подсчет миелограмм в стернальном пунктате производили стандартными гематологическими методами [Кост Е.А., 1977].

Изучение колониеобразующей способности клеток-предшественников

эритро- и грануломоноцитопоэза из костного мозга и периферической крови проводили по методу Е.Д. Гольдберга и соавт. (1992) в метилцеллюлозе.

. Для оценки костномозгового резерва нейтрофильных гранулоцитов использовали преднизолоновую пробу [Dalí D е.а., 1975]. Содержание лейкоцитов и их отдельных морфологических форм определяли до, а также через 2,3, 4, 5 и 6 часов после введения препарата. Результат пробы оценивали по величине выброса нейтрофильных гранулоцитов в процентах от исходного уровня, отмечали величину максимального выброса нейтрофилов в процентах и абсолютных числах.

Уровень кислородзависимого метаболизма нейтрофилов определяли в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) по методу И.В. Нестеровой с соавт. (1999), учитывая их способность генерировать активные формы кислорода (АФК). Оценивали спонтанную и стимулированную (при добавлении in vitro опсонизированного зимозана) продукцию АФК по проценту активных (формазанположительных) нейтрофилов и интенсивности реакции, о которой судили по показателям среднего цитохимического коэффициента. Фагоцитарный резерв, отражающий способность нейтрофилов к завершенному фагоцитозу, подсчитывали как разницу между показателями в стимулированном и спонтанном вариантах реакции.

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании периферической крови больных с установленным диагнозом РМЖ в процессе химиотерапевтического лечения, нами было зафиксировано достоверное уменьшение числа эритроцитов и концентрации гемоглобина относительно данных, полученных до начала терапии. При этом минимальные величины указанных показателей приходились на период после третьего курса лечения. Содержание в костном мозге эритроидных клеток, способных к активной пролиферации, также снижалось более чем вдвое уже после первого курса химиотерапии и оставалось несколько ниже исходного уровня вплоть до окончания периода наблюдения (рис. 2).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что лечение по схеме CAF негативно сказывается на состоянии периферического звена эритрона и вызывает достаточно выраженное опустошение эритроидного ростка костного мозга. Данное обстоятельство связано, по всей вероятности, с тем, что эритронормобласты, представляя собой интенсивно делящуюся популяцию клеток костного мозга, весьма чувствительны к токсическому действию ци-тостатиков с разными механизмами действия [Козинец Г.П., Гольдберг Е.Д., 1982]. Так, известно, что в случае использования адриамицинй, наибольшей чувствительностью к действию данного препарата характеризуется именно эритроидный росток кроветворения [Гольдберг Е.Д., Новицкий В.В., 1986]. Возможно, что процессы дифференцировки данной группы клеток преобла-

дают в условиях химиотерапии по схеме CAF над процессами их пролиферации.

В то же время лечение по протоколу CAF оставляло неповрежденными коммитированные клетки-предшественники красного ростка гемопоэза, составляющие его глубокий резерв. К началу второго курса лечения число КОЕ-Э достоверно возросло на 22 % и сохранялось на этом уровне до третьего курса химиотерапии, что можно объяснить компенсаторными усилиями эритрона, направленными на восполнение дефицита его элементов (рис. 3). К настоящему времени доказано, что в восстановлении гемопоэза после цитостатических воздействий участвуют как генетически запрограммированные механизмы, лежащие в основе реакции системы крови на любое экстремальное воздействие, так и процессы, характерные исключительно для определенного раздражителя и определенного отдела кроветворной ткани [Дыгай A.M., Жданов В.В., Хлусов И.А. и др., 1995; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В„ 1999]. При повреждении эритронормобластов и эритроцитов цитостатиками в циркуляцию поступают продукты их распада, способные активировать эритропоэз. Н.М.Новиковым с соавторами (1988) была выдвинута гипотеза, в соответствии с которой макрофаги костного мозга, печени, селезенки и почек, захватывая фрагменты разрушенных эритроцитов и эритрокариоцитов, передают стимулирующую информацию в строму костного мозга [Новиков Н.М., 1988].

Число тромбоцитов у онкологических больных уже после первого курса приема цитостатических препаратов, входящих в схему CAF, уменьшалось на 30 %. В дальнейшем число тромбоцитов несколько возрастало, хотя и оставалось к завершению периода наблюдения ниже исходного уровня. Уменьшение числа тромбоцитов обусловлено, вероятно, разнообразными ДНК-повреждающими эффектами цитостатических препаратов, которые, оказывая воздействие на нуклеиновый аппарат клетки, вызывают нарушение течения нормальных эндомитотических процессов в мегакариоцитах [Горбунова В.А., 1982]. Кроме того, препараты схемы CAF, наряду с нуклео-фильной "атакой", оказывают выраженное токсическое действие на мембрану тромбоцитов, вызывая их повышенную деструкцию в периферической крови [Гольдберг Е.Д., Новицкий В.В., 1986].

К наиболее частым осложнениям при проведении химиотерапии относится лейкопения с преимущественным снижением количества нейтрофиль-ных гранулоцитов [Гершанович M.JI., 1982; Гольдберг Е.Д., Новицкий В.В., 1986], которые, с одной стороны, обеспечивают защиту организма от разного рода инфекций, а с другой - участвуют в формировании противоопухолевой резистентности [Лаврова B.C., Чердынцева Н.В., Васильев Н.В. и др., 1992]. При этом частота развития и глубина лейкопении зависит от используемых цитостатических препаратов и режимов лечения [Блохин H.H., Переводчи-кова Н.И., 1984; Булкина З.П., 1991].

Проведенные нами исследования показали, что обшее количество лей-

коцитов (ОКЛ) у пациентов закономерно уменьшилось почти в 2 раза уже после первого курса химиотерапии. К началу второго курса лекарственной терапии общее число белых клеток крови возросло, не достигая при этом исходного уровня, а далее происходило прогрессирующее уменьшение ОКЛ после завершения каждого курса химиотерапии, с максимальным падением (в 3 раза) числа лейкоцитов на момент окончания третьего курса специфического лечения (рис. 1).

Уменьшение числа лейкоцитов было обусловлено снижением содержания лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов, в частности сегмептоядер-ных нейтрофилов, в периферической крови, что явилось закономерным результатом воздействия цитостатических препаратов на клеточную продукцию.

Анализ стернальных пункций показал наличие компенсаторных сдвигов со стороны костномозгового кроветворения. Так, уже перед началом второго курса химиотерапии содержание незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов достоверно выросло на 22 и 16 % соответственно в сравнении с уровнем до начала лечения (рис. 2). Это обстоятельство, возможно, обусловлено отсутствием значительных повреждений цитостатическими препаратами комбинации CAF способных к митозу предшественников гранулоци-топоэза, что создает основу для активации регенераторных процессов в костном мозге на ранних этапах цитостатической болезни [Козинец Г.П., Гольдберг Е.Д., 1982]. Однако в ходе дальнейшего лечения, по-видимому, происходило истощение репаративных возможностей гранулоцитарного ростка. Подтверждением этого является снижение содержания незрелых нейтрофильных гранулоцитов ниже исходного уровня перед началом третьего курса химиотерапии, хотя, возможно, это связано и с их ускоренным созреванием. Как следствие, в кроветворной ткани наблюдается накопление зрелых гранулоцитарных элементов и некоторое возрастание количества лейкоцитов в периферической крови.

Уже перед началом второго курса химиотерапии по схеме CAF наблюдалось увеличение содержания в кроветворной ткани клеток-предшественников эритро- и грануломоноцитопоэза. Перед третьим курсом специфического лечения и тот и другой показатели оставались повышены, хотя и без достоверных различий по сравнению с исходным уровнем (рис. 3). Увеличение колониеобразующей способности кроветворной ткани является неотъемлемой составляющей универсальной реакции гемопоэза на действие любого чрезвычайного раздражителя, каковым и является цитостатическая травма [Дыгай A.M., Клименко H.A., 1992; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 1999]. При этом центральные стрессреализующие структуры посредством активации нейро-эндокринных механизмов, действующих как непосредственно на гемопоэтические клетки, так и через элементы ГИМ, вызывают повышение интенсивности процессов пролиферации и дифференци-ровки кроветворных клеток [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Хлу-

сов И.А., 1999]. Поэтому увеличение числа клоногенных клеток уже перед началом второго курса химиотерапии, обнаруженное у больных, леченых по протоколу CAF, представляется вполне естественным. Некоторое снижение величин указанных показателей (остающихся, однако, на достаточно высоком уровне), которое наблюдалось перед третьим курсом, связано, по всей видимости, с определенным истощением компенсаторных механизмов, обеспечивающих регенерацию кроветворения.

Совершенно иной оказалась динамика содержания кроветворных прекурсоров в периферической крови у больных РМЖ в процессе цитостатиче-ской химиотерапии. Так, число предшественников эритро- и грануломоно-цитопоэза прогрессивно снижалось от курса к курсу, достигая своих минимальных значений к окончанию периода наблюдения (рис. 3 В,Г).

Установлено, что в условиях длительного курсового воздействия цито-статических препаратов и ионизирующего излучения в системе крови развиваются нарушения, способные отрицательно влиять на процесс мобилизации кроветворных клеток-предшественников в периферическую кровь. Во-первых, на уровне синусов костного мозга происходит изменение проницаемости выстилающего их эндотелия [Mohle R. е.а., 1997; Daldrup-Link Н.Е. е.а., 2000; Tordjman R. е.а.', 2001] и, во-вторых, возникает постепенное истощение продукции гемопоэзстимулирующих цитокинов (вследствие их постоянного напряжения), таких как Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИЛ-3, фактор Стила (SF), вызывающих при однократном применении цитостатиков в больших дозах выход кроветворных предшественников из костного мозга в периферическую кровь, путем воздействия на специфические рецепторы [Liu F. е.а., 1997; Knopinska-Posluszny W. е.а., 1998].

Выше указывалось, что в периферической крови больных, получавших лечение по схеме CAF, происходило снижение числа лимфоцитов, минимальный уровень которых наблюдался на момент завершения третьего курса химиотерапии. Вероятно, это было связано с угнетением под действием цитостатиков костномозгового лимфопоэза, подтверждением чего служит достоверное снижение (почти в 1,5 раза) содержания лимфоидных клеток в костном мозге больных РМЖ перед началом второго курса специфической терапии (рис. 1Д, 2Е).

Характеризуя состояние моноцитарно-макрофагального ростка гемо-поэза у больных, леченных по схеме CAF, необходимо отметить достоверное снижение содержания моноцитов в периферической крови после каждого курса химиотерапии и в костном мозге перед вторым курсом (рис. IE, 2В). Уменьшение числа клеток указанного ряда может быть связано, кроме истощения их костномозгового пула, с ускоренной дифференцировкой в органо-и тканеспецифические макрофаги (характерная особенность действия ад-риамицина, входящего в схему), либо с более быстрым разрушением клеток в результате непосредственного токсического, действия препаратов указанной комбинации. S-u: .

Мы провели достаточно подробное изучение изменений содержания основных категорий лейкоцитов и их предшественников в различных отделах системы крови. Однако не только количественные, но и качественные характеристики гемопоэтических клеток представляются чрезвычайно важными для выполнения ими своих функций. В полной мере это относится к элементам нейтрофильного ростка - важнейшего звена системы противоопухолевой резистентности организма.

Одной из наиболее важных функциональных особенностей нейтрофи-лов костномозгового пула является их свойство выходить в большом количестве в циркуляцию в ответ на введение глюкокортикоидов. При введении преднизолона больным РМЖ нами было выявлено преходящее повышение числа нейтрофилов в периферической крови, что свидетельствует о наличии типичной реакции на гормональный препарат (рис. 4). Результаты проведенных проб перед вторым и третьим курсами химиотерапии существенно не отличались от реакции на введение преднизолона у больных РМЖ до начала лечения. Однако при этом величина максимального выброса нейтрофилов как в абсолютных, так и в относительных значениях неуклонно падала, достигая минимального уровня перед третьим курсом цитостатического воздействия. Ослабление реакции на преднизолон может быть обусловлено повреждением эндотелия синусов костного мозга цитостатическими препаратами; (циклофосфан) [Блохин Н.Н., Переводчикова Н.И., 1984; Булкина З.П., 1991], что, в свою очередь, влияет на перераспределение поступающих в периферическую кровь нейтрофилов. Снижение величин максимального выброса нейтрофилов может быть связано также с уменьшением числа нейтрофилов в результате более длительного воздействия цитостатиков, вызывающих угнетение их продукции [Кулагина И.В., 1990].

Известно, что выполнение нейтрофилом специализированных функций, в том числе противоопухолевой и антиинфекционной, во многом обеспечивается качественными и количественными характеристиками его внутриклеточных систем [Бережная Н.М. и др., 1984; Чердынцева Н.В. и др.. 1989]. Мы провели оценку циркулирующих нейтрофильных гранулоцитов на состояние окислительно-восстановительных процессов в НСТ-тесте.

Выполненные исследования выявили существенное угнетение показателей кислородзависимого метаболизма (спонтанного и стимулированного НСТ-теста) у больных РМЖ перед началом второго курса химиотерапии, а также достоверное снижение фагоцитарного резерва к моменту его завершения (рис. 5). Активация кислородзависимого метаболизма относится к важным проявлениям опсонизации клетки и служит критерием ее эффективности [Виксман М.Е., 1980]. Снижение опсонических свойств сыворотки, имеющее место в условиях химиотерапии по схеме САР, может приводить к нарушению процессов рецепции и недостаточной активации кислородзависимого метаболизма [Маянский Д.Н., 1982; Гусева С.А., 1989].

Таким образом, лечение больных РМЖ с использованием цитостатиче-

ских препаратов, входящих в протокол САР, вызывает существенное угнетение различных показателей системы крови, в частности ее лейкоцитарного звена, что сопровождается заметными изменениями функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов.

Последующие исследования были направлены на изучение эффективности коррекции кропанолом нарушений, развивающихся в системе крови в ходе цитостатического лечения больных РМЖ.

Изучение содержания эритроцитов и гемоглобина в периферической крови больных РМЖ в динамике цитостатической терапии в комбинации с препаратом животного происхождения не выявило достоверных отличий от аналогичных показателей у пациентов контрольной группы, не получавших кропанол. Содержание же в костном мозге эритроидных клеток, не способных к активной пролиферации снижалось более чем вдвое уже после первого курса приема кропанола и оставалось ниже уровня данного показателя в контрольной группе вплоть до окончания периода наблюдения.

Совершенно иной была реакция на включение в схему лечения кропанола в отделе коммитированных клеток-предшественников эритропоэза, составляющих его глубокий резерв. Содержание КОЕ-Э в костном мозге больных, получавших лечение по схеме САР в комбинации с исследуемым препаратом, уже после первого курса приема кропанола в 2 раза превосходило аналогичные значения в контрольной группе и оставалось достоверно выше вплоть до окончания периода наблюдения (рис. ЗБ). Сходной оказалась и динамика содержания эритроидных прекурсоров в периферической крови (рис. ЗГ). Таким образом, несмотря на малую активность исследуемого препарата в отношении эритроидного ростка в целом, репродуктивная способность эритрона, остается на достаточно высоком уровне за счет глубокого резерва при назначении кропанола в перерывах между курсами химиотерапии у больных РМЖ.

Следует отметить, что в группе больных, принимавших кропанол, к началу второго курса химиотерапии и после завершения второго и третьего курсов специфического лечения отмечалась тенденция к росту числа тромбоцитов, однако эти изменения оказались недостоверными. Следовательно, исследуемый препарат был малоактивен в отношении угнетенного цитоста-тиками мегакариоцитарного ростка кроветворения.

При анализе динамики показателей белой крови, в первую очередь, обращал на себя внимание факт повышения под действием кропанола общего количества лейкоцитов и их отдельных морфологических форм, регистрируемый на протяжении всей программы лечения. Так, содержание лейкоцитов у больных, получавших исследуемый препарат, уже после первого курса его приема на 28,3 % превосходило значение данного показателя в контрольной группе за счет увеличения числа сегментоядерных форм нейтро-филов.

Рис. 1. Изменения общего количества лейкоцитов (А), содержания палочкоя-дерных (Б), сегментоядерных нейтрофилов (В), эозинофилов (Г), лимфоцитов (Д) и моноцитов (Е) в периферической крови у больных раком молочной железы III - IV стадии в динамике противоопухолевой химиотерапии по схеме САБ (незаштрихованные столбики), либо САБ в комбинации с кропано-лом (заштрихованные столбики).

По оси абсцисс - сроки исследования (1 - до лечения, 2 - после 1 курса, 3 - перед 2 курсом, 4 - после 2 курса, 5 - перед 3 курсом, 6 - после 3 курса), по оси ординат - содержание клеток в периферической крови (Г/л); доверительные интервалы при Р<0,05.

В дальнейшем, после второго и третьего курсов цитостатического лечения, достоверная разница между показателями контрольной и опытной групп составила 35 % и 95,9 % соответственно преимущественно за счет возрастания числа сегментоядерных нейтрофилов, а также лимфоцитов и моноцитов (рис. 1).

Картина периферической хрови в целом соответствовала изменениям со стороны миелоидного ростка кроветворения. Прием кропанола приводил к достоверному возрастанию числа зрелых нейтрофильных гранулоцитов перед вторым и третьим циклами специфического лечения как по сравнению с исходным уровнем (в 1,4 - 1,5 раза), так и с величиной соответствующего показателя у больных, леченых по схеме CAF (в 1,2 - 1,3 раза) (рис. 2).Учитывая, что назначение препарата животного происхождения вызывало достоверное снижение содержания в костном мозге незрелых нейтрофильных гранулоцитов во все сроки исследования по сравнению с контрольной группой, можно сделать вывод о преобладании процессов дифференцировки миелоидных клеток над процессами их пролиферации под влиянием кропанола.

Обращало на себя внимание существенное увеличение (в 2,1 раза) числа моноцитов - макрофагов перед вторым курсом химиотерапии при включении кропанола в схему лечения онкологических больных по сравнению с "чистой" схемой. В то же время, кропанол практически не оказывал влияния на содержание в костном мозге лимфоидных клеток в ходе проводимого цитостатического лечения. ;

Говоря о механизмах гемостимулирующего действия кропанола, следует иметь в виду [Гольдберг Е.Д. и др., 2000; Дыгай A.M., Жданов В.В., Гурьянцева JI.A., 2000; Гурьянцева JI.A.. 2001], что в основе активирующего влияния пантогематогена - сухого на процессы восстановления костномозгового кроветворения у мышей после введения циклофосфана лежит возрастание уровней эркхропоэтияеской и колониестимулирующей активностей сыворотки периферической крови, увеличение продукции клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения короткодистантных гуморальных регуляторов типа КСА, стимуляция образования гемопоэтических островков и процессов пролиферации коммитированных клеток-предшественников типа КОЕ-ГМ.

Нами было установлено, что число КОЕ-ГМ при лечении по схеме CAF достоверно возрастало лишь перед вторым курсом специфической терапии на 22 %. В эти же сроки, при лечении больных в сочетании с кропано-лом содержание КОЕ-ГМ увеличивалось на 88,5 % по сравнению с нелечеными пациентами, при этом оно превышало аналогичные параметры у больных, не принимавших кропанол, в 1,6 раза.

12 3 12 3

Рис. 2. Изменения содержания незрелых (А), зрелых (Б) нейтрофильных гра-нулоцитов, моноцитов (В), незрелых (Г), зрелых (Д) эритрокариоцигов и лимфоцитов (Е) в костном мозге больных раком молочной железы III - IV стадии в динамике противоопухолевой химиотерапии по схеме САБ (неза-штргосованные столбики), либо САР в комбинации с кропанолом (заштрихованные столбики).

По оси абсцисс - сроки исследования (1 - до лечения, 2 - перед 2 курсом, 3 - перед 3 курсом), по оси ординат - содержание клеток в костном мозге (%);

доверительные интервалы при Р<0,05.

Перед третьим курсом химиотерапии в группе больных, принимавших кро-панол, число клеток-предшественников грануломоноцитопоэза оставалось достоверно выше аналогичных значений в контрольной группе в 1,7 раза (рис. ЗА).

Что касается количества циркулирующих клеток-предшественников грануломоноцитопоэза у больных, леченых кропанолом в процессе химиотерапии, то, хотя оно и было на протяжении всего периода наблюдения значительно выше уровня аналогичного параметра в контрольной группе, достоверно от него не отличалось (рис. ЗВ). Приведенные факты могут быть обусловлены, наряду с усилением пролиферативной активности коммитирован-ных предшественников в костном мозге, перераспределительными реакциями в системе крови под действием кропанола, поскольку обнаруженные изменения соответствуют картине мобилизации кроветворных прекурсоров из костного мозга в Периферическую кровь. Таким образом, применение кропанола расширяет возможность расселения гемопоэтических предшественников на внекостномозговые территории.

При сравнительном анализе реакции на преднизолон костномозгового пула нейтрофильных гранулоцитов нами было выявлено, что выраженность ее значительно возрастает (как перед вторым курсом химиотерапии, так и перед третьим) при использовании схемы САР в комбинации с кропанолом по сравнению не только с "чистой" схемой, но и с нелечеными больными ( рис. 4). Так, перед третьим курсом химиотерапии при использовании схемы САР пик выброса нейтрофилов (составивший всего 143% от исходного против 178 % перед вторым курсом) приходился на 3-х часовую точку пробы, в то время как перед вторым курсом - на 4-х часовую. При включении в схему лечения кропанола пик выброса гранулоцитов перед вторым курсом химиотерапии приходился на 6-й час, а перед третьим - на 5-й, составив 212 % и 187 % от уровня, наблюдавшегося до введения преднизолона соответственно. Достоверно выше (в 2 раза) перед вторым курсом лечения по схеме САГ в комбинации с кропанолом оказалась и величина максимального выброса нейтрофилов в ответ на фармакологическую стимуляцию по сравнению с аналогичным показателем у больных, леченых по схеме САР без включения пре парата- корректора.

Перед третьим курсом химиотерапии и после двух курсов приема препарата-корректора разница между опытной и контрольной группами была несколько менее выражена, но при этом оставалась достоверной, причем абсолютное значение максимального выброса нейтрофилов у больных, леченных по схеме САР в комбинации с кропанолом, также в 2 раза превышало аналогичный показатель в группе сравнения.

Обсуждая возможные механизмы данного феномена, следует иметь в виду, что одним из факторов, влияющих на выраженность лейкоцитарных реакций на преднизолон, является уровень нейтрофильных гранулоцитов в

Рис. 3. Содержание коммутированных клеток-предшественников грануло-моноцитопозза (А), эритропоэза (Б) в костном мозге и коммитированных клеток-предшественников грануломоноцитопоэза (В), эритропоэза (Г) в периферической крови больных раком молочной железы III - IV стадии в динамике проведения противоопухолевой химиотерапии по схеме САБ (неза-штрихованные столбики), либо САБ в комбинации с кропанолом (заштрихованные столбики).

По оси абсцисс - сроки исследования (1 - до лечения, 2 - после 1 курса, 3 - перед 2 курсом, 4 - после 2 курса, 5 - перед 3 курсом, 6 - после 3 курса), по оси ординат - содержание КОЕ/Ю5 нуклеаров; доверительные интервалы при Р<0,05.

периферической крови больных перед проведением проб [Осалчая Т.Н., 1978]. Полученные нами результаты показали возрастание общего количества лейкоцитов и их отдельных морфологических форм под действием крона-кола в процессе цитостатической терапии.

Полноценность ответа на преднизолон зависит, кроме того, от объема костномозгового пула нейтрофильных гранулоцитов [Грибова И.А., Свинки-на Н.В., 1968; Кулагина И.В., 1990]. Именно при применении схемы CAF в комбинации с кропанолом, нами был отмечен достоверно более высокий уровень зрелых нейтрофильных гранулоцитов, способных выходить в кровоток в ответ на гормональную стимуляцию.

Особенности процесса .мобилизации их в кровь определяются также состоянием комплекса нейтрофилвысвобождающих факторов, природа которых остается малоизученной. Высказывается мнение, что в мобилизации костномозговых нейтрофилов участвует комплемент - один из важнейших источников нейтрофильных хематтрактантов [Алмазов В.А., Афанасьев Б.В., Зарицкий А.Ю., Шишков A.JI., 1981]. Выход клеток в кровоток зависит и от состояния стенок синусов костного мозга, свойств самих гранулоцитарных клеток - наличия в них комплекса протеолитических ферментов, обеспечивающих разжижение белкового желатинообразного вещества, окружающего очаги гранулоцитопоэза [Истманова Т.С., Алмазов В.А., 1973; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989].

Полученные результаты свидетельствуют о том, что назначение кропа-нола активирует механизмы, обеспечивающие мобилизацию костномозговых нейтрофилов в периферическую кровь. Возможно, данное обстоятельство обусловлено активацией под влиянием кропанола центральных звеньев ги-поталямо-гипофизарно-надпочечниковой системы и, как следствие, стимуляция выработки эндогенного АКТГ и кортизола [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Суслов Н.И., 1997; Pragina L.L., Tushmalova N.A., Shebalin A.I., 2000; Semenov V.A., Antoshechkin A.G., Shebalin A.I., 2000].

Для оценки функциональной активности нейтрофилов периферической крови при назначении препарата-корректора животного происхождения мы также провели исследование уровня окислительно-восстановительных процессов в НСТ-тесте.

Наиболее выраженными оказались отличия между опытной и контрольной группами больных по показателям кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов перед вторым курсом химиотерапии, что было обусловлено преимущественно угнетением показателей НСТ-теста у пациентов, леченных по схеме CAF. Так, под действием препаратов, используемых в данном режиме химиотерапии, параметры спонтанного НСТ-теста, характеризующего степень функциональной активности нейтрофилов в кровотоке, существенно снижались по сравнению с исходным уровнем. При этом способность нейтрофилов отвечать респираторным взрывом на :тимуляцию также значительно уменьшалась к началу второго курса

2 3 4 6 6

Рис. 4. Динамика преднизолоновых проб у больных раком молочной железы III - IV стадии до лечения (А), перед вторым курсом (Б), перед третьим курсом (В) противоопухолевой химиотерапии по схеме САР (незакрашенные точки), либо САБ в комбинации с кропанолом (закрашенные точки).

По оси абсцисс - время после введения преднизолона (час), по оси ординат - прирост числа нейтрофилов (Г/л); доверительные интервалы при Р<0,05.

1 2 3 4 1 2 3 4

Рис. 5. Изменения показателей спонтанного НСТ-теста в процентах (А) и условных единицах (Б), стимулированног НСТ-теста в процентах (В) и условных единицах (Г), фагоцитарного резерва в процентах (Д) и условных единицах (Е) в нейтрофилах периферической крови больных раком молочной железы П1 - IV стадии в динамике противоопухолевой химиотерапии по схеме САБ (незаштрихованные столбики), либо САР в комбинации с кропано-лом (заштрихованные столбики).

По оси абсцисс - сроки исследования (1 - до лечения, 2 - после 1 курса, 3 - перед 2 курсом, 4 - после 2 курса), по оси ординат - значение показателя; доверительные интервалы при Р<0,05.

специфического лечения. Назначение кропанола в перерыве между первым и вторым курсами цитостатического воздействия привело к возрастанию вышеназванных показателей в сравнении с контрольной группой, причем количество формазанположительных клеток в спонтанном варианте НСТ-теста в среднем в 4,5 раза превосходило аналогичные значения в группе пациентов, не принимавших препарата животного происхождения (рис.5).

Аналогичным образом изменялись значения фагоцитарного резерва нейтрофилов после завершения второго курса специфического лечения. Назначение больным РМЖ в процессе химиотерапии кропанола приводило к полной отмене угнетающего влияния препаратов схемы CAF на показатели фагоцитарного резерва, и даже некоторому их возрастанию в сравнении с исходным уровнем.

Приведенные выше факты подтверждают благоприятное влияние кропанола на показатели функциональной активности нейтрофилов в процессе цитостатической терапии.'Материалы данной работы не позволяют сделать какого-либо определенного заключения о механизмах данного явления в конкретной клинической ситуации.

Таким образом можно констатировать, что под действием кропанола в системе крови больных РМЖ, леченных по схеме CAF, развивается целый ряд изменений, способствующих ускорению компенсации повреждений, вызванных цитостатическими препаратами. Тот факт, что стимулирующий эффект препарата проявляется на различных уровнях организации кроветворной ткани, свидетельствует о системном характере действия кропанола, что согласуется с данными о его ноотропных свойствах [Гольдберг Е.Д., Дыгай

A.M., Суслов Н.И., 1997]. Известно, что регуляция кроветворения и крове-разрушения находится под контролем нервной системы во главе с ее высшим отделом - корой больших полушарий головного мозга [Горизонтов П.Д., Федотова М.И., Белоусова О.И., 1983; Павлов А.Д., Морщаков Е.Ф., 1987]. При этом кора головного мозга осуществляет свое регулирующее влияние на систему крови прежде всего через вегетативную нервную систему [Вогралик

B.Г., 1953; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Хлусов И.А., 1997], которая, в свою очередь, действует через гипоталамо-гипофизарный комплекс и через нервные волокна, иннервирующие различные органы гемопоэза (селезенка, костный мозг и др.) [Черниговский В.Н., Шехтер С.Ю., Ярошевский А.Я., 1967; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Хлусов И.А., 1997].

В работе A.C. Грибова было показано, что одновременно с проявлением у пантогематогена вегетостабилизирующего эффекта (у пациентов с синдромом вегетативной дистонии), регистрируется значимое повышение цветового показателя и числа ретикулоцитов в периферической крови [Грибов

C.А., 2000]. Таким образом, вполне вероятно, что в основе активации данным препаратом гемопоэза лежит модуляция функции центральных нейро-эндокринных механизмов регуляции кроветворения.

Подтверждением справедливости высказанного предположения могут

служить результаты исследования В.М. Рыжакова, в которых дана комплексная оценка участия вегетативной нервной системы в регуляции гемопоэза в условиях проведения полихимиотерапии у онкологических больных [Рыжа-ков В.М., 1998]. Автором впервые доказано модулирующее влияние экстракта шлемника байкальского, являющегося ноотропным средством, на состояние тонуса и реактивности вегетативной нервной системы, что во многом определяет стимулирующее влияние этого препарата на процессы восстановления костномозгового кроветворения.

С другой стороны, различные механизмы восстановления клеточности пулов кроветворных предшественников и морфологически идентифицируемых элементов подтверждают сведения об участии локальных контролирующих гемопоэз структур в реализации гемостимулирующих свойств кро-панола [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Гурьянцева Л .А., 2000].

ВЫВОДЫ

1. При использовании схемы CAF в химиотерапии больных раком молочной железы HI-IV стадии наблюдается выраженное угнетение кроветворения и, как следствие, развитие анемии, лейкопении и тромбоцитопе-нии.

2. Развитие гемодепрессии у больных раком молочной железы в процессе цитостатической терапии сопровождается уменьшением резервного запаса зрелых нейтрофилов в костном мозге, снижением содержания кроветворных предшественников и функциональной активности (НСТ-тест) нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови.

3. Под действием кропанола у больных раком молочной железы Ш-IV стадии ускоряется компенсация нарушений преимущественно грануломо-ноцитопоэза, вызванных препаратами схемы CAF.

4. В основе активирующего влияния кропанола лежит стимуляция функциональной активности гемопоэтических клеток - предшественников с последующим накоплением в. костном мозге зрелых нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов, а в периферической крови - нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов.

5. При включении в схему противоопухолевой химиотерапии (CAF) кропанола значительно возрастает костномозговой резерв сегментоядерных форм нейтрофильных гранулоцитов и нивелируется токсическое влияние цитостатиков данной схемы на кислородзависимый метаболизм нейтрофилов периферической крови.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и пантогематогена на гемопоэз в условиях цитостатической миелосупрессии // Актуальные вопросы экспериментальной морфоло-

гии. - Томск, 1999. - С. 10-12 (соавторы J1.A. Гурьянцева, Е.В. У дут, В.Е. Гольдберг и др.).

2. Экстракт шлемника байкальского в терапии анемий различного генеза // Тез. докл. VII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 2000. - С. 494 (соавторы A.M. Дыгай, В.Е. Гольдберг, A.A. Родионченко и др.).

3. Новые препараты - стимуляторы грануломоноцитопоэза И Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины (Материалы молодежной научной конференции СО РАМН). - Новосибирск, 2000. -

(.... С. 35-36 (соавторы JI.A. Гурьянцева, Н.С. Поженько). г, 4. Новые подходы в создании гемостимуляторов для клинической практики К Тез. докл. VII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 2000. - С. 494 (соавторы A.M. Дыгай, Е.Д. Гольдберг, В.В. Жданов и др.).

5. Влияние пантогематогена на гемопоэз у больных раком молочной железы в условиях химиотерапии // Проблемы эксперим. и клин, фармакологии (Сборник научных работ молодых ученых). - Томск, 2000. - С. 5051.

6. Новые препараты - стимуляторы грануломоноцитопоэза // Бюллетень СО РАМН. - 2000. - № 2. - С. 53-58 (соавторы JI.A. Гурьянцева, Н.С. Поженько).

7. Механизмы стимуляции миелопоэза при цитостагических миелодепрес-сиях пантогематогеном и гранулоцитарным колониестимулирующим фактором // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2000. - Т. 130. - № 11. - С. 512-515 (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, JI.A. Гурьянцева и др.).

8. Механизмы компенсации при повреждении гранулоцитарного ростка у больных раком легкого в условиях противоопухолевой химиотерапии // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2001. - Т. 131. - № 6. - С. 669672 ( соавторы В.Е. Гольдберг, В.В. Жданов, М.Г. Матяш и др.).

9. Механизмы гемостимулирующего действия пантогематогена в условиях цитостатической миелосупрессии у онкологических больных // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. -Томск, 2001.-С. 169-170.

10. Резервные возможности гранулоцитопоэза у больных раком легкого в условиях противоопухолевой химиотерапии CVC и САМ // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск, 2001.-С. 136-138.

11. Влияние пантогематогена на гемопоэз у больных раком молочной железы в условиях химиотерапии // Науки о человеке (сборник статей молодых ученых и специалистов). - Томск, 2001. - С. 156-157.